Optimisation de plasmides pour la thérapie génique : expression et

Optimisation de plasmides pour la
thérapie génique :
expression et régulation
P. Bigey – 2002
Introduire un gène médicament à l’intérieur d’une cellule pour pouvoir :
• corriger une maladie génétique en introduisant dans les cellules
malades le gène qui fait défaut
• inhiber ou stimuler la synthèse d’une protéine donnée (maladies
génétiques, vaccination)
• provoquer la mort d’une cellule cancéreuse en y
introduisant un gène suicide
• stimuler la réponse immunitaire (cancer)
• prévenir la mort cellulaire (neurones)
La thérapie génique
Introduire de l’ADN dans un organisme
• Techniques virales : adénovirus, rétrovirus…
Ces techniques sont efficaces (transfert de gènes), mais
posent des problèmes :
adénovirus immunogène,
rétrovirus : intégration aléatoire peut-être néfaste
(ex. des bébés-bulle)
…
• Techniques non virales : ADN nu ou électrotransfert,
ADN formulé par des vecteurs chimiques.
Dans ce cas, l’ADN est utilisé sous forme de plasmide.
Problème : le transfert de gène est souvent inefficace.
Electrotransfert dans le muscle squelettique : principe
Muscle
tibial cranial
Electrodes à plaques
Générateur
Gel conducteur
Solution
d’ADN

Utilisation du muscle squelettique comme organe sécréteur
de protéines circulantes en thérapie génique :
•Hémophilie →→
→→ facteurs de coagulation (VIII ou IX)
•Anémie →→
→→ érythropoïétine (EPO)
•Thalassémie →→
→→ ββ ββ-globine, EPO
•Nanisme →→
→→ facteurs de croissance
•Inflammation ou cancer
→→
→→ Cytokines
• Anticorps
Plasmides
• Petite molécule d’ADN double brin, circulaire, présente dans les
bactéries de façon extra-chromosomique.
• Unités de réplication autonome : possèdent leur propre origine de
réplication, se répliquent de manière indépendante du chromosome
bactérien
• Optionnels pour la cellule hôte (non indispensables au métabolisme)
dans des conditions normales de croissance.
• Fonction parfois connue (résistance), parfois inconnue.
• Les plasmides sont utilisés comme vecteur de clonage, et d’expression
: on sait les produire et les manipuler
pCR2.1
3906 bp
LacZ
Kana
Amp
M13 reverse
T7 prom
f1 ori
ColE1 ori MCS
ApaI (355
)
BamHI (253)
KpnI (245)
XhoI (333)
SpeI (259)
XbaI (345)
pVAX2
2933 bp
BGH polyA
CMV beta promoteu
r
promoteur kanam
y
pUC ori (pMB1)
Kanamycin
ApaI (737)
EcoRI (688)
XhoI (721)
SpeI (671)
AcsI (688)
ApoI (688)
AvaI (721)
Bsp120I (733)
DraII (733)
EcoO109I (73
3
EcoRV (700)
NotI (715)
PaeR7I (721)
PmeI (742)
Vecteur de clonage Vecteur d’expression eucaryote
• Promoteur eucaryote
• Signal polyA
• marqueur de sélection
• Marqueurs de sélection
Contraintes de la thérapie génique
• Niveau et durée de l’expression du transgène :
Efficacité du transfert de gènes
Importance du plasmide
structure du squelette, taille
• Régulation de l’expression :
Induire la sécrétion du transgène à volonté
Promoteurs inductibles

Le plasmide pour la thérapie génique
• Sécurité : sans gène de résistance aux antibiotiques
(Kanamycine ou Neomycine tolérées)
limiter la dissémination
idéalement, spécifique du tissu choisi
• problème de l’ADN bactérien : limiter au maximum sa
quantité.
• Problème de la taille : au dessus de 16 kb, l’expression
du transgène diminue (transfection moins efficace?).
• problème des séquences CpG
L’ADN peut être méthylé en position 5 des cytosines.
L’ADN bactérien et l’ADN eucaryote ne sont pas méthylés
de la même façon.
D’où :
stimulation du système immunitaire par des séquences de
type PuPuCGPyPy
D’où production de cytokines proinflammatoires :
Élimination des cellules transfectées
Extinction des promoteurs, en particulier CMV
Production d’anticorps Diminution de l’expression
ADN bactérien
Pir 116
Chromosome bactérien
.
ArgE
pXL3296
2023 bp
sup Phe expression cassette
pUC28 MCS
SphI (717) (! contains
cer
SV40 late polyA signal
CMV E/P (-522/+72)
R6K ori gamma
UAG
Exemple : le plasmide pCOR
CMV E/P
R6k ori γγ
γγ
cer
Sup Phe Poly A SV 40
MCS
pCOR
2023 pb
Ne pousse pas sans le plasmide Ne se réplique pas sans la bactérie
Plasmide
Recombinaison
Décaténation
Miniplasmide
Gène
thérapeutique
Origine de réplication
sélection
Gène thérapeutique
Site AttB
Minicercle
Site AttP
Minicercle

Une application : EPO et ββ
ββ-thalassémie
Mauvaise expression de la chaîne ββ
ββ agrégats membranaires de chaîne αα αα
D’où : hémolyse, surcharge en fer, anémie, déformations du squelette
EPO à haute dose stimule la production de chaîne γγ
γγ qui peut remplacer la
chaîne ββ
ββ
2 sous-unités globine αα
αα
2 sous-unités globine ββ
ββ
mois
Sur des souris ββ
ββ-thalassémiques
Emmanuelle Fabre et Mickaël Bettan
Augmentation de l’hématocrite
Allongement de la durée de vie des érythrocytes (de 5 à 10 jours)
Amélioration du phénotype des érythrocytes
30
40
50
60
70
80
0123456789101112
Hématocrite (%)
ET
ET
Régulation
• induire l’expression du transgène à volonté
• éventuellement contrôler le niveau d’expression du transgène
• limiter au maximum l’expression résiduelle
Systèmes existants :
• tétracycline (origine bactérienne)
• Ecdysone (origine insecte)
• RU486 (hormone abortive)
• Rapamycine (immunosuppresseur)
• PPARγγ
γγ
But :
Système tétracycline
Tet O gène
Tet O gène
Dérivé du système bactérien de résistance à la tétracycline :
+ Tet
pas de transcription
transcription
tetR

Tet O gène
Utilisation dans une cellule eukaryote
Protéine de fusion tetR-VP16 (VP16 est un activateur
de transcription d’origine virale) codée par un plasmide
VP16
tetR
Tet O gène
+ Tet
Tet O gène
transcription
Tet O gène
Tet-off Tet-on
transcription
+ Tet
Contrôle de l’expression par un antisens: promoteur CMV
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365 J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365
Lot 1 Lot 2
Activité SeAP en CPS
pCMV SeAP pCMV SeAP
pCMV SeAP
+
Contrôle de l’expression par un antisens :
promoteur tétracycline
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
J8 J15 J22 J30 J63 J70 J170J189 J358 J365 J8 J15 J22 J30 J63 J70 J170 J189 J358 J365
Lot 3 Lot 4
Activité SeAP en CPS
doxycycline
pCMV SeAP pTet SeAP
+
C
A
A
AG G G C C G
C C C G G U
U G A G C G
A C U C G C
G
U
C
A
G
AAG U
C
U G
C C
A
A
U
A
G
U
G
Hélice IHélice II
Hélice III
3’ 5’
Activité catalytique de coupure intramoléculaire
Utilisation de ribozymes