Optimisation de plasmides pour la thérapie génique : expression et

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La thérapie génique
Introduire un gène médicament à l’intérieur d’une cellule pour pouvoir :
Optimisation de plasmides pour la
thérapie génique :
expression et régulation
P. Bigey – 2002
• corriger une maladie génétique en introduisant dans les cellules
malades le gène qui fait défaut
• inhiber ou stimuler la synthèse d’une protéine
génétiques, vaccination)
donnée (maladies
• provoquer la mort d’une cellule cancéreuse en y
introduisant un gène suicide
• stimuler la réponse immunitaire (cancer)
• prévenir la mort cellulaire (neurones)
Introduire de l’ADN dans un organisme
Electrotransfert dans le muscle squelettique : principe
• Techniques virales : adénovirus, rétrovirus…
Ces techniques sont efficaces (transfert de g ènes), mais
posent des problèmes :
adénovirus immunogène,
rétrovirus : intégration aléatoire peut-être néfaste
(ex. des bébés-bulle)
…
• Techniques non virales : ADN nu ou électrotransfert,
ADN formulé par des vecteurs chimiques.
Dans ce cas, l’ADN est utilisé sous forme de plasmide.
Problème : le transfert de gène est souvent inefficace.
Muscle
tibial cranial
Générateur
Electrodes à plaques
Solution
d’ADN
Gel conducteur
Utilisation du muscle squelettique comme organe sécréteur
de protéines circulantes en thérapie génique :
• Hémophilie
→ facteurs de coagulation (VIII ou IX)
• Anémie
→ érythropoïétine (EPO)
• Thalassémie
→ β-globine, EPO
• Nanisme
→ facteurs de croissance
Plasmides
• Petite molécule d’ADN double brin, circulaire, présente dans les
bactéries de façon extra-chromosomique.
• Unités de réplication autonome : possèdent leur propre origine de
réplication, se répliquent de manière indépendante du chromosome
bactérien
• Optionnels pour la cellule hôte (non indispensables au métabolisme)
dans des conditions normales de croissance.
• Inflammation ou cancer
• Anticorps
→ Cytokines
• Fonction parfois connue (résistance), parfois inconnue.
• Les plasmides sont utilisés comme vecteur de clonage, et d’expression
: on sait les produire et les manipuler
Vecteur de clonage
Vecteur d’expression eucaryote
Contraintes de la thérapie génique
M13 reverse
KpnI (245)
BamHI (253)
SpeI (259)
CMV beta promoteur
LacZ
ColE1 ori
SpeI (671)
MCS
pUC ori (pMB1)
XhoI (333)
AcsI (688)
XbaI (345)
pCR2.1
ApoI (688)
ApaI (355)
EcoRV (700)
T7 prom
NotI (715)
pVAX2
f1 ori
3906 bp
• Niveau et durée de l’expression du transgène :
EcoRI (688)
2933 bp
XhoI (721)
AvaI (721)
PaeR7I (721)
Bsp120I (733)
Amp
Efficacité du transfert de gènes
DraII (733)
Importance du plasmide
structure du squelette, taille
EcoO109I (733
Kana
ApaI (737)
Kanamycin
PmeI (742)
BGH polyA
• Régulation de l’expression :
promoteur kanamy
• Marqueurs de sélection
• Promoteur eucaryote
• Signal polyA
• marqueur de sélection
Induire la sécrétion du transgène à volonté
Promoteurs inductibles
ADN bactérien
Le plasmide pour la thérapie génique
•
Sécurité : sans gène de résistance aux antibiotiques
(Kanamycine ou Neomycine tolérées)
limiter la dissémination
idéalement, spécifique du tissu choisi
problème de l’ADN bactérien : limiter au maximum sa
quantité.
•
• Problème de la taille : au dessus de 16 kb, l’expression
du transgène diminue (transfection moins efficace?).
•
problème des séquences CpG
L’ADN peut être méthylé en position 5 des cytosines.
L’ADN bactérien et l’ADN eucaryote ne sont pas méthylés
de la même façon.
D’où :
stimulation du système immunitaire par des séquences de
type
PuPuCGPyPy
D’où production de cytokines proinflammatoires :
Élimination des cellules transfectées
Extinction des promoteurs, en particulier CMV
Diminution de l’expression
Production d’anticorps
Exemple : le plasmide pCOR
Minicercle
Miniplasmide
Pir 116
.
γ
R6k
ori
R6K ori
gamma
CMV
CMV E/P E/P
(-522/+72)
Origine de réplication
sélection
UAG
ArgE
pCOR
pXL3296
2023pb
bp
2023
cercer
Site AttP
Site AttB
Recombinaison
Décaténation
MCS
pUC28 MCS
SphI (717) (! contains
sup Phe expression cassette
Sup Phe
Chromosome bactérien
SV40 late polyA signal
Poly
A SV 40
Gène thérapeutique
Ne pousse pas sans le plasmide
Gène
thérapeutique
Ne se réplique pas sans la bactérie
Minicercle
Plasmide
Sur des souris β-thalassémiques
Une application : EPO et β-thalassémie
2 sous-unités globine β
Mauvaise expression de la chaîne β
Hématocrite (%)
2 sous-unités globine α
Emmanuelle Fabre et Mickaël Bettan
ET
80
70
60
50
40
30
ET
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
agrégats membranaires de chaîne α
mois
D’où : hémolyse, surcharge en fer, anémie, déformations du squelette
Augmentation de l’hématocrite
EPO à haute dose stimule la production de chaîne γ qui peut remplacer la
Allongement de la durée de vie des érythrocytes (de 5 à 10 jours)
chaîne β
Amélioration du phénotype des érythrocytes
Régulation
Système tétracycline
But : • induire l’expression du transgène à volonté
Dérivé du système bactérien de résistance à la tétracycline :
• éventuellement contrôler le niveau d’expression du transgène
tetR
pas de transcription
• limiter au maximum l’expression résiduelle
Systèmes existants :
• tétracycline (origine bactérienne)
Tet O
gène
+ Tet
• Ecdysone (origine insecte)
transcription
• RU486 (hormone abortive)
• Rapamycine (immunosuppresseur)
• PPARγγ
Tet O
gène
Utilisation dans une cellule eukaryote
Contrôle de l’expression par un antisens: promoteur CMV
VP16
50000
Activité SeAP en CPS
tetR
Protéine de fusion tetR-VP16 (VP16 est un activateur
de transcription d’origine virale) codée par un plasmide
Tet-on
Tet-off
transcription
gène
Tet O
gène
Tet O
45000
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365
+ Tet
+ Tet
Lot 1
transcription
SeAP
pCMV
pCMV
+
SeAP
pCMV
Contrôle de l’expression par un antisens :
promoteur tétracycline
SeAP
Utilisation de ribozymes
16000
Activité SeAP en CPS
Lot 2
gène
Tet O
gène
Tet O
J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365
3’ 5’
Hélice III C G
14000
12000
doxycycline
A
10000
U
8000
G
4000
A U
C
U G
A
U G A G C G
U
G
6000
G G G C C G A
A
C C C G G U
Hélice II
A
C
G
U
AAG
A C U C G C
A
C C
Hélice I
2000
0
J8
J15 J22 J30 J63 J70 J170J189 J358 J365
J8
J15 J22 J30 J63 J70 J170J189 J358 J365
Lot 3
Lot 4
+
pCMV
SeAP
pTet
SeAP
Activité catalytique de coupure intramoléculaire
Promoteurs spécifiques du tissu
Utilisation de ribozymes
Hélice III
N
N N
N
N
Y
N’ R
G
A
A
A
3’
N
N
N
A
5’
N’
N’
N’
U
H
U
G
Promoteur
N A
G
Tissu cellulaire
gène thérapeutique
substrat
N’ N’ N’ N’ 3’
C
Le transgène ne doit s’exprimer que dans le tissu choisi (muscle, foie…)
N
N
N
N
5’
Structure secondaire
Ribozyme-substrat
Hélice I
Hélice II
PEPCK
hépatocytes
(PhosphoEnolPyruvate
CarboxyKinase)
facteur IX
SPA
cellules épithéliales
CFTR
(Surfactant ProteinA)
( Poumon)
MLC1:3
Myoblastes
(Myosin light chains)
minidystrophine
CEA
cellules tumorales
(CarcinoEmbryonic Antigen)
HSV-tk
Introduire la séquence cible en 5’, de façon à éliminer la coiffe :
5’ coiffe……………….N’N’N’UHN’N’N’N’….AUGNNNNNNNN ARNm
3’ ……………….NNNAAAGYNNNNNN’RAGNAGUCNNN….
Conclusion
• mise au point de plasmides efficaces, adaptés et
sûrs.
• ne pas stimuler le système immunitaire
• atteindre les cellules cibles uniquement
• Réguler : exprimer le gène à un taux déterminé
pendant une période déterminée en parvenant à un
contrôle spatio-temporel efficace de l’expression des
gènes
MCK
muscle squelettique
(muscle creatine kinase)
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