Etude du processus de translecture chez S. cerevisiae par spectrométrie de masse David Cornu La terminaison de la traduction 4. Recyclage 1. 2. 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans 3. Translecture et terminaison chez S. cerevisiae Terminaison ERREURS DE TRADUCTION DES PROTEINES Type spontanées Cible tous les ARNm contexte programmés spécifiques Fréquence < 10-4 compétition 0.5 tRNA suppresseur Translecture Codon stop Le taux de translecture dépend du contexte nucléotidique du condon stop Namy et al.,EMBO Rep, 2001, p 787-793 Mécanismes moléculaires encore peu connus 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Intérets thérapeutiques de la translecture traitement de maladies a codons stops prematures Protéine tronquée AUG stop codon stop prématuré Myopathie de Duchenne Mucoviscidose Cancers Protéine entière AUG Translecture Activité ? L’activité de la protéine dépend de la nature de l’acide aminé inseré Il est essentiel d’établir des règles prédictives de la nature de l’acide aminé incorporé 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Etude de la translecture par spectrométrie de masse ● Identification des acides aminés incorporés au niveau des 3 codons stops UAA, UAG et UGA lors de la translecture ● Fréquence d’insertion des acides aminés au niveau de chaque codon stop ● Influence du contexte nucléotidique du codon stop sur la nature et le taux d’incorporation des acides aminés de translecture 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Strategie analytique QUANTIFICATION RELATIVE DES PEPTIDES DE TRANSLECTURE IDENTIFICATION DES ACIDES AMINES INCORPORES POUR CHAQUE CODON STOP ² TAUX D’INCORPORATION IN VIVO DES ACIDES AMINES POUR CHAQUE CODON STOP + DETERMINATION DES FACTEURS CORRECTIFS ANALYSE DES MELANGES PEPTIDIQUES ISSUS PROTEOLYSE IN-GEL nanoLC-MS (QTOF-Premier) nanoLC-MS/MS (QTOF-Premier, LTQ-Orbitrap) 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Expression et purification des protéines issues de la translecture • Construction d’un système rapporteur GST Promoteur Sequence de translecture AUAAAAAAUGAATAACAAAUAAACAAC TAG TGA • Purification des protéines de translecture sur colonne d’affinité et gel d’éléctrophorèse UAA UAG UGA 25 kDa coloration à l’argent GQINNLSPILGYWK MAREIKNEKQINNLSPILGYWK MAREIKNERQINNLSPILGYWK Q ... X MAREIKNE 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans GST GST GST Détermination des acides aminés de translecture en fonction du codon stop UAA UAG UGA 25 kDa c nanoLC-MS/MS apres digestion enzymatique par Trypsine ou LysN Identification des peptides chevauchant le site de translecture Codon Stop UAA UAG UGA Acide aminés incorporés Q, Y, K Q, Y, K C, W, R 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Spectres MS/MS des peptides de translecture • Spectre MS/MS QTOF après trypsine K W Y G L I P 100 876.52 b7 y7 NEQQINNLSPILGYWK NEYQINNLSPILGYWK QINNLSPILGYWK UAA Trypsine L N N I Y Q 1304.75 y11 EN yMax NEYQINNLSPILGYWK 244.10 b2 407.17 b3 553.30 y4 1417.84 y12 666.39 y5 KNEQQINNLSPILGYW KNEYQINNLSPILGYW KQINNLSPILGYW LysN S 963.57 y8 % 535.24 b4 333.21 292.14 y2 136.08 Y 1076.65 b9 y9 648.34 b5 216.11 a2 1305.83 877.58 496.28 y3 431.17 1190.72 y10 964.63 631.31 101.08 Q K 859.39 730.42 955.52 858.51 1287.70 989.52 b8 1077.72 1418.92 1400.85 1191.64 1545.91 y13 1315.73 1173.70 b10 1708.97 y14 1547.00 1691.96 1527.96 1710.07 1952.10(M+H) + 1918.07 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 1952.98 M/z 2000 Extracted from: D:\retraitement_Protein_dicoverer\Namy-03AVR12\20120403_SICAPS_GST-IXR1-TAA_LysN.raw #4453 RT: 23.11 ITMS, CID, z=+2, Mono m/z=773.42529 Da, MH+=1545.84331 Da, Match Tol.=0.8 Da • Spectre MS/MS LTQ-Orbitrap après LysN y6? 748.39 70 60 b7? 798.44 b10? 1121.56 K Q I N N L S P I L G Y W b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9b10b11b12 Intensity [counts] (10^3) Recouvrement des acides aminés de translecture necessaire pour eviter les ambiguites b12²?‐H2O 662.68 y12y11y10y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 50 b9? 1008.53 b6? 711.38 40 y7? 835.37 b11? 1178.55 30 20 10 y2? 368.23 b4²? 242.14 b2? 257.27 y5²? 326.21 y4? 538.20 y3? 425.23 y6²? 375.36 b5? 597.53 b11²? 589.73 b9?‐H2O 990.52 b8? 895.40 b4? 484.32 y8? 948.44 b12? 1341.63 y9? 1062.49 y11? 1289.61 y9?‐H2O 1044.39 y12? 1417.80 0 200 400 600 800 1000 m/z 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans 1200 1400 Ambiguités sur la nature des acides aminés incorporés à partir des spectres MS/MS Spectre MS/MS QTOF: ambiguité Cystéine/Glutamine Pas de recouvrement de C ou Q • ∆m= 4 ppm/Ion score= 26 • • pas de * ∆m= 14 ppm/Ion score= 37 → NEQQSNLSPILGYWK : m1 perte de O2 • • * *• * * *• 2 Ox m1= m2 * perte de O → NECQSNLSPILGYWK: m2 2 Cam Spectre MS/MS LTQ-Orbitrap: pas d’ambiguité Cystéine/Glutamine ∆m= 0.4 ppm Recouvrement de Q D’autres ambiguités ont été relevées à partir de spectres MS/MS LTQ -Orbitrap 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Mesure du taux d’incorporation des acides aminés de translecture par LC-MS NanoLC-MS : XIC des peptides chevauchant le site de translecture • Réponse MS du peptide de translecture dépend de l’acide aminé incorporé → Détermination d’un facteur correctif de l’efficacite d’ionisation et de digestion Expression des 6 protéines recombinantes…KNE Q Y K C W R Q QINN… Y K C W R LC-MS sur 5 réplicats → XIC des peptides avec Q, Y, K, C, W et R Peptides standards de translecture facteur correctif KNEQQINNLSPILGYW 1.65 ± 0.1 KNEYQINNLSPILGYW 1.09 ± 0.06 KQINNLSPILGYW KNECQINNLSPILGYW KNEWQINNLSPILGYW KNERQINNLSPILGYW 3.7 ± 0.05 1.04 ± 0.04 0.57 ± 0.02 0.7 ± 0.03 +n octyl glucopyranoside Normalisation par la moyenne des intensités des 3 peptides les plus intenses (N) Correction des données quantitatives de translecture acquises dans une meme série d’analyse Facteur Correctif pour chaque peptide standard = XIC/N UAA 25 kDa 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans UAG UGA Mesure du taux d’incorporation des acides aminés de translecture par LC-MS Q Y Y UAG UAA 40% 58% 8% Q Q Y Y K K 89% K K Q W 20% UGA C C W 77% R R → Résultats en accord avec les regles d’appariement codon/anticodon? 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans tRNAs suppresseurs naturels potentiels impliqués dans la translecture Il existe plusieurs tRNAs naturels proches cognats par codon stop. Plusieurs acides amines peuvent etre potentiellement incorpores au sein d’un meme codon Affinités des tRNAs suppresseurs potentiels. UAA Gln (2 tRNAs) Tyr (1 tRNA) > Ser (2 tRNAs) Leu (1 tRNA) > Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA) UAG Gln (2 tRNAs) Tyr (1 tRNA) > Ser (1 tRNA) Leu (1 tRNA) Trp ( 1 tRNA) > Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA) UGA Cys (1 tRNA) Trp (1 tRNA) > Arg (2 tRNAs) Ser (2 tRNAs) Gly (1 tRNA) Leu (1 tRNA) 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans tRNAs suppresseurs naturels potentiels impliqués dans la translecture Il existe plusieurs tRNAs naturels proches cognats par codon stop. Plusieurs acides amines peuvent etre potentiellement incorpores au sein d’un meme codon Affinités des tRNAs suppresseurs potentiels UAA Gln (2 tRNAs) Tyr (1 tRNA) > Ser (2 tRNAs) Leu (1 tRNA) > Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA) UAG Gln (2 tRNAs) Tyr (1 tRNA) > Ser (1 tRNA) Leu (1 tRNA) Trp ( 1 tRNA) > Lys (1 tRNA) Glu (1 tRNA) UGA Cys (1 tRNA) Trp (1 tRNA) > Arg (2 tRNAs) Ser (2 tRNAs) Gly (1 tRNA) Leu (1 tRNA) Les acides aminés identifiés correspondent à ceux prédits par les règles d’appariement codon/anticodon 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Correlation entre les taux d’incorporation calculés et les données génétiques Taux d’incorporation des tRNA suppresseurs naturels dépend de: Non canonique •• complémentarité codon/anticodon •• nombre de copies de gènes de tRNA 58% 40% Appariement Watson et Crick Non apparié Nombre de copies ( ) de genes de tRNA 2% (7) AΨG GUU GUC UUS (14) UUC UAA UAA UAA UAA UAA Y tRNATyr (8) (9) Q tRNAGln 89% Y tRNATyr (8) Q tRNAGln (1) K tRNALys 8% Q tRNAGln (9) K tRNALys 3% Q tRNAGln (1) K tRNALys (7) K tRNALys AΨG GUU GUC UUS UUC UAG UAG UAG UAG UAG 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans (14) Correlation entre les taux d’incorporation calculés et les données génétiques 77% W tRNATrp 20% (6) C tRNACys ACC ACG UGA UGA (4) (1) GCI GCC (11) UCU UGA UGA UGA (6) R tRNAArg Non canonique Non apparié 3% R tRNAArg Appariement Watson et Crick R tRNAArg Nombre de copies ( ) de genes de tRNA Validation de la levure S. cerevisiae comme modèle de choix pour l’etude qualitative et quantitative des acides aminés incorporés 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Influence du contexte nucléotidique sur la nature des acides amines de translecture Codon stop ●UAA ●UGA Contexte Taux de translecture Acide aminés …KNE●QINN… 11% …KNE●QSN… 39% …QF●QSN… 11% …KNE●QINN… 22% …NR●QSV… 11% Q, Y, K C, W, R Pour les contextes testés, la nature du codon stop détermine le choix des acides aminés majoritairement insérés Prochaine étape sera la mesure du taux d’incorporation des acides aminés insérés en fonction du contexte 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Perspectives • Effet d’antibiotiques (paromomycine, gentamicine, G418…) sur la nature et le taux d’incorporation des acides aminés de translecture en fonction du codon stop et du contexte nucléotidique. • Adaptation de ce système d’étude de la translecture aux cellules humaines en vue des applications théraupetiques potentielles. 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Remerciements Sandra Blanchet Olivier Namy Jean-Pierre Rousset Alain Brunelle Jean-Pierre LeCaer 29èmes JFSM, 17-20 septembre 2012, Orléans Manuela Argentini Laila Sago Willy Bienvenut Virginie Redeker