Thème 3 – Chapitre 3 – Activité 1. IDENTIFIER UN MICROORGANISME DANS UN PRÉLÈVEMENT URINAIRE Éléments de réponse 1re partie 1. Jour 1 Recueil des urines – Conservation à 4 °C Centrifugation de l’urine Sur le culot urinaire Coloration de Gram et observation microscopique des microorganismes. - Sur l’urine « entière » Examen macroscopique Dénombrement des leucocytes et des globules rouges en cellules de comptage (hématimètre) Dénombrement des microorganismes avec une lame immergée ou sur gélose Cled et anse calibrée incubation 24 h à 37°C Jour 2 Lecture de la lame immergée ou de la gélose Cled et détermination du nombre de microorganismes dans l’urine. À partir d’une colonie isolée ensemencement d’une galerie miniaturisée pour identification de l’espèce bactérienne. Incubation 24 h à 37°C. Jour 3 Lecture de la galerie miniaturisée et identification de l’espèce bactérienne 2. 3. 4. 5. Observation microscopique du frottis coloré à l’aide de l’objectif X100 et sous huile à immersion. Observation de bactéries en forme de bâtonnets, de quelques micromètres de longueur et colorées en rose car Gram négative. L’urine contient plus de 10 000 leucocytes/mL et plus de 105 UFC/mL. Ces deux éléments signent une infection urinaire. L’urine est normalement un liquide biologique stérile ; la présence d’un très grand nombre de bactéries dans ce liquide biologique (plus de 105 UFC/mL) suffit à diagnostiquer l’infection, sans qu’il soit indispensable de connaître l’espèce bactérienne. L’identification de l’espèce bactérienne permet de déterminer l’origine de l’infection. 6.1. Les antibiotiques présents dans les disques diffusent dans la gélose Muller-Hinton et leur présence peut inhiber la croissance de la souche bactérienne ensemencée en nappe sur la gélose. Biotechnologies 1re STL – CRDP Aquitaine, 2012 6.2. Antibiotique Antibiotique 1 Antibiotique 2 Antibiotique 3 Diamètre en mm Résultats sensible résistant intermédiaire 6.3. Dans le document 1, E.coli, responsable de l’infection urinaire, est sensible à tous les antibiotiques testés. 6.4. Le médecin pourra prescrire n’importe lequel de ces antibiotiques pour traiter l’infection urinaire diagnostiquée. 2e partie 1. Le signe « ? » signifie que le résultat de la mobilité est inconnu pour l’espèce bactérienne identifiée. Pour déterminer la mobilité il faut mettre en œuvre l’examen microscopique nommé « état frais ». 2.1. Le caractère oxydase est déterminé par la mise en œuvre du test enzymatique du même nom. Les caractères OF/O et OF/F sont déterminés par ensemencement puis incubation d’une gélose VF régénérée. 2.2. Après 24 h à 37°C il y aura présence de colonies bactériennes dans la totalité de la gélose VF. 2.3. Le type respiratoire de E.coli est aéro-anaérobie. 3.1. Ensemencer une gélose Hugh et Leifson ou CTA régénérée et additionnée de chaque glucide stérile à étudier à une concentration finale de 1 %. 3.2. Il existe plusieurs voies de fermentation du glucose. Si le test VP est négatif c’est que E.coli fermente le glucose par une autre voie comme celle des acides mixtes (test RM) absent de la galerie API20E. 3.3. Si E.coli est ONPG+ cela signifie qu’elle possède l’enzyme nommée béta-galactosidase. 3.4. Le substrat naturel ce et enzyme est le lactose. 3.5. Le milieu choisi doit contenir du lactose (substrat de l’enzyme) et un indicateur de pH permettant de visualiser la dégradation du lactose par acidification du milieu. Deux milieux peuvent être choisis : Mac Conkey et BCP, le milieu Mac Conkey contient en plus des inhibiteurs des bactéries Gram + (sels biliaires et cristal violet) ce qui le rend sélectifs des bactéries Gram - (cas de E.coli). 3.6. Mac-Conkey : colonies beiges entourées d’un halo rouge (teinte acide de l’indicateur de pH car dégradation du lactose par la bactérie). BCP : colonies beiges entourées d’un halo jaune (teinte acide de l’indicateur de pH car dégradation du lactose par la bactérie). 4.1.1. Milieu de culture synthétique : milieu de culture dont la composition qualitative et quantitative est exactement connue. Biotechnologies 1re STL – CRDP Aquitaine, 2012 4.1.2. Urée : substrat de l’uréase Tryptophane ; substrat de la tryptophanase et de la tryptophane désaminase. 4.1.3. L’urée est dégradée en CO2 et NH3 ; le tryptophane est dégradé en indole, acide pyruvique et ammoniac par la tryptophanase ou en acide indolpyruvique et ammoniac par la tryptophane désaminase. 4.1.4. Le nom plus approprié serait urée-tryptophane car il fait référence aux deux substrats présents dans le milieu. 4.1.5. Pour mettre en évidence la présence de tryptophanase, on rajoute le réactif de Kovacs dans la cupule du test «IND ». 4.1.6. Formation d’un anneau rouge dans la cupule du test IND, car le réactif de Kovacs réagit avec l’indole et forme un composé rouge en sa présence, or E.coli est IND +. 4.2. Le caractère biochimique mis en évidence est la présence d’une protéase nommée gélatinase. 4.3.1. A = arginine ; L = lysine ; O = ornithine. 4.3.2. Cupule LDC api positive : coloration orange à rouge due à l’alcalisation du milieu par libération de l’amine issue de la décarboxylation de la lysine. Moeller LDC positif : milieu trouble (culture) + teinte violette du BCP due à la réalcalinanisation du milieu lié à la libération de l’amine issue de la décarboxylation de la lysine. 4.3.3. Dans la cupule LDC on peut faire l’hypothèse que le tampon acide remplace le glucose du milieu de Moeller, ce qui permet d’être immédiatement en milieu acide, condition favorable à la synthèse de la lysine décarboxylase. Biotechnologies 1re STL – CRDP Aquitaine, 2012