Génétique Typage d`un individu

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Introduction
Génesetgénomes
Polymorphisme
Mutagenèse
Analyse
fonctionnelle
Cartographie
Biodiversite,
évolution
Applications
Diagnostic
prénatal
Thérapiegénique
Dépistage
systématique
Médecinelégale
Typaged’un
individu
Interprétation
desrésultats
etlimites
Exemples
Organismes
génétiquement
modifiésen
agronomie
Ethique
Glossaire
Génétique
Typaged’unindividu
Chaqueêtrehumainsedistingue deses" semblables "parunensemble decaractéristiquesmorphologiques
etbiologiquesquirendentsonidentificationpossible.
Les techniques utilisées pour mettre en évidence le polymorphisme de l'ADN permettent aujourd'hui
d'obtenir,dansdecourtsdélais,desrésultatsextrêmementprécisàpartird'échantillonsnecontenantqu'une
quantitéinfimedeproduitbiologique.Ellesimposent,encontrepartie,desprécautionsrigoureusespourparer
auxrisquesdecontaminationquicompromettraientlafiabilitédesanalyses.
Polymorphismesutilisables
.Lepolymorphismedel'ADNnucléaire
Pour4à5%,lamoléculed'ADNestconstituéeparlesgènesquisontlesupportdel'information.Cesunités
codantesseretrouventauniveaudel'ARNmessagerlorsduphénomènedetranscriptionpuissetraduisenten
protéines.
En revanche, la plus grande partie (95 à 96 %) de l'ADN nucléaire ne commande directement aucune
synthèseprotéiqueetl'onignoreactuellementsafonctionprécise.Danscettepartienoncodante,l'analysea
misenévidencedesrégionsvariables:ils'agit desegmentsd'ADNcaractérisésparlarépétitionentandem
d'unitésdebasecomposéesdedeuxouplusieursnucléotides.Latailledecesfragments,ouallèles,varieen
fonctiondunombrederépétitions.Ondistingueainsideuxtypesdepolymorphisme:
1. les minisatellites ou VNTR (Variable Numbers of Tandem Repeats) correspondent à des motifs répétées
en tandem, de 15 à 40 paires de bases. Le nombre de ces répétitions est variable d'un individu à l'autre,
constituantunesérieallélique.Desétudesrécentesconsidèrentquenousaurions1500zonesdecetype,soit
1500systèmesdepolymorphisme.
2. les microsatellites ou STR (Short Tandem Repeats), unités répétitives dont le motif est très court (4
pairesdebasesenmoyenne)etrépétédedeuxàdixfoisouplus.Descentainesdemicrosatellitesontété
étudiésmais,peuventseulsêtreretenuspourlapratiquedesempreintesgénétiquesceux
*quisontaisémentamplifiablesavecuneexpressionsimpledesallèles,
*présententunforttauxd'hétérozygotie
*exprimentunnombred'allèlessuffisammentélevé.
Deuxpointsimportantsdoiventêtresoulignésàproposdecetexamendeszonesvariables:
* plus nombreux sont les sites polymorphes qui font apparaître une concordance entre un
échantillon recueilli sur le lieu d'une infraction et un échantillon connu (prélevé sur un
suspect),moinsilestprobablequel'échantillonprovienned'unindividudifférent.
* La nonconcordance constatée sur un seul site polymorphe conduit à écarter de façon
absoluel'individudontleprofilADNestconfrontéàceluidel'échantillonrecueilli.
Lacertitudedel'identifications'apprécieentermesdeprobabilité,l'exclusionentermesdecertitude.
Lepolymorphismedel'ADNmitochondrial
L'ADN mitochondrial (ADNmt), présent dans le cytoplasme, peut également être utilisé pour l'expertise
génétique : il s'agit d'une petite molécule circulaire et monocaténaire de 16 569 paires de bases qui code
pour des chaînes polypeptidiques nécessaires au fonctionnement de la mitochondrie et pour des ARN. Sa
séquenceestentièrementconnueetelleprésentedeuxrégionshypervariables.Lepolymorphisme n'estpas
liéiciàdesvariationsdelongueurmaisàdesvariationsdanslacompositionennucléotides(polymorphisme
destructure).
Une autre caractéristique de l'ADNmt est son hérédité maternelle. En effet, l'ovule est bien fourni en
mitochondries(entre100000et200000)alorsquelespermatozoïden'encontientqu'unpetitnombrequine
persistent pas dans la descendance. La mère transmet donc son ADNmt à tous ses enfants mais seules les
fillesletransmettrontàleurtouràleurprogéniture.
Parailleurs,lepolymorphismedel'ADNmtestmoinsmarquéqueceluidel'ADNnucléaireetl'analysequien
estfaiteestdoncmoinsdiscriminante.Ilprésentenéanmoinsundoubleintérêt:
* préservéparlahauterésistance delamitochondrieetprésent àdenombreuxexemplaires
dansunecellule(del'ordrede50génomesmitochondriauxpourunseulgénomenucléaire),il
peut être analysé sur des traces anciennes ou fortement dégradées sur lesquelles l'ADN
nucléaire n'est plus exploitable. La recherche historique en a fait ces dernières années un
fréquent usage, notamment pour les ossements de la famille impériale de Russie et pour le
coeurprésumédeLouisXVIIconservéàStDenis.
* ilpeutégalementpermettre d'expertiserdestissusbiologiquesdépourvusd'ADNnucléaire,

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maisrichesenmitochondries, quisontprélevéssurune scènedecrime.C'est notammentle
casdestigesdecheveux.
Techniques
Analyseparhybridation
Technique utilisée dès 1985 avec des sondes multilocus puis des sondes monolocus. L'ADN est tout d'abord
digéréparuneenzymederestriction,cequigénèredel'ordred'unmilliondefragmentstousdifférents.Ces
fragmentssonttriésparordredetailleparélectrophorèsesurgeld'agarose,puistransférésparSouthernBlot
surmembranedenylonoùl'onpeutleshybrideravecdifférentstypesdesondes.
Sondesmultilocus
Dès 1985 on a utilisé des sondes oligonucléotidiques pouvant reconnaître plusieurs sites dont les séquences
d'ADN sont très voisines sur l'ensemble du génome, il est possible, en les rendant radioactives, de faire
apparaître les fragments hybridés sur une autoradiographie. Le polymorphisme de taille, différent chez
chaqueindividu,setraduitparlamiseenévidencedebandesnoiresressemblantàuncodebarredontilfaut
définiravecprécisionlatailledesfragments.Cessondespeuspécifiquesontétéappeléesmultilocus.
Figure824.Empreintegénétiquede5personnesétablieavecunesondemultilocus.
Malgré son très fort pouvoir discriminant, cette méthode a été abandonnée car elle présentait, pour la
médecinelégale,uncertainnombred'inconvénients:
*lourdeuretlongueurdelamiseenoeuvre(cinqjoursenviron),
* nécessité d'une grande quantité d'ADN (une tâche de sang de la taille d'une pièce de cinq
francs),
*difficulté,voireimpossibilité,d'interprétationencasdemélangesd'ADN,
*impossibilitédeconserverdesdonnéespouruneinterprétationultérieure.
Sondesmonolocus
En1989,cetteméthodefutamélioréeparl'usagedesondesmonolocusquiutilisent,commelesprécédentes,
la technique du Southern Blot et étudient le même type de variabilité mais se concentrent sur une seule
localisationdugénome.L'autoradiographienerévèledoncqu'unlocusreprésentéparunoudeuxallèlesselon
que le sujet est homozygote ou hétérozygote. Il est possible d'augmenter la puissance de ce test en
multipliantlessondesspécifiques.

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Figure825.Utilisationdesondesmonolocuspourconfirmerunefiliation.
Cette technologie robuste est peu sensible aux contaminations, très discriminante et d'une interprétation
aisée. Elle présente d'autre part l'avantage de permettre un travail sur les mélanges d'ADN, mais elle
demeurecoûteuseentempsetenpersonneletsafaiblesensibilitérequiertunequantitéimportante(500ng
auminimum)d'ADNnon dégradéet bienpurifié. Sielle resteencoreemployée,dansledomaine civil,pour
les recherches de paternité, elle a été supplantée au pénal par la réaction de polymérase en chaîne
(PCR)baséesurl'amplificationgénique.
AnalyseparPCR
L'amplification génique est plus facile à réaliser sur des unités répétitives du génome dont le motif n'est
composée que de deux à sept nucléotides, lesmicrosatellites ou STR(Short Tandem Repeats), qui
serontlocaliséssurdifférentschromosomesetexprimerontunnombred'allèlessuffisammentélevé.
Le nombre de loci étudiés doit être assez élevé pour conférer à l'analyse du profil génétique un pouvoir
réellementdiscriminant.Tousleslaboratoiresfrançaisutilisentaujourd'huideskitsquiincluentunequinzaine
de régions du génome sélectionnées par le système américain CODIS pour leur haute valeur discriminante.
Septd'entreeuxsontceuxqu'aconsacréslapratiqueanglaiseetquitendentdésormaisàêtremisenoeuvre
par tous les laboratoireseuropéens. Ceskits permettentd'amplifiersimultanémentplusieursSTR associés à
unmarqueursexuel(legènedel'amélogéninequichezl'hommeestprésentsurlechromosomeXetavecune
addition de 6bp sur le gène Y, ce qui permet de distinguer un ADN d'origine mâle d'un ADN d'origine
femelle).
Ce système multiplexe présente, outre son coût réduit et sa rapidité de réalisation, l'avantage de
permettrel'analysesurdetrèsfaiblesquantitésd'ADN(casfréquentdanslecasdetracesprélevéessurdes
scènes de crime). Il convient cependant d'observer que plus les zones étudiées sont nombreuses, plus les
conditionsdebonneamplificationsontdélicatesàréuniretpluslaréactionestfragile.
Lesmarqueurssontrévélés,soitdefaçonmanuellesurgeldepolyacrylamidecoloréàl'argent,soitdefaçon
automatisée sur un séquenceur avec une détection en fluorescence. Le choix des loci coamplifiés est
déterminé par la nécessité d'obtenir des conditions d'amplification homogène et de permettre une lecture
simple : les zones de taille des fragments ne doivent pas se chevaucher et des échelles de références
possédanttouteslestaillesd'allèlesdoiventêtredisposéessurlegeltouslesdeuxéchantillons.
Cette technique présente de nombreux avantages qui expliquent qu'elle se soit imposée dans tous les
laboratoiresspécialiséspourl'établissementdesprofilsgénétiques:
* Une réaction PCR peut être réalisée sur une très faible quantité d'ADN représentant
cinquante à cent cellules, qu'il soit dégradé ou non, purifié ou non, récent ou ancien et,
pratiquement, quel que soit le support. Ceci permet d'obtenir des résultats à partir de très
petitséchantillonsetdepratiqueruncomplémentd'expertiseaveclematérielrestant.
*Laméthodeestfacileàpratiquer,lesréactifspouvantêtrefournissousformedekitsprêts
àl'emploi.
* Le recours à l'informatique permet d'obtenir le résultat de l'analyse dans un délai très
court, avantage décisif dans le cadre d'une enquête judiciaire : douze heures pour une trace
de sang, soixante douze heures pour une trace de sperme. Dans le cas d'un prélèvement
buccal opéré sur un suspect, ce délai n'excède pas six heures et est donc compatible avec
celuidelagardeàvue.
Laseulefaiblessedecetteméthode,liéeàsatrèsgrandesensibilité,résidedanslerisquedecontamination
par un ADN étranger, et ce d'autant plus que la quantité d'ADN analysable est réduite. Des précautions
draconiennesdoiventdoncêtreobservéestantaustadedurecueildeséchantillonsqu'àceluidel'analyse.
Touteslesméthodescidessus,quiutilisentdesSTR,sontapplicablesàl'ADNnucléaire.
Séquençage
L'analysedel'ADNmitochondrialviseàmettreenévidenceunpolymorphismedestructure.Ladéfinition
du mitotype (type de l'ADNmt) porte sur la détermination d'environ 700 nucléotides par la technique du
séquençage.L'utilisationd'unséquenceurautomatiquepermetderaccourcirledélaideréponse.

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La séquence déterminée est comparée à une séquence de référence. Les points de mutation sont mis en
évidence et les mitotypespermettront,commepour l'ADNnucléaire, d'affirmer, soit uneexclusion(certaine
si plus de trois différences sont observées entre les deux ADN), soit une identité (avec une certaine
probabilité).
Dans le cas de l'affirmation d'identité, la fréquence du mitotype est déterminée à partir d'une banque de
données internationale comportant les séquences de 1657 individus non apparentés. La majorité des
séquences déterminées n'existent pas dans cette banque de données. Dans ce cas, l'estimation de la
fréquence en cas d'identification est inférieure à 1/1657, soit moins de 0,06 %. Néanmoins, certaines
séquences d'ADN mitochondrial sont surreprésentées dans la population générale et leur fréquence peut
atteindre 2,8 %. Dans ce cas, on considère que cette fréquence élevée ne permet pas une identification
fiableetqueseuleuneexclusionestpossible.
Cette technologie est lourde et onéreuse. Comme il s'agit d'une méthode permettant l'analyse de micro
prélèvements, elleesttrès sensible auxcontaminations. Plusencore quepourl'ADNnucléaire, laséparation
des activités et la mise en place de nombreux contrôles (extractionamplification) revêtent une importance
particulièrepourlavalidationdesrésultats.