La culture in vitro - Thèses et Mémoires

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE.
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE.
UNIVERSITE D’ORAN
FACULTÉ DES SCIENCES
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE
LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIE DES RHYZOBIUMS ET
AMELIORATION DES PLANTES.
MEMOIRE
POUR L'OBTENTION DU TITRE DE MAGISTER EN AMELIORATION DES PLANTES
Par
LACHACHI SARA
Organogénèse et embryogénèse
somatique directe chez la tomate.
Jury composé de:
President: Mr. Bekki A.
Professeur
Université d’Oran
Rapporteur: Mme. Fyad-Lameche F/Z. .
Professeur
Université d’Oran
Examinateur: Mr. Lothmani B.
Maitre de conférence
Université de Mostaganem
Examinateur: Mr. Hadjadj-Aoul Seghir. .
Maitre de conférence
Université d’Oran
Examinateur: Mr. Henni J.
Professeur
Université d’Oran
2009/2010
Remerciement
Ce mémoire a été accompli sous la direction de Mme FyadLameche F/Z, Professeur à l’Université d’Oran Es-Sénia. Je tiens à lui
exprimer ma plus profonde reconnaissance pour m´avoir épaulé tout
au long de ce travail, pour m´avoir fait profiter de ses connaissances
et pour son soutien précieux lors de la rédaction de ce mémoire malgré
ses très nombreuses charges. Je souhaite remercier également toute
l’équipe du laboratoire de génétique et amélioration des plantes pour l’aide,
le temps et l’attention qu’ils m’ont accordés pendant ces années.
Ma gratitude et mes vifs remerciements vont aussi à Mr Bekki
Abdelkader,
Professeur
au
Département
de
Biotechnologie
de
l’Université d’Oran Es-Sénia qui n’a pas hésiter à présider le jury de ce
mémoire.
J’exprime aussi mes vifs remerciements à Mr
Lothmani B,
Professeur à l’Université de Mostaganem, Mr Hadjadj A, Professeur à
l’Université d’Oran Es-Sénia et à Mr Henni J, Professeur à l’Université
d’Oran Es-Sénia de me faire l’honneur de participer à mon jury de
thèse.
Je voudrais remercier mon père, ma mère, mes frères, pour tout le
soutien, la confiance et leurs mots d´encouragement qu´ils m´ont
accordés. Mais surtout à toi, Djawed mon mari, mon confident, mon
partenaire. Merci pour ton soutien, ta patience et tes encouragements.
Enfin, merci à toute l’équipe du laboratoire de génétique et
amélioration des plantes
qui m’a accueillie chaleureusement. Je
garderai un merveilleux souvenir de leur amitié et de leur aide.
Table des matières
1
Introduction
Chapitre I : Généralités sur la tomate
I.1- Introduction
2
I.2- Intérêt de la culture de tomate
3
I.2.1- Alimentation humaine
3
I.2.2- Phytothérapie
3
I.3- Importance économique de la plante
4
I.3.1- Dans le monde
4
I.3.2- En Algérie
5
I.4- Origine phylogénétique de la plante
6
I.5- Les variétés cultivées
7
I.6- Biologie de la tomate
11
I.6.1- Morphologie de la plante
11
I.6.2- La biologie florale
11
I.6.3- La fructification et la maturation des tomates
12
I.6.4- La graine
12
I.6.5- La pollinisation des tomates
13
I.6.6- Types de croissance des pieds de tomates
14
I.6.6.1- Croissance indéterminée
14
I.6.6.2- Croissance déterminée
14
I.6.6.3- Croissance semi déterminée
14
I.7- Problèmes phytosanitaires
15
I.7.1-Variétés résistantes
15
I.7.2- Amendements organiques et minéraux
15
I.7.3- Moyens de lutte biologique
16
I.8- Amélioration de la plante et culture in vitro
16
I.8.1- Amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies
17
I.8.2- Amélioration de la tomate pour la résistance à la sécheresse
17
I.8.3- Amélioration de la qualité gustative des tomates
17
I.8.4- Les tomates OGM créées
18
I.8.4.1- Tomates transgéniques 1401F, H282F, 11013F et 7913F
18
I.8.4.2- Tomate transgénique 1345-4
19
I.8.4.3- Tomate transgénique contre le cancer
19
Chapitre II : La culture in vitro
II.1- Introduction
20
II.2- Qu'est-ce que la culture in vitro?
21
II.2.1- Définition
21
II.2.2- Historique et fondement de la culture in vitro
21
II.2.2.1- Historique
21
II.2.2.2- Fondement
22
a- La différenciation
22
b- La dédifférenciation
23
c- La totipotence
24
II.3- Les applications de la culture in vitro
24
II.3.1- Le sauvetage d'embryons
24
II.3.2- La micropropagation
24
II.3.2.1- Cultures de méristème
25
II.3.2.2- Organogenèse
26
a- Caulogenèse
26
b- Rhizogenèse
27
II.3.2.3- L'embryogenèse somatique
27
II.3.3- Production de plantes haploïdes
28
II.3.4- Culture et fusion des protoplastes
28
II.3.5- La variation somaclonale et la culture in vitro
28
II.4- Les bénéfices de la culture in vitro
29
II.4.1- Collection de génotypes et état physiologique du matériel conservé
29
II.4.2- Obtention de matériels indemnes de maladies
30
II.4.3- Développement de méthodes de production de plants
30
II.4.4- La culture in vitro au service de l'amélioration variétale
II.5- Les problèmes liés à la culture in vitro
30
31
II.5.1- La vitrification
31
II.5.2- La perte de caractères intéressants
31
II.5.3- Problèmes inhérents à la technique
31
II.5.3.1- L’asepsie
31
II.5.3.2- L’acclimatation
32
II.5.3.3- L’apparition d’anomalies génétiques
32
II.6 - Le milieu de culture
II.6.1- Les éléments minéraux
32
32
II.6.1.1- Les macroéléments
32
II.6.1.2- Les microéléments
32
II.6.2 - Les éléments organiques
33
II.6.2.1- Les sucres
33
II.6.2.2- Les vitamines
33
II.6.2.3- Les acides aminés
33
II.6.3 – Les régulateurs de croissance
33
II.6.3.1 - Les auxines
33
II.6.3.2- Les cytokinines
34
II.6.3.3- Les gibbérellines
34
II.6.4- Les géloses
II.7 - Facteurs de la régénérabilité
II.7.1- Effet de l'explant
34
34
34
II.7.1.1- L'âge physiologique et ontogénique de l'organe
35
II.7.1.2- L'époque du prélèvement
35
II.7.1.3- La taille de l'explant
35
II.7.2- Influence du génotype
35
II.7.3- Influence du milieu de culture
36
II.7.4- Les régulateurs de croissance
37
II.7.5- Influence de la source carbonée
39
Chapitre III : L’embryogénèse somatique
III.1- Introduction
41
III.2- Présentation de l’embryogenèse somatique
41
III.3- Analyse de l’embryogenèse somatique par la génomique
43
III. 4- Les molécules signal participant au développement des embryons somatiques
43
III.5- Le contrôle hormonal de l’embryogenèse
44
III.5.1- Rôle de l’auxine
44
III.5.2- Rôle des cytokinines
45
III.6- Origine et développement des embryons somatiques
45
III.7- Différences entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse zygotique
46
III.8- Intérêt de l'embryogenèse somatique
47
III.9- Les principaux stades de l’embryogenèse somatique
50
III.9.1- Initiation et prolifération du tissu embryogénique
50
III.9.2- Maturation des embryons somatiques
50
III.9.3- Germination des embryons somatiques
50
III.9.4- Culture en serre et transplantation sur le terrain
50
Chapitre IV : Matériels et méthodes
IV.1- Objectif recherché
51
IV.2- Première expérience : essai préliminaire
51
IV.2.1- Matériel végétal
52
IV.2.2- Méthodes
52
IV.2.2.1- Désinfection des graines
52
IV.2.2.2- Germination des graines
52
IV.2.2.3- Choix du milieu de culture
52
IV.2.2.4- Mise en culture
53
IV.2.2.5- Dispositif de l’essai
54
IV.2.2.6- Méthode d’évaluation
54
IV.3- Deuxième expérience : Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issus de
jeunes plantules chez cinq variétés de tomate
55
IV.3.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants
55
IV.3.2- Les explants
55
IV.3.3- La mise en culture
56
IV.3.4- Le repiquage
57
IV.3.5- Dispositif de l’essai
57
IV.4- Répétition de la deuxième expérience : Embryogenèse somatique directe à partir
d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate
IV.4.1- La mise en culture
IV.5- Troisième expérience : Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures
58
58
59
IV.5.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants
59
IV.5.2- Les explants
59
IV.5.3- Milieux et conditions de culture
59
IV.5.4- Dispositif de l’essai
60
Chapitre V : Résultats et discussion
V.1- Première expérience : Essai préliminaire
61
V.1.1- Résultats obtenus
61
V.1.2- Discussion et conclusion
69
V.2- Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issues de jeunes plantules
V.2.1- Résultats obtenus
V.3- Embryogenèse somatique directe à partir d’embryons immatures
71
71
81
V.3.1- Résultats obtenus et discussion
81
V.3.2- Conclusion
83
Conclusion générale et perspectives
85
Chapitre VI : Références bibliographiques
VI- Références bibliographiques
87-100
Liste des tableaux
Tableau 1 : Valeur nutritive d’une portion de tomate
3
Tableau 2 : Production mondiale de tomate en tonnes
5
Tableau 3 : Espèces sauvages du genre Lycopersicon
7
Tableau 4 : Interfertilité des espèces sauvages avec l’espèce Lycopersicon esculentum
8
Tableau 5 : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de tomate
9
Tableau 6 : Techniques de culture in vitro et leurs principales applications
29
Tableau 7 : Variétés testées
52
Tableau 8 : Différentes concentrations d’hormones testées
53
Tableau 9 : Dispositif de l’essai
54
Tableau 10 : Composition des différents milieux testés pour l’induction de l’embryogenèse
somatique directe
55
Tableau 11 : Composition du milieu de MURASHIGE et SKOOG (M.S) en macro et
microéléments
56
Tableau 12 : Solution de vitamines de MURASHIGE et SKOOG (M.S)
56
Tableau 13 : Dispositif de l’essai
57
Tableau 14 : Composition des différents milieux testés
59
Tableau 15 : Dispositif de l’essai
60
Tableau 16 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété AGO pour chaque milieu et chaque type d’explant
64
Tableau 17 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété RG pour chaque milieu et chaque type d’explant
65
Tableau 18 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété HZ pour chaque milieu et chaque type d’explant
66
Tableau 19 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété Top 48 pour chaque milieu et chaque type d’explant
67
Tableau 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après
deux mois de mise en culture
cultivées sur milieu MSI.
sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères
77
Tableau 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après
deux mois de mise en culture
sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères
cultivées sur milieu MSI
78
Tableau 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSI
79
Tableau 23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSII
80
Liste des figures
Figure 1 : Fleur de tomate
12
Figure 2 : Diagramme floral
12
Figure 3 : Fleur autogame
14
Figure 4 : Fleur allogame
14
Figure 5 : Embryogenèse somatique et zygotique chez la carotte
35
Figure 6 : Embryogenèse somatique : intégration dans un programme d’amélioration, pour
la fabrication de variétés multi clonales et la diffusion de plants améliorés
42
Figure 7 : Cals formés chez la variété HZ sur milieu II2 après un mois de mise en culture
62
Figure 8 : Formation de racines sur les cals issus de cotylédons et d’hypocotyles d’AGO sur
milieu I1
63
Figure 9 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété AGO après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS +2,4D)
64
Figure 10 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété RG après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS +2,4D)
65
Figure 11 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété HZ après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS + 2,4D)
66
Figure 12 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété Top 48 après 30 jours de mise
en culture sur le milieu I (MS + 2,4D)
Figure 13 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre
67
variétés testées après 30
jours de mise en culture sur le milieu I (MS +2,4D)
Figure 14 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre
68
variétés testées après 30
jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D)
69
Figure 15 : Différents stades de développement des embryons somatiques
73
Figure 16 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et
d’embryogénèse somatique chez la variété MCH.
74
Figure 17 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et
d’embryogénèse somatique chez les variétés HZ et RG.
75
Figure 18 : Vitroplants régénérés par organogénese
76
Figure 19 : Vitroplants régénérés par embryogenèse somatique.
76
Figure 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSI.
77
Figure 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSII.
78
Figure 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSI.
79
Figure 23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées
sur milieu MSII.
80
Figure 24 : Cals formes à partir d’embryons immatures chez deux variétés de tomates (HZ
et MMD) après deux mois de mise en culture sur milieux d’initiations
84
Figure 25 : Structures globulaires apparaissant par cal après repiquage sur milieu de
régénération MS8
84
Liste des abréviations
MS
: MURASHIGE et SKOOG, (1962)
AIA : Acide - indolylacétique
ANA : Acide naphtalène acétique
2,4-D : Acide 2,4- dichlorophénoxyacétique
BAP : 6 - benzyladénine
GA3 : Gibberélline
mg/l : milligramme par litre
H
: Hypocotyle
C
: Cotylédon
µM
: Micromole
MT
: Méristème terminal
ABSTRACT
The tomato is an annuel plant belonging of the solanaceous familly, it was cultivated
in the hold world. It is by volume of production, the second vegetable after potato.
This present study representes an interest for the genetic improvement of tomato. The
investigation ways are
orgnogenesis and
direct somatic embryogenesis (formation of
somatic embryos without callogenesis phase), from explants of cotyledons, the hypocotyls,
shoot apical meristems and immature embryos of five tomato varieties (Rio grande, Heinz,
Agora, Merveille des marchés and Marmande). The culture was carried out on MS medium
added with auxines (2,4D and ANA) and
cytokinines (BAP and Kinetine) at various
concentrations.
The observations showed a variation in responses according to the nature, the hormone
concentration and the explant origin. The results revealed that cytokinines rich medium (BAP)
allowed induction of
vegetative parts (caulogenesis) from
hypocotyls and cotyledons
explants and from shoot apical meristems with whole genotyps tested except for agora which
appeared recalcitrant. The transfert of leafed seedling on MS medium added with ANA
allowed their developement and also their rooting.
The embryons are formed directly on the explant (directe somatic embryogenesis). The
embryons were obtained after one month of the culture on MS medium containing cytokinine
(BAP), with different concentrations. The best embryogenesis productions are obtained with
cotyledons explants for Heinz and Merveille des marchés genotyps (case of mothers plants
cultivated in MSI medium) and also from Heinz and Rio grande genotyps (case of mothers
plants cultivated in MSII medium). The developement of somatic embryos requires their
transfer on MS medium without growth regulators.
In vitro micropropagation by somatic embryogenesis of the five varieties of tomatos
tested on MS medium with various growth regulators opens a promising way for
fast
multiplication of theses varieties.
Key words : Tomato, in vitro culture, direct organogenesis, direct somatic embryogenesis,
culture medium, explant, growth regulators, micropropagation.
RESUME
La tomate est une plante annuelle de la famille des Solanacées. Elle est cultivée dans
presque tous les pays du monde. C’est par le volume de production, le deuxième légume
derrière la pomme de terre.
Le présent travail représente un intérêt pour l'amélioration génétique de la tomate. Les
voies à explorer sont l'organogenèse
et l'embryogenèse somatique directe (formation
d'embryons somatiques sans passage par la phase de callogenèse), à partir d’explants de
cotylédons, d’hypocotyles, de méristèmes terminaux et d’embryons immatures de cinq
variétés de tomates (Rio grande, Heinz, Agora, Merveille des marchés and Marmande). La
mise en culture est réalisée sur le milieu MS additionné d’auxines (2,4D et ANA) et de
cytokinines (BAP, Kinétine) à différentes concentrations.
Les observations montrent une variabilité de réponses en fonction de la nature, la
concentration de l’hormone et de l’origine de l’explant. Les résultats révèlent que les milieux
riches en cytokinines (BAP) permettent l'obtention de parties végétatives (caulogenèse) à
partir d'explants d’hypocotyles, de cotylédons et de méristèmes terminaux avec l'ensemble des
génotypes testés sauf Agora qui se montre récalcitrante. Le repiquage des pousses feuillées,
sur milieu MS additionné d’ANA a permis leur développement et aussi leur enracinement.
Les embryons se forment directement sur l'explant (embryogenèse somatique directe).
Les embryons sont obtenus après un mois de culture sur milieu de culture contenant une
cytokinine, la BAP, à différentes concentrations. Les meilleures productions embryogènes
sont obtenues avec les explants de cotylédons pour les génotypes Heinz et Merveille des
marchés (cas des plantes mères cultivées sur milieu MSI) et les génotypes Heinz et Rio
grande (cas des plantes mères cultivées sur MSII). Le développement des embryons
somatiques nécessite leur transfert sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance.
La micropropagation in vitro par embryogenèse somatique des cinq variétés de tomates
testées sur milieu MS additionné de différents régulateurs de croissances ouvre une voie
prometteuse pour la multiplication rapide de ces variétés.
Mots clés : Tomate, culture in vitro, organogenèse directe, embryogenèse somatique directe,
milieux de culture, explant, régulateurs de croissance, micropropagation.
‫ﻣـــﻠﺨـــــــﺺ‬
‫اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ ﻫﻲ ﻧﺒﺎت ﺳﻨﻮي ﻳﻨﺘﻤﻲ إﻟﻰ ﻓﺼﻴﻠﺔ اﻟﺒﺎذﻧﺠﺎﻧﻴﺎت و ﺗﺰرع ﻓﻲ ﻛﻞ‬
‫ﺑﻠﺪان اﻟﻌﺎﻟﻢ ﺗﻘﺮﻳﺒﺎ ﻛﻤﺎ ﺗﺤﺘﻞ اﻟﻤﺮﺗﺒﺔ اﻟﺜﺎﻧﻴﺔ ﻣﻦ ﺣﻴﺚ ﻛﻤﻴﺔ اﻹﻧﺘﺎج ﺑﻌﺪ اﻟﺒﻄﺎﻃﺎ‪.‬‬
‫ﻳﻤﺜﻞ اﻟﻌﻤﻞ اﻟﺤﺎﻟﻲ ﻣﺼﻠﺤﺔ ﻣﻦ أﺟﻞ اﻟﺘﺤﺴﻴﻦ اﻟﻮراﺛﻲ ﻟﻨﺒﺎت اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ و‬
‫ﻣﻨﻪ ﻓﺈن اﻟﻄﺮق اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﺔ ﻫﻲ اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻌﻀﻮي و اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺠﻨﻴﻨﻲ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ‬
‫اﻟﺨﻼﻳﺎ اﻟﻨﺴﻴﺠﻴﺔ ‪.‬‬
‫ﺗﺘﺤﻘﻖ اﻟﺰراﻋﺔ ﻓﻲ وﺳﻂ )‪ (Murachige et Skoog‬ﻣﻀﺎف إﻟﻴﻪ ﻫﺮﻣﻮﻧﺎت‬
‫اﻟﻨﻤﻮ )‪ 2,4D‬و ‪ (ANA‬و )‪ (BAP‬ﺑﺘﺮاﻛﻴﺰ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ اﻧﻄﻼﻗﺎ ﻣﻦ )اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ ‪ ,‬اﻟﺴﻮﻳﻘﺔ‬
‫و اﻟﻨﺴﻴﺞ اﻹﻧﺸﺎﺋﻲ اﻟﻨﻬﺎﺋﻲ ( ﻟﻠﻔﺼﺎﺋﻞ اﻟﺨﻤﺴﺔ ﻣﻦ اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ ‪(RG, HZ, AGO,‬‬
‫)‪. MMD, MCH‬‬
‫ﺗﻈﻬﺮ اﻟﻤﻼﺣﻈﺎت ﺗﻐﻴﺮات ﻓﻲ اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ و ذﻟﻚ ﺗﺒﻌﺎ ﻟﻄﺒﻴﻌﺔ و ﺗﺮﻛﻴﺰ اﻟﻬﺮﻣﻮن‬
‫و ﻧﻮع اﻟﻘﻄﻌﺔ اﻟﺰراﻋﻴﺔ‪ .‬ﻛﻤﺎ ﺗﺒﻴﻦ اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أن اﻟﻮﺳﺎﺋﻂ اﻟﻐﻨﻴﺔ ﺑﺎﻟﺴﻴﺘﻮﻛﻴﻨﻴﻦ )‪(BAP‬‬
‫ﺗﻤﻜﻦ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﻰ أﺟﺰاء زراﻋﻴﺔ )ﺗﻜﻮن اﻟﺴﺎق و اﻷوراق ( اﻧﻄﻼﻗﺎ ﻣﻦ‬
‫)اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ ‪,‬‬
‫اﻟﺴﻮﻗﻴﺔ‬
‫و اﻟﻨﺴﻴﺞ اﻹﻧﺸﺎﺋﻲ اﻟﻨﻬﺎﺋﻲ( ﻣﻊ ﻛﻞ أﻧﻮاع اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ‬
‫اﻟﻤﺨﺘﺒﺮة إﻻ ﻧﻮع ‪ . AGORA‬ﺳﻤﺢ ﻧﻘﻞ اﻷﺟﺰاء اﻟﺰراﻋﻴﺔ اﻟﺘﻲ ﺣﺼﻠﻨﺎ ﻋﻠﻴﻬﺎ‬
‫ﺑﺘﻄﻮرﻫﺎ و ﺗﺠﺪﻳﺮﻫﺎ ﻓﻲ وﺳﻂ ‪ MS‬ﺑﺈﺿﺎﻓﺔ ﻫﺮﻣﻮن ‪. ANA‬‬
‫ﺗﺘﻜﻮن اﻷﺟﻨﺔ ﻣﺒﺎﺷﺮة ﻓﻮق اﻟﺠﺰء اﻟﺰراﻋﻲ اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻞ )ﺗﻜﺎﺛﺮ ﺟﻨﻴﻨﻲ ﻣﺒﺎﺷﺮ‬
‫( ﺗﻢ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﻴﻬﺎ ﺑﻌﺪ ﺷﻬﺮ ﻣﻦ اﻟﺰراﻋﺔ ﻓﻲ وﺳﻂ ‪ MS‬ﻣﻀﺎف إﻟﻴﻪ ﺗﺮاﻛﻴﺰ‬
‫ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻣﻦ ‪ BAP‬ﻛﻤﺎ و ﻗﺪ ﺗﻢ اﻟﺘﺤﺼﻞ ﻋﻠﻰ أﻓﻀﻞ إﻧﺘﺎج ﻟﻨﻮع ‪ HZ‬و ‪ MCH‬ﻋﻦ‬
‫ﻃﺮﻳﻖ اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ ﻓﻲ ﺣﺎﻟﺔ زراﻋﺔ اﻟﻨﺒﺎت اﻷم ﻓﻲ وﺳﻂ ‪ 60 μm) MSI‬ﻣﻦ ‪ (BAP‬و‬
‫ﻧﻮع ‪ HZ‬و ‪ RG‬ﻓﻲ ﺣﺎﻟﺔ زراﻋﺔ ﻧﺒﺎﺗﺎت اﻷﺧﺮ ﻓﻲ وﺳﻂ‬
‫‪ 90 μm) MSII‬ﻣﻦ ‪(BAP‬‬
‫ﻳﺤﺘﺎج ﺗﻄﻮر اﻷﺟﻨﺔ اﻟﺴﻮﻣﺎﺗﻴﻜﻴﺔ إﻟﻰ وﺳﻂ ﻣﺠﺮد ﻣﻦ ﻫﺮﻣﻮﻧﺎت اﻟﻨﻤﻮ‪.‬‬
‫اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻤﺨﺒﺮي ﻟﻠﻔﺼﺎﺋﻞ اﻟﺨﻤﺴﺔ ﻣﻦ اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ اﻟﻤﺨﺘﺒﺮة ﻓﻲ وﺳﻂ‬
‫)‪ (Murachige et Skoog‬ﻣﻀﺎﻓﺔ إﻟﻴﻬﺎ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﻨﻈﻤﺎت اﻟﻨﻤﻮ ﺗﻔﺴﺢ ﻃﺮق واﻋﺪة ﻣﻦ‬
‫أﺟﻞ اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺴﺮﻳﻊ ﻟﻬﺬه اﻷﻧﻮاع‪.‬‬
‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ ‪:‬‬
‫اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ‪ ،‬اﻟﺰراﻋﺔ اﻟﻤﺨﺒﺮﻳﺔ‪ ،‬وﺳﺎﺋﻂ زراﻋﻴﺔ‪ ،‬ﻣﻨﻈﻤﺎت اﻟﻨﻤﻮ ‪،‬اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻌﻀﻮي‬
‫اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻤﺨﺒﺮي ‪ ,‬اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺠﻨﻴﻨﻲ ‪.‬‬
INTRODUCTION :
La tomate est la culture la plus répandue dans le monde après la pomme de terre. La
production mondiale de la tomate en 2004 a atteint 115.950.851 Mt, dont les trois grands
producteurs mondiaux sont la Chine, les Etats-Unis et la Turquie (Faostat, 2004). Elle est
adaptée à des conditions de cultures très variées et est destinée à la consommation en frais ou
à la transformation industrielle (Philouse, 1999).
La culture de la tomate en Algérie a démarré dans les années 1920, dans la région de l’Est
avec la création de la première conserverie TOMACOOP à Annaba. Les surfaces consacrées à
la tomate d’industrie ont augmenté, pour passer de 100 hectares en 1930 à 2000 en1960, pour
arriver à une fourchette comprise entre 24000 et 31000 hectares ces dernières années.
La tomate est multipliée par graines et le marché des semences hybrides demeure de plus
en plus tributaire de l’importation et on sait que le seul kilogramme de semences hybrides
peut couter entre 300000 et 2000000 dinars. La culture in vitro permet de contourner ce
problème, dans la mesure où les embryons somatiques obtenus à partir des explants de
plantes hybrides constituent un matériel adéquat pour la multiplication conforme.
Contrairement à d’autres espèces, la technique de la micropropagation de la tomate est
loin d’être maitrisée en laboratoire et encore moins pour la production de plants à l’échelle
industrielle.
La capacité d’induction de l’organogenèse qui est la base fondamentale de la
multiplication végétative et de l’embryogenèse somatique qui est la méthode de régénération
la plus performante pour la propagation clonale du fait de son taux de multiplication élevé et
la production des graines artificielles par cryoconservation des cultures embryogènes, laisse
entrevoir la possibilité de disposer à volonté de matériel juvénile et
d’un moyen de
reproduction conforme pour les plantes à grande diffusion telle que la tomate.
1
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
I .1- Introduction :
La tomate (Solanum lycopersicum L. ou Lycopersicon lycopersicum L.), est une plante
annuelle de la famille des Solanacées (Guignard, 2001), Cette espèce est originaire du Nordouest de l'Amérique du Sud. Le terme désigne aussi ce fruit charnu, qui est l'un des aliments
les plus importants dans l'alimentation humaine et qui se consomme frais ou transformé. Elle
est cultivée sous presque toutes les latitudes, sur une superficie d'environ 3 millions
d'hectares, ce qui représente près du tiers des surfaces mondiales consacrées aux légumes
(Philouse et Laterrot, 1992). Longtemps appelée "pomme d'amour" ou "pomme d'or", son
nom de « tomate » n'a été accepté par l'Académie française qu'en 1835. Elle a aussi été
appelée Lycopersicon esculentum. Cependant, des études récentes en génomique classent la
tomate dans le genre Solanum, le même que la pomme de terre. L'introduction en France fut
lente. En 1600, Olivier de Serres, un des premiers agronomes français, classe la tomate parmi
les plantes d’ornement.
La tomate est originaire des Andes, en Amérique du Sud, où l’on trouve encore
aujourd'hui des formes sauvages. On croit que l'ancêtre de l'espèce cultivée pourrait être la
tomate cerise, Lycopersicon esculentum var. cerasiforme. Introduite en Amérique centrale et
au Mexique à une époque préhistorique, il y a plus de 2 000 ans par le vent, les cours d'eau,
les oiseaux ou les Indiens migrant vers le nord, elle a trouvé là un terrain fertile à son
établissement. Elle a d'abord été introduite en Espagne au XVIe siècle. Les Espagnols et les
Italiens ont été les premiers à l'adopter comme aliment. C'est que l'odeur peu engageante de
ses feuilles et de ses tiges, de même que sa ressemblance avec les plantes toxiques de la
famille des Solanacées inspirent alors la méfiance. Au XVIIIe siècle, on la cultive de façon
intensive en Italie et, à un moindre degré, dans les autres pays d'Europe. Les Italiens
effectueront un travail considérable de sélection dans le but d'obtenir des fruits plus gros, plus
lisses et à la peau plus épaisse, et mettront au point une technique efficace pour les sécher au
soleil. Beaucoup plus tard, lorsque, par vagues successives, ils quitteront leur pays pour
l'Amérique, ils amèneront avec eux leurs traditions culinaires qu'ils feront connaître aux
Nord-américains. La même chose s'est produite en Chine où on ne l'adoptera qu'au XXe
siècle, bien qu'elle y ait été introduite trois siècles auparavant (Philouse, 1999).
Victime de son succès, la tomate a perdu, au cours de la deuxième moitié du XXe
siècle, les qualités organoleptiques qui la caractérisaient auparavant, afin de satisfaire aux
exigences de la production industrielle.
2
GENERALITES SUR LA TOMATE
CHAPITRE I
I.2- Intérêt de la culture de tomate:
I.2.1- Alimentation humaine :
La tomate présente une bonne valeur nutritive, elle est riche en potassium qui sert à
équilibrer le pH du sang et à stimuler la production d’acide chlorhydrique par l’estomac,
favorisant ainsi la digestion, en manganèse qui a son tour agit comme cofacteur de plusieurs
enzymes qui facilitent une douzaine de différents processus métaboliques, et en cuivre qui
est nécessaire à la formation de l’hémoglobine et du collagène. La tomate est aussi très riche
en vitamine B3, B6, C, A, E et K (Chagnon et al., 2000).
Tableau 1 : Valeur nutritive d’une portion de tomate (INAF, 2008).
Poids/volume
Tomate rouge moyenne, mûre, 123 g
Calories
22
Protéines
1 ,1 g
Glucides
4,8 g
Lipides
0,3 g
Fibres
alimentaires
1,5 g
La tomate tient une place importante dans l'alimentation humaine. Elle s'utilise en frais,
en salade et en jus, ou transformée, sous forme de purée, de concentré, de condiment et de
sauce. Des industries de transformation de la tomate sont implantées dans toutes les régions
du monde et sont approvisionnées par des milliers d'hectares de culture mécanisée, c’est un
aliment diététique, très riche en eau (plus de 90 %) et très pauvre en calories (22 kcal pour
123 grammes) (tableau1).
I.2.2- Phytothérapie :
Plusieurs études prospectives et épidémiologiques ont démontré qu’une consommation
élevée de fruits et de légumes diminuait le risque de maladies cardiovasculaires, de certains
cancers et d’autres maladies chroniques (Bazzano et Serdula, 2003). Quelques mécanismes
d’action ont été proposés pour expliquer cet effet protecteur, la présence d’antioxydants dans
les fruits et les légumes pourraient jouer un rôle.
Les caroténoïdes sont les principaux composés antioxydants de la tomate, dont le plus
abondant est le lycopène (Khachik et al., 2002). La tomate contient aussi une quantité non
3
GENERALITES SUR LA TOMATE
CHAPITRE I
négligeable de différents composés phénoliques (Vinson et al., 1998) (Raffo et al., 2006)
qui contribuent aussi à son activité antioxydante (Takeoka et al., 2001). La pelure de la
tomate contient davantage d’antioxydants (composés phénoliques, vitamine C et lycopène)
que sa chair et ses graines (Kaur et al., 2004) (Toor, 2005).
Les tomates
sont les principales sources de lycopène, fournissant 85 % de ce
caroténoïde (Barber, 2002). Ce composé exerce une importante action antioxydante ainsi que
d’autres fonctions dans l’organisme (Heber et Lu, 2002). On lui attribue entre autres des
effets hypocholestérolémiant et anti-inflammatoires ainsi que la capacité à empêcher la
prolifération de certains types de cellules cancéreuses (Heber et Lu, 2002). Ainsi, des
concentrations élevées de lycopène dans le sang ont été associées à de plus faibles incidences
de certaines maladies chroniques, telles les maladies cardiovasculaires (Arab et Steck, 2000).
La tomate contient plusieurs nutriments essentiels (antioxydants, vitamines, minéraux,
fibres) qui exercent différents effets sur la santé. Ces composés actifs agissent de façon
synergique. Cet effet ne serait pas observé lorsque l’on consomme un supplément de
lycopène. La consommation des tomates, demeure donc le meilleur moyen de se prévaloir
des bienfaits qui leurs sont attribués (Basu et Imrhan, 2006).
I.3- Importance économique de la plante :
I.3.1- Dans le monde :
La tomate est cultivée dans presque tous les pays du monde. C'est, par le volume de
production, le deuxième "légume" au plan mondial, derrière la pomme de terre (tableau 2).
Pour les principaux pays francophones les chiffres de la production mondiale pour
l’année 2004 sont : la France avec 843 220 tonnes, le Canada avec 805 090 tonnes, la
Belgique avec 245 900 tonnes et la Suisse avec 29 600 tonnes. En France plus des trois quarts
des semences de tomates autorisées à la vente sont celles de plantes hybrides F1 et 98% des
semences sont sous brevet (FAO, 2004).
4
GENERALITES SUR LA TOMATE
CHAPITRE I
Tableau 2 : Production mondiale de tomate en tonnes (FAO, 2006).
Production en tonnes. Chiffres 2004-2005
Chine
États-Unis
Turquie
Égypte
Inde
Italie
Espagne
Iran
Brésil
Mexique
Russie
Grèce
Chili
Maroc
Ouzbékistan
Ukraine
Portugal
Irak
Syrie
Tunisie
Autres pays
Total
30 143 929,00
12 867 180,00
9 440 000,00
7 640 818,00
7 600 000,00
7 682 504,00
4 441 800,00
4 200 000,00
3 515 567,00
2 148 130,00
2 017 860,00
1 932 000,00
1 200 000,00
1 201 230,00
1 245 470,00
1 145 700,00
1 200 930,00
988 000,00
920 000,00
1 118 000,00
21 780 606,00
124 429 724,00
24 %
10 %
8%
6%
6%
6%
4%
3%
3%
2%
2%
2%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
18 %
100 %
31 644 040,00
11 043 300,00
9 700 000,00
7 600 000,00
7 600 000,00
7 187 016,00
4 473 573,00
4 200 000,00
3 303 530,00
2 148 130,00
2 100 000,00
1 713 580,00
1 230 000,00
1 201 230,00
1 200 000,00
1 200 000,00
1 175 000,00
1 000 000,00
920 000,00
920 000,00
20 752 357,00
122 311 756,00
26 %
9%
8%
6%
6%
6%
4%
3%
3%
2%
2%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
1%
17 %
100 %
I.3.2- En Algérie :
L’Algérie continue d’importer la tomate. Le volume de production en tomate fraîche
demeure encore faible comparativement aux pays voisins, notamment la Tunisie et le Maroc.
Le rendement actuel est estimé à 15 tonnes/hectare contre 45 à 75 tonnes en Tunisie et à 68
tonnes tonnes/hectare en Italie. En Chine, il est de 66 tonnes/hectare. Donc, le rendement de
l’Algérie reste, loin de celui des pays concurrents bien qu’elle dispose d’atouts importants
pour le développement de cette filière. Des spécialistes estiment que la filière de la tomate
industrielle dispose d’un tissu industriel expérimenté, un potentiel agricole important mais
mal exploité, un coût de main-d’œuvre très compétitif et un coût énergétique très
concurrentiel. Mais, elle est pénalisée par plusieurs obstacles dont un contexte tarifaire
5
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
défavorable, des cours mondiaux actuellement en baisse, des conditions de culture difficiles et
des méthodes de production traditionnelles. Par conséquent, l’outil de production est sousexploité et le rendement faible.
L’Algérie pourrait jouer un rôle important sur les marchés internationaux si elle parvient
à améliorer sensiblement ses rendements agricoles et rationaliser son industrie. Cette filière
dispose, de plusieurs atouts pour se développer davantage, à condition que les différents
intervenants, en l’occurrence les agriculteurs, les industriels et l’État, travaillent en étroite
collaboration pour lui permettre d’être plus compétitive. Il s’agit notamment d’une mise à
niveau des méthodes de travail des fellahs qui continuent à travailler avec des moyens
traditionnels. L’industrie locale assure 85% des besoins. La production nationale est évaluée à
55 000 tonnes de double concentré de tomate en 2004 pour une superficie totale de 27 642
hectares dont 7 000 à Annaba et 8 000 à El-Tarf. La taille moyenne des exploitations agricoles
est de 2,5 hectares (Fayçal, 2004).
La filière de la tomate en Algérie est en crise. Une douzaine d’entreprises sont fermées
sur les 17 existantes. D’autres encore risquent de fermer. Même les banques ne veulent plus
accorder de crédits aux transformateurs, car ils considèrent que ce secteur n’est plus rentable.
Et pourtant, la capacité de production du concentré de tomate en Algérie est de 160 000
tonnes par an. Non seulement les besoins de la consommation nationale, qui sont de 70 000
tonnes par an, peuvent être satisfaits, mais il est possible d’exporter le double concentré de
tomate et même le triple vers d’autres pays, pourvu que le secteur soit relancé par des mesures
concrètes. La reprise de la filière est conditionnée en premier lieu par la relance de
l’agriculture (Mourad, 2008).
I.4- Origine phylogénétique de la plante :
La tomate appartient à la famille des solanacées, au genre Lycopersicon et à l’espèce
Esculentum. Ce genre comprend 9 espèces distinguées par la couleur des fruits à maturité, le
nombre de feuilles entre les bouquets floraux, leurs modes de reproductions et leur répartition
géographique (Rick et al ., 1990) (tableau 3). Les espèces sauvages du genre Lycopersicon
sont restées inféodées à leur zone d’origine, à l’exception de Solanum lycopersicum
cerasiforme (Philouze, 1999).
6
GENERALITES SUR LA TOMATE
CHAPITRE I
Tableau 3 : Espèces sauvages du genre Lycopersicon (d’après Philouze, 1999).
Couleurs du
Fruits
Nombre de feuilles par
sympode
L .esculentum
var. cersiforme
Rouge
3
AF
AUTO
L. pimpinellifolium
Rouge
3
AF
AUTO FAC
L. cheesmanii
Orange
3
AF
AUTO
L. hirsutum
Vert
3
AF
L. parviflorum
Vert
2
AF
L. chmielewskii
Vert
2
AF
L.piravianum
Vert
2
AI
ALLO
L. chilense
Vert
2
AI
ALLO
L. pennellii
Vert
2
AI
ALLO
Espèces
(1) AF: auto fertile;
Compatibilité
(1)
Mode de reproduction
(2)
AI
FAC ALLO
AUTO
FAC
AI: auto-incompatible, (2) AUTO: autogame; ALLO: allogame; FAC: facultatif
I.5- Les variétés cultivées :
Les caractéristiques que l'on favorise aujourd'hui chez les tomates que l'on trouve sur le
marché sont : une couleur bien rouge, la fermeté et une longue durée de conservation. Le goût
est secondaire par rapport à ces critères. Ces caractéristiques ont été obtenues en faisant des
croisements entre différentes variétés. On distingue cependant plusieurs catégories de
tomates, selon le mode de croissance de la plante indéterminé ou déterminé et surtout selon
le type de fruit. On a les variétés à fruit plat et côtelé, type
Marmande, dont le poids est
élevé puisqu'il peut dépasser 1 kg ; les variétés à fruit arrondi, dont le poids varie de 100 à 300
grammes, pour lesquelles il existe des hybrides dont les fruits se conservent longtemps, et les
variétés à fruit allongé avec une extrémité arrondie, de type Roma, ou pointue, de type Chico
(tableau 5). Ces dernières variétés sont destinées à l'industrie. Elles ont toutes un port
déterminé et leurs fruits répondent à un certain nombre de critères technologiques liés à leur
transformation (Tomodori, 2008).
7
GENERALITES SUR LA TOMATE
CHAPITRE I
Tableau 4 : Interfertilité des espèces sauvages
(Wikipédia, 2008).
Espèces
avec l’espèce
Caractéristiques
lycopersicon esculentum
Interfertilité avec
lycopersicon esculentum
Lycopersicon
cheesmanii
Tolérante au sel.
+
Lycopersicon
chmielewskii
Pousse dans les zones montagneuses
+
Lycopersicon
hirsutum
Fruits verts, pousse dans les zones
montagneuses (500-3300 m) et
humides de l'Amérique du Sud.
+
Solanum
lycopersicoides
Pousse dans les zones montagneuses
+
Lycopersicon
parviflorum
Pousse dans les zones montagneuses
(1000-3000 m) et humides des Andes
+
Lycopersicon
pennellii à
Fruits verts, pousse dans les milieux
montagneux (500-1500 m) et secs de
l'Amérique du Sud, présente de
nombreux stomates sur la face
supérieure de ses feuilles.
+
(1000-3000 m) et humides des
Andes.
(1000-3000 m) et humides des Andes
Naturellement très sucrée.
Lycopersicon
pimpinellifolium
Fruits rouges.
+
Solanum rickii
Fruits rouges.
+
Lycopersicon
chilense
Pousse dans les environnements secs
du sud chilien, où son enracinement
profond lui permet d'exploiter les
rares réserves en eau. Elle a de longs
bouquets floraux, de 14 à 20
centimètres.
-
Lycopersicon
peruvianum
Fruits verts.
-
8
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
Tableau 5 : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de tomate
(tomodori, 2008).
Variétés
Absinthe
African Beefsteak
Aker's West Virginia
Allegany Sunset
Amana Orange
Amana Pink
Ambre
Amritsar aus India
Ananas
Ananas Noire
Anna Aasa
Anna Hermann
Anna Russian
Arbuznyi
Aunt Ginny's Purple
Caractères
Excellente tomate vert ambre, petit plant de 1,20 m. Un peu sensible au
mildiou.
Variété type chair de bœuf, légèrement en forme de cœur, parfois plus aplatie et
un peu côtelée. Chair de bonne qualité. .
Très grosse tomate, d'un beau rouge, un peu côtelée. Très charnue. Saveur
intense de tomate du jardin à l'ancienne. Plant produisant un premier bouquet
de 4 ou 5 tomates de plus de 500 g chacune. La production est moindre par la
suite. Assez Tardive (80 à 85 jours). Variété à croissance indéterminée et à
feuillage normal. Originaire des USA.
Très belles tomates bigarrées, côtelées. Très bonne saveur.
Belles tomates de type beefsteak, très charnues avec très peu de graines. Bonne
saveur.
Très belles tomates roses, charnues. Saveur excellente, parfumée.
Tomate ronde légèrement aplatie, d'un bel orange. Fruits en grappes de
quelques unités. Plant à croissance indéterminée, assez haut. Originaire de
Russie.
Variété de tomates rouge allongée, type Roma, avec un petit téton bien marqué.
Adaptée pour faire sécher. Variété originaire du Pakistan ou d'Inde.
Très belles tomates de couleur allant du jaune au rouge, bariolées. Tardive.
Saveur excellente, parfumée et légèrement acidulée.
Grosse tomate légèrement côtelée de couleur rouge sombre à maturité et
verdâtre aux épaules. Très bonne saveur, charnue avec de nombreuses loges.
Chair verte au bord et rouge sombre au centre. Productivité limitée.
Petites tomates de taille cocktail (3 cm) légèrement aplaties, parfumées, rouges,
juteuses.
Variété très productive de petites tomates rondes avec un téton marqué, en
bouquets de 5 à 10 tomates. Plant à croissance indéterminée, dépassant les 2
mètres. Variété de saison à feuilles normales, originaire des USA.
Tomates généralement en forme de cœur, rose foncé, à la chair riche et au goût
très parfumé, assez productive.
Fruits rouge de 150 à 200 grammes, très sombre, presque noirs, avec des
rayures vert foncé partant des épaules. Aplati à tendance ronde, aspect plus ou
moins difforme. Les rayures apparaissent déjà sur les fruits verts. Texture
juteuse, charnue et fondante. Peau très fine. Saveur musquée, légèrement
sucrée, avec beaucoup de caractère, presque "sanguine ". Variété très
productive et résistante. Variété russe au feuillage normal, de mi-saison.
Très belles tomates d'un rose sombre, côtelées sur le dessus. La chair de ses
tomates est ferme et la saveur est douce, juste équilibre entre le goût d'une
tomate rose et la douceur d'une tomate noire. Variété proche de pruden's purple.
Fruit de taille moyenne, légèrement côtelé, un peu aplati. Variété de saison.
Croissance indéterminée. Origine: Allemagne.
9
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
Tableau 5 (suite) : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de
tomate (tomodori, 2008).
Variétés
Bengladesh Heart
Bianca Cherry
Marmande
Merveille des Marchés
Rio Grande
Big Zebra
Aunt Ruby's German
Green Cherry
Australian Oxheart
Bali
Banana Legs
Banana Orange
Banantchik
Barbaniaka
Baselbieter rötli
Caractères
Tomate de type cœur de bœuf, de taille moyenne et d'un beau rouge. Fruit
charnu, de bonne saveur franche de tomate. Plant à croissance indéterminée,
tardif et au feuillage normal. Originaire du Bengladesh.
Une hydre qui pousse et repousse de partout. Conduite sur un pied, elle a
colonisé 4 m et est montée jusqu'à plus de 3,5 m. Petites tomates cerises,
presque groseilles, jaunes pâles en petites grappes de 6 ou 7 fruits, extrêmement
sucrées. Les feuilles sont vert pâle, petites, ovales et dentelées. Production très
longue,
Bonne tomate côtelée, à la saveur typique. Précoce.
Gros fruits rouge vif, lisses.
Une tomate de type Roma, en grappes fournies. Fruits ovales, avec
une légère pointe, d'environ 70 grammes. Plant à croissance
indéterminée, à feuillage normal. Originaire d'Italie. Resistance VFF.
Une très belle tomate rouge foncé zébré de vert doré à maturité. Fruit charnu, à
la chair très colorée et juteuse. Saveur très parfumée, un peu acidulée avant
complète maturité. Production intéressante de gros fruits, assez tardifs.
Croissance indéterminée sur des plants à feuillage normal. Originaire des Etats
Unis d'Amérique.
Tomates de taille cocktail, en grappes de 3 à 6 fruits, ronds, de couleur verte,
agrémentée d'irisations rosées. Saveur typique et prononcée de tomate verte.
Assez sensible à l'éclatement. Plant à croissance importante, indéterminée et au
feuillage normal. Variété de saison, un peu tardive.
Belle tomate de type cœur de bœuf, d'un beau rouge. Un peu de vert au collet.
Fruit très charnu à la bonne saveur de tomate. Variété à croissance
indéterminée, de saison, à feuilles normales. Vient d'Australie.
Variété de tomates d'assez petite taille, bien côtelées, rouge assez clair à rose
soutenu. Les fruits sont en grappes fournies, la variété est bien productive.
Croissance indéterminée. Originaire de Bali en Indonésie.
Tomates très originales en forme de petites bananes jaunes. Peu de jus. Très
productive, mais à croissance déterminée.
Identique à Banana legs mais orange. Tomate de forme allongée et pointue.
Excellente saveur. Croissance indéterminée. Feuillage normal, très découpé et
retombant.
Très belle variété de tomates allongées, orange. Fruit assez creux, sans jus, mais
assez charnu : idéal pour faire sécher. Plant très productif à croissance
indéterminée, produisant des grappes de 5 à 10 tomates. Variété assez tardive, à
feuillage normal.
Tomate cerise de saveur sucrée et agréable malgré le froid. Une vraie pieuvre.
A ne pas tailler Résistante, insensible à l'éclatement et très productive.
Petites tomates cocktail de forme oblongue, en grappe. Très bonne saveur.
Variété de mi-saison, récoltes jusqu'aux gelées. Croissance indéterminée. Bon
rendement. Feuillage normal. Convient aussi pour la culture en pots.
10
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
I.6- Biologie de la tomate :
I.6.1- Morphologie de la plante :
La tomate (Lycopersicon esculentum ou Solanum lycopersicum), est une plante herbacée
de la famille des solanacées comme la pomme de terre. Elle est aussi parente de l’aubergine,
des piments et poivrons, et du tabac. C'est une plante ramifiée, à tige sarmenteuse, se
soutenant difficilement sans l'aide de supports artificiels.
•
Le système radiculaire est normalement très important avec enracinement profond
(plus d'un mètre).
• La tige et les feuilles sont charnues et velues. Les tiges sont grosses, presque
ligneuses, renflées aux nœuds et recouvertes d'une écorce verte, rude au toucher. La
migration vers les racines, vers les fruits et vers les divers organes de la plante, des
produits élaborés dans les feuilles pendant la journée grâce à l'assimilation
chlorophyllienne, ne se fait pratiquement que la nuit, à température plus basse que le
jour, et à condition que cette température se maintienne plusieurs heures au dessus de
10°C.
• Les feuilles sont composées, à folioles ovales, un peu dentées sur les bords, grisâtres à
la face inférieure, souvent repliées en forme de cuillère ou même à bords roulés en
dessus.
• Les fleurs axillaires, de couleur jaunâtre, auxquelles succèdent des fruits, sortes de
grosses baies charnues, de forme et de couleurs variables, sont sujettes à la coulure
(non fécondation) pour les raisons suivantes, nutrition défectueuse de l'ovaire,
température défavorable, maladies et insectes.
I.6.2- La biologie florale :
Les fleurs sont les organes sexuels de la tomate et elles sont hermaphrodites. Dans une
fleur de tomate, les sépales (S) sont verts. Les pétales (Pé) généralement jaunes sont en partie
soudés et forment une corolle étoilée (figure 1). Les étamines (E) sont soudées en un tube
staminique et le pistil (Pi) est caché dans ce tube. Le nombre des sépales et des pétales varie
de 5 à 8. Mais chez les espèces sauvages ces chiffres sont strictement : (5S) + (5Pé) + (5E) +
(2C) (figure2) (Yves et Marcel, 1999).
11
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
Figure 1 : Fleur de tomate (Tomodori, 2007).
S : sépales, Pé : pétales, E : étamines, Pi : pistil
Figure 2 : Diagramme floral
(Tomodori, 2007)
I.6.3- La fructification et la maturation des tomates :
Après la floraison, c’est le pistil qui se développe pour former le fruit. La paroi de
l'ovaire s'épaissit et les ovules qui ont été fécondés se transforment en graines qui contiennent
les embryons. Le reste du pistil (style et stigmate) disparaît, ainsi que les pétales et les
étamines qui tombent. Ce qui peut favoriser la mise à fruit sont des températures pas trop
fortes, un peu fraîches mais pas trop froides pendant la préfloraison et tout ce qui contribue à
augmenter la pollinisation (le vent, les mouvements, le secouage des fleurs).
Après la floraison, la moitié du temps est consacré à la croissance des tomates. L'autre
moitié est consacrée à leur maturation. La maturation commence lorsque la croissance est
terminée. Les caractéristiques de la maturation sont : un éclaircissement de la couleur du fruit,
un ramollissement, une belle coloration et une acquisition des arômes. Ces processus de
maturation irréversibles se poursuivent rapidement par le pourrissement du fruit. Les tomates
ne peuvent pas se garder mûres longtemps.
Les sélectionneurs essaient aujourd'hui de distinguer dans le processus de maturation les
gènes qui contrôlent les différents aspects de cette maturation, pour réussir à obtenir des
variétés qui se conservent et se transportent, tout en gardant des qualités organoleptiques
satisfaisantes (Tomodori, 2007).
I.6.4- La graine :
Chez la tomate les semences sont des petites graines hérissées de petits poils de 1 à 5
mm environ selon les variétés, leur germination est épigée. C'est la forme de résistance de la
plante. La graine peut résister au froid, à la sècheresse, à la digestion par les animaux etc. Les
12
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
graines sont situées dans les loges du fruit, initialement attachées par un pédoncule au
placenta et entourées d'une gangue gélatineuse qui les protège et les empêche de germer dans
la tomate.
Le nombre de graines dans une tomate varie de 50 à 300 selon le nombre d’ovules
fécondés (Achour, 1987).
La faculté germinative des graines de tomates est de 4 à 10 ans environ. On rapporte que
des graines plus âgées ont germé sans problème. Pour germer, les graines de tomate ont
besoin d'eau et de chaleur. L'imbibition est la première étape de la germination. Elle consiste
en l'absorption d'eau par la graine. La graine absorbe alors jusqu'à 3 fois sa masse. En pratique
c'est la mise en présence d'eau de la graine sèche qui déclenche ce processus. La reprise de la
respiration accompagne l'imbibition : dès que l'eau est entrée dans les cellules, les enzymes de
la respiration s'activent et la graine commence à augmenter sa respiration. La graine à cet
instant nécessite de l'oxygène. Elle doit donc être au contact de l'air (Tomodori, 2007).
I.6.5- La pollinisation des tomates :
La pollinisation est la rencontre du pollen mâle avec le stigmate du pistil femelle de la
fleur. Elle est évidemment indispensable au développement de la fleur en fruit. Elle est suivie
de la fécondation des ovules par les cellules polliniques mâles. Cette fécondation donne les
cellules œufs, points de départ de la nouvelle génération qui se développe et forme l'embryon,
contenu dans la graine jusqu'à la germination.
La structure de la fleur chez la tomate assure une autogamie stricte, en effet la plupart
des fleurs présentent cette particularité anatomique d'avoir le pistil enfermé dans le tube
staminique (figure 3). Le pollen apporté par le vent ou même les insectes ne peut donc pas
rentrer dans le tube et se déposer sur le stigmate du pistil. Seul le pollen des étamines de la
fleur peut entrer en contact avec le stigmate. De plus la période de réceptivité du stigmate au
pollen est courte : elle commence 1 jour avant l'ouverture de la fleur (ce qui favorise
l'autogamie) et se poursuit entre 1 et 7 jours environ. Cependant les risques de pollinisation
croisée ne sont pas nuls. Le critère qui permet de savoir quel est le risque d'allogamie chez la
tomate est la forme de la fleur. Certaines fleurs ont le pistil qui dépasse du tube staminique au
moment où il est réceptif (figure 4). Dans ce cas le pollen étranger peut venir se déposer sur
le stigmate. Il y a donc possibilité de fécondation croisée ou allogamie. Les insectes butineurs
sont alors les principaux vecteurs de pollen et donc les principaux responsables de la
fécondation croisée.
13
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
Figure 3 : Fleur autogame : le stigmate du pistil
Figure 4 : Fleur allogame : le stigmate dépasse
n'est pas visible à l'extérieur du tube d'étamines.
le tube staminique.
I.6.6- Types de croissance des pieds de tomates :
I.6.6.1- Croissance indéterminée :
Le haut de la tige s'allonge régulièrement en produisant en continu une nouvelle pousse,
de nouvelles feuilles et de nouvelles inflorescences. C'est la mort du pied qui arrête la
croissance. On peut avoir, en une saison 6 ou 7 générations de fleurs, voire plus. Et des pieds
qui peuvent atteindre quelques mètres de longueur (7mètres pour certaines variétés)
(Exemples : Rose de Berne, Black Cherry).
I.6.6.2- Croissance déterminée :
La croissance se poursuit jusqu'à ce que les extrémités des tiges ne produisent plus que
des fleurs. Il n'y a plus d'allongement possible. Le nombre d'inflorescences est fini. Souvent
l'aspect de ses pieds est buissonnant et compact (si on ne les taille pas, ce qui est le cas
généralement). La production de tomates est alors plus "concentrée"(Exemples : Siniy, Roma,
Roma Jaune).
I.6.6.3- Croissance semi déterminée :
Il s'agit de la situation intermédiaire. Soit la croissance est déterminée mais assez
tardivement, ce qui fait que les pieds s'allongent assez, soit la croissance est déterminée un
temps, puis une nouvelle pousse démarre tardivement pour redonner une nouvelle étape
végétative (Exemple : San Marzano).
14
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
I.7- Problèmes phytosanitaires :
La Tomate, comme les autres Solanacées,
peut être attaquée par de nombreux
champignons, bactéries et virus. La régulation climatique des serres et abris, le paillage, le
palissage précoce des plants présentent un grand intérêt dans la lutte contre la plupart des
maladies.
Les principaux ravageurs dans le cas des cultures sous serres sont l'Aleurode des serres
(Trialeurodes vaporarium) et la mouche mineuse américaine (Liriomyza trifolii) sont les plus
importants. La petite limace grise (Deroceras reticulatum), la noctuelle des moissons (Agrotis
segetum) et la noctuelle ypsilon (Agrotis ipsilon) attaquent les plantules. Plusieurs espèces de
nématodes provoquent la formation de nodosités sur le système racinaire. Le puceron vert du
pécher (Myzus persicae) déforme les feuilles.
On trouve quatre espèces de nématodes d'importance parasitant les racines de la
tomate dans le monde. Il s'agit des nématodes des racines noueuses Meloidogyne incognita,
M. arenaria, M. hapla et M. javanica, ce dernier ne vivant que dans les régions chaudes de la
planète. Le signe le plus évident d'une infestation de ces nématodes est la présence de galles
racinaires ou nodosité des racines. La lutte intégrée se fait conventionnellement au moyen de
variétés résistantes, de rotations et de nématicides. Depuis les années 60, il s'est cependant fait
beaucoup de recherches sur d'autres techniques susceptibles de réduire et/ou de repousser les
nématodes de la tomate.
I.7.1-Variétés résistantes :
Les variétés de tomates résistantes aux nématodes sont en réalité des variétés tolérantes.
Les nématodes infectent quand même leurs racines mais les plantes peuvent croître et porter
des fruits malgré tout.
Toutes les variétés résistantes disponibles portent le même gène appelé VFN. Il n'est
donc pas conseillé d'utiliser ces variétés année après année car les nématodes pourront
rapidement outrepasser la résistance. La variété Supersteak hybride VFN possède ce gène.
I.7.2- Amendements organiques et minéraux :
Les tourteaux d'oléagineux semblent particulièrement efficaces contre les nématodes.
Ces substances augmentent les phénols et les acides aminés dans la plante ce qui rebute les
nématodes (Singh et al., 1986). Le tourteau d'arachide réduit les populations de nématodes
avec ou sans plants de tomate dans le sol. Le traitement est toutefois plus efficace suivi d'une
jachère (Haq et al., 1986).
15
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
L'irrigation constante augmente l'efficacité nématicide des tourteaux d'oléagineux
(Singh et al., 1980).
Finalement, l'application de concentrés d'algues accroît la population de nématodes
dans le sol mais elle réduit la population sur les racines de la tomate (Featonby-Smith et
Staden, 1983). Il s'agit donc d'un répulsif à nématodes plutôt que d'un nématicide. Paracer et
al. (1987) ont comparé plusieurs espèces d'algues des côtes de Floride et en ont conclu que
seulement Spatoglossum schroederi est vraiment efficace contre les Meloidogyne. Cette algue
peut être utilisée comme amendement de sol ou comme traitement racinaire avec des extraits
au méthanol de l'algue.
Plus il y a d'acide ascorbique dans les plants de tomates, moins les nématodes les
attaquent. L'utilisation de vitamine C et de l'acide aminé arginine sont des moyens de contrôle
potentiels de M. incognita (Al-Sayed et Thomason, 1988).
I.7.3- Moyens de lutte biologiques :
Les agents biologiques ayant fait l'objet du plus de recherches sont des champignons
comme Paecilomyces lilacinus et Arthrobotrys irregularis. Ces champignons ne sont
efficaces que dans des conditions très précises et prennent un certain temps avant d'agir ce qui
implique l'introduction des champignons jusqu'à deux mois avant la culture. La lutte
biologique n'est donc pas à utiliser en cas d'urgence.
La bactérie Streptomyces avermitilis produit l'avermectine qui est une toxine très
efficace contre toute sorte de nématodes. Garabedian et Van Gundy (1983) ont obtenu un
contrôle aussi bon qu'avec les nématicides chimiques contre Meloidogyne incognita en
appliquant l'avermectine à travers un système d'irrigation goutte-à-goutte.
1.8- Amélioration de la plante et culture in vitro :
Depuis qu’il s’est organisé en communautés sédentaires pratiquant l’agriculture, l’homme,
de manière empirique d’abord, puis en utilisant les données scientifiques ensuite, a toujours
œuvré pour l’augmentation de la productivité des agro écosystèmes : en choisissant dans les
populations naturelles les plantes les plus productrices et surtout aptes à produire dans
différentes conditions de culture, en protégeant les semences en les conservant dans des silos
clos ou des greniers enfumés et en utilisant des plantes à cycles courts qui arrivent à maturité
avant la période de grande multiplication du parasite.
16
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
I.8.1- Amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies :
L’amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies, et particulièrement le
flétrissement bactérien provoqué par Pseudomonas solanacearum par la voie classique des
hybridations, permet d’obtenir des résultats qui satisfont aux exigences de la culture en sols
contaminés pendant au moins deux cycles de culture. Du fait de la ségrégation de l’hybride,
les caractères parentaux réapparaissent et le nombre d’individus présentant la résistance se
réduit au cours des générations. Après avoir fait le point sur l’un des systèmes de culture qui
permet, dans les conditions de culture paysannes, d’atténuer les effets du flétrissement, il a été
envisagé l’utilisation de la voie biotechnologique, en espérant obtenir des variants soma
clonaux présentant une tolérance qui pourrait se conserver à travers le passage par la méiose.
Sur des cals obtenus par mise en culture des cotylédons excisés des jeunes plants de tomate,
des bactéries appartenant à une souche de Pseudomonas solanacearum ont été inoculées avant
la formation des racines, des tests effectués sur les plantes régénérées et sur le terrain
montrent une conservation du caractère tolérance obtenue.
Un recours constant est fait aux biotechnologies dans la résolution des problèmes qui se
posent en phytopathologie et en amélioration des plantes. Dans la recherche de la variété
tolérante, la culture in vitro a été pratiquée en référence aux travaux de Sibi, Nsika-Mikoko,
Chagvardieff et Demarly (Nsika et Mikoko, 1995).
I.8.2- Amélioration de la tomate pour la résistance à la sécheresse :
Afin de cultiver la tomate dans les régions désertiques situées en bordure de l'océan, des
scientifiques des États-Unis ont mis au point des variétés de tomate que l'on peut irriguer avec
de l'eau salée. Mais cette solution inquiète : l'irrigation des terres par l'eau de mer risquant de
faire augmenter les dépôts de sel dans le sol de ces régions, tandis que c'est justement à cause
du sel qu'il a été rendu stérile. De leur côté, quelques multinationales de l'agroalimentaire
travaillent à la création d'une tomate transgénique résistante à la sécheresse (Paulette, 2007).
I.8.3- Amélioration de la qualité gustative des tomates :
Afin de répondre aux souhaits des consommateurs, l'amélioration de la qualité
organoleptique du fruit est devenue un nouvel enjeu pour les sélectionneurs. C’est l’objet d’un
important programme de recherche à l’INRA, basé sur l’exploitation de la biodiversité de la
tomate. A la demande des consommateurs, la qualité des fruits est aujourd'hui prise en compte
dans les programmes de sélection. Il s'agit d'un critère composite, multi caractères (aspect
externe et interne du fruit, saveurs, arômes, texture), fortement influencé par les conditions
17
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
environnementales, avec des relations antagonistes fréquentes, notamment entre qualité et
quantité. Des études de diversité ont permis aux chercheurs d'identifier une lignée, de l’espèce
Lycopersicon esculentum, aux fruits de très petite taille, de type cerise et aux caractéristiques
aromatiques remarquables. Cette lignée a été croisée avec une lignée de la même espèce, à
gros fruits mais à valeur gustative limitée. Une population composée de 150 lignées issues de
ce croisement a été créée et une carte génétique a été construite à l’aide de marqueurs
moléculaires. La qualité des fruits de chaque lignée a été évaluée pour des composantes
physiques (poids, couleur, fermeté), chimiques (teneurs en sucres, acides, pigments et
composés volatils) et sensorielles (saveur sucrée, acide, intensité aromatique, arôme
pharmaceutique, agrume, bonbon, texture ferme, farineuse, juteuse, fondante). De nombreuses
régions chromosomiques impliquées dans la variation des caractères ont été détectées,
certaines expliquant une part importante de la variation de la qualité. Les gènes favorables
proviennent principalement du parent à petits fruits (INRA, 2005).
Un programme visant à transférer les QTL de la lignée de type cerise dans plusieurs
lignées fermes et de bonne valeur agronomique a été ensuite conduit. Il a permis de créer des
génotypes de bonne qualité organoleptique mais dont les fruits sont trop petits pour que ces
prototypes soient exploités directement par les circuits de production et de distribution. Un
second niveau d'approche s'avère donc nécessaire pour faire progresser les connaissances
fondamentales et les intégrer en vue de l'innovation variétale (INRA, 2005).
I.8.4- Les tomates OGM créées :
Comme pour d'autres fruits ou légumes, des tentatives de tomates génétiquement
modifiées ont été effectuées. Un OGM est un organisme génétiquement modifié. C'est donc
un organisme dont le programme génétique a été modifié, généralement par ajout d'un gène
provenant d'une autre espèce, ou par modification de l'expression d'un gène.
En France la moitié des études sur les fruits et les légumes sont consacrées à la tomate.
Elles sont financées aux deux tiers par le secteur privé. Une tomate OGM avait été créée dès
la fin des années 1980. Le fruit se conservait plus longtemps. Mais la production a été
abandonnée car le produit ne présentait pas d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire.
18
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA TOMATE
I.8.4.1- Tomates transgéniques 1401F, H282F, 11013F et 7913F :
Cette tomate transgénique a été mises au point pour réduire la dégradation de la pectine
en supprimant l’activité de la polygalacturonase. Il y a eu hybridation avec une lignée
consanguine transgénique, la lignée F0, issue d’une modification génétique spécifique qui
vise à réduire l’activité de la polygalacturonase (PG). La lignée F1 transgénique a été
développée à partir de la lignée consanguine commerciale de tomate de transformation,
TGT7, en introduisant un gène PG tronqué qui a entraîné une « régulation à la baisse » du
gène PG endogène. L’enzyme PG active la dégradation de la pectine dans la tomate, ce qui
fait ramollir le fruit. Les nouveaux hybrides produits par transgénèse mûrissent normalement.
Cependant, la dissociation de la pectine y est moindre. Le fruit ramollit donc moins vite, ce
qui présente un avantage pour toutes les étapes de récolte et de transformation.
I.8.4.2- Tomate transgénique 1345-4 :
Elle a été mise au point pour réduire l’accumulation d’éthylène et, par conséquent,
retarder la maturation. La lignée de tomate 1345-4 a l’activité de l’enzyme 1aminocyclopropane-1-acide carboxylique (ACC) synthase réduite. Cette enzyme endogène
provoque la conversion de s-adénosylméthionine en ACC, le précurseur immédiat de
l’éthylène, une phytohormone reconnue pour jouer un rôle clé dans la maturation des fruits.
L’accumulation in situ d’éthylène dans les tomates transgéniques ne représente qu’environ
1/50 du niveau trouvé dans la lignée parentale non modifiée et le fruit ne parvient pas à une
maturité complète sans l’application d’une source extérieure d’éthylène.
I.8.4.3- Tomate transgénique contre le cancer :
Elle est mauve et aurait la capacité de protéger contre certains types de cancers et
maladies dégénératives liées à l’âge. La tomate n’avait jamais disposé de tant de propriétés
médicinales. Mis au point au « John Innes Centre » de Norwich, en Angleterre, l’organisme
génétiquement modifié serait capable d’empêcher l’apparition du cancer, de prévenir les
maladies cardio-vasculaires et de ralentir le vieillissement. Il a en effet été enrichi en
anthocyanes, des pigments naturels abondants dans les végétaux bleus et mauves comme la
mûre, la prune, le raisin noir ou encore l’aubergine. Ces pigments sont responsables de la
teinte de ces derniers sont également connus pour leurs propriétés antioxydantes et leur
capacité à prévenir le cancer. Ainsi, la tomate mauve est devenue la variété la plus riche en
anthocyanine jamais observée et un véritable alicament (Cohignac, 2008).
19
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.1- Introduction:
Depuis les débuts de l'agriculture l'homme a cherché à améliorer les plantes qu'il cultivait
par rapport à des critères de qualité ou de rendement correspondant à ces besoins. Tout
d'abord assez empiriques, ces techniques d'amélioration ont évolué grâce, en particulier à
l'apport de la génétique. L'objectif de l'amélioration des plantes est de créer de nouvelles
variétés combinant un certain nombre de caractères définis par le sélectionneur. Les méthodes
classiques de création variétales ont donné beaucoup de résultats mais présentent certaines
limites par exemple :
• La stabilisation du matériel demande beaucoup de temps, obligeant le sélectionneur à
prévoir à long terme l'évolution de la demande et des marchés.
• Au plan biologique, fécondation et méiose représentent des contraintes importantes.
En particulier, des signaux de reconnaissance pollen-pistil rendent vaines toutes les
pollinisations
biotechnologies
étrangères
(incompatibilité
cellulaires
et
pollinique).
moléculaires
laisse
Mais
le
entrevoir
développement
des
possibilités
des
de
contourner ces difficultés (Scriban, 1993).
Les méthodes de culture in vitro sont de plus en plus employées pour assurer la
propagation clonale des génotypes élites afin de satisfaire les besoins en agriculture et
horticulture. La culture in vitro est par ailleurs un outil très efficace au service de la recherche
biologique et physiologique (Haicour, 2002).
Le développement fulgurant des biotechnologies dans les pays industrialisés commande
une analyse spécifique de leur application dans les régions chaudes du globe dont
l'agriculture joue un rôle socio-économique majeur.
Plusieurs niveaux doivent être distingués en l'occurrence. Certaines méthodes de type
biotechnologie ont été mises en œuvre et transférées depuis près d'un demi-siècle. Enfin,
l’utilisation du génie génétique des plants, couplées aux hybridations somatiques, à
l'haploïdie, au embryons somatiques, au variant somaclonaux et gamétoclonaux, ouvre des
perspectives quasi infinies pour l'obtention de cultivars possédant des propriétés nouvelles
requises en vue d'usages déterminés (Semal et Lepoivre, 1989).
20
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.2- Qu'est-ce que la culture in vitro?
II.2.1- Définition :
De très nombreux ouvrages ont traité de la culture in vitro au cours de la deuxième
moitié de ce siècle décrivant toutes les méthodes déployées aussi bien dans le domaine animal
que végétal (Augé et al., 1989 ; Margara, 1989). Nous pouvons retenir qu'il s'agit
globalement d'une méthode de culture des plantes en conditions aseptiques, c'est à dire sans
champignon et sans bactérie, utilisant des milieux de culture assez complexes (hormones,
sucres, vitamines, acides aminés, sels minéraux) qui peuvent être liquides, gélosés, voire
même solides avec l'emploi de la vermiculite (Jay-Allemand et al., 1992).
La culture in vitro permet de cultiver des tissus ou des fragments d'organes isolés d'une
plante tels que des apex, des bourgeons, des nœuds pouvant régénérer des pousses, mais aussi
des racines ayant une croissance de type infini, ou encore des feuilles maintenues en survie.
Cette technique permet également de cultiver des cellules isolées voire même des protoplastes
capables de se diviser, de former des cals, des tissus organisés et même de régénérer une
plante entière. La culture in vitro permet donc d'utiliser toutes les potentialités régénératrices
d'une plante, jusqu'à la totipotence cellulaire qui peut se traduire suivant cette formule
simple : 1 cellule = 1 plante entière (Jay-Allemand et Capelli, 1997).
II.2.2- Historique et fondement de la culture in vitro :
II.2.2.1- Historique :
La culture in vitro est par comparaison, une technique très récente puisqu'elle fut
développée seulement au début de ce siècle (Jay-Allemand et Capelli, 1997). Les premiers
pas de culture in vitro sont dus
à un allemand Haberlandt en 1902. Il obtient ainsi,
sur un milieu KNOP amélioré, la survie durant plusieurs mois de petits amas cellulaires. Mais
il n'y avait pas de multiplication cellulaire (Augé et al., 1989). En 1912 Alexie Carrel
réussissait la culture indéfinie de cellules de cœur d'embryon de poulet par repiquages
successifs. Il fallut attendre 1922 et les travaux de Rablens pour voir apparaître une croissance
chez les pointes de racines isolées sur milieu synthétique. Mais la date qui marque réellement
le début de la culture in vitro est 1932 avec les travaux de White au USA sur la croissance
indéfinie en milieu liquide de racines de tomates. Ce succès fut sans doute à l'origine du
regain d'effort qui se portera sur la culture de tissus végétaux. Dés 1934 Gautheret obtient à
partir de prélèvement de tissus cambiaux d'arbre des proliférations de tissus qui
malheureusement, ne dépassèrent pas huit mois (Morel , 1952) (Scriban, 1988). Après les
travaux de White au USA en 1932 sur le Tabac, Nobecourt en France sur la Carotte, Limasset
et Cornuet en 1949 qui publiaient leurs observations sur l'absence de virus dans les
21
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
méristèmes de Tabac virosé. Morel & Martin, en 1952 mirent à profit ces observations et
entreprirent de mettre en culture in vitro des méristèmes de Dahlia et de pomme de terre
atteints de maladies à virus. A partir de ces méristèmes, ils obtinrent in vitro des plantes
entières qui furent remises en culture normale et se révélèrent saines au contrôle (Augé et al.,
1989).
C'est ainsi qu'est née en 1952 cette technique universellement employée actuellement pour
assainir toutes sortes de plantes virosées.
Un dernier point longtemps contesté, est la possibilité d'obtenir une prolifération de tissus
à partir d'une cellule végétale mise en culture in vitro. Torrey, en 1957 réussit à suivre au
microscope l'évolution de cellules isolées de pois, mises en culture à proximité d'un tissu
nourricier. La culture in vitro de tissus végétaux connaitra un essor particulier. Aujourd'hui
avec l'évolution de la recherche agronomique, la culture in vitro occupe une place importante
dans l'agriculture moderne (Augé et al., 1989).
II.2.2.2- Fondement :
Chez les végétaux, l’organogenèse est assurée par les méristèmes qui sont constitués de
massifs de cellules non différenciées, conservant la capacité de se diviser activement.
L’organogenèse implique une différenciation cellulaire, à l’inverse d'une dédifférenciation,
dans les tissus déjà spécialisés, peut conduire à la formation de nouveaux massifs
méristématiques. Cette particularité illustre la totipotence des cellules végétales, c’est à dire
l'aptitude des cellules à se diviser puis à se différencier de nouveau en fonction des conditions
expérimentales (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992). C'est à cette remarquable capacité de
la cellule végétale que la culture in vitro doit toute son extension, et peut on dire, son pouvoir.
A cause de cela, tout individu du règne végétal peut ou pourra être cultivé in vitro, il n'y a pas
d'exception. Cependant cela ne veut pas dire que le développement actuel des milieux de
culture, et les connaissances que l'on peut avoir du comportement de différentes espèces sur
ces milieux de culture, permettent de réaliser immédiatement et sans problème la culture in
vitro de toutes les plantes existant sur la terre (Augé et al., 1989).
a- La différenciation:
Tout individu est issu d'une cellule indifférenciée, la cellule-œuf. Cette cellule se
multiplie et donne des masses cellulaires qui se différencient pour construire l'individu. Cette
différenciation se fait sous la pression d'un certain nombre d'informations de différents types :
• Les régulateurs de croissance : ex : l'auxine pour former des racines
• Les ressources : les carences/disponibilités orientent les métabolismes et la
22
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
différenciation
• Le troisième facteur pouvant jouer sur l'orientation de la différenciation est l'échange
d'énergie. Toute synthèse cellulaire, nécessaire à la différenciation, nécessite de
l'énergie et dépend donc, entre autres, de la disponibilité en molécules de type NTP.
b- La dédifférenciation :
Il est bien évident que le passage d'un état différencié à l'état de cellules méristématiques
proliférantes, ne se fait pas sans que des modifications profondes n'apparaissent dans la
structure de la cellule. Ces modifications ramènent la cellule adulte à l'état juvénile (recouvrer
les caractéristiques cytologiques et les potentialités des cellules embryonnaires), capable de
s'orienter vers la formation de n'importe quel organe. Suivant la composition du milieu de
culture, les cellules dédifférenciées continueront à proliférer pour ainsi dire a l’infini, elles
deviennent parfois capables de poursuivre leur prolifération, même en l'absence de substances
stimulantes, telle que les auxines et les cytokinines. Les cellules végétales se dédifférencient
et retournent à l'état cellulaire indifférencié (embryonnaire ou méristématique). Cette perte de
l'inhibition corrélative permet l'expression de toutes les possibilités embryonnaires
(Rajnchapel, 1987). En 1964 l'équipe de Steward obtenait une plantule de carotte à partir
d'une seule cellule in vitro en milieu liquide agité. Depuis beaucoup d’autres chercheurs ont
obtenu des résultats semblables.
Toutes les cellules qui forment un organisme sont, à l'origine, totipotentes. Au cours de
l'ontogenèse (formation d'un individu, croissance, mort), chaque cellule, sous la pression des
différents paramètres, est programmée pour une fonction. Ceci se fait en exprimant seulement
une partie du programme génétique disponible et en réprimant le reste. Ce phénomène a la
particularité, chez les végétaux, d'être réversible, ce qui permet l'existence de la
dédifférenciation. Ce phénomène n'est absolument pas possible chez les animaux. Donc,
comme pour la différenciation, il y a une pression du milieu sur le devenir de la cellule. Ceci
prouve que la répression du programme génétique, lors de la différenciation, n'altère pas ce
programme. Les fonctions non usitées sont encore disponibles. D'autre part, si la cellule ne
subit aucune pression du milieu, elle se dédifférencie. Il y a donc entretien des fonctions par le
milieu. Par exemple :
Une cellule chlorophyllienne maintenue à la lumière reste chlorophyllienne, mais si elle
est placée à l'obscurité, ses chloroplastes s'étiolent et redeviennent des protoplastes
indifférenciés. Dans une plante vasculaire, si un vaisseau est détruit par blessure (attaque de
parasites, etc), les cellules voisines changent d'environnement direct (la sève ne circule plus).
Elles redeviennent totipotentes et peuvent reformer le vaisseau en quelques jours.
23
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
c- La totipotence :
La théorie de la totipotence énoncée en 1902 par Haberlandt a été reprise et banalisée par
Steward (1967). Cette théorie se base sur le fait que toutes les informations génétiques et donc
le programme de l'embryogenèse sont présents dans le noyau de chaque cellule vivante
(Norreel, 1973).
Un tissu ou une cellule dédifférencié peut évoluer dans toute sorte de direction cela
manifeste la totipotencialité de la cellule végétale. Cette totipotence de la cellule végétale se
retrouve aussi au niveau des cellules reproductrices : grains de pollen ou ovules. Elle a été
mise a profit avec le succès que l'on connait depuis 1966, pour obtenir des haploïdes dont on
peut ensuite doubler les chromosomes par cholchicine. Cette propriété est également à
l'origine
du
succès
remporté
par
l'isolement
et
la
culture
des
protoplastes.
Théoriquement, chaque protoplaste est capable de reproduire une plante parfaitement
identique à la plante mère.
Une cellule végétale même très différenciée est souvent capable de revenir à l'état
juvénile en se dédifférenciant, elle peut ensuite se diviser pour donner tel ou tel tissu
dépendant des circonstances (Djennane et Klifatti, 1996).
La totipotence est une dédifférenciation expérimentale qui peut être déclenchée par la
perturbation de corrélations organiques, par des traumatismes, de l'action des phytohormones
ou par leur suppression (Demarly et Sibi, 1996).
II.3- Les applications de la culture in vitro:
La culture in vitro d'explants ou de fragments prélevés sur la plante permet différentes
applications :
II.3.1- Le sauvetage d'embryons :
Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en culture in vitro
et donner un nouvel individu. Le sauvetage d'embryons consiste à prélever un embryon
précocement, pour le cultiver in vitro, soit pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu'il
ne
pourrait
pas
se
développer
dans
les
tissus
maternels.
II.3.2- La micropropagation :
La multiplication végétative par culture in-vitro ou micropropagation présente plusieurs
avantages sur les méthodes classiques dites "conventionnelles" de propagation. Cette
technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez lesquelles les semences sont rares,
ou présentant des difficultés de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de
greffage sont inapplicables, ce qui a conduit à une plus grande diversité des plantes
commercialisées.
24
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
La micropropagation est utilisé dans un but de multiplication en masse, puisqu'elle
permet, en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre considérable de plantes
génétiquement identiques à la plante mère (Ferry et al., 1998 ; Semal, 1998). Les plants
reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une grande uniformité.
Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite peu d'espace et peu être programmé
indépendamment des saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant
aux perspectives industrielles et économiques importantes (Margara, 1982 ; Boxus, 1995;
Semal, 1998 ; Skirvin et al., 2000).
Les techniques de micropropagation empruntent essentiellement deux voies :
L'une qui utilise des tissus méristématiques (méristème ou apex de tige, bourgeons
axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au développement normal, d'un individu
est appelée microbouturage (Saadi, 1991) cette technique est souvent appelée "multiplication
conforme" car elle part de méristème préexistant dans les quels , les cellules sont
génétiquement très stables (Amato, 1977 in Boxus, 1995) l'individu est généralement obtenu
en deux étapes successives, d'abord la production de tige, puis son enracinement .
L'autre voie, utilise toute sorte de tissus différenciés (fragments de tige, de racines, de
pétiole, de feuilles, d'embryons matures et immatures, d'hypocotyles, de cotylédons...etc) pour
aboutir à la néoformation soit de tiges (caulogenèse) et de racines (Rhizogenèse), c’est
l’organogenèse soit d'embryons somatique et c’est l’embryogenèse somatique.
II.3.2.1- Cultures de méristèmes :
Les premiers résultats de cultures de méristèmes appelées communément "cultures
d'apex" furent obtenus par Kotte et Robbins, dès 1922 à partir de méristème radiculaires de
fève et de maïs (Toute, 1998).
Dix ans plus tard, White (1934) obtiendra une culture indéfinie de racines de tomate. En
même temps, il s'apercevait que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans
des racines de tomate isolées, le virus n'atteignait pas les cellules méristématiques. Plus tard,
Limasset et Cornuet (1949) montrent que les organes jeunes de tabac ne renferment que très
peu de virus et que les méristèmes apicaux n'en contiennent pas.
En 1952, partant de ces observations, Morel et Martin tentent de prélever des pointes
méristèmatiques de dahlias virosés pour reproduire des dahlias génétiquement semblables aux
parents, mais exempts de virus. Ils réussiront à éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted
wilt virus". En 1955, ils régénéreront de façons analogues des pommes de terre atteintes de
virus A et Y (Boxus, 1995).
25
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
Depuis lors, la culture de méristèmes a conduit à des applications nouvelles, originales
concernant le domaine du phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses
maladies (viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a permis la régénération d'un
grand nombre d'espèce saines (Toute, 1998).
Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue, confèrent à la
plante une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs. Ils représentent des petits
massifs de cellules indifférenciées (0.1mm) et conservent la capacité de se diviser activement.
Ces zones méristèmatiques gardent jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un rôle
capital dans le développement végétal puisqu’elles édifient tous les organes (Camefort, 1977;
Margara, 1989).
En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon
axillaire, le plus souvent indemne de maladies, on pourra très rapidement obtenir de
nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et débarrassées de maladies
dont elles étaient affectées (Schmid et Keller, 1984 ; Sama et al., 1998). Il est même
possible de reconstituer des clones indemnes de maladies à partir de pieds-mères malades.
D'après Toute, 1998 ; Fletcher et al., 1998, il existe plus de 50 espèces végétales qui ont été
ainsi assainies c'est le cas de la pomme de terre, la canne à sucre, du dahlia ..etc.
La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre pour éviter
l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou variantes (Saadi, 1991). Elle paraît
plus intéressante chez les plantes allogames où il est généralement impossible de conserver
des génotypes intacts par reproduction sexuée classique.
II.3.2.2- Organogenèse :
L’organogenèse est la base fondamentale de la multiplication végétative, laquelle
s'appuie toujours sur la formation de méristèmes nouveaux.
a- Caulogenèse :
La caulogenèse désigne à la fois l'initiation et le développement des tiges. Les tiges
néoformées in vitro peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal. Ils sont induits sur
n'importe quel type d'organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les
conditions naturelles (Camefort, 1977 ; Zryd, 1988 ; Margara, 1989).
Les études cytologiques, conduites dans le but de déterminer l'origine des tiges
néoformés à partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent que
l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de certaines catégories de tissus telles que: le
cambium, le parenchyme vasculaire ou libérien (Belanger, 1998 ; Fortes et Pais, 2000).
26
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
L'intensité de cette néoformation est nettement dépendante de la nature des tissus
contenus dans l'explant. Elle est maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les tissus du
phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le parenchyme cortical ou médulaire
(Margara, 1989).
b- Rhizogenèse :
La rhizogenèse désigne la néoformation et la croissance de racine. Les méristèmes de
racines se répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines.
Les racines néoformées, au sein d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être considérées
comme un cas particulier de méristèmes adventifs (rhizogenèse indirecte) ou l'émission de
racines sur un explant dans des endroits inhabituelles (rhizogenèse directe).
La rhizogenèse est un phénomène complexe, il comporte différentes phases: la
dédifférenciation, formation d'amas de cellules méristèmatiques, différenciation et
organisation des amas méristèmatiques en primordium racinaire qui se développeront en
jeunes racines (Margara, 1989 ; Boxus, 1995).
II.3.2.3- Embryogénèse somatique :
Les embryons somatiques peuvent être induits à partir de cellules cultivées en
suspension, ce qui rend possible une production en fermenteur et réduit considérablement le
coût de production. Ainsi les taux de multiplication sont généralement importants et chez
certaines espèces, les embryons peuvent être encapsulés et traités comme des graines
artificielles. Des plantes complètes sont obtenues directement suite au processus de
germination. Les manipulations sont donc simplifiées par rapport à la micropropagation
traditionnelle qui nécessite plusieurs milieux différents pour le développement des tiges et des
racines et l'obtention de plantules complètes.
Cependant, plusieurs difficultés subsistent en embryogenèse somatique :
L'induction du potentiel embryogène et la régénération restent souvent difficiles.
Les cultures de cals, et plus encore les cultures de cellules isolées, sont propices à l'apparition
de mutations géniques pouvant être responsable d'une variabilité des plantes issues de la
culture. Toutefois, dès que cette variabilité sera maîtrisée, l'embryogenèse somatique
permettra de produire des quantités très élevées de plantes à faible coût. Certaines espèces,
telles que le palmier dattier ou certains conifères font déjà l'objet d'une production industrielle
par embryogenèse somatique.
27
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.3.3- La production de plantes haploïdes :
Cette technique présente un grand intérêt pour l’amélioration des plantes, elle permet
d’accélérer les cycles de sélection. Pour l’androgenèse, on part d’anthères immatures. A partir
des microspores, il peut y avoir apparition d’embryons directement ou après formation d’un
cal haploïde.
II.3.4- Culture et fusion des protoplastes :
Le terme protoplaste désigne une cellule végétale débarrassée de sa paroi : elle apparaît
alors sous forme d’une cellule sphérique, limitée par sa membrane plasmique. L’intérêt de ces
cellules réside dans le fait qu’il est possible de faire pénétrer dans la cellule des molécules
diverses dont de l’ADN, des organites (chloplaste, mitochondrie), des noyaux (fusion) et
effectuer des manipulations génétiques. Toutes les espèces ne peuvent pas régénérer à partir
de protoplastes et le rendement est faible.
II.3.5- La variation somaclonale et la culture in vitro :
Un taux élevé de variation peut être induit en culture in vitro lorsque les cultures sont
réalisées dans des conditions particulières. Plus précisément, les plantes régénérées à partir de
cultures initiées d'explants différenciés (ne contenant pas de méristèmes préexistant) ou à
partir de cultures de cals présentent des taux parfois importants de non-conformité. Cette
variabilité semble de plus être proportionnelle au temps de culture. Des mutations induites
pendant la culture ont été détectées chez de nombreuses espèces végétales. L'existence de ces
variations spontanées a stimulé l'intérêt de la culture de cellules ou de tissus pour l'isolement
de plantes présentant des caractéristiques nouvelles. La majorité des lignées isolées à ce jour
se sont toutefois révélées sans intérêt agronomique. Dans quelques cas cependant, l'existence
de cette variation somaclonale a permis d'isoler des plantes présentant des caractères
intéressants d'un point de vue agronomique. Par exemple, des plants de canne à sucre
présentant un taux de sucre plus important ont été isolés. De même, des génotypes résistants à
certains virus, ont été obtenus chez la tomate et la pomme de terre (Evans, 1989).
28
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
Tableau 6 : Techniques de culture in vitro et leurs principales applications :
Techniques de culture in vitro
Applications
Culture d'embryons zygotiques
Sauvegarde de génotypes
Embryogenèse somatique
Production et transformation génétique
Culture de nœuds et de bourgeons
Rajeunissement et microboutures
Culture d'apex
Etat sanitaire et rajeunissement
Microgreffage
Etat sanitaire et rajeunissement
Micropropagation
Rajeunissement et production
Androgenèse et gynogenèse
Amélioration (haploïdes)
Culture de cellules isolées
Modèle d'études et de recherches
Culture de tissus, de cals
Substances pharmacologiques
II.4- Les bénéfices de la culture in vitro:
II.4.1- Collection de génotypes et état physiologique du matériel conservé:
A partir d'un matériel sélectionné en forêt, en verger ou en pépinière, il est possible de
produire par culture de nœuds et/ou micropropagation des copies végétatives qui serviront à
l'installation de parcs à pieds-mères.
Grâce à la culture d'embryons zygotiques, à la micropropagation et à l'embryogenèse
somatique, des génotypes peuvent être conservés in vitro (tubes, bocaux ou boites de pétri)
sur de longues périodes pouvant dépasser les 10 ans (cas de l'orme, du noyer, des portegreffes fruitiers...).
Cette technique demande d'importants moyens humains pour entretenir les souches in
vitro tout au long de l'année sur la base de repiquages mensuels. Cependant, on peut envisager
de conserver les génotypes clonés dans l'azote liquide par cryoconservation (Engelmann et
Baubault, 1986) de méristèmes (cas du merisier et du noyer), d'embryons somatiques (cas du
mélèze) et zygotiques (cas du palmier à huile). Enfin, l'application des techniques de culture
29
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
in vitro (Micropropagation et microgreffage) permet de maintenir le matériel sélectionné dans
un état proche de la juvénilité favorable à la multiplication végétative, au bouturage en
particulier (Franclet, 1980). Cette opération est généralement couplée à des techniques dites
de rajeunissement (taille sévère, recépage) des pieds-mères ou des arbres âgés sélectionnés
qu'il est nécessaire d'utiliser pour obtenir de bons résultats en culture in vitro (prolifération,
croissance des pousses feuillées et formation des racines adventives).
II.4.2- Obtention de matériels indemnes de maladies :
Grâce à la culture de méristèmes ou à la technique de microgreffage on peut produire des
variétés indemnes de virus en particulier (cas du fraisier, de la pomme de terre, de la vigne et
des porte-greffes fruitiers) et éviter ainsi des pertes de productivité voire même la
dégénérescence des plants cultivés. Ces variétés peuvent être conservées soit en culture in
vitro soit en pépinière. Un suivi de ces variétés peut être effectué grâce à des tests
sérologiques attestant la qualité de l'état sanitaire des plants commercialisés.
II.4.3- Développement de méthodes de production de plants :
La culture in vitro a depuis longtemps fait ses preuves comme outil de production de
plants par sa rapidité à amplifier une variété donnée, par sa capacité à raccourcir les cycles de
production et à stocker de grandes quantités de matériel dans un espace réduit, par sa
puissance de production en masse sur des temps courts permettant une programmation précise
de la sortie des plants commandés. Dans le domaine de l'horticulture, deux principales
méthodes sont aujourd'hui utilisées : la micropropagation et l'embryogenèse somatique.
La première est bien adaptée à la production de plantes herbacées, d'arbres fruitiers et de
feuillus forestiers, alors que la seconde est performante pour les conifères et certaines
monocotylédones telles que le palmier dattier par exemple (Jay-Allemand et al., 1992).
De nombreuses entreprises ou pépinières privées ont intégré cette technique en tant
qu'outil de production leur permettant de gérer la quantité de plants selon les commandes.
Mais plus rares sont celles qui l'utilisent comme un outil central de gestion du matériel et de
production, situé en permanence à l'interface pieds mères et élevage en serre. C'est le cas de
l'entreprise BIOFORESTA située à Oyarzun en Espagne qui a construit son laboratoire au
cœur de la pépinière constituée de plus de 250 variétés différentes, toutes élevées en pot.
II.4.4- La culture in vitro au service de l'amélioration variétale :
L'amélioration génétique traditionnelle tient et tiendra encore toute sa place pour les
années à venir afin de sélectionner des variétés bien adaptées à l'environnement dans lequel
elles seront cultivées, tolérantes aux maladies et possédant des caractéristiques agronomiques
intéressantes. Cependant, là encore la culture in vitro joue et jouera un rôle déterminant à trois
30
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
principaux niveaux :
•
La sauvegarde de génotypes produits par fécondation contrôlée grâce à la culture
d'embryons zygotiques ou d'axes embryonnaires.
•
La production d'haploïdes par androgenèse (culture d'anthères) ou gynogenèse (sacs
embryonnaires,
oosphères
non
fécondés)
permettant
d'obtenir
des
lignées
homozygotes après diploïdisation, recherchées par les améliorateurs.
•
La production de plants génétiquement modifiés via Agrobacterium tumefaciens par
l’utilisation de techniques de régénération faisant appel à l'embryogenèse somatique
au bourgeonnement adventif et à la micropropagation.
II.5- Les problèmes liés à la culture in vitro:
II.5.1- La vitrification :
Certains accidents, non prévisibles au départ, peuvent intervenir en cours de culture in
vitro, comme des malformations dues à un déséquilibre hormonal.
II.5.2- La perte de caractères intéressants :
La production répétée de grands nombres de plants uniformes (clones) peut entraîner la
perte des gènes nécessaires, par exemple, à la résistance aux maladies nouvelles, il faut donc
conserver les pieds mères et à certains moments, repasser par la reproduction sexuée.
II.5.3- Problèmes inhérents à la technique :
II.5.3.1 - L’asepsie :
La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des cultures en
condition d’asepsie. Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes
causes. Il peut s’agir d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie. S’il s’agit d’un
champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche
ou grisâtre. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à
l’intérieur du milieu et à la surface. Si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et
le milieu, ce sont les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part
d’un point quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise
stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de
condensation au niveau du couvercle (Auger et al., 1989).
31
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.5.3.2- L’acclimatation :
Le passage à des conditions de culture normale est parfois délicat. En effet, durant son
séjour in vitro, la plante est à l’abri des stress.
II.5.3.3- L’apparition d’anomalies génétiques :
Certains cas d’hyperfloraison, perte de sexualité chez certaines espèces, apparition
d’organes anormaux : c’est la variation somaclonale.
II.6 - Le milieu de culture :
En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétative du tabac et mettent au
point le premier milieu de base pour la culture in vitro. Ce milieu contient des sels minéraux,
des sucres, des vitamines B, des auxines et des cytokinines. Ce milieu rend possible la culture
et la prolifération de méristèmes de tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative
in vitro.
L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin pour survivre, se
multiplier et éventuellement régénérer un nouvel individu, en fait, tout ce que la plante mère
peut fournir, par les racines et les feuilles.
II.6.1 – Les éléments minéraux :
Les besoins des cultures de tissus en éléments minéraux ont été étudiés par différents
auteurs et le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes compositions minérales
toujours utilisées aujourd’hui. Ces formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels
que Gamborg (Canada), Gautheret (France), Heller (France), Murashige et Skoog (EtatsUnis), White (Etats-Unis), Morel (France), etc. La composition du milieu de culture
Murashige et Skoog est sans doute la plus utilisée car elle convient à un très grand nombre de
plantes. Ce milieu est très riche en sels minéraux.
II.6.1.1- Les macroéléments :
Il s'agit de 6 éléments présents à des concentrations élevées tels que l’azote (N), le
calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnésium (Mg) et le phosphore (P).
II.6.1.2- Les microéléments :
Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu'ils ne soient nécessaires à la plante qu'en
faibles concentrations, leur rôle est essentiel. Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le
cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore
(Cl), le cobalt (Co), le nickel (Ni), etc...
32
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.6.2 - Les éléments organiques :
II.6.2.1- Les sucres :
Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne
est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le développement de l'explant. Dès lors, on
ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir à
l'explant une source de carbone.
II.6.2.2- Les vitamines :
Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance.
Elles sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la
plante est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces
circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui-même) de vitamines risque d’être
insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence.
Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la
biotine, le pantothénate de calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considéré
comme un sucre).
II.6.2.3- Les acides aminés :
Il a parfois été observé que l'apport d'acides aminés favorisait la prolifération.
II.6.3 – Les régulateurs de croissance :
On les appelle aussi « phytohormones » ou « hormones végétales », mais considérant
qu’il s’agit variablement de produits de synthèse ou de produits synthétiques, il est préférable
d’utiliser le terme régulateur de croissance. Ces substances sont utilisées à des doses très
faibles.
Les trois principaux groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les
auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Le choix du ou des régulateurs utilisés ainsi que
leur quantité est généralement guidé par la littérature.
II.6.3.1 - Les auxines :
Elles favorisent la croissance des cals, les divisions cellulaires, l’allongement cellulaire, le
développement des bourgeons adventifs ainsi que l’enracinement.
a - Acide indole-3-acétique (AIA) : L’AIA est une substance naturelle pouvant être
obtenue par synthèse chimique.
b - Acide naphtalène acétique (ANA) : Cette molécule
est souvent utilisée pour
favoriser la rhizogénèse.
33
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
c - Acide indole butyrique (AIB)
d- Acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4-D) : Le 2,4-D est largement utilisée comme
herbicide et pour la production de cals surtout.
II.6.3.2- Les cytokinines :
Elles stimulent les divisions cellulaires, la croissance des bourgeons axillaires,
régularisent la morphogenèse et contribuent au renouvellement de la chlorophylle.
a - Zéatine : C’est une substance naturelle.
b - Isopenthényladédine (2-i-P) : C’est une substance naturelle.
c - Kinétine : La Kinétine est une substance de synthèse.
d - 6-benzylaminopurine (BAP) et benzyladénine (BA) : La BAP est une substance de
synthèse, largement utilisé en raison de sa grande activité et de son faible coût.
II.6.3.3- Les gibbérellines :
Elles favorisent le grandissement cellulaire, l’allongement des entre-nœuds et lèvent la
dormance des graines. Seul l’acide gibbérellique (Ga3) est utilisé.
II.6.4 – Les géloses :
La gélose (ou agar) ajoutée au milieu nutritif permet l’obtention d’un milieu semi solide
ou solide dans lequel les explants peuvent être repiqués et supportés. La gélose a l’avantage
de retenir très peu les ions mais en contrepartie elle fournit un milieu de vie pauvre en
oxygène lorsqu’elle est utilisée à forte concentration. La qualité d’un milieu gélosé est donc
dépendante d’une part de sa fermeté, indispensable au support des plantes, et d’autre part de
sa souplesse, qui facilite la diffusion des éléments nutritifs. La concentration utilisée varie
selon le niveau de pureté de la gélose et l’objectif de la culture.
La gélose la plus utilisée c’est l’Agar-agar. Il s’agit d’une substance naturelle extraite de
différentes espèces d’algues marines. On la classe parmi les sucres parce qu’elle est identifiée
comme un polyoside (donc un glucide).
II.7- Facteurs de la régénérabilité :
Les facteurs influant sur la régénérabilité in vitro peuvent être schématiquement
répartis en deux groupes. Le premier représente les facteurs internes, (ceux liés à la plante) et
concerne d'une part le génotype, la nature et l'âge ontogénique de l'explant et d'autre part l'état
physiologique de la plante mère sur laquelle, l'explant a été prélevé. Le second réunit les
différents facteurs externes qui englobent et les milieux (notamment leur composition en
régulateurs de croissance et les sucres) et les conditions de cultures.
34
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
II.7.1- Effet de l'explant :
Un des atouts majeurs de la culture in vitro est de montrer que des cellules somatiques
(à 2n chromosomes), pouvaient produire, soit des structures comparables à des embryons
somatiques, soit des bourgeons dont le développement permet de régénérer des plantes
conformes à la plante mère. Pratiquement, n'importent quel organe (bourgeon, racine, feuille,
anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant), prélevé sur celle-ci, peut être cultivé isolément
sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de celui-ci est d'une importance primordiale. On
retiendra cependant que la réponse in vitro est sous la dépendance de nombreux facteurs.
II.7.1.1- L'âge physiologique et ontogénique de l'organe :
Généralement dans les cultures in vitro, on privilégiera les explants les plus jeunes
(embryons immatures, jeunes feuilles, méristèmes etc.) car c'est l'état juvénile qui semble
offrir le plus de possibilités de régénération (Davis, 1986 ; Saadi, 1991). Souvent, ce sont les
tissus provenant d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière nette et
reproductible, l'aptitude à la régénération. C'est le cas par exemple du pois (Saadi, 1991), du
lupin (Desire, 1988), du coton (Brar et al., 1998), du soja (Santarem et al., 1997), du
tournesol (Charniere et al., 1999), Pinus sylvestris ( Haggman et al., 1999) et bien d'autres
espèces.
II.7.1.2- L'époque du prélèvement :
Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade de
vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à développer des
réactions différentes en culture in vitro. Cette différence peut être expliquée par la
modification des équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines,
gibbérellines ...) lors des différentes saisons (Auge et al., 1989).
II.7.1.3- La taille de l'explant :
Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants et les
conditions extérieures seront influentes. La taille choisie variera selon la nature de l’explant.
Si le tissu végétal est de nature organisée, un ensemble assez complet sera nécessaire (soit un
nœud, un apex, ou un bourgeon entier) mais dans le cas d'une structure différenciée (éléments
de feuilles, de tige, de racines, inflorescence..) des fragments de 5 à 10 mm suffiront (Zryd,
1988 ; Auge et al., 1989 ; Hannweg et al., 1996).
D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles » qui
répondent à un stimulus indicateur qui orientera le programme morphogénétique vers une
voie particulière de développement contrairement à certains tissus récalcitrants aux
35
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
manipulations in vitro, due essentiellement à un manque de compétence cellulaire (Coleman
et Ernst, 1990 ; Ronchi, 1995 ; Yadav et Rajam, 1998).
II.7.2- Influence du génotype
La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée à l'espèce.
A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis qu'un autre ne peut
fournir que des embryons (Auge et al., 1989) . Cependant, plusieurs auteurs mentionnent que
seulement certains génotypes paraissent posséder la capacité d'induire une embryogenèse
somatique. Cette capacité, chez beaucoup d'espèces semble être génotypiquement contrôlée
(George et Sherrington, 1984 ; Brown, 1988 ; Dodeman et al., 1997).
Un tel contrôle de la régénération (par la voie de l'embryogenèse somatique ou de la
caulogenèse) a été rapporté chez les Légumineuses fourragères et spécialement chez la
luzerne par Brown et Atanasov (1985) ; Trifolium repens par Parrot (1991) et bien d'autres
espèces. Bencheikh et Gallais (1996) indiquent la présence de quelques gènes majors pouvant
contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De même Bingham et al (1975) ont réussi à
augmenter considérablement la fréquence embryogène chez Medicago sativa après deux
étapes de sélection récurrente. Reisch et Bingham, (1980) trouvent chez un génotype de
luzerne diploïde que la différenciation de bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux
gènes dominants désignés Rn1 et Rn2 dont la présence simultanée permet un taux élevé de
régénération (plus de 75 % des explants) . L'hétérogénéité existante chez les Légumineuses
fourragères, permet d'expliquer la facilité à identifier les génotypes favorables à la
régénération.
II.7.3- Influence du milieu de culture :
Avec le développement des cultures de tissus, divers milieux de base comprenant des
sels inorganiques, des composés organiques (sucres, vitamines et régulateurs de croissances)
ont été progressivement utilisés. Certains milieux proposés dans un but donné sont en fait
utilisables d'une manière beaucoup plus étendue. Les milieux de culture sélectionnés doivent
être le plus parfaitement adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude afin de
laisser s'exprimer pleinement son potentiel génétique. Les principaux constituants d'un milieu
de culture sont généralement représentés par les macro et les micro-éléments, une source
carbonée et azotée, des vitamines et des régulateurs de croissance.
Selon Evans et al, (1981), dans 70% des cas, des milieux de culture de base de type
Murashige et Skoog (MS) ont été utilisés. Le milieu MS a été employé d'une manière générale
pour tous les types de cultures in vitro. Mais c'est essentiellement pour le déclenchement de
36
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
l’organogenèse, en particulier pour la néoformation de bourgeons qu’il s'est révélé nettement
supérieur à d'autres milieux (Margara, 1989).
Le milieu de Murashige et Skoog est caractérisé principalement par une très forte
teneur en sels minéraux, en particulier en potassium et par une concentration également
élevée en azote (sous forme de nitrate et d’ammonium) dont 1/3 apporté sous forme réduite
(ionsNH4+); le rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à l'induction de
l'embryogenèse somatique, en particulier chez Feijoa sellowiana (Delvesco et Guerra, 2001).
II.7.4- Les régulateurs de croissance :
Un régulateur de croissance est défini comme étant, une substance qui, suivant sa
concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous
certaines conditions les processus de cytodifférenciation (Street, 1977). Aucun régulateur de
croissance ne provoque une initiation directe du phénomène d'organogenèse ou
d'embryogenèse somatique, mais il interfère dans de nombreux métabolismes internes de la
cellule végétale.
L'organogenèse est fortement influencée par les régulateurs de croissance. Les deux
hormones, les plus souvent utilisés, d'une manière conjointe ou séquentielle, sont les auxines
et les cytokinines. Nitsh et Nougarede, (1967) ont montré que des explants de parenchyme
médullaire de tabac cultivés in vitro dans un milieu ne contenant ni auxine, ni cytokinine ne
prolifèrent pas. Il en était de même lorsque seulement une auxine ou une cytokinine était
incorporée au milieu. Par contre, la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux
substances sont présentes dans le même milieu de culture.
Le rapport hormonal (auxine/cytokinine) conditionne, en grande partie, le type de
néoformation obtenu. Ce rapport a conduit, dans le cas de la culture in vitro du parenchyme
médullaire de tabac, par exemple, à l'orientation des tissus, soit vers la caulogenèse, soit vers
la rhizogenèse (Skoog et Miller, 1957). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent
favorisée par des teneurs élevées en cytokinine (Frett, 1977; Walker et al., 1979; Margara,
1989; Abrie et Stadn, 2001; Compton et al., 2001; Tang et Guo, 2001 ) alors que les fortes
doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs qualités (Druart,
1992 ; Hobbie, 1998; Abrie et Stadn, 2001; Compton et al., 2001).
L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant, pas une règle générale pour toutes les
espèces végétales. En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au milieu de culture l'un ou
l'autre des deux régulateurs précités pour parvenir à une réponse morphogénétique (Seon et
al., 1998). Dans ce cas précis, nous pouvons citer deux exemples : le premier, concerne le
Triticale où l'organogenèse a été obtenue en se servant uniquement d'auxine (milieu dépourvu
37
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
de cytokinine) (Vikrant et Rashid, 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi gamble
où l'équipe d'Anand et Rao, (2000) a obtenu des bourgeons néoformés en utilisant des
cytokinines seules dans le milieu d'induction
Par ailleurs, il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses obtenues
dans ce domaine, qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité des différentes
auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les effets paraissent varier
essentiellement avec le matériel végétal employé.
Tout comme à l'organogenèse, les régulateurs de croissance de type auxine et cytokinine
sont aussi indispensables à l'embryogenèse somatique.
La production d'embryons somatique est généralement obtenue en deux phases de
culture, sur des milieux qui différent essentiellement par leurs concentrations en régulateurs
de croissance (Auge et al., 1989). Par exemple, chez la carotte ou la luzerne, les embryons
sont obtenus en deux phases: Une phase dite d'induction réalisée sur un milieu souvent riche
en régulateurs de croissance en particulier en auxines permet la formation et / ou la
prolifération des cellules embryogènes. Ces cellules n'évolueront en embryons qu'au cours
d'une deuxième phase dite de développement qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus
induits, sur un nouveau milieu moins riche, voir dépourvu de régulateurs de croissance
essentiellement en
auxines (Saadi, 1991 ; Giorgetti et al.,1995). Cette façon de faire ou plutôt ce schéma de
transfert a été appliqué avec succès dans de nombreux travaux de recherche portant sur
l'obtention de l'embryogenèse somatique. Nous citons, à titre d'exemple, les travaux réalisés à
partir d'embryons immatures de graminées (Jullien, 1991), de pois (Saadi, 1991), de coconut
(Nair et al., 1999), de Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999), d'Arabidopsis thaliana (Gaj,
2001), de boutons floraux du bananier (Escalant et al., 1994), d'hypocotyles du tournesol
(Laparra et al., 1997), des feuilles du Santalum album et Santalum spicatum (Rugkhla et
Jones, 1998) etc...
Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un milieu pauvre n'est pas
toujours indispensable pour le déroulement des différentes phases annoncées précédemment.
L'exemple des travaux de Maheswaren et Williams (1984), portant sur l'embryogenèse du
trèfle et la luzerne, est très significatif puisque ces auteurs ont réussi à obtenir, des embryons
somatiques, directement sur les explants d'embryons immatures cultivés sur un milieu riche
en cytokinines et totalement dépourvu d'auxines. C'est l'exemple aussi des travaux de Kristen
et al (2000), réalisés sur les explants de pétioles d’Echinecea purpurea L. Par contre d'autres
cultures exigent en phase inductive, la présence conjointe d'une auxine et d'une cytokinine,
38
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
c'est le cas de la luzerne (Jullien, 1991), du papayer (Monmarson et al., 1994), du cocotier
(Serge, 1998) et bien d'autres espèces.
Les auxines les plus souvent utilisées en embryogenèse somatique sont le 2,4-D,
l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon pouvoir inducteur, le 2,4 -D semble détenir,
d'après Evans et al, (1981), le record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse
somatique (puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme régulateur). Quand aux
cytokinines, elles sont représentées par la Kinétine, la benzyladenine (BA), la 2isopentenyladénine et la zéatine. Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de
croissance peuvent intervenir dans le processus d'embryogenèse somatique tels que les
gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur utilisation reste limitée. Les
gibbérellines, selon Jayasree et al, (2001), stimulent fortement la production de bougeons
néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles sont combinées aux cytokinines. Par contre,
d'après Margara (1989), les gibbérellines ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et
particulièrement la rhizogenèse chez le Chou-fleur. L’acide abscissique (ABA) quant à lui, est
employé par certains auteurs dans le but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique
des embryons (Unnikrishan et al., 1990 ; Dodeman et al., 1997). Son usage peut inhiber, en
même temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et empêcher la
germination précoce des embryons somatiques (Milena et al., 1998 ; Svobodova et al.,
1999).
II.7.5- Influence de la source carbonée :
Les tissus en cultures in vitro sont largement hétérotrophes vis à vis du carbone en raison
de l'absence ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc indispensable
d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de culture. Les glucides remplissent
deux fonctions principales dans les milieux de culture ; ils fournissent de l'énergie nécessaire
pour la croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du milieu de
culture (Zryd, 1988). Cette pression osmotique, appelée aussi « effet osmoticum », peut avoir
diverses actions sur les tissus. Elle agit, dans certains cas, sur l'orientation ou l'expression
morphogénétique des tissus (Belaizi et Boxus, 1995 ; Charniere et al., 1999), dans d'autres,
sur la maturation des embryons somatiques produits (Walker et Parrot, 2001).
Les glucides, les plus généralement utilisés sont le saccharose et le glucose (Margara,
1989 ; Druart et Samyn, 1995). Selon certains auteurs, le maltose peut constituer une bonne
source carbonée puisqu'il permet, dans certains travaux portant sur l'embryogenèse,
d'améliorer à la fois, et la qualité et la quantité des embryons somatiques produits (Saadi,
1991).
39
CHAPITRE II
GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO
L'embryogenèse somatique ne semble pas être influencée uniquement par la nature des
sucres mais aussi, et pour un même sucre, par sa concentration dans le milieu de culture.
Généralement, selon Piatti, (1988), les doses employées oscillent entre 2 et 12 %. L'effet dose
peut avoir une grande influence sur le devenir morphogénétique des cultures. Dans ce cas,
l'exemple du tournesol est très significatif, l'usage d'une concentration de 12% en saccharose
peut orienter le processus vers la voie de l'embryogenèse somatique, alors qu'une
concentration de 3 % conduirait vers la néoformation de bourgeons (Charniere, 1999).
40
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
III.1- Introduction :
L’embryogenèse somatique est potentiellement la méthode de régénération la plus
performante pour la propagation clonale du fait de son taux de multiplication élevé. L’intérêt
de cette technologie pour l’amélioration génétique est indéniable. La cryoconservation des
cultures embryogènes (dans l’azote liquide à –196°C) laisse entrevoir la possibilité de
disposer à volonté de matériel juvénile et la conservation des ressources génétiques.
L’embryogenèse somatique représente aussi un outil de développement en foresterie. De
fait, cette technologie est déjà utilisée à l’échelle industrielle pour les épicéas et différents pins
au Canada, aux USA et en Nouvelle Zélande (Laurence et al., 2006).
III.2- Présentation de l’embryogenèse somatique :
L’embryogenèse somatique est une particularité des végétaux. C’est le processus par
lequel des cellules somatiques, non-gamétiques, produisent des embryons normaux du point
de vue morphologique et du développement. Dans ce cas, une cellule diploïde se dédifférencie
de sorte que, mise dans un milieu adéquat, elle se développe en un embryon qui donne, par la
suite, une plante entière.
La production d’embryons somatiques a été décrite pour la première fois chez la carotte
en 1958 (Steward et al., 1958) (Figure 1). Les explants (morceaux de la plante d’origine)
sont cultivés dans un milieu riche en auxine. Les cellules de l’explant se dédifférencient et se
divisent, elles deviennent compétentes pour initier un programme embryogène, mais ce n’est
que lorsqu’elles sont mises en culture dans un milieu sans auxine que le développement des
embryons somatiques a lieu. Depuis, des embryons somatiques ont été obtenus chez
différentes plantes en utilisant des techniques très variées et à partir de différents explants :
microspores, protoplastes, embryons immatures, explants tissulaires et cellules en culture in
vitro (Van Englen et De Vries, 1992 ; De Jong et al., 1993 ; Zimmerman, 1993 ;
Mordhorst et al., 1997).
L'embryogenèse somatique est une technique qui s'adapte bien à la production
industrielle. Les embryons somatiques peuvent être initiés dans des bioréacteurs, afin de
produire des semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif, ou pour la synthèse
de métabolites secondaires utilisés dans des médicaments, colorants, etc.
41
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Figure 5 : Embryogenèse somatique et zygotique chez la carotte (Steward et al., 1958).
De toutes les techniques de culture in vitro, l’embryogénèse somatique
conduit sans aucun doute au taux de multiplication le plus élevé. D'autre part, l'embryon
somatique est une structure bipolaire qui développe simultanément un pôle racinaire et un
pôle caulinaire opposés. Ainsi, par rapport à l'enracinement de bourgeons (axillaire ou
adventif) l'obtention de plants par embryogenèse somatique est plus rapide puisqu'il n'existe
pas d'étape d'enracinement proprement dite.
Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé lors
de la reproduction sexuée (embryon zygotique). Cependant, d'autres types d’embryons
peuvent également se développer à partir de cellules du sporophyte ou du gamétophyte,
embryons qui ne sont pas le produit d'une fusion gamétique et qui sont appelés « embryons
somatiques ». Parfois, chez certaines espèces, ils résultent d'une embryogenèse somatique
naturelle qualifiée d’embryogenèse adventive spontanée. Dans certains cas en effet, les
anthérozoïdes, l’oosphère, voire d'autres cellules gamétophytiques peuvent engendrer des
embryons parthénogénétiques. Dans d'autres cas, certaines cellules sporophytiques localisées
au niveau des tissus intra-ovulaire, en particulier le nucelle, fournissent naturellement des
42
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
embryons appelés « embryons nucellaires ». Ce type d'embryogenèse est très développé dans
la famille des Rutacées, spécialement chez les Citrus (Tisserat et al., 1979 ; Vardi et al.,
1990) Toutefois, cette appellation est essentiellement appliquée, selon certains auteurs comme
Piatti, (1988) et Margara, (1989), aux embryons obtenus à partir de culture de tissus in-vitro
du sporophyte .
III.3- Analyse de l’embryogenèse somatique par la génomique :
Différentes études menées sur des embryons somatiques ont permis d’identifier divers
gènes participant à l’embryogenèse somatique. Ainsi, Thibaud-Nissen (Thibaud-Nissen et al.,
2003) ont mis en évidence une activation des gènes de détoxification, de défense ou de
maintien du statut redox chez le soja. Ceci suggère la possibilité d’un « burst » oxydatif en
réponse au 2,4-D cela avait été décrit par Pfeiffer (Pfeiffer et Hoftberger, 2001).
L’équipe de Vries a mis en évidence par « Differential Display » l’existence d’un gène
codant pour un récepteur kinase avec des motifs LRR (Schmidt et al., 1997). Ce gène est
exprimé par les cellules de carotte ayant acquis la compétence embryogène, il a été appelé
SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase). Chez Arabidopsis AtSERK1 marque les
cellules compétentes pour produire des embryons et il interviendrait dans l’acquisition de la
compétence embryogène (Hecht et al., 2001). L’expression de SERK est transitoire pendant
l’embryogenèse somatique et zygotique, il s’exprime jusqu’au stade cœur. AtSERK1
s’exprime aussi avant la fécondation de façon polaire dans l’ovule en développement puis
dans tout le gamétophyte femelle. Son expression persiste dans l’oosphère et dans les
synergides jusqu’à la fécondation, puis dans toutes les cellules de l’embryon et du suspenseur
jusqu’au stade cœur. La surexpression d’AtSERK1 induit une augmentation de la compétence
à former des embryons somatiques.
En 1998, Jung et al décrivent le clonage par « differential display » de deux gènes
différentiellement exprimés dans des cultures embryogènes de riz. Le premier de ces gènes,
REC1 ne présente pas d’homologie avec des gènes connus alors que le deuxième, REC2, est
similaire à une protéine nickel-cobalt résistante. Le rôle de cette protéine au cours de
l’embryogenèse somatique reste à déterminer, mais elle pourrait participer au contrôle du
niveau de production d’éthylène.
III.4- Les molécules signal participant au développement des embryons somatiques :
L’embryogenèse somatique a permis d’étudier le rôle de l’auxine au cours de
l’embryogenèse. L’induction de l’embryogenèse somatique nécessite la présence d’auxine
dans le milieu de culture, mais son développement se fait dans un milieu sans hormone.
43
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
L’utilisation d’inhibiteurs du transport polaire d’auxine bloque le développement de
l’embryon somatique alors que ce traitement a un effet moindre sur les embryons zygotiques
(Liu et al., 1993), ce qui suggère l’existence chez ces derniers de deux mécanismes régulant
la morphogenèse, un intrinsèque à l’embryon et un maternel (Zimmerman, 1993).
En 1992, De Jong a montré que le développement embryonnaire de cellules de carotte
ts11 sensibles à la température reprend grâce à une endochitinase (De Jong et al., 1992), et
que les facteurs Nod, molécules bactériennes contenant de la chitine, lèvent aussi cette
inhibition (De Jong et al., 1993). Ainsi, l’endochitinase serait nécessaire à la production de
molécules similaires aux facteurs Nod à partir d’un substrat de plante jouant un rôle lors de
l’embryogenèse somatique. L’embryogenèse somatique nécessiterait aussi la présence de
certaines protéines qui seraient des composés de la paroi cellulaire et qui contrôleraient
l’extension de la paroi (Van Englen et de Vries, 1992 ; van Engelen et al., 1993).
III.5- Le contrôle hormonal de l’embryogenèse :
Lors du développement embryonnaire chez les plantes, il n’y a pas de phénomènes de
migration cellulaire, ainsi le développement est dépendant de la position des cellules. Les
molécules signal qui agissent à courte et à longue distance sont donc potentiellement
importantes pour l’organisation de l’embryon.
III.5.1- Rôle de l’auxine :
L'identification de mutants affectés pour le transport de l'auxine montre que cette
hormone joue un rôle essentiel au cours de l’embryogenèse. Elle pourrait jouer un rôle majeur
dans la coordination du patron embryonnaire à partir du stade globulaire. Le transport de
l'auxine pendant l'embryogenèse précoce est organisée en deux vagues. L'auxine est d'abord
transportée vers le pole apical (Friml et al., 2003). Ce transport se ferait par le biais de PIN7,
une protéine localisée dans les membranes apicales de la cellule basale et de ses cellules filles,
et participerait au complexe à « efflux » de l'auxine. Par la suite, au stade globulaire, le
transport de l'auxine se fait vers la partie basale de l'embryon, ce qui marque la formation de
l'axe embryonnaire. Puis, le passage de la symétrie radiale à la bilatérale traduit une
redistribution de cette hormone associée avec la mise en place d’un transport actif dirigé de la
partie basale vers le méristème apical (Liu et al., 1993). Du point de vue génétique, Pin1 code
pour une protéine de transport putative appartenant au complexe « efflux carrier » (Galweiler
et al., 1998). Son expression devient polarisée vers la moitié du stade globulaire avant que les
cotylédons ne commencent à se développer : lors du passage 16-32 cellules, il est exprimé par
les cellules internes de la partie centrale de l’embryon. La protéine PIN1 s’accumule dans les
membranes basales induisant une polarité apico-basale. Pinoid code pour une serine-thréonine
44
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
kinase (Christensen et al., 2000). Son expression débute au stade globulaire et il régulerait
négativement le signal auxinique. Le phénotype des mutants pinoid, pin-formed et
monopteros, caractérisé par des malformations des cotylédons ou leur fusion, témoigne du
rôle joué par l’auxine lors de la transition de symétrie radiale à bilatérale. Ces gènes seraient
nécessaires pour le transport correct et la localisation coordonnée de l’auxine. Ainsi, l’auxine
pourrait agir comme un messager intercellulaire dans les processus d’établissement du patron
morphologique et son rôle dans le signalement de longue distance intègrerait aussi la
morphogenèse.
III.5.2- Rôle des cytokinines :
Le rôle des cytokinines au cours de l’embryogenèse précoce reste à déterminer. Un
mutant présentant un niveau élevé de cytokinines, amp1 est affecté dans la
photomorphogenèse et le moment de floraison. De plus, les plantules présentent un plus grand
nombre de cotylédons (Jurgens et al., 1991 ; Chaudhury et al., 1993). Ainsi, un changement
local de la balance auxine/cytokinines influe sur la formation des primordia cotylédonaires en
bonne quantité et orientation dans l’embryon globulaire tardif. De par leur fonction, les
cytokinines devraient être aussi impliquées au cours de l’embryogenèse précoce. Cependant, à
ce jour, aucune implication claire n’a été mise en évidence. Cette absence de données signale
une fois de plus le manque d’information concernant les premières étapes du développement
embryonnaire.
III.6 - Origine et développement des embryons somatiques :
Les donnés cytologiques montrent que les embryons somatiques ont pour origine des
cellules particulières dites embryogènes. Elles présentent des caractères de cellules
méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense, gros noyaux aux nucléoles
proéminents et petites vacuoles. Elles fixent de manière intense les colorants ce qui les rend
aisément repérables en cytologie (Jullien, 1991 ; Loiseau et al .,1998 ; Vaslenko et al,
2000).
Sharp et al (1980) in Piatti (1988) décrivent deux voies pour l'embryogenèse somatique:
La première dite est l'embryogenèse somatique directe où les embryons sont initiés
à partir de tissus en absence de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules préembryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou bien les cellules sont déjà engagées dans un
développement embryogène et elles ont besoin seulement d'être libérées (Piatti, 1988 ;
Rouget, 1989). Elles semblent préexister dans les tissus de certains explants comme les
embryons immatures ou les fragments de très jeunes plantes (Saadi, 1991). Dans le cas de
cette embryogenèse somatique (qui se reproduit rarement), les embryons apparaissent sur la
45
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
surface des explants. Le processus commence tout d'abord par l'apparition de petits
gonflements, au niveau de l'épiderme des explants, qui évoluent en petites structures de forme
sphérique et à aspect lisse verdâtre. Ces structures traversent, par la suite, les mêmes stades de
développement morphologique que traversent habituellement les embryons zygotiques.
La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte, pour la quelle une
prolifération cellulaire est requise. Les travaux de Sharp (1980) et d'Evans (1981) in Piatti
(1988) ont également pu servir à mettre en évidence, l'existence de cellules initiatrices qui
sont déjà différenciées mais dépourvues de capacité embryogènes. Ils les nomment des
cellules pré-embryogènes indéterminées (PEIC). Les cellules embryogènes apparaissent
tardivement au sein du cal produit par la réactivation mitotique des cellules différenciées et/
ou la prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de type racines, tige ou de feuille
(Jullien, 1991 ; Rugkhla & Jones, 1998). Leurs multiplications aboutissent à la formation de
groupes de cellules embryogènes "nodules méristèmatiques" dispersés, parmi les autres
cellules du cal et qui sont généralement de type parenchymateux. A la suite de leur repiquage
sur des milieux dépourvus d'auxines, ces nodules évoluent en des embryons somatiques
comme c'est le cas chez la carotte (Saadi, 1991).
Les embryons somatiques connaissent les mêmes stades de développement
morphologiques que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir : stade
globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire (Egertsdotter et Arnold, 1998). Ils ont une
structure chromosomique souvent semblable à celle de la plante- mère dont ils sont issus
(Ranchi, 1995). Le critère qui permet de reconnaître un embryon somatique est certainement
sa structure bipolaire, qui développe précocement et simultanément un méristème caulinaire
et un méristème racinaire (Norrel, 1973 ; Ranchi, 1990). Généralement les embryons
somatiques produits présentent souvent des malformations morphologiques (embryons
monocotylé, tricotylé, en forme de bouteille.....etc.). On enregistre cependant, un faible taux
d'embryons somatiques à morphologie normale.
III.7- Différences entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse zygotique :
Quelques différences existent entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse
zygotique. Cette dernière débute toujours à partir d’une seule cellule, le zygote, qui se forme à
la suite de la fécondation, alors que l’embryogenèse somatique peut être indirecte, c’est à dire
d’origine multicellulaire, ou directe lorsqu’elle dérive d’une seule cellule (Williams et
Maheswaran, 1986). Une autre différence concerne le suspenseur qui peut soit ne pas se
former lors de l’embryogenèse somatique ou bien avoir une morphologie très différente
(Yeung et Meinke, 1993).
46
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Pour finir, les embryons somatiques ne rentrent pas en dormance. En revanche,
l’expression des gènes semble être similaire chez les deux types d’embryons (Perez-Grau et
Goldberg, 1989 ; De Jong et al., 1993).
III.8- Intérêt de l'embryogenèse somatique :
L’embryogenèse somatique est
un bon modèle d’étude du développement
embryonnaire :
Aujourd’hui, l’embryogenèse somatique est reconnue comme modèle d’étude de
l’embryogenèse. Ce système permet d’étudier le développement embryonnaire sans
l’influence maternelle. Ce dernier intérêt est d’autant plus important que, dans ce cas, les
embryons se développent libres, ils ne sont pas entourés par les tissus maternels, leur étude est
donc aisée et l’obtention de matériel est facilitée. Elle présente aussi un grand intérêt en tant
que modèle in vitro pour l’analyse de la régulation de gènes essentiels pour l’embryogenèse
ainsi que pour la validation de résultats.
L’embryogenèse chez les dicotylédones débute par une division asymétrique qui est à
l’origine du suspenseur et de l’embryon. Les méthodes classiques de mutagenèse mises en
œuvre pour élucider les mécanismes de ce processus développemental ne sont pas adaptées
pour mettre en évidence les mécanismes d’acquisition de la polarité embryonnaire à l’origine
de cette division asymétrique. L’embryogenèse somatique est reconnue comme un modèle
d’étude de l’embryogenèse zygotique chez les végétaux supérieurs. Notamment, le modèle
d’embryogenèse somatique in vitro du tournesol. Dans ce modèle, un protoplaste de tournesol
mis en culture enrobé dans une matrice d’agarose (condition embryogène) se divise
asymétriquement donnant une structure appelée embryoïde alors que lorsqu’il est mis en
culture en milieu liquide (condition non-embryogène), il se divise de façon symétrique pour
donner un tissu somatique (Tamborindeguy, 2004).
L’embryogenèse somatique des plantes est un outil biotechnologique utilisé à
différentes fins :
Elle constitue tout d’abord un outil de recherche. Intégrée aux programmes
d’amélioration (figure 6), elle permet d’étudier les mécanismes qui régissent, entre autres, les
phénomènes de dédifférenciation cellulaire, de programme ontogénétique permettant
d’accréditer le concept de totipotence cellulaire. Par ailleurs, disposer d’un système fiable et
efficace de régénération, c’est-à-dire reproductible et performant par le nombre de plants
régénérés, est un pré-requis aux études de la fonctionnalité de gènes via la transformation
génétique.
47
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in vitro, l'embryogenèse
somatique se montre plus séduisante en terme de performance et d'efficacité (Harkman et
Arnold, 1985 ; Piatti, 1988). En effet, la maîtrise de la production d'embryons, chez certaines
espèces, via les suspensions cellulaires permet d'obtenir des milliers d'embryons par litre de
milieu de culture et par conséquent la régénération de milliers de plants. L'embryogenèse
somatique permet aussi en un temps très court de produire des plantes entières sans passer par
les contraintes que connaît habituellement l'organogenèse (phase de caulogenèse et de
rhizogenèse) (Daikh et Demarly, 1987 ; Rouget, 1989).
L’embryogenèse somatique est actuellement intégrée dans de nombreux schémas de
sélection puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des cycles d'amélioration
comme par exemple, le temps nécessaire à la valorisation du matériel sélectionné âgé ou
juvénile ou la production de parents hybrides nécessaires à la diffusion de nouvelles variétés
(Demarly et Sibi, 1989 ; Demarly, 1994 ; Stanantino et al., 1998 ; Tremblay et al., 1999).
De telles applications ont été réalisées chez plusieurs espèces comme la carotte (Toute, 1998),
la luzerne (Redenbough et al., 1986 ; Fujii et al., 1987 ; Stuart et al., 1987 ; Ray et
Bingham, 1989), Asparagus officinalis (Mamiya et Sakamot, 2001), le palmier dattier
(Ferry et al., 1998).
48
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
Figure 6 : Embryogenèse somatique : intégration dans un programme d’amélioration, pour la
fabrication de variétés multi clonales et la diffusion de plants améliorés (Lelu et Thompson,
2007) :
Population
d’Amélioration
Matériel
sélectionné
Phase
de
sélection
Masses
embryogènes
Plants
acclimatés
Pépinière
Tests comparatifs
Tests Clonaux
Clones
sélectionnés
Masses embryogènes
congelées
Pieds mères de
bouture
Production
pilote
de plants
Multiplication
végétative
horticole
Phase de
diffusion
de plants
améliorés
Plantations
49
CHAPITRE III
GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
III.9- Les principaux stades de L’embryogenèse somatique :
L’embryogenèse somatique comporte quatre stades principaux (Laurence et al., 2006):
III.9.1- Initiation et prolifération du tissu embryogéniques :
L’embryogenèse somatique débute avec un embryon de plante que l’on a retiré d’un
grain, ou par un explant. L’embryon, ou l’explant, est placé dans une boîte de Pétri contenant
un milieu d’initiation, c’est-à-dire un milieu contenant les éléments nutritifs dont l’embryon
ou l’explant a besoin pour commencer à se développer. Au bout de quelques « semaines »,
une partie du tissu végétal produit se transforme en tissu embryogénique présentant un aspect
blanc, duveteux et translucide unique en son genre. Il s’agit du stade d’initiation de
l’embryogenèse somatique. Le tissu embryogénique continue à proliférer tant qu’il est
maintenu dans ce milieu d’initiation. Pendant la phase de prolifération, il est possible de le
cryoconserver dans l’azote liquide afin de l’utiliser plus tard pour relancer le processus
d’embryogenèse.
III.9.2- Maturation des embryons somatiques :
Dès que la quantité de tissu embryogénique est suffisante, la prolifération est
interrompue pour permettre la maturation des embryons somatiques. Des amas de tissus sont
alors transférés dans un milieu de maturation contenant un régulateur de croissance des
plantes qui favorise la maturation des embryons somatiques. Au bout de quelques
« semaines », des embryons somatiques matures, ressemblant aux embryons que l’on trouve
dans les graines, commencent à apparaître sur les amas.
III.9.3- Germination des embryons somatiques :
Les embryons somatiques matures sont extraits des amas de tissu et placés dans un
milieu de germination contenant un mélange des éléments nutritifs nécessaires aux premiers
stades de développement de la plante. Les embryons somatiques germent et forment des
racines et des pousses, tout comme les plantes germant à partir de graines. Les plantes
propagées par embryogenèse somatique sont souvent appelées « plantules somatiques »,
« semis somatiques » ou « plantules dérivées d’embryons somatiques ».
III.9.4- Culture en serre et transplantation sur le terrain :
Lorsque les plantules cultivées ont atteint une taille suffisante et forme des racines,
elles sont mises en terre pour favoriser leur croissance et assurer leur acclimatation. Après une
période normale de culture en serre, les plantules sont transplantées sur le terrain.
50
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.1- Objectif recherché :
L'objectif essentiel visé par ce travail consiste à essayer de régénérer in vitro des
plantes entières de tomate via l'embryogenèse somatique et l’organogenèse.
Pour parvenir à cela, nous avons testé trois principaux facteurs susceptibles
d'influencer la régénération qui sont le milieu de culture, la nature de l'explant et le génotype.
L’embryogenèse somatique
une des plus remarquable technique qu'offrent les
cultures in vitro et la biotechnologie en général permet d'obtenir des individus semblables et
génétiquement "conformes" aux plantes d'origine, devrait fournir un moyen efficace pour
multiplier par exemple des individus hybrides très performants à des fin de production
commerciale.
En effet partant d'un fragment de végétal, placé en conditions aseptique, la plante
mère peut être multipliée en un temps très court, en plusieurs millions d'exemplaires et cela à
l'infini. Il s'agit là probablement d'un objectif lointain dont l'intérêt technico-économique doit
être soumis à évaluation.
Le présent travail représente un prélude pour l'amélioration génétique de la tomate.
Cette tentative s'appuyait sur les résultats déjà obtenus avec les autres plantes. Les voies à
explorer sons l’embryogenèse somatique directe (formation d’embryons somatiques) sans
passage par une phase de callogenèse et l’organogenèse directe. La démarche scientifique
suivie pour essayer d'atteindre les objectifs que nous étions fixés consiste à tester trois
principaux paramètres pouvant influencer ce processus. Il s'agit d'abord de la nature de
l'explant, puis l'effet génotypique et aussi la nature du milieu (régulateurs de croissance).
IV.2- Première expérience : essai préliminaire
Nous étions amené donc à nous inspirer, dans une première série d'expérience,
que nous avons qualifiée de préliminaire, d'un certains nombre de travaux réussis portant sur
l'embryogenèse somatique de plusieurs espèces appartenant à la famille des Solanacées en vue
d'établir un protocole expérimental susceptible de nous conduire à résoudre notre
problématique. Cette problématique qui se résume en fait à essayer d'obtenir des embryons
somatiques et par la même, réussir dans la mesure de possible, à régénérer des plantes entières
via cette méthode de micropropagation.
51
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.2.1- Matériel végétal :
Le matériel végétal qui a fait l’objet de cette étude est issu de quatre variétés de
tomate (Solanum lycopersicum L. ou Lycopersicon lycopersicum L.) (Tableau 7).
Tableau 7: Variétés testées
Variétés
Abréviations
Rio Grande
RG
Heinz 1350
HZ 1350
Top 48 (hybride)
TOP48
Agora (hybride)
AGO
IV.2.2- Méthodes :
IV.2.2.1- Désinfection des graines :
Les graines ont été lavées avec de l’eau contenant quelques gouttes d’agent mouillant
pendant 3 minutes puis rincées avec l’eau du robinet pendant 30 min avant la désinfection.
Celle-ci consiste en une immersion dans l’éthanol à 70° pendant 2 secondes puis dans une
solution d’hypochlorite de sodium (1 à 2%)
pendant 15 à 20 minutes. Cette dernière
immersion est suivie de plusieurs rinçages à l’eau distillée stérile pendant 10 min chacun.
IV.2.2.2- Germination des graines :
Les graines sont mises à germer dans des boites de pétri contenant 25 ml de milieu de
Murashige et Skoog (1962) à raison de 10 graines par boite pour produire des plantules d’où
proviendront les explants. Les différents explants utilisés proviennent de plantules de 15
jours.
IV.2.2.3- Choix du milieu de culture :
Un milieu de culture est une solution aqueuse comprenant des sels minéraux, des
éléments organiques et éventuellement des phytohormones ou régulateurs de croissance. Le
milieu de culture le plus utilisé est sans doute celui de Murashige et Skoog (1962) enrichi des
hormones de croissance. Le milieu de base MS est additionné de 10 g d’agar, 30 g de
saccharose.
L’autoclavage des milieux a lieu à 115 °C pendant 30 min sous une pression de
1,6 kg.cm-2 après ajustement du pH à 5,7.
52
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.2.2.4- Mise en culture :
Les explants de cotylédons et d’hypocotyles ont été introduits dans des boites de Pétri
renfermant les milieux d’initiation de l’ESD qui contient les éléments de Murashige et Skoog
(1962) enrichis de régulateurs de croissance : auxines (2,4 D et ANA) (Tableau 8). Le 2,4D
est choisie pour son aptitude à stimuler l'embryogenèse somatique. Un bon nombre d'auteurs
parlent de l'importance de l'utilisation des auxines seules (en particulier celui du 2,4-D), à
l'obtention des embryons somatiques chez plusieurs espèces comme le Castanea sativa
(Piagnani et Eccher., 1990); le pois (Saadi, 1991); le sorgho (Patil et Kuruvinashetti,
1998); le Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999) et le coton (Zhang et al., 2001).
Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec du papier
film. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la
variété introduite, la nature de l’explant et le milieu de culture. Le repiquage des explants à
lieu un mois après la mise en culture. Il peut être précoce si le milieu de culture est envahi par
des composés phénoliques. Chaque repiquage dure environ un mois. Toutes les cultures ont
été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une photopériode de 16 h
d’éclairement.
Tableau 8 : Différentes concentrations d’hormones testées : Milieu I : MS additionné de
différentes concentrations de 2,4 D et milieu II : MS additionné de différentes concentrations
d’ANA.
Hormones
Milieux
ANA mg/l
2,4 D mg/l
I1
0
0,2
I2
0
0,5
I3
0
1
I4
0
2
II1
0,2
0
II2
0,5
0
II3
1
0
II4
2
0
53
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.2.2.5- Dispositif de l’essai (tableau 9) :
Explants
C1
C2
H1
H2
H3
Milieux
Total
explants
I1
4
4
4
4
4
20
I2
4
4
4
4
4
20
I3
4
4
4
4
4
20
I4
4
4
4
4
4
20
II1
4
4
4
4
4
20
II2
4
4
4
4
4
20
II3
4
4
4
4
4
20
II4
4
4
4
4
4
20
Total explants
32
32
32
32
32
160
C : cotylédon et H : hypocotyle
Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les quatre variétés testées est de
160 explants.
IV.2.2.6- Méthode d’évaluation :
La réponse à l’induction hormonale
a été évaluée par le comptage du nombre
d’explants ayant évolué en formations différenciées ou non différenciées au bout d’un mois,
et ce pour chaque type d’explants, chaque variété et chaque milieu (nombre d’explants ayant
évolué en formations/ nombre totale d’explants = Taux de réponse à l’induction hormonale
Les moyennes ont été reparties en trois classes :
• 0% à 30% : réponse faible +
• 30% à 70% : réponse moyenne ++
• 70% à 100% : réponse forte +++
54
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.3- Deuxième expérience : Embryogenèse somatique et organogenèse directes à partir
d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate :
IV.3.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants :
Les graines de tomate ont été stérilisées en suivant la même méthode utilisée lors de la
première expérience. Ces graines vont germer sur deux milieux différents MSI et MSII à
raison de 5 graines par boite pour produire des plantules d’où proviendront les explants.
Les cinq variétés de tomate testée lors de cette expérience sont : Rio Grande, Marmande,
Heinz 1350, Agora (hybride), Merveille des marchés.
IV.3.2- Les explants :
Les explants utilisés ont une surface moyenne de 5 mm², ils proviennent de jeunes
plantes (10 jours) cultivées in vitro sur milieu MS additionné d’une cytokinine en conditions
aseptiques.
L’embryogenèse somatique est initiée par culture d’explants de cotylédons,
d’hypocotyle et de méristème terminal sur le milieu de base enrichi de régulateurs de
croissance (tableau 9).
Tableau 10: Composition des différents milieux testés pour l’induction de l’embryogenèse
somatique directe.
Rôles
germination des plantes mères.
Milieux
Abréviations
MS + 60 micromoles de BAP
MSI
MS + 90 micromoles de BAP
MSII
Induction de l’embryogenèse somatique
MS + 10 micromoles de BAP
MS1
Milieu d’induction.
MS + 20 micromoles de BAP
MS2
MS + 25 micromoles de BAP
MS3
MS + 0 hormone
MS0
MS + 0,2 mg/l d’ANA
MSA
Maturation des embryons somatiques.
Milieu de développement.
Enracinements des pousses feuillées
55
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
Tableau 11: Composition du milieu de MURASHIGE et SKOOG (M.S) en macro et
microéléments.
Macroéléments
Microéléments
mg.l-1
mg.l-1
KNO3
1900
H3BO3
6,2
MgSO4, 7H2O
370
MnSO4, 7H 2O
22,3
NH4NO3
1650
ZnSO4, 7H 2O
8,6
CaCl2, 2H2O
440
KI
0,83
KH2PO4
170
NaM0O4, 2H2O
0,25
CuSO4, 5H2O
0,025
CoCl2,6H2O
0,025
Na2-EDTA
37,3
FeSO4, 7H 2O
27,8
Tableau 12 : Solution de vitamines de MURASHIGE et SKOOG (M.S).
Vitamines
Concentrations
Acide nicotinique
0,5 mg.l-1
Aneurine
0,1 mg.l-1
Pyridoxine
0,1 mg.l-1
IV.3.3- La mise en culture :
Les explants réduits à la taille de 5 mm² sont introduits dans des boites de Pétri
renfermant les milieux d’induction (MS1, MS2, MS3) à raison d’une plantule par boite (C1,
C2, H1, H2, MT). Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec
du papier film étirable. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en
culture, le nom de la variété introduite, le milieu de culture et le milieu de germination des
plantes mères.
56
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.3.4- Le repiquage :
Le repiquage des explants à lieu chaque mois après la mise en culture. Cette phase dite
de démarrage dure 1 à 2 mois. Les formations globulaires produites sont ensuite transférées
dans le milieu de développement, soit le milieu MS sans hormones et les parties végétatives
formées sont transférés sur un milieu MS additionné d’auxine pour favoriser l’enracinement.
Au stade régénération, les explants sont transférés dans des bocaux contenant 30 ml de milieu
de culture MS0 afin de favoriser la croissance et l’allongement des vitroplants. Toutes les
cultures ont été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une photopériode de
16 h d’éclairement.
IV.3.5- Dispositif de l’essai (tableau 13) :
Explants
C1
C2
H1
H2
MT
Milieux
Total
explants
MSIxMS1
5
5
5
5
5
25
MSIxMS2
5
5
5
5
5
25
MSIxMS3
5
5
5
5
5
25
MSIIxMS1
5
5
5
5
5
25
MSIIxMS2
5
5
5
5
5
25
MSIIxMS3
5
5
5
5
5
25
30
30
30
30
30
150
Total explants
C : cotylédon, H : hypocotyle et MT : méristème terminal.
Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les cinq variétés testées est de
150 explants.
57
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
Photo 1 : Germination des graines de tomate sur milieu
MS additionné de cytokinine.
IV.4- Répétition de la deuxième expérience : Embryogenèse somatique et organogenèse
directes à partir d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate :
IV.4.1- La mise en culture :
Afin de diminuer le risque de contamination, mieux apprécier les résultats et faire une
étude statistique plus précise, nous avons répété la même expérience en mettant un seul
explant par boite. Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec
du papier film étirable. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en
culture, le nom de la variété introduite, la nature de l’explant, le milieu de culture et le milieu
de germination des plantes mères.
Photo 2 : Repiquage d’explant de cotylédon
sur milieu MS additionné de cytokinine
Photo 3 : Repiquage d’explant d’hypocotyle
sur milieu MS additionné de cytokinine
58
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.5- Troisième expérience : Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures
IV.5.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants :
Les plantes ayant servi au prélèvement des explants d’embryons immatures ont été
cultivées sur terreau et au bout de quatre mois, les plantules avaient atteint leur stade
morphologique d’utilisation (formation des fleurs).
IV.5.2- Les explants :
Les explants utilisés dans cet essai consistaient exclusivement en embryons
immatures. Les fleurs ont été prélevées environ 10 jours après la pollinisation. A ce stade les
fruits immatures ont une taille moyenne de 4 mm.
IV.5.3- Milieux et conditions de culture :
Pour chaque variété les fruits ont été désinfectés par trois flambages successifs à
l’alcool. Les embryons ont été prélevés strictement, sous loupe binoculaire à raison de 10
embryons par boite contenant les milieux dits d’induction (MS4, MS5, MS6, MS7). Chaque
boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la variété
introduite et le milieu de culture. Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont
scellées avec du papier film. Le repiquage des explants à lieu un mois après la mise en
culture. Il peut être précoce si le milieu de culture est envahi par des composés phénoliques.
Toutes les cultures ont été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une
photopériode de 16 h d’éclairement. Les régulateurs de croissance utilisés sont le 2,4D et la
kinétine. Les formations produites sont ensuite transférés sur milieu de régénération, soit le
milieu (MS8) avant leur transfert sur le milieu de développement (MS0).
Tableau 14 : Composition des différents milieux testés
Hormones
Milieux
2,4D
Kinétine
MS0
0
0
MS4
10 µM
0
MS5
0,1 mg/l
0
MS6
0,2 mg/l
0
MS7
0,3 mg/l
0
MS8
1µM
1µM
59
CHAPITRE IV
MATERIEL ET METHODES
IV.5.4- Dispositif de l’essai (Tableau 15) :
Nombre d’explants
Total
RG
MMD
MCH
HZ
AGO
explants
MS4 xMS8
10
10
10
10
10
50
MS5 xMS8
10
10
10
10
10
50
MS6 xMS8
10
10
10
10
10
50
MS7 x MS8
10
10
10
10
10
50
Total explants
40
40
40
40
40
200
Traitements
Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les cinq variétés testées est de
600 explants (trois répétitions).
60
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Après l'étude bibliographique, nous sommes parvenus à établir un protocole de travail,
qui prenait en compte les paramètres suivants :
1- Un milieu de culture, composé des sels minéraux et des vitamines de Murashige et
Skoog, additionné de régulateurs de croissance, représentés essentiellement par le 2,4D, l’ANA (substance à effet auxinique), la BA et la kinétine (cytokinine) employées
dans le milieu de culture seule et à différentes doses.
2- Des explants de nature et d'origines diverses (cotylédons, hypocotyles, méristème
terminal et embryons immatures).
3- Des écotypes différents de tomate.
Les explants sont prélevés à partir de plantules cultivée in vitro et dont l'âge varie de 10
à 15 jours (C1, C2, H1, H2, MT) et aussi sur des plantes cultivées en pots sur terreau âgées
de quatre mois environ (embryons immatures).
V.1- Première expérience : essai préliminaire
V.1.1- Résultats obtenus :
L’utilisation du 2,4 D à différentes concentrations induit la formation de cals à partir des
deux types d’explants testés chez les quatre variétés de tomate. Après 10 jours de mise en
culture on observe un phénomène de gonflement des explants et dans certain cas un début de
callogenèse quel que soit le milieu testé. Cette prolifération cellulaire débute
sur les
cotylédons. Au plan morphologique, la nature des cals formés est différente selon l’explant.
Dans le cas des cotylédons, les cals ont une couleur marron clair, un aspect nodulaire et une
consistance compacte (Figure7), les cals issus des hypocotyles sont de couleur verte ou
marron foncé à clair et ils ont un aspect turgescent de consistance friable. Après repiquage sur
les mêmes milieux, le développement des cals est plus important avec quelque fois la
disparition de l’explant.
Les cotylédons
sont plus réactifs au milieu de culture et présentent déjà des
transformations morphologiques (gonflement et boursouflure). Après 10 jours de culture,
seuls les cotylédons comparés aux autres explants expriment un pouvoir callogène.
Les différents explants développent des cals après un mois de mise en culture. Une
réactivité maximale, chez les trois variétés (HZ, RG, AGO) est obtenue sur le milieu I2 (0,5
mg/l de 2,4 D) (figure9, figure 10, figure 11), alors que c’est le milieu I3 (1mg/l de 2,4D) qui
semble favorable à la formation des cals chez la variété Top 48 (figure12).
61
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
La lecture des différents résultats obtenus montre, qu’au 30
ème
jour de culture, les
différents milieux testés ont induit, chez les cotylédons, une multiplication cellulaire
importante observée sur tous les milieux (figure13). Les explants d’hypocotyles expriment un
pouvoir plus tardif et présentent toujours un aspect turgescent.
Enfin et d’une manière générale les différents résultats montrent une variabilité des
réponses des explants par rapport au milieu de culture, selon la variété étudiée et selon le type
d’explant utilisé. Les quatre concentrations de 2,4 D testées ont orienté les explants mis en
cultures vers la formation des cals, c’est le milieu I2 qui a favorisé le maximum de réactivité
des explants et c’est les cotylédons de la variété HZ qui ont donné le plus grand taux de
callogenèse (Figure13).
Figure 7 : Cals formés chez la variété HZ sur
Figure 8 : Formation de racines sur les cals
milieu I2 après un mois de mise en culture.
issus de cotylédons et d’hypocotyles d’Ago
sur milieu I1
62
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau 16 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété AGO pour chaque milieu et chaque type d’explant.
Milieux
I1
I2
I3
I4
Hypocotyles
60% ++
70% +++
60% ++
25% +
Cotylédons
70% +++
90% +++
80% +++
60% ++
Explants
Figure 9 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété AGO après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS + 2,4D).
63
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau 17: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété RG pour chaque milieu et chaque type d’explant.
Milieux
I1
I2
I3
I4
Hypocotyles
20% +
80% +++
20% +
40% ++
Cotylédons
40% ++
90% +++
40% ++
40% ++
Explants
Figure 10 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété RG après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS + 2,4D).
64
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau 18: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété HZ pour chaque milieu et chaque type d’explant.
Milieux
I1
I2
I3
I4
Hypocotyles
20% +
70% +++
60% ++
30% +
Cotylédons
20% +
100% +++
90% +++
50% ++
Explants
Figure 11 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété HZ après 30 jours de mise en
culture sur le milieu I (MS + 2,4D).
65
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau 19: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la
variété Top 48 pour chaque milieu et chaque type d’explant.
Milieux
I1
I2
I3
I4
Hypocotyles
10% +
0%
10% +
0%
Cotylédons
10% +
10% +
20% +
10% +
Explants
Figure 12: Pourcentage d’explants callogènes chez la variété Top 48 après 30 jours de mise
en culture sur le milieu I (MS + 2,4D).
66
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4:Top48.
Figure 13 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre variétés testées après 30 jours
de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D).
L’utilisation de l’ANA à différentes concentrations induit une réaction de rhizogénèse
à partir des deux types d’explants testés chez les quatre variétés de tomate, après 10 jours de
la mise en culture. Ainsi les explants de cotylédons sont plus réactifs au milieu de culture.
En effet les meilleures réponses sont enregistrées sur le milieu II4 (2 mg/l d’ANA).
Après un mois de mise en culture, les différents milieux testés ont induit, chez les
variétés : Top 48, AGO et RG (figure 14) une rhizogénèse très importante avec absence de
callogenèse à l’exception de la variété HZ qui a exprimé un pouvoir callogène plus ou moins
important avec l’ANA (40%).
67
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
(RG MSII1, 1mois)
Figure 14 : Formation de racines sur les cotylédons et les hypocotyles de la variété RG sur
milieu II1.
V.1.2- Discussion et conclusion :
Les résultats obtenus permettent de conclure que la callogenèse est toujours précédée par
une augmentation du volume des explants. Ces explants sont constitués de tissus différenciés
et leur mise en culture dans le milieu MS additionné d’auxine a provoqué la dédifférenciation
des cellules et l’acquisition d’un pouvoir mitotique qui a abouti dans un premier temps à la
formation de cal. De nombreux méristèmes sont formés à partir de cellules différenciées sous
l’influence de régulateur de croissance. Le programme mis en place est d’abord une
dédifférenciation qui conduit des cellules à retrouver une activité mitotique ensuite une
organisation spécifique. En effet les cellules somatiques spécialisées sont engagées dans une
phase de dédifférenciation par réactivation sous l’effet des hormones de croissance (Gueye et
al., 2008). Ces substances jouent directement ou indirectement un rôle inducteur en activant
des séquences génétiques spécifiques à la morphogénèse.
Il faut cependant souligner que la réponse des explants mis en culture varie en fonction de
la variété, la nature et la concentration de l’hormone de croissance additionnée. Cette
différence de réponse est probablement liée au fait qu’il existe des différences dans les
68
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
concentrations endogènes des régulateurs et à l’efficacité relative de leur systèmes
enzymatiques de dégradation.
Le suivi de la cinétique de croissance des cals nous a permis de mettre en évidence que la
callogenèse est profondément influencée par le facteur génotypique. L'implication du facteur
génotypique en callogenèse a été décrit par Brown et Meijer, (1987) sur la luzerne ; Saadi,
(1991) sur le pois ; Kalamani et Ramasamy, (1998) sur le sorgho.
Plusieurs travaux montrent que l’utilisation d’auxines et en particulier le 2,4D assure le
déclenchement de cals chez un grand nombre d’espèces botaniques : le palmier à huile (Ahée
et al., 1981) ; les kolatiers C. anomala et C. acuminate (Fotso et al., 2002) ; les bananiers
(Stross et al., 2003) ; le cotonnier (Kouadio et al., 2004) ; l’absinthe (Zia et al., 2007) ; le
palmier dattier (Sané et al., 2006 ; Asemota et al., 2007 et Gueye et al., 2008) et chez deux
Sapotacées (Fotso et al.,2008).
Concernant la rhizogenèse, les résultats de notre étude nous ont amené à confirmer une
fois de plus le rôle essentiel que jouent les régulateurs de croissances. Cependant, on constate,
que l'usage du 2,4D dans le milieu d'induction, s'est révélé incapable d'induire une
rhizogenèse sur l'ensemble des explants testés sauf pour la variété hybride (AGORA). Par
contre, l'addition de l’ANA au milieu d'induction, lui est très favorable quelque soit l’explant
et l’écotype testé.
Le remplacement du 2,4D par l’ANA qui est une auxine aussi a changé complètement la
réponse des explants mis en culture. Seul le 2,4D a permit d’induire une callogenèse, l’ANA
s’est montré inefficace. Pour une même dose, les réponses diffèrent en fonction du régulateur
employé. L’emploi de l’ANA a permis d’induire une rhizogenèse, coïncidant avec les
résultats signalés dans la littérature, cas d’un arbre fruitier de l’Afrique centrale le Safoutier
(Youmbi et Benbadis, 2001) chez lequel différentes concentrations d’AIA, ANA, AIB
stimulent la rhizogenèse, sur les explants d’hypocotyles et de cotylédons alors que le 2,4D a
un effet uniquement callogène.
L'emploi de l'ANA dans le milieu d'induction, se montre sans effet aucun sur
l'embryogenèse somatique. Contrairement aux résultats signalés dans la littérature, d'autres
auteurs utilisent l'ANA avec succès dans de nombreux travaux portant sur l'embryogenèse
somatique : Laparra et al, (1997) chez le tournesol et Brar et al, (1998) chez le coton.
Contrairement aux résultats obtenus dans notre expérience, un bon nombre d'auteurs
parlent de l'importance de l'utilisation des auxines seules (en particulier celui du 2,4-D), pour
l'obtention des embryons somatiques chez plusieurs espèces comme le Castanea sativa
69
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
(Piagnani et Eccher., 1990); le pois (Saadi, 1991); le sorgho (Patil et Kuruvinashetti,
1998); le Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999) et le coton (Zhang et al., 2001).
V.2- Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issues de jeunes plantules
chez cinq variétés de tomate :
V.2.1- Résultats obtenus et discussion:
Concernant l'embryogenèse somatique, les résultats préliminaires indiquent qu'elle est
possible chez la tomate (figure16, figure 17). Cependant, elle reste tributaire, comme c'était
le cas en callogenèse de plusieurs facteurs tels que : la nature de l'explant, le génotype et la
composition hormonale du milieu. Les embryons somatiques obtenus suivent les mêmes
stades de développement des embryons zygotiques (figure 15).
Le présent travail, nous a aussi permis d'obtenir une organogenèse, avec formation de
pousses feuillées directement sur les explants (organogenèse directe) (figure16, figure 17),
des racines (rhizogenèse), et de régénérer des plantes entières de tomate (figure18).
Les trois types d’explants testés (cotylédons, hypocotyles et méristème terminal) ont
exprimé des potentialités embryogènes et organogènes mais seulement avec les génotypes
Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés.
A la lumière des résultats obtenus au cours de l’essai préliminaire, et qui nous a permis de
conclure que la régénération par organogenèse ou embryogenèse somatique est possible chez
les quatre écotypes (Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés). Nous
avons lancé une deuxième série d'expérience, dans le but de voir l'éventualité de régénérer
des plantes entières via l'organogenèse ou l'embryogenèse, autrement dit, tester la
convertibilité des embryons somatique en plantes.
Concernant l'embryogenèse somatique, l'impact des régulateurs de croissance apparaît
une fois de plus essentiel dans les processus morphogènes. L'embryogenèse somatique varie
considérablement en fonction de la dose du régulateur de croissance employé. L’usage des
cytokinines seules dans le milieu d'induction est capable de conduire à une production
d'embryons, ce qui fait nos résultats coïncident avec ceux signalés dans la littérature.
Au cours de la phase d'induction, nos résultats montrent que l'embryogenèse somatique
est sous la dépendance du génotype. En effet, parmi les génotypes que nous avons testé, la
variété
AGORA s’est montrée récalcitrante
alors que d'autres comme : Rio Grande,
Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés ont manifesté de bonnes aptitudes
embryogènes.
70
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Les rendements obtenus sont nuls pour la variété AGORA quelque soit le milieu de
culture de la plante mère, moyens pour les génotypes RG et MMD, élevés pour les génotypes
HZ et MCH (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 20), élevés pour les génotypes
HZ et RG et moyens pour les génotypes MCH et MMD (cas des plantes mères cultivées sur
MSII) (figure 21). Cette relation entre le génome et l'aptitude à l'embryogenèse somatique a
déjà été reconnue par plusieurs auteurs, Saadi, (1991) ; Benchiekh et Gallais (1996) sur le
pois ; et Carneiro, (1999) sur le café.
Nos expériences ont permis de mettre en évidence une variabilité dans les aptitudes
embryogènes, des différents types d'explants testés. En effet ce sont les explants cotylédons
qui ont présenté les meilleures potentialités embryogènes.
S'agissant de l’organogenèse, elle se trouve aussi conditionnée par l'action de divers
facteurs. Les plus influents sont les facteurs que nous avons cités précédemment à savoir : la
composition hormonale du milieu, le génotype et la nature de l'explant.
L'effet de la composition hormonale intervient à la fois dans l'obtention des pousses
feuillées et aussi dans l'enracinement des tiges régénérées (Walker et al., 1979; Margara,
1989) .
Nous avons constaté que, l'usage de la BAP seules dans le milieu d'induction est
favorable à l’organogenèse et à l'embryogenèse sur l'ensemble des explants et cela quelle que
soit la concentration utilisée.
Des résultats similaires aux nôtres, signalent tous l'intérêt que peuvent avoir les
cytokinines, en l'occurrence la BA sur l’organogenèse. C'est le cas de Li et al (1986) sur
Medicago inpulina L ; Vardi et al (1990) sur le Passiflora coerule ; Jadimath et al (1998)
sur Guizotia scabra et Handro et Floh (2001) sur Melia azedarach.
En organogenèse, le facteur génotypique s'impose comme étant un facteur essentiel. Les
résultats, de notre étude, confirment cela. Les meilleures aptitudes organogènes sont
exprimées par le génotype MCH et RG (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 22)
et les génotypes RG et HZ (cas des plantes mères cultivées sur MSII) (figure 23). L'effet
génotypique sur l’organogenèse n'est pas nouveau puisque de nombreux auteurs le signalent
comme Foucault, (1994), sur le tabac ; Christophere et Rajam, (1996), sur le poivre et
Tang et Guo, (2001) sur le pin.
La totipotence de ces explants n'est pas toujours complète et s'exprime à des degrés
divers allant d'une bonne aptitude à l'organogenèse ou à l'embryogenèse somatique jusqu'à
l'inaptitude totale à la régénération selon leur nature.
71
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
La composition hormonale joue également un rôle déterminant sur le processus
morphogène (organogenèse ou embryogenèse somatique). L'induction est
favorisée par
l’addition de cytokinine dans le milieu. Les meilleures réponses ont été enregistrées avec la
BAP aux doses de
10
micromoles (MS1)
pour l’organogenèse ainsi que
pour
l’embryogenèse somatique (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 20, figure 22) et
25 micromoles (MS3) pour l’organogenèse et l’embryogenèse somatique (cas des plantes
mères cultivées sur MSII) (figure 21, figure 23).
Le facteur génotype influence énormément la réponse morphogène mais d'une manière
générale c’est la variété HZ qui expriment les meilleures réponses aussi bien pour
l’organogenèse que l'embryogenèse somatique.
Au terme de ce travail, on peut dire que la régénération chez la tomate via
l'organogenèse et l'embryogenèse somatique est donc possible. Mais il reste de nombreux
problèmes à résoudre, pour que la technique soit exploitable en sélection végétale.
Figure
15 :
Différents
stades
de
développement
des
embryons
somatiques :
a : globulaire ; b : torpille ; c : cotylédonaire ; d : embryon somatique en germination.
72
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Embryogenèse somatique
(MCH MS2, 1 mois)
Organogénèse
Organogénèse
Embryogénèse somatique
(MCH MS3, 1 mois)
Figure 16 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse
et d’embryogénèse somatique chez la variété MCH.
73
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Organogenèse
s
Embryogenèse
sese
Cotylédon (HZ MS2, 1 mois)
Organogenèse
s
Embryogenèse
Cotylédon (RG MS1, 1 mois)
Figure 17 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et
d’embryogénèse somatique chez les variétés HZ et RG.
74
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Vitroplants
Cotylédon (HZ MS1, 3 mois)
Hypocotyle (MMD MS2, 3 mois)
Figure 18 : Vitroplants régénérés par organogénese.
Cotylédons (HZ MS2, 2 mois)
Figure 19 : Vitroplants régénérés par embryogenèse somatique.
75
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau20: Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSI
Milieux
MS1
Explants
V1 V2
MS2
MS3
V3
V4
V5 V1 V2
V3
V4
V5
V1 V2
50
0
50
68
0
0
V3
V4
V5
50
0
0
0
Hypocotyles
0
5
68
0
0
Cotylédons
0
68
90
68
80 0
0
68
76
90
0
0
0
80
0
Méristème
0
0
50
0
50 0
0
0
0
50
0
0
0
50
50
terminal
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
Figure 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSI.
76
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSII
Milieux
MS1
Explants
V1 V2
MS2
V3
V4
V5 V1 V2
MS3
V3
V4
V5
V1 V2
V3
V4
V5
Hypocotyles
0
80
0
0
0
0
20
0
0
10
0
10
80
50
0
Cotylédons
0
66
80
0
0
0
15
66
25
76
0
55
66
68
25
Méristème
0
76
0
0
0
0
0
0
76
00
0
0
76
0
0
terminal
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
Figure 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSII.
77
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSI
Milieux
MS1
Explants
V1 V2
MS2
V3
V4
V5 V1 V2
MS3
V3
V4
V5
V1 V2
V3
V4
V5
Hypocotyles
0
0
0
0
0
0
50
0
0
20
0
50
0
0
0
Cotylédons
0
76
50
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
50
0
Méristème
0
50
50
20
68
0
0
20
68
20
0
50
68
50
20
terminal
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
Figure 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSI.
78
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Tableau23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSII.
Milieux
MS1
Explants
V1 V2
MS2
V3
V4
V5 V1 V2
MS3
V3
V4
V5
V1 V2
V3
V4
V5
Hypocotyles
0
0
50
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
Cotylédons
0
0
30
0
0
0
30 50
0
0
0
30
0
50
0
Méristème
0
50
50
0
68
0
50
68
50
0
50
68
50
50
30
terminal
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD
Figure 23: Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux
mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur
milieu MSII.
79
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
V.3- Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures chez cinq variétés de
tomate :
V.3.1- Résultats obtenus et discussion :
L’utilisation du 2,4 D à différentes concentrations induit la formation de cals à partir
des explants testés chez les cinq variétés de tomate. Après 25 jours de mise en culture on
observe un phénomène de gonflement des explants et dans certains cas un début de
callogenèse quel que soit le milieu testé. Ces cals continuent à proliférer, prennent un aspect
granuleux et deviennent chlorophylliens (figure24, figure25).
Les différents explants développent des cals après 2 mois de mise en culture. Une
réactivité maximale, chez les trois variétés (HZ, MMD, AGO) est obtenue sur les milieux
d’induction MS4 et MS5 (10 µM et 0,1 mg/l de 2,4 D).
Après repiquage sur les mêmes milieux, le développement des cals est plus important.
Enfin et d’une manière générale les différents résultats montrent une variabilité des réponses
des explants par rapport au milieu de culture et
selon la variété étudiée. Les quatre
concentrations de 2,4 D testées ont orienté les explants mis en culture vers la formation de
cals, c’est le milieu d’induction MS4 qui a favorisé le maximum de réactivité des explants et
c’est les variétés HZ, MMD et AGORA qui ont donné le plus grand taux de callogenèse.
En effet, nous observons 75% d’explants avec cal sur le milieu d’induction MS5 et 80%
d’explants avec cal sur le milieu d’induction MS4. Cependant, les cals formés sur les autres
milieux d’induction se sont avérés moins volumineux et plus pâles avec seulement quelques
points verts.
Les traitements de développement et de maturation n’ont pas apporté d’importants
changements au niveau des structures présentes dans les cals. Nous avons observé plus de
formations globulaires bien délimitées mais aucun embryon somatique en développement n’a
été observé. Contrairement aux résultats obtenus dans notre expérience, un bon nombre
d'auteurs signalent qu’une cytokinine (BAP ou K) est nécessaire au développement des
embryons jusqu’au stade cotylédonaires (Rajasckaran et Mullins, 1985). Cette constatation
est confirmée par Féraud- Keller et Espagnac (1988) pour le chêne vert.
Lorsque les cals sont transférés sur le milieu de régénération MS8, on constate après
trois semaines de culture une prolifération plus ou moins rapide des formations globulaires
probablement des
embryons somatiques au stade globulaire. Ceux-ci verdissent et leur
contour devient plus régulier vers la quatrième semaine de culture (Figure 25). Au bout de la
quatrième semaine nous remarquons que la combinaison hormonale 2,4D (1 µM) + Kinetine
80
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
(1µM) permet d'optimiser le nombre moyen des structures globulaires apparaissant par cal.
Cette balance hormonale offre un meilleur compromis entre la croissance des cals et la
prolifération des formations globulaires.
L'étape de la callogenèse, qui correspond généralement à la phase la plus longue du
processus de régénération (Verdeil, 1993), montre que les tissus utilisés sont très sensibles au
2,4-D et ne nécessitent pas des niveaux d'auxine élevés. La phase de croissance cellulaire, liée
à la sensibilité au 2,4-D des tissus
survient dès la deuxième semaine de culture. La
multiplication des cellules débuterait au cours de la callogenèse, par une hyperpolarisation de
certains polypeptides membranaires sous l'action de l'auxine (Barbier-Bryggoo et al., 1989).
Cette hyperpolarisation est expliquée par Goldsworthy et Rathore (1991) comme étant la
conséquence d'une déstabilisation de la polarité des champs électriques cellulaires qui serait à
l'origine de la croissance désorganisée observée en présence du 2,4-D au cours de la
callogenèse.
Cette étude montre, en outre, que l'apport de cytokinines exogènes, permet d'optimiser
la fréquence d'apparition de cals organisées (probablement embryogènes) à partir des explants
d’embryons immatures de tomate. En effet, en agissant de façon synergique avec le 2,4-D
(Branton et Blake, 1984 ; Sané, 1998), les cytokinines en particulier la BAP stimuleraient
davantage la sensibilité des tissus, en particulier celle des cellules compétentes, pendant la
phase de la callogenèse.
La prolifération des structures globulaires à partir des cals des cinq variétés testées de
tomate nécessite leur transfert
sur un milieu de cultures contenant une cytokinine. La
nécessité d'effectuer un tel rééquilibrage de la balance hormonale, pendant la phase
d'expression de I'embryogenèse somatique, a été démontrée chez d'autres espèces comme le
bananier (Dhed'A et al., 1991) ou le cocotier (Verdeil, 1993). Ainsi, il apparaît que les
cytokinines notamment la BAP jouent un rôle déterminant au cours du processus
d'embryogenèse chez A. raddiana grâce, en particulier, à son action sur l'initiation de la
proembryogenèse et la prolifération des globules embryogènes à la surface des cals.
V.3.2- Conclusion :
La callogenèse s’est manifestée pour chaque variété et pour chaque concentration de
2.4-D, après un transfert dans un milieu additionné de cytokinine et de 2.4-D, les cals se sont
révélés plus organisés. Tenning et al. (1992) ont mis en évidence l’influence négative de
l’âge de l’embryon zygotique en tant qu’explant pour l’embryogenèse somatique directe chez
la betterave et chez le chêne liège et le chêne pubescent. Féraud-Keller et al. (1989) ont
81
CHAPITRE V :
montré que
RESULTATS ET DISCUSSION
les embryons zygotiques prélevés à des stades très précoces de leur
développement se nécrosent totalement. Prélevés au contraire à un stade proche de la
maturité, ils poursuivent leur développement normal en une jeune plantule. Au stade
intermédiaire, ils produisent des embryons somatiques. Nous pouvons donc envisager un
nouvel essai d’embryogenèse somatique directe avec des embryons immatures sur différentes
époques de prélèvement.
La présence de formations organisées dans les cals d’embryons immatures révèle que
ces masses pourraient avoir un potentiel embryogène. Dans ce cas, on s’approche plutôt du
contexte embryogenèse somatique indirecte. Les cals induits sur un milieu enrichi en 2.4-D,
ont tous produit des formations globulaires bien délimitées. Cependant, nous ne possédons
pas encore assez de preuves pour affirmer le caractère embryogène de ces cals.
Les milieux de développement et de maturation ont à nouveau provoqué l’apparition de
masses vertes, compactes à la surface ou au sein du cal qui n’ont pas abouti à une
organogenèse caulinaire. Ces masses vertes pourraient indiquer une capacité organogène ou
embryogène du cal. Si les formations globulaires
présentes au sein des cals sont
véritablement embryogène, il est donc évident que ce sont les étapes de développement et de
maturation des embryons somatiques qui sont limitantes. Pour contourner cet obstacle, le
transfert sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance en fin d’étape d’induction
pourrait être plus favorable au développement des masses pro- embryonnaires qu’un milieu
contenant de la Kinétine, étant donné que ce premier se retrouve dans de nombreux protocoles
d’embryogenèse
somatique.
Une
autre
possibilité
serait
d’augmenter
le
rapport
cytokinine/auxine (George, 1993/1996). La capacité embryogène d’un cal dépend souvent du
génotype (Brown et al., 1995). L’effet du génotype peut aussi inter réagir avec le milieu ou
les conditions environnementales de la culture (Brown et al. 1995).
82
CHAPITRE V :
RESULTATS ET DISCUSSION
Figure 24 : Cals formés à partir d’embryons immatures chez deux variétés de tomates
(HZ et MMD) après deux mois de mise en culture sur milieux d’initiations.
Figure 25 : Structures Globulaires apparaissant par cal après repiquage sur milieu de
régénération MS8.
83
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES :
L'objectif essentiel visé par ce travail consiste à essayer de régénérer in-vitro des plantes
entières de tomate via l'organogenèse et l'embryogenèse somatique directe.
Pour parvenir à cela, nous avons testé trois principaux facteurs susceptibles d'influencer
la régénération qui sont le milieu de culture, la nature de l'explant et le génotype.
Concernant la callogenèse, on constate que la composition hormonale influence
considérablement la taille et la texture des cals produits. Ainsi l'usage du 2,4D, seul dans le
milieu de culture, s'est révélé capable d'induire une callogenèse sur l'ensemble des explants
testés et cela quelle que soient leurs origines. A ce sujet, de nombreux travaux rapportent
l'efficacité du 2,4-D, employé seul ou en association avec une cytokinine, vis à vis de la
callogenèse (Sanghamitra et Sumitra, 1998 ; Jayasree, 2001).
L'importance de la callogenèse ne dépend pas seulement de la nature du régulateur de
croissance mais aussi de sa concentration. Il faut une dose minimale de 0,1 mg/l de 2,4-D
pour pouvoir obtenir une induction callogène.
En plus de l'effet hormonal, la nature de l'explant peut avoir une incidence considérable
sur la callogenèse. En effet, les explants d'hypocotyles et de cotylédons semblent présenter de
bonnes aptitudes.
Le suivi de la cinétique de croissance des cals nous a permis de mettre en évidence que
la callogenèse est profondément influencée par le facteur génotypique. Ainsi, nous constatons
que l'ensemble des génotypes Ago, RG, HZ réagissent mieux à la callogenèse que la variété
hybride Top48.
Concernant la rhizogenèse, les résultats de notre étude nous ont amené à confirmer une
fois de plus le rôle essentiel que jouent les régulateurs de croissances. Cependant, on constate,
que l'usage du 2,4D, s'est révélé incapable d'induire une rhizogenèse sur l'ensemble des
explants testés et cela quel que soit le génotype utilisé. Par contre, l'addition de l’ANA au
milieu d'induction, lui est très favorable. En effet les meilleures réponses sont enregistrées sur
le milieu II4 (2 mg/l d’ANA).
Le présent travail, nous a aussi permis d'obtenir une organogenèse directe, avec une
production de pousses feuillées directement sur les explants et de racines (rhizogenèse), ainsi
qu’ une embryogenèse somatique directe, les deux conduisant à la régénération des plantes
entières de tomate.
84
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
S'agissant de l’organogenèse et l’embryogenèse somatique
elles se trouvent aussi
conditionnées par l'action de divers facteurs. Les plus influents sont les facteurs que nous
avons cité précédemment à savoir : la composition hormonale du milieu, le génotype et la
nature de l'explant.
Au cours de cette étude, nous nous sommes confrontés à plusieurs problèmes ; le plus
important parmi eux est celui relatif au taux de conversion des embryons somatiques en
plantes entières. Dans cette phase, l'échec était presque total puisque le taux de conversion n'a
pas dépassé les 5 %. Cela est du, en partie, aux expériences limitées, conduites lors de cette
étude et qui nous semble très insuffisantes pour résoudre une telle problématique. Les
problèmes de germination des embryons peuvent être attribués soit aux malformations des
embryons (le méristème racinaires ou caulinaire étant inexistant), soit aux techniques de
transferts, des embryons vers les milieux de germinations. Sur ce dernier point, Svobodova et
al., (1999) précisent que les dommages causés durant les procédures de transfert affectent
considérablement la conversion des embryons en plantes entières.
En résumé ce travail nous a permis de réaliser en grande partie les objectifs que nous
avions fixés au départ à savoir l'obtention d'embryons somatiques, l'optimisation de la
production et la régénération de plantes entières.
Concernant l'embryogenèse somatique, le rendement et la qualité des embryons
somatique doivent être améliorés d'avantage et devraient conduire à l'amélioration de la
germination.
Une autre voie de recherche très prometteuse devra se porter sur la maîtrise de
l'enracinement des embryons et la résolution du problème de l'acclimatation qui reste une des
étapes les plus réfractaires à réaliser.
La phase de sevrage des plantes (passage des plantules des tubes à essais aux pots dans
la mini serre) n'a pas été réussie probablement à cause d'une part de la fragilité des plantules
et de leur système radiculaire manquant toujours de vigueur et d’autre part des conditions de
sevrage mal adaptées à notre expérimentation.
Les résultats auxquels nous sommes parvenus sont encourageants. Ce travail mérite
d'être poursuivi pour mieux maîtriser la régénération chez la tomate.
Notre motivation ne serait que plus grande quand on sait qu’un kilogramme de semence
hybride de tomate a un prix fluctuant selon les variétés entre trois cent milles dinars et deux
millions de dinars.
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