réplication 1 LES MECANISMES DE LA

réplication 1
LES MECANISMES DE LA REPLICATION
Le mécanisme de réplication est basé sur le fait que l'ADN est constitué d'une double hélice et que
chaque brin est complémentaire de l'autre. La transmission de l’information génétique se fait au
moment de la mitose, mais la réplication proprement dite se fait avant. Dans le cycle cellulaire des
eucaryotes, on peut distinguer les trois phases: G1, S, et G2. La réplication de l'ADN nucléaire a lieu
lors de la phase S. Cet événement est repérable en soumettant la population de cellules (en tissus, ou en
culture) à un marquage court avec de la 3H thymidine et en suivant, par autoradiographie, le devenir de
ces cellules.
1) Découverte de l'ADN en tant que matériel génétique
* Expérience de Griffith (1912) puis d’Avery (1944) avec Pneumococcus
Griffith a utilisé deux souches de pneumococces: la première souche est sauvage, ce sont des
pneumococces vivants et virulent c'est à dire qui tuent la souris. Ces pneumococces peuvent être
inactivés en les tuant par la chaleur, dans ce cas l'injection ne tue pas par la souris. La deuxième souche
de pneumococces sont des mutants qui ont perdu une paroi de polysaccharides et de ce fait sont
détruits par la souris, cette souche est avirulente. Si on mélange la souche inactivée par la chaleur (qui
ne tue pas) à la souche avirulente (qui ne tue pas non plus) on observe la mortalité de la souris
Conclusion de l'expérience: il existe un principe transformant dans la souche inactivée par la chaleur qui
transforme la souche avirulente en souche virulente. Ce principe transformant provient de la souche
mutante.
* Avery a recherché le principe transformant. Il a séparé les différents composants de la souche
inactivée et fait l'expérience précédente avec les composants de la bactérie. Il en est arrivé à la
conclusion que le principe transformant est de l'ADN.
Définition : la transformation d'une bactérie corespond à l'introduction d'un fragment d'ADN qui lui
confère une nouvelle propriétée L'entrée d'ADN dans une cellule eucaryoteest appelé transfection
simplement parce que les premier essais qui ont été effectués utilisait des virus recombinants,
transfection vient d'infection. Le terme de transformation d'une cellule eucaryote était déjà utilisé, c’est
la conversion de la cellule en un état de croissance non restreint en culture, ce qui ressemble ou est
identique à un état tumoral.
* Expérience de Hershey et Chase (1952) avec le phage T2 (un phage est un virus de bactérie).
Ils ont infecté des bactéries avec des phages comportant de l'ADN marqué au 32P et des protéines
marquées aus 35S. En séparant les bactéries du milieu, on s'appercoit que les bactéries sont marquées au
32P et que le 35S reste dans le milieu. L'ADN rentre dans les bactéries et non les protéines. Lorsque les
phages se développent et lysent les cellules, l'ADN marqué est relargué dans le milieu. Conclusion :
l'ADN assure la descendance.
L'ADN est donc responsable de l'information génétique.
* En 1940 Linus Pauling et Max Delbrüch proposent que la duplication des gènes implique la synthèse
de molécules complémentaires

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Cette hypothèse a été testée par Meselson et Stahl (1958)
Ils ont utilisé la technique de centrifugation isopycnique pour séparer des molécules en fonction de
leurs densité, pour séparer des molécules
denses, des molécules moins denses. En
cultivant E. coli en présence de 15N
(isotope lourd de l'azote), la totalité de
l'ADN incorpore du 15N qui est plus dense
que celui avec 14N. En conséquence,
l'ADN est lui même plus dense. En
centrifugation isopycnique sur gradient de
chlorure de césium, l’ADN migre jusqu'à
sa densité. On observe une bande, si on
charge un mélange de deux ADN,
provenant de bactéries cultivées en
présence de 15N et de 14N, on obtient deux
bandes.
Si on transfère les bactéries ayant poussé
sur 15N sur un milieu 14N, on obtient à la première génération de l'ADN qui migre à une position
intermédiaire.
A la deuxième génération on obtient deux bandes correspondant à la bande légère et à la bande
intermédiaire.
L'information génétique est donc contenue dans l'ADN et la réplication est semi-conservative. Il restait
alors à montrer comment une molécule peut se répliquer. Pour ce faire il fallait avoir une idée de la
structure de l'ADN.
* En 1930 des physicochimistes suedois démontrent que l'ADN est un polymère de 20 Å d'épaisseur.
* En 1951 Edwing Chargaff remarque que la composition en bases de l'ADN varie selon les espèces. De
plus il remarque que A = T et G=C (règle de Chargaff).
* En 1950 le physicien Maurice Wilkins obtient un cliché aux rayons X identique à celui d'un cristal :
l'ADN a donc une structure régulière
* Rosalind Franklin obtient par la suite un cliché en croix caractéristique d'une structure en forme
d'hélice. Mais le diamêtre de l'hélice (20Å était trop grand pour une seule chaine).
* En 1953 Francis Crick et James Watson construisent un modèle sur les données de Rosalind Franklin:
Ils en concluent que l'ADN est double brin:
c'est une hélice, ce qui est en accord avec les résultats de Maurice Wilkins et Rosalind Franklin, la régle
de chargaff est respectée, il y a possibilité de synthèse à partir d'une molécule complémentaire ce qui est
en accord avec l'hypothèse de Pauling et Delbrüch.
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1 : bactéries cultivées en présence de 14N
2 : bactéries cultivées en présence de 15N
3 : bactéries cultivées en présence de 15N et une génération en présence de 14N
4 : bactéries cultivées en présence de 15N et deux générations en présence de 14N

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conclusion : l'ADN est le support de l'hérédité. Explication de l'expérience de transformation de
Griffith et Avery
3) Initiation de la réplication
Chez les bactéries comme chez les mammifères, les fourches de réplication vont par paires et avancent
le plus souvent en direction opposée pour former ce que l’on appelle l'oeil de réplication. Le démarrage
de la réplication se situe au niveau d'une séquence appelé: origine de réplication.
Parmi les éléments importants dans la réplication, on peut considérer les éléments en cis, ceux qui sont
au niveau ou à proximité du site d’initiation et les éléments en trans qui viennent d’ailleurs dans le
génome. Chez E. coli, les éléments en cis sont représentés par une séquence de 250 bp qui est appelée
origine de réplication du chromosome ou ori C. Les éléments en trans sont des protéines qui se lient à
cette séquence. La première est la Dna A, 10-12 Dna A reconnaîssent une séquence sur l’origine de
réplication (Dna A box) et cette liaison ouvre partiellement les deux brins. Deux autres protéines Dna B
et Dna C, peuvent alors se lier sur l’origine, continuer à ouvrire les deux brins et permettre à une
primase d’initier la réplication en synthétisant un petit ARN qui servira d’amorce à une DNA
polymérase.
La réplication d’un plasmide utilise les éléments en trans produits par le chromosome. Comment
délimiter l’origine de réplication sur un plasmide ? on effectue des délétions progressives in vitro, puis
on transforme des bactéries. Si le plasmide se réplique c’est qu’on a toujours une origine de réplication
fonctionnelle, s'il ne se propage plus, on a éliminé une séquence importante dans la réplication. On
défini ainsi la séquence minimum pour que le plasmide se maintienne dans la bactérie.
Il faut associer un marqueur au plasmide pour différentier les bactéries transformées des non
transformées. On utilise un gène de résistance aux antibiotiques, si après transformation, les colonies
bactériennes se développent sur un milieu avec antibiotique, le gène de résistance est transcrit et traduit,
donc le plasmide s’est répliqué.
Comme les origines de réplication sont reconnue par des protéines d'initiation. Il y a donc une certaine
spécificité, par exemple, une origine de réplication de bactérie n'est pas reconnue par la protéine
d'initiation d'eucaryote. Donc si on introduit un plasmide bactérien dans une cellule eucaryote, il ne se
réplique pas et se perd lors des division cellulaires

réplication 4
Chez les eucaryotes, il doit exister des séquences spécifiques pour les origines de réplication. Elles ne
sont connues que chez la levure (Saccharomyces cerevisiae)
chez qui il existe des équivalent des plasmides bactériens. Les
origines de réplication sont appelées: séquences ARS
(Autonomous Replication Sequence) . Elles font 100 bp et
sont composées de copies de 11 nucléotides:
(A ou T)TTTAT(A ou G)TTT(A ou R)
Pour les mettre en évidence on suit le même principe que pour
les origines de réplication des plasmides. On utilise une levure
mutante par exemple incapable de synthétiser l'uracile. Cette
levure ne peut pas pousser sur un milieu dépourvu en uracile.
On transforme ces levures à l'aide d'un plasmide contenant le
gène manquant (URA3) chez le mutant et un morceau d'ADN
de la levure. Si la levure pousse on récupère le plasmide dans
E. coli et on regarde ce qu'il y a dans le morceau d'ADN de
levure, dans l'insertion. C'est un exemple de clonage par
complémentation.
Les unités de réplication
Ils existe une seule unité de réplication chez les bactéries et plusieurs unités de réplication chez les
eucaryotes. Chez les eucaryotes, s'il n'y avait qu'une seule origine de réplication par chromosome, huit
heures, la durée de la phase S, serait un temps trop court. En effet, la DNA polymérase eucaryote
polymérise 50 nucléotides à la seconde.
1 Chr = 150 x 106 bp (en moyenne) / 50 = 3 x 106 s = 800 heures
Il y a donc au moins une centaine origines de réplication, espacées de 30000 à 300000 pb.
Pour qu’il y ait synthèse d’ADN, comme la réplication est semi conservative, il faut tout d’abord
séparer les deux brins. Mais la double hélice est extrêmement stable, il faut la chauffer à une
température d’environ 90°C pour séparer les brins ce qui n’est pas possible sans altérer les autres
composant de la cellule. Lorsqu’on rencontre un tel problème, il y a une protéine. C’est l'ADN hélicase
qui se fixe sur l a protéine d'initiation. Les ADN hélicases ont besoin d’énergie pour séparer les deux
brins. Elles trouvent cette énergie en métabolisant de l’ATP, ce sont donc des ATPases. Elles se
déplacent le long de la chaîne d'ADN monocaténaire et déroulent la double hélice.
ARS
génome de levure fragmenté
Ura3
AmpR
ori
construction
tansformation d’une levure déficiente
en Ura3
ARS
Sélection du plasmide portant l’ARS

réplication 5
L’ADN se retrouve sous forme simple brin. Si sur le même brin, il y a des structures
autocomplémentaires, capables de
s’apparier (de s’hybrider), l’ADN va
former des structures doubles brins, des
structures en tige et boucle (hairpin
loop). Pour éviter ce problème, il y a des
protéines qui stabilisent l’ADN simple
brin qui sont appelées les SSB protéines
pour single-strand DNA-binding (SSB)
proteins ou protéines de déstabilisation
de l'hélice. Les SSB protéines ne
recouvrent pas les bases donc
n'empêchent pas le passage des DNA-
polymérases.
La synthèse d'ADN est due à une ADN polymérase, mais cette dernière a besoin d’une amorce. Ce
n'est pas le cas des ARN polymérase. Dans la transcription, l'ARN polymérase se fixe sur l'ADN sur un
site qui dans ce cas est appelé promoteur, elle ne nécessite pas d'amorce. Un moyen de fabriquer une
amorce est donc d’utiliser une RNA polymérase. De même dans la fourche de réplication, il existe une
ARN primase qui catalyse de courtes amorces d'ARN (primer en anglais = amorce). Cette amorce est
d’environ 10 nucléotides.
A ce niveau, tout est prêt pour synthétiser l’ADN. Cette synthèse est due à une DNA polymérase qui
catalyse le formation de liaisons entre le groupement OH en 3' du désoxyribose de l’amorce ou la
chaîne en élongation et le phosphate a fixé sur le carbone 5' du dNTP. Il y a libération d'un
pyrophosphate PPi qui est immédiatement hydrolysé (la polymérase ne peut donc pas désassembler et
reformer dNTP). La polymérisation est donc unidirectionnelle (sens 5' vers 3').
La polymérase doit donner lieu à une réplication très fidèle (une erreur pour 109 copies de paires de
base). Cette fidélité est assurer par le fait que la polymérisation nécessite une amorce. La polymérase ne
peut pas assembler des dNTP si le dernier nucléotide à l’extrémité 3'-OH n’est pas apparié. En cas
d’erreur, la polymérisation est bloquée, jusqu’à ce qu’une DNAse enlève le nucléotide non apparié.
Ces DNAses qui digèrent l’ADN à partir de l’extrémité sont appelées des exonucléases. Cette activité
exonucléase est portée par la polymérase, comme l’activité 3'5' exonucléase est plus faible que l’activité
polymérase, la polymérisation l’emporte si il n’y a pas d’erreur. Par contre si la polymérisation est
bloquée par une erreur, l’activité exonucléase l’emporte. C'est le premier mécanisme de correction
pendant la réplication
Cette action de correction explique le sens de la polymérisation de 5' vers 3'. L’énergie est donnée par
les nucléotides triphosphates, dans l’autres sens de 3’ vers 5’, l’énergie serait donnée par le dernier
nucléotide en 5’ de la chaîne en cours d’élongation. En cas d’erreur, l’excision du dernier nucléotide
incorporé libérerait un 5’ monophosphate, et il n’y aurait plus d’énergie disponible pour continuer la
polymérisation..
La polymérisation est très rapide (500 nucléotides/sec chez les bactéries - 50 nucl./s chez les
mammifères). Les eucaryotes n'ont pas à répliquer que leur ADN mais aussi à synthétiser les protéines
qui lui sont associées. Chez les eucaryotes, il y a aussi assemblage des protéines chromosomiques pour
former la chromatine ce qui explique pourquoi la fourche progresse à 50 nucléotides par seconde.
- SSB protéines
+ SSB protéines