(Microsoft PowerPoint - UE 2.1-Master_IADE_3bis [Mode de
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Approfondissement des connaissances en biologie moléculaire [email protected] Master IADE – Année 2013-2014 Plan du cours • Rappels de biologie moléculaire et de biologie cellulaire – Les molécules du vivant – Le support de l’information génétique et son décodage – L’organisation de la cellule animale • Les outils et les approches expérimentales utilisées par les chercheurs • Les mécanismes qui permettent aux cellules de communiquer entre elles Les outils et approches expérimentales utilisées par les chercheurs Master IADE – Année 2013-2014 Les outils et les approches expérimentales • Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules • Les cultures bactériennes • Clonage et manipulation de l’ADN dans des bactéries • Les cultures de cellules eucaryotes • Les techniques de biologie cellulaire • Souris transgéniques et souris porteuses de mutations génétiques ciblées Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules (1) • Lyse de cellules en absence ou en présence de détergents • Selon les cas : – Purification des organelles, des membranes et du cytosol par centrifugation – Fractionnement par chromatographie d’exclusion, chromatographie sur couche mince ou chromatographie en phase gazeuse – Purification des acides nucléiques par extraction phénol/chloroforme et précipitation en présence d’éthanol Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules (2) • Séparation et visualisation des protéines par électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide • Séparation et visualisation de fragments d’ADN par électrophorèse à travers un gel d’agarose • Détermination de la séquence nucléotidique d’un gène • Détermination de la séquence d’acides aminés d’une protéine Centrifugation Chromatographie d’exclusion Séparation de protéines par électrophorèse Séparation de fragments d’ADN par électrophorèse Les cultures de bactéries • Boites de Pétri, fioles de culture, pipettes • Milieux de culture liquides (tubes, Erlenmeyer) ou gélosés (Boites de Pétri) • Centrifugeuse • Microscope • Incubateur à 37°C Les cultures bactériennes Les plasmides bactériens • Molécules d'ADN surnuméraires et circulaires distinctes de l'ADN chromosomique • Non essentielle à la survie de cellule • Capables de réplication autonome • Peuvent contenir des gènes qui permettent à une bactérie d’être résistante à une antibiotique • Peuvent être modifiés par des Les plasmides bactériens • Molécules d'ADN surnuméraires et circulaires distinctes de l'ADN chromosomique • Non essentiels à la survie de cellule • Capables de réplication autonome • Peuvent contenir des gènes qui permettent à une bactérie d’être résistante à une antibiotique • Peuvent être modifiés par des techniques de recombinaison génétique in vitro • Peuvent être réintroduits dans des bactéries par transfection Le clonage d’un gène dans un plasmide Les principales enzymes utilisées pour modifier des plasmides • Enzymes des restriction : protéines qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée « site de restriction ». Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Il en existe plusieurs centaines qui reconnaissent chacune une séquence différente. • ADN ligase : protéine qui répare les brins cassés d'ADN et qui peut former des liaisons phospho-diester covalentes, et donc lier ou connecter des brins d'ADN entre eux. Exemples d’enzyme de restriction Exemple de ligation Les cultures de cellules eucaryotes • Boites de Petri, fioles de culture, pipettes • Milieu de culture (isotonique, pH neutre) – Acides aminés, glucose, vitamines, ions (chlorure de calcium, chlorure de magnesium,...) • • • • Hotte à flux laminaire Centrifugeuse Microscope Incubateur (37°C, CO2) Fibroblastes de souris en culture Cellules issues d’une tumeur cérébrale Lymphocytes de souris Neurones en culture Le dénombrement direct des cellules permet de déterminer un nombre absolu de cellules dans un volume déterminé. Ce type de numération est bien adapté aux cellules eucaryotes. Les méthodes d’analyse et de modification génétique des cellules eucaryotes (1) • Identification et quantification d’ARN messagers – Hybridation moléculaire avec une sonde spécifique (Northern) – Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des amorces spécifiques – Analyse globale du transcriptome par hybridation sur des puces à ADN • Identification et quantification des protéines exprimées – Immunofluorescence – Electrophorèse à travers un gel de polyacrylamide et détection de la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique – Analyse globale du protéome Réaction de polymérisation en chaîne Hybridation moléculaire Les méthodes d’analyse et de modification génétique des cellules eucaryotes (2) • Transfert de gènes – Transfection au phosphate de calcium – Electroporation – Lipofection – Infection avec un virus recombinant • Invalidation d’un gène par transfert d’ARN interférents Production de souris transgéniques par micro-injection dans un oocyte Production de souris transgéniques par micro-injection dans un oocyte Production de souris transgéniques par injection de cellules ES modifiées génétique dans un blastocyste
