DIB Wafaâ Mémoire de Magister Effet probiotique du lait fermenté

‫ﺟﺎﻣﻌﺔ وهﺮان اﻟﺴﺎﻧﻴﺔ‬
‫آﻠﻴﺔ اﻟﻌﻠﻮم‬
‫ﻗﺴﻢ اﻟﺒﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺎ‬
‫ﻣﺨﺒﺮ ﻓﺴﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺎ اﻟﺘﻐﺬﻳﺔ واﻷﻣﻦ اﻟﻐﺬاﺌي‬
Université d'Oran Es-Sénia
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Laboratoire de Physiologie de la
Nutrition et Sécurité Alimentaire
Mémoire de Magister
Spécialité: Biologie Animale
Option : Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire
Présenté Par
DIB Wafaâ
Effet probiotique du lait fermenté sur l’induction
de la tolérance orale à la β-lactoglobuline chez la
souris BALB/c
Soutenu le
Devant le Jury composé de:
Président
Rapporteur
KHEROUA Omar
CHEKROUN Abdallah
Examinateurs
SAIDI Djamel
BENSOLTANE Ahmed
Professeur, Université d’Oran
Maître de Conférences,
Université d’Oran
Professeur, Université d’Oran
Professeur, Université d’Oran
Je dédie ce travail à
mes chers parents ;
Symbole d’amour inconditionnel
Symbole de tous les sacrifices
mes chers frères et sœurs;
mes beaux frères et belle sœur;
mes chers neveux et nièces;
mes chers oncles et tantes;
mes cousins et cousines ;
mes chères amies.
Ce travail rentre dans le cadre d’un projet de recherche intitulé : "Fonction intestinal –
Nutrition - Alimentation". Agréé par le vice rectorat de la post-graduation de l’université
d’Oran. Il a été réalisé au laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire
sous la direction et le suivi du Dr Chekroun Abdallah, Maître de conférence de physiologie à
l’Université d’Oran qui a su me faire bénéficier de son expérience et de sa compétence. Je le
remercie pour la confiance qu'il m'a prodigué.
Un remerciement particulier à Mr Kheroua Omar, Professeur à l’Université d’Oran
pour avoir accepté de présider ce modeste travail et pour les conseil qu’il ma prodigués. Qu’il
trouve ici, mes sincères remerciements et toute mon estime.
Je remercie vivement Mr Saidi Djamel, Professeur à l’Université d’Oran. C’est avec
beaucoup de plaisir que je l’ai vu accepter d’être examinateur de ce modeste travail. Je lui
exprime mes sincères remerciements et toute mon estime.
Mes vifs et sincères remerciements vont à Mr Bensoltane Ahmed, Professeur à
l’université d’Oran pour avoir acceptés d’examiner ce modeste travail. Qu’il trouve ici,
l’expression de toute ma reconnaissance.
Je remercie également Mr Bensahla Ahmed et Mr Abi Ayad Sidi Mohamed El Amine,
Maîtres de conférence à l’université d’Oran pour leur accueil au laboratoire de Biologie
Marine où a été réalisé une partie de l’histologie.
Mille mercis à Dr Bensalah Farid, Mme Ben Abdallah Louiza, Mr Taleb Zohir,
enseignants au département de Biologie de l’université d’Oran.
Mes remerciements vont également à Dr Brahimi Mohamed et Dr Aimeur Omar,
Maîtres assistants au centre hospitalo-universitaire d’Oran.
Toute ma reconnaissance va à l’équipe de recherche et aux techniciennes de
Laboratoire de la Nutrition et Sécurité Alimentaire en particulier Boudine Nora, Benziane
Yamina, El Mecherfi Kamel eddine, Kaddouri Hanane, Mehidi Nabila, Boutiba Nawel,
Mezmaze Fatseh, Addou Samia, Benacriche Benmhel et la promotion de magister 2005.
Je tiens à remercier chaleureusement toutes mes amies de ma promotion : Belarbi
Hanane, Youcef Narimene, Haddi Soraya et Sidi Mahmoud Ghalia. Je leur exprime ma
profonde sympathie et leur souhaite une bonne continuation.
Mes remerciements vont également au personnel administratif de notre département
ainsi que tout les techniciens des laboratoires de biologie.
Les personnes que j’apprécie étant nombreuses, je ne pourrais les citer toutes, mais
elles savent que je leur suis très reconnaissante pour toutes les discussions professionnelles ou
personnelles et tous les moments qu’on a partagé ensemble.
Sommaire
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................................................... 3
1. Ecosystème gastro-intestinal................................................................................................. 3
1.1 Description générale ........................................................................................................ 3
1.2. La microflore intestinale.................................................................................................. 3
1.3 Les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale.................................... 5
1.4. Les organes lymphoïdes .................................................................................................. 7
1.5. Le système immunitaire de la muqueuse intestinale ....................................................... 7
2. La tolérance orale ................................................................................................................. 10
2.1. Définition de la tolérance orale ....................................................................................... 10
2.2. Mécanismes cellulaires de la tolérance orale .................................................................. 10
2.2.1 La délétion clonale ........................................................................................................ 11
2.2.2. L’anergie clonale .......................................................................................................... 11
2.2.3. L’immunosuppression active........................................................................................ 12
2.3. Interactions entre les différents mécanismes ................................................................... 13
3. Allergies et intolérances alimentaires ................................................................................. 14
3.1. Les allergies alimentaires ................................................................................................ 14
3.2. L’intolérance alimentaire................................................................................................. 15
3.2.1. Mécanismes impliqués ................................................................................................. 15
3.3. La β-lactoglobuline bovine (β-Lg) .................................................................................. 16
3.4. Stratégies de prévention des allergies aux protéines du lait de vache ............................ 19
3.4.1. Allaitement maternel et régime d’éviction des protéines du lait de vache................... 19
3.4.2. Hydrolyse des allergènes par des enzymes digestives.................................................. 20
3.4.3. Hydrolyse des allergènes par des enzymes bactériennes.............................................. 22
4. Les laits fermentés ................................................................................................................ 23
4.1. Les bactéries lactiques ..................................................................................................... 24
4.2. Les ferments à effet probiotiques .................................................................................... 25
4.2.1. Les bactéries probiotiques ............................................................................................ 26
4.2.1.1. Les bifidobactéries..................................................................................................... 27
4.3. Critères de sélection des souches probiotiques................................................................ 28
5. Les probiotiques et le système immunitaire ..................................................................... 30
5.1. Effet des probiotiques sur le système immunitaire.......................................................... 30
5.2. Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé .................................................. 30
5.3. Probiotiques et tolérance orale ....................................................................................... 33
5.4. Probiotiques et allergies .................................................................................................. 34
5.5. Mécanismes d’interaction entre les probiotiques et les cellules immunitaires.............. 35
MATERIELS & METHODES.................................................................................................. 38
1. Provenance des bactéries ...................................................................................................... 38
2. Lait .......................................................................................................................................... 38
2.1. Ecrémage ............................................................................................................................. 38
3. Caractérisation morphologique des bactéries...................................................................... 38
3.1. Purification des bactéries................................................................................................... 38
3.2. Etude microbiologique ...................................................................................................... 40
3.2.1. Caractérisation morphologique des bactéries ................................................................. 40
3.2.1.1. Identification morphologique ...................................................................................... 40
Sommaire
3.2.1.1.1 Etude macroscopique............................................................................................. 40
3.2.1.1.2. Etude microscopique ............................................................................................ 40
3.2.1.1.2.1. Coloration de Gram ........................................................................................... 40
3.2.2. Identification physiologique des bactéries ................................................................. 40
3.2.2.1. Recherche de l’enzyme catalase .............................................................................. 40
3.2.2.2. Recherche du type respiratoire et fermentaire......................................................... 41
3.2.2.3. Mobilité ou non des bactéries.................................................................................. 41
4. Préparation des ferments.................................................................................................... 41
4.1. Préparation de l’inoculum .............................................................................................. 41
4.2. Préparation des ferments ................................................................................................ 41
5. Protocoles de préparation des différents laits fermentés ................................................. 42
6. Caractérisation des cultures mixtes au cours de la fermentation du lait ....................... 42
6.1. Profil fermentaire des bactéries ...................................................................................... 42
6.1.1. Mesure de la production d’acide ................................................................................. 42
6.1.1.1. Principe de mesure ................................................................................................... 42
6.1.1.2. Procédure .................................................................................................................. 42
6.1.2. Mesure de la cinétique de variation du pH .................................................................. 44
7. Caractérisation biochimique des laits fermentés.............................................................. 44
7.1. Préparation des échantillons ........................................................................................... 44
7.1.1. Constitution des échantillons de laits fermentés.......................................................... 44
7.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries ............................................................ 44
7.2.1. Dosage des protéines totales........................................................................................ 44
7.2.1.1. Procédure .................................................................................................................. 44
8. Etude de l’antigénicité résiduelle des laits fermentés....................................................... 46
8.1. Model animale ................................................................................................................ 46
8.2. Adjuvants........................................................................................................................ 46
8.2.1. Hydroxyde d’aluminium ............................................................................................. 46
8.3. Immunisation des animaux à la β-Lg ............................................................................. 46
8.3.1. Répartition des lots ...................................................................................................... 46
8.3.2. Protocole d’immunisation ........................................................................................... 47
8.3.3. Prélèvements des échantillons sanguins ...................................................................... 49
9. Evaluation du degré de sensibilisation des animaux ....................................................... 49
9.1. Titrage des anticorps IgG sériques anti β-Lg par dosage immunoenzymatique ............ 49
9.1.1. Principe........................................................................................................................ 49
9.1.2. Mode opératoire........................................................................................................... 50
10. Etude histologique de l’intestin de souris sensibilisé par voie parentérale à la βLg ................................................................................................................................................. 50
10.1. La fixation .................................................................................................................... 52
10.2. Inclusion et coupe des tissus ........................................................................................ 52
10.2.1. Les procédés d’inclusion .......................................................................................... 52
10.2.2. Inclusion à la paraffine ............................................................................................. 53
10.2.2.2. Imprégnation par la paraffine ................................................................................ 53
10.2.3. Microtomisation et étalement des coupes................................................................. 54
10.3. Coloration .................................................................................................................... 54
10.3.1. Déparaffinage ........................................................................................................... 54
10.3.2. Réhydratation ........................................................................................................... 54
10.3.3. Technique de coloration ........................................................................................... 55
10.3.3.1. Coloration nucléaire .............................................................................................. 55
10.3.3.2. Coloration topographique générale ....................................................................... 55
10.3.4. Mesure des villosités .................................................................................................. 56
Sommaire
10.3.4.1. Principe de la mesure............................................................................................... 56
10.3.4.2. Calcul....................................................................................................................... 58
10.3.5. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux .................................................... 58
10.4. Analyse statistique......................................................................................................... 58
RESULTATS .............................................................................................................................. 59
1. Etude microbiologique ........................................................................................................... 59
1.1. Caractérisation morphologique des ferments .................................................................. 59
1.1.1. Aspect macroscopique et microscopique des bactéries................................................ 59
1.1.1.1. Les lactobacilles ........................................................................................................ 59
1.1.1.1.1. Lactobacillus acidophilus....................................................................................... 59
1.1.1.1.2. Lactobacillus plantarum......................................................................................... 59
1.1.1.2. Les bifidobactéries..................................................................................................... 59
2. Etude biochimique des laits fermentés ............................................................................. 63
2.1. Cinétique de production de l’acide par les associations de lactobacilles et
bifidobactéries .............................................................................................................................. 63
2.2. Cinétique de variations du pH au cours de la fermentation du lait par les
associations de lactobacilles et de bifdobactéries......................................................................... 63
2.3. Evaluation de la quantité de protéines totales dans les laits fermentés comparée à
celle du lait stérile......................................................................................................................... 66
2.3.1. Teneurs en protéines totales des laits fermentés par Lactobacillus
acidophilus (La) associé à des bifidobactéries ............................................................................. 66
3. Titrage des anticorps IgG sériques anti –β-Lg .................................................................. 68
3.1. Contrôle de l’immunisation chez les souris sacrifiées au 28ème jours ............................. 68
3.2. Contrôle de l’immunisation chez les souris sacrifiées au 50ème jour............................... 70
3.3. Etude comparative de l’induction de la tolérance orale à la β-Lg................................... 70
4. Etude histologique de l’intestin des souris immunisées comparé au témoin .................. 73
4.1. Effet de la sensibilisation et du gavage sur la structure intestinale des souris
sacrifiées au 28ème jour ................................................................................................................. 73
4.1.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris témoins au faible
grossissement (Gx10) ................................................................................................................... 73
4.1.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris témoins au fort grossissement
(Gx40)........................................................................................................................................... 73
4.1.3. Aspect des muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une
solution saline et immunisées à la β-Lg ....................................................................................... 77
4.1.4. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF1 ........................................................................................................................................ 77
4.1.5. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF2 ......................................................................................................................................... 77
4.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris gavées avec une solution saline puis
immunisées à la β-Lg et sacrifiées au 50ème jour.......................................................................... 81
4.2.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF1 ......................................................................................................................................... 81
4.2.2. Aspect des muqueuses et des villosités intestinales des souris immunisées à la βLg et gavées au lait LF2 ............................................................................................................... 81
4.2.3. Etude comparative de la hauteur des villosités des souris sacrifiées au 28ème jour
et des souris sacrifiées au 50ème jour............................................................................................. 88
5. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) ................................................ 90
Sommaire
5.1. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au
28ème jour ...................................................................................................................................... 90
5.2. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au
50ème jour ...................................................................................................................................... 90
DISCUSSION.............................................................................................................................. 92
1. Evaluation de l’activité protéolytique des bactéries au cours de la fermentation ......... 93
2. Evaluation de la sensibilisation des souris à la β-Lg par voie parentérale...................... 94
3. Aspect histologique des muqueuses intestinales en réponse à l’immunisation à la
β-Lg, à la colonisation de l’intestin et au gavage par un lait fermenté par des
probiotiques................................................................................................................................. 96
CONCLUSION ........................................................................................................................... 99
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................. 100
Abréviations
Abréviations
ADN
: Acide DésoxyriboNucléique.
APLV
: Allergie au protéines du lait de vache.
β-Lg
: bêta lactoglobuline.
BB
: Bifidobacterium bifidum.
BL
: Bifidobacteruim longum.
°C
: degré celsus.
CMH
: Complexe Majeur d’Histocompatibilité.
CPA
: Cellule Présentatrice d’Anticorps.
D°
: degré dornic.
Eh
: potentiel d’oxydo-réduction.
ELISA
: Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
GALT
: Gut Associated lymphoid Tissue
Gx
: Grossissement.
: Peroxyde d’hydrogène.
H2O2
Ig
: Immunoglobuline.
IgA
: Immunoglobuline de type A.
IgE
: Immunoglobuline de type E.
IgG
: Immunoglobuline de type G.
IgM
: Immunoglobuline de type M.
IL
: Interleukine.
INF-γ
: Interferon gamma.
IPLV
: Intolérance aux protéines du lait de vache.
KDa
: kilodalton.
La
: Lactobacillus acidophilus.
Lb pl
: Lactobacillus plantarum.
LF1
: Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2
: Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LIE
: Lymphocytes intra-épithéliaux.
LPS
: Lypopolysaccharide.
min
: minute.
MRS
: Man Regosa Scharpe.
NaOH
: hydroxyde de sodium.
NK
: Natural Killer (cellule tueuse).
O2
: Oxygène.
OPD
: Orthophénylène diamine.
PBS
: tampon phosphate salin.
pH
: potential d’oxygène.
PLV
: Protéines du lait de vache.
PM
: poids moléculaire.
SAB
: serum albumine bovine.
TGF-β
: transforming growth factor.
Th
: cellule T helper.
Th 1
: Lymphocyte T helper 1.
Th 2
: Lymphocyte T helper 2.
TLR
: toll like receptor.
TNF-α : tumor necrosis factor α.
Trl
: cellule T régulatrice.
Trs
: tours.
Abréviations
UFC
V
: Unité Formant Colonie.
: volume.
Liste des figures
Liste des figures
1. Schéma simplifié décrivant les compartiments de l’appareil digestif de l’homme et leurs
microflores.................................................................................................................................... 4
2. Description schématique générale du système immunitaire associé à la muqueuse
intestinale...................................................................................................................................... 9
3. Position des acides aminés substitués dans les variants A et B de la β-Lg .............................. 18
4. Propriétés et critères de sélection des probiotiques .................................................................. 29
5. Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques.................................................... 32
6. Schéma illustrant l’interaction entre les composants bactériens (Lactobacillus grasseri)
et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor ....................................................................... 36
7. Différentes étapes de préparation des échantillons de lait de vache......................................... 43
8. Protocole de sensibilisation et de gavage des souris ................................................................ 48
9. Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La, sur milieu MRS
acidifié, après coloration de Gram................................................................................................ 60
10. Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La pl, sur milieu MRS,
après coloration de Gram.............................................................................................................. 60
11. Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BB, sur milieu MRS
cystéiné, après coloration de Gram............................................................................................... 61
12. Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BL, sur milieu MRS
cystéiné, après coloration de Gram............................................................................................... 61
13. Cénitique de production de l’acide au cours de la fermentation du lait de vache à 45°C
(LF1, ♦; LF2, ■ ; LS, ▲) ............................................................................................................. 64
14. Cinétique de variations du pH au cours de la fermentation de lait de vache à 45°C
(LF1, ♦ ; LF2, ■ ; LS, ▲) .............................................................................................................. 65
15. Teneur en protéines totales (µg/mg) dans les laits (LF1, ♦ ; LF2, ■ ; LS, ▲) au cours de
la fermentation à 45 °C................................................................................................................. 67
16. Titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez les souris sensibilisées à la βLg (n=5) par voie sous cutanée et chez les souris témoins (n=5) sacrifiées au 28ème jour........... 69
Liste des figures
17. Titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez des souris sacrifiées au 50ème
jour et sensibilisées à la β-Lg (n=5) par voie sous cutanée comparés à celui des souris non
sensibilisées (n=5) (témoins négatif)............................................................................................ 71
18. Comparaison des titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez des souris
gavées puis sensibilisées à la β-Lg par voie sous cutanée, sacrifiées au 28ème jour et au
50ème jour ...................................................................................................................................... 72
19. Effet du gavage et de la sensibilisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités des
fragments de jejunum des souris sacrifiées au 28ème jour comparé aux souris non
sensibilisée (n=5) (témoin négatif)............................................................................................... 75
20. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin ........................................................................................................... 76
21. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée avec une solution saline et immunisée à la β-Lg et sacrifiée au
28ème jour ( témoin positif) ........................................................................................................... 76
22. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème jour ............... 78
23. Observation microscopique(Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème jour ............... 78
24. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin ........................................................................................................... 79
25. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée avec une solution saline et immunisée à la β-Lg et sacrifiée au
28ème jour (témoin positif) ............................................................................................................ 79
26. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème jour ............... 80
27. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème jour ............... 80
28. Effet du gavage et de la sensibilisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités de
fragments de jejunum des souris sacrifiées au 50ème jour comparé au souris non sensibilisés
(témoin) ........................................................................................................................................ 83
29. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin ........................................................................................................... 84
30. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin positif, sacrifiée au 50ème jour.......................................................... 84
31. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème jour ............... 85
Liste des figures
32. Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème jour ............... 85
33. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin ........................................................................................................... 86
34. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris témoin positif, sacrifiée au 50ème jour........................................................... 86
35. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF1, immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème jour .................. 87
36. Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à l’hémalunéosine d’une souris gavée au LF2,immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème jour ................... 87
37. Evaluation de l’effet de l’immunisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités de
fragments de jéjunum entre les groupes sacrifiés au 28ème jour et les groupes sacrifiés au
50ème jour ..................................................................................................................................... 89
Liste des tableaux
Liste des tableaux
1. Les principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la microflore
intestinale...................................................................................................................................... 6
2. Principaux effets des probiotiques sur la réponse immunitaire................................................ 31
3. Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) ............................................. 39
4. Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales................................ 45
5. Composition du tampon phosphate salin PBS, 1 M, pH=7,4 .................................................. 51
6. Composition des solutions tampons d’ELISA ......................................................................... 51
7. Composition du colorant à l’hématoxyline de Harris............................................................... 57
8. Résultats des différents aspects macroscopiques et microscopiques des souches étudiées ..... 62
9. Effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités intestinales des souris
(J28) ............................................................................................................................................... 74
10. Effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités intestinales des souris
(J50) ............................................................................................................................................... 82
Résumé
Les protéines et leurs fragments allergéniques (en particulier la β-Lg du lait de vache)
peuvent provoquer par des réactions cellulaires complexes, la production d’anticorps
spécifiques de la classe des IgE et des IgG et la stimulation de lymphocytes cytotoxiques,
responsables de phénomènes d’allergie et d’hypersensibilité.
L’objectif visé est d’induire une tolérance orale chez des animaux de laboratoire
(souris BALB/c) par une colonisation de l’intestin par une bactérie probiotique suivie d’un
gavage avec des laits fermentés par l’association de différentes bactéries lactiques et
bifidobactéries.
Deux laits fermentés ont été préparés par des bactéries, sélectionnées pour leur forte
activité protéolytique :
• Un premier lait est fermenté par l’association de Lactobacillus acidophillus+
Bifidobacterium longum (LF1),
• Un second lait est fermenté par l’association bactérienne Lactobacillus acidophillus+
Bifidobacterium bifidum (LF2). Les deux laits fermentés sont mis à incuber à 45°C
pendant 4 heures. Au temps t0, t30, t60, t90, t120,t150, t180, t210 et t240 de la fermentation,
des prises aliquotes sont effectuées pour mesurer les paramètres suivants :
• La quantité d’acidité titrable produite, le pH et la quantité des protéines totales.
• La production d’anticorps (IgG) anti-β-Lg obtenus chez des souris sensibilisées à la βLg par voie sous cutanée.
• Evaluation de la hauteur des villosités et le nombre des lymphocytes intra- épithéliaux.
Les résultats obtenus ont été les suivants :
Le taux d’acidité produite est significativement élevé (p≤ 0,001) dans les deux laits fermentés,
(36 ± 0,63°D) pour LF1 et (34,8 ± 0,37 D°) pour LF2 comparé au lait stérile (18,4 ± 0,24 D°) ;
ceci se traduit par une baisse significative de pH, (5,32 ± 0,09 ; 5,92 ± 0,1) respectivement
pour le lait LF1 et LF2, par rapport au lait stérile (6,62 ± 0,06) (p ≤ 0,001). Le dosage des
protéines totales montre que c’est l’association (La + BL) qui donne le meilleur profil
protéolytique (215,89± 5,68µg/mg) (p≤0,001) par rapport au témoin (301,86 ± 3,19 µg/mg)
et au lait LF2 (La + BB) (242,44 ± 6,34µg/mg) (p≤0,001).
Les titres en IgG sériques anti-β-Lg sont significativement diminués chez les souris gavées
au lait LF1 (1/280ème), (1/640ème) chez le groupe gavé au lait LF2 par rapport au groupe témoin
positif (1/64000ème)(p ≤ 0,001).
L’étude histologique de la muqueuse intestinale montre que l’induction de la tolérance orale
à la β-Lg est évidente chez les souris ayant subit une colonisation avec Lactobacillus
plantarum suivit d’un gavage au lait LF1, ceci est prouvé par des villosités intestinales
longues (54,01 ± 1,1 µm) avec un aspect fin et une infiltration des lymphocytes intraépithéliaux peu marquée.Le groupe témoin positif présente une atrophie partielle des villosités
avec un décollement du chorion de l’épithélium, des pseudostratifications et une infiltration
dense des lymphocytes intra-épithéliaux ; tous ces paramètre sont significativement différents
par rapport aux autres groupes de l’étude (p ≤ 0,001).
En conclusion, les résultats présentés dans ce travail confirment que les probiotiques et plus
précisément les bifidobactéries jouent un rôle crucial dans la prévention des allergies
alimentaires, via l’induction de la tolérance orale.
Mots clés : Tolérance orale, β−lactoglobuline, Allergénicité, Probiotique, Bifidobactéries,
Bactérie lactique, Lait de vache.
Abstract
Protein and their allergic fragments (specially the β-Lg of cow milk are able to induct by
some complex cellular reaction, the production of IgE and IgG specific antibodies and
cytotoxic lymphocytes stimulation which are responsible of allergic phenomena and
hypersensitivity.
The aim of this work is to induce an oral tolerance in laboratory animals (BALB/c mice) by
colonizing the intestine by proteolytic bacteria followed by the mice gorging with milks
fermented by of the association of lactic bacteria and bifidobacteria.
Both two fermented milks by selected bacteria; for their strong proteolytic activity:
• The first milk was fermented by Lactobacillus acidiphilus + Bifidobacterium longum
(LF1).
• The second milk was fermented by Lactobacillus acidiphilus + Bifidobacterium
bifidum (LF2). Both fermented milks were incubated at 45°C for 4 hours.
At the time t0, t30, t60, t90, t120, t150, t180, t210and t240 of fermentation, aliquot samples had been
taking of in order to measure the following parameters:
• The quantity of acid production, the pH and the quantity of total proteins.
• The production of antiβ-Lg antibodies obtained in sensitized mice by the β-Lg by
cutanous way.
• The estimation of the villosities and the high number of intra-epithelial lymphocytes.
The obtained results were as followed:
The acidity level is significantly increased (p≤ 0,001) by both fermented milks, (36 ± 0,63°D)
for LF1 and (34,8 ± 0,37 D°) for LF2 compared to the germ-free milk(18,4 ± 0,24 D°); which
results in a significant decrease of the pH (5,32 ± 0,09 ; 5,92 ± 0,1) respectively for LF1 and
LF2 milks, compared to germ-free milk (6,62 ± 0,06) (p ≤ 0,001). The dosage of total proteins
show that it’s the association of (La + BL) which gives the best proteolytic activity (215,89±
5,68µg/mg) (p ≤ 0,001) compared with the control(301,86 ± 3,19 µg/mg) and the LF2 milk
(La + BB) (242,44 ± 6,34µg/mg) (p≤0,001).
The concentration of anti-β-Lg sera IgG are significantly decreased in the gorged mice with
LF1 milk (1/280th), (1/640th) in the group gorged with LF2 milk compared with the positive
control group(1/64000th)(p ≤ 0,001).
The histological study of intestinal mucus showed that induction of oral tolerance with
β-Lg is evident in the mice colonized by Lactobacillus plantarum followed by gorging with
LF1 milk which is proved the intestinal villosities length (54,01 ± 1,1 µm) with this aspect and
an infiltration of intraepithelial lymphocytes was less obvious. The positive control group
showed partial atrophy of the villosities and a detachment of the epithelium chorion,
pseudostratifications and dense infiltration by intra-epithelial lymphocytes; all these
parameters were significantly different comparing to the other studies groups (p ≤ 0,001).
In conclusion, the results presented in this work confirm that the probiotics and more
specially the bifidobacteria have a crucial role in the prevention of food allergies, by inducing
an oral tolerance.
Key words: Oral tolerance, β-lactoglobuline, Allergenecity, Probiotic, Bifidobacteria, Lactic
bacteria, Cow milk.
‫ﻣﻠﺨـﺺ‬
‫إن اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت و ﺟﺰﻳﺌﺎﺗﻬﺎ اﻟﻤﺴﺆوﻟﺔ ﻋﻠ ﻰ اﻟﺤ ﺴﺎﺳﻴﺔ )ﺑﺎﻟﺨ ﺼﻮص ‪ β-Lg‬ﻟﺤﻠﻴ ﺐ اﻟﺒﻘ ﺮ( ﺗﺤ ﺖ ﻋﻠ ﻰ ردود ﻓﻌ ﻞ‬
‫ﺧﻠﻮﻳﺔ ﻣﻌﻘﺪة‪ ،‬إﻧﺘﺎج أﺟﺴﺎم ﻣﻀﺎدة ﺧﺎﺻﺔ ﻣﻦ ﺻﻨﻒ ‪ IgE‬و ‪ IgG‬و إﺛﺎرة ﺳﻤﻴﺔ اﻟﺨﻼﻳﺎ اﻟﻠﻤﻔﺎوﻳﺔ‪ ،‬اﻟﻤﺴﺆوﻟﺔ ﻋﻠﻰ ﻇﺎهﺮة‬
‫اﻟﺤﺴﺎﺳﻴﺔ و اﻟﺤﺴﺎﺳﻴﺔ اﻟﻤﻔﺮﻃﺔ‪.‬‬
‫اﻟﻬﺪف ﻣﻦ هﺬا اﻟﻌﻤﻞ هﻮ ﺧﻠﻖ ﻗﺒﻮل ﻏﺬاﺋﻲ ﻟﺪى ﻓﺌﺮان اﻟﻤﺨﺒﺮ )ﻓ ﺄر ‪ ( Balb/c‬ﻋ ﻦ ﻃﺮﻳ ﻖ اﻟ ﺰرع ﻓ ﻲ اﻷﻣﻌ ﺎء‬
‫ﺑﺒﻜﺘﻴﺮﻳﺎ ﺑﺮوﺑﻴﻮﺗﻴﻚ ذات ﻓﺎﺋﺪة ﻣﺘﺒﻮﻋﺔ ﺑﺸﺮب ﺣﻠﻴﺐ ﻣﺨﻤﺮ ﺑﺄﻧﻮاع ﻣﻦ ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎت اﻟﺤﻠﻴﺐ و ﺑﻔﻴﺪوﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ‪.‬‬
‫ﺣﻀّﺮﻧﺎ ﻧﻮﻋﻴﻦ ﻣﻦ اﻟﺤﻠﻴﺐ اﻟﻤﺨﻤﺮ‪ ،‬أﺧﺘﻴﺮوا ﻧﺴﺒﺔ ﻟﻘﺪرﺗﻬﻢ اﻟﻘﻮﻳﺔ ﻋﻠﻰ اﻟﺘﺤﻠﻞ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﻲ‪.‬‬
‫• اﻟﺤﻠﻴﺐ اﻟﻤﺨﻤﺮ اﻷول‪ ،‬ﺧﻤّﺮ ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺔ‪:‬‬
‫‪(LF1) Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum‬‬
‫• اﻟﺤﻠﻴﺐ اﻟﻤﺨﻤﺮ اﻟﺜﺎﻧﻲ‪ ،‬ﺧﻤّﺮ ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺔ‪:‬‬
‫‪(LF2) Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum‬‬
‫ﺣ ﻀّﻦ اﻟﺤﻠﻴﺒ ﺎن ﺗﺤ ﺖ درﺟ ﺔ ﺣ ﺮارة ‪°45‬م ﻟﻤ ﺪة أرﺑ ﻊ )‪ (4‬ﺳ ﺎﻋﺎت ﻓ ﻲ اﻟ ﺰﻣﻦ‪ :‬ز‪ ،0‬ز‪ ،30‬ز‪ ،60‬ز‪ ،90‬ز‪،120‬‬
‫ز‪ ،150‬ز‪ ،180‬ز‪ ،210‬ز‪ 240‬ﻣﻦ اﻟﺘﺤﻀﻴﻦ‪ ،‬أﺧﺬﻧﺎ ﻋﺪة ﻋﻴﻨﺎت و ذﻟﻚ ﺑﻬﺪف ﻗﻴﺎس اﻟﻤﻌﺎﻳﻴﺮ اﻟﺘﺎﻟﻴﺔ‪:‬‬
‫• آﻤﻴﺔ اﻟﺤﻤﻮﺿﺔ اﻟﻨﺎﺗﺠﺔ‪ ،‬اﻟـ ‪ pH‬و آﻤﻴﺔ اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨﺎت اﻟﻜﻠﻴﺔ‪.‬‬
‫• آﻤﻴﺔ ﻣﻮﻟﺪات اﻟﻀﺪ ) ‪ ( IgG‬ﺿﺪ ﺑﻴﺘﺎﻟﻜﺘﻮﻏﻠﻮﺑﻴﻦ ﻟﺪى اﻟﻔﺌﺮان اﻟﻤﺤﺴﺴﺔ ﻟـ ‪ β-Lg‬ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﺤﻘﻦ ﺗﺤﺖ اﻟﺠﻠﺪ‪.‬‬
‫• ﺗﻘﺪﻳﺮ إرﺗﻔﺎع اﻟﺰﻏﺒﺎت اﻟﻤﻌﻮﻳﺔ و ﻋﺪد اﻟﺨﻼﻳﺎ اﻟﻤﻨﺎﻋﻴﺔ ‪.LIE‬‬
‫اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ اﻟﻤﺘﺤﺼﻞ ﻋﻠﻴﻬﺎ هﻲ آﺎﻟﺘﺎﻟﻲ‪:‬‬
‫إرﺗﻔﺎع هﺎم ﻓﻲ ﻧ ﺴﺒﺔ اﻟﺤﻤﻮﺿ ﺔ اﻟﻨﺎﺗﺠ ﺔ )‪ (p≤ 0,001‬ﻓ ﻲ اﻟﺤﻠﻴﺒ ﺎن اﻟﻤﺨﻤ ﺮان )‪ (°D 0,63 ± 36‬ﺑﺎﻟﻨ ﺴﺒﺔ ﻟ ـ‬
‫‪ LF1‬و )‪ (°D 0,37 ±34‬ﺑﺎﻟﻨﺴﺒﺔ ﻟ ـ ‪ LF2‬و ه ﺬا ﻣﻘﺎرﻧ ﺔ ﺑﺎﻟﺤﻠﻴ ﺐ اﻟﻤﻌﻘ ﻢ )‪(°D 0,24 ±18,4‬؛ و ﻳﻨ ﺘﺞ ﻋ ﻦ ه ﺬا اﻷﺧﻴ ﺮ‬
‫إﻧﺨﻔ ﺎض ه ﺎم ﻓ ﻲ اﻟ ـ ‪0,09±5,32) ، pH‬؛ ‪ (0,1±5,92‬ﻋﻠ ﻰ اﻟﺘ ﻮاﻟﻲ ﻟﻠﺤﻠﻴ ﺐ ‪ LF1‬و ‪ LF2‬ﻣﻘﺎرﻧ ﺔ ﺑﺎﻟﺤﻠﻴ ﺐ اﻟﻤﻌﻘ ﻢ‬
‫)‪ ،(p≤ 0,001) (0,06±6,62‬ﺗﺒﻴﻦ ﻣﻦ ﻗﻴﺎس اﻟﺒﺮوﺗﻴﻨ ﺎت اﻟﻜﻠﻴ ﺔ أن اﻟﻤﺠﻤﻮﻋ ﺔ )‪ (La+BL‬ﻟ ﺪﻳﻬﺎ أﺣ ﺴﻦ ﺗﺤﻠ ﻞ ﺑﺮوﺗﻴﻨ ﻲ‬
‫)‪ 5,68±215,89‬ﻣﻴﻜﺮوﻏ ﺮام‪/‬ﻣﻠ ﻎ( )‪ (p≤ 0,001‬ﻣﻘﺎرﻧ ﺔ ﺑﺎﻟ ﺸﺎهﺪ )‪ 3,19±301,86‬ﻣﻴﻜﺮوﻏ ﺮام‪/‬ﻣﻠ ﻎ( و ‪LF2‬‬
‫)‪ 6,34±242,44) (La+BB‬ﻣﻴﻜﺮوﻏﺮام‪/‬ﻣﻠﻎ ( )‪.( p≤ 0,001‬‬
‫إﻧﺨﻔﺎض هﺎم ﻓﻲ اﻷﺟﺴﺎم اﻟﻤﻀﺎدة اﻟﻤﺼﻠﻴﺔ ‪ IgG‬ﺿﺪ ‪ β-Lg‬ﻟﺪى اﻟﻔﺌﺮان اﻟﻠﻮاﺗﻲ ﺷﺮﺑﻦ اﻟﺤﻠﻴ ﺐ اﻟﻤﺨﻤ ﺮ ‪LF1‬‬
‫)‪ (1/640ème) ،(1/280ème‬ﻟ ﺪى اﻟﻔﺌ ﺮان اﻟﻠ ﻮاﺗﻲ ﺷ ﺮﺑﻦ اﻟﺤﻠﻴ ﺐ اﻟﻤﺨﻤ ﺮ ‪ LF2‬ﻣﻘﺎرﻧ ﺔ ﺑﺎﻟﻤﺠﻤﻮﻋ ﺔ اﻟ ﺸﺎهﺪة اﻟﻤﺤﻘﻨ ﺔ‬
‫)‪ (p≤ 0,001) (1/64000ème‬ﺑﻴﻨﺖ اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﻬﻴﺴﺘﻮﻟﻮﺟﻴﺔ ﻟﻤﻘﻄﻊ اﻹﺛﻨﺎ ﻋﺸﺮ أن ﺧﻠ ﻖ ﻗﺒ ﻮل ﻏ ﺬاﺋﻲ آ ﺎن واﺿ ﺤﺎ ﻟ ـ ‪β-‬‬
‫‪ Lg‬ﻟﺪى اﻟﻔﺌﺮان اﻟﻠﻮاﺗﻲ زرﻋﻦ ﺑـ ‪ Lactobacillus plantarum‬ﻣﺘﺒﻮﻋﺔ ﺑﺸﺮب ‪ ،LF1‬و ﻗﺪ ﺑﺮهﻦ هﺬا اﻷﺧﻴ ﺮ ﺑﻮﺟ ﻮد‬
‫زﻏﺒ ﺎت ﻣﻌﻮﻳ ﺔ ﻃﻮﻳﻠ ﺔ )‪ 1,1±45,01‬ﻣﻴﻜﺮوﻣﺘ ﺮ( ﺑﻤﻈﻬ ﺮ ﻃﺒﻴﻌ ﻲ و ﻋ ﺪد ﻗﻠﻴ ﻞ ﻣ ﻦ اﻟﺨﻼﻳ ﺎ اﻟﻠﻤﻔﺎوﻳ ﺔ ‪ .LIE‬اﻟﻤﺠﻤﻮﻋ ﺔ‬
‫اﻟﺸﺎهﺪة اﻟﻤﺤﻘﻨﺔ ﺗﺘﻤﻴﺰ ﺑﻈﻬﻮر ﻧﻘﺺ ﻓﻲ إرﺗﻔ ﺎع اﻟﺰﻏﺒ ﺎت اﻟﻤﻌﻮﻳ ﺔ ﻣ ﻊ إﻧﻔ ﺼﺎل اﻟﻨ ﺴﻴﺞ اﻟﻤﻌ ﻮي )‪ (chorion‬ﻋ ﻦ اﻟﺨﻼﻳ ﺎ‬
‫اﻟﻄﻼﺋﻴﺔ ﻣﻊ ﻇﻬﻮر ﺷﺒﻪ ﺗﺨﻄﻴﻂ و إرﺗﻔﺎع آﺒﻴﺮ ﻓ ﻲ ﻋ ﺪد اﻟﺨﻼﻳ ﺎ اﻟﻤﻨﺎﻋﻴ ﺔ ﻣ ﻦ ﻧ ﻮع ‪ ، LIE‬آ ﻞ ه ﺬﻩ اﻟﻤﻌ ﺎﻳﻴﺮ ﺗﺨﺘﻠ ﻒ ﻋ ﻦ‬
‫اﻟﻤﺠﻤﻮﻋﺎت اﻷﺧﺮى ﺑﺼﻔﺔ هﺎﻣﺔ ﺟﺪا )‪.(p≤ 0,001‬‬
‫ﺧﻼﺻﺔ اﻟﻘﻮل‪ ،‬ﻧﺘﺎﺋﺞ هﺬا اﻟﻌﻤﻞ ﺗﺆآ ﺪ أن ﺑﻜﺘﻴﺮﻳ ﺎت ﺑﺮوﺑﻴﻮﺗﻴ ﻚ و ﺑﻮﺟ ﻪ اﻟﺨ ﺼﻮص اﻟﺒﻴﻔﻴ ﺪوﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ ﺗﻠﻌ ﺐ دورا‬
‫هﺎﻣﺎ ﻓﻲ ﺗﺠﻨﺐ اﻟﺤﺴﺎﺳﻴﺔ اﻟﻐﺬاﺋﻴﺔ‪ ،‬و ذﻟﻚ ﺑﺨﻠﻖ ﻗﺒﻮل ﻏﺬاﺋﻲ‪.‬‬
‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ‪ :‬ﻗﺒﻮل ﻏﺬاﺋﻲ‪ ،‬ﺑﻴﺘﺎﻟﻜﺘﻮﻏﻠﻮﺑﻴﻠﻴﻦ‪ ،‬ﺣﺴﺎﺳﻴﺔ‪ ،‬ﺑﺮوﺑﻴﻮﺗﻴﻚ‪ ،‬ﺑﻴﻔﻴﺪوﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ‪ ،‬ﺑﻜﺘﻴﺮﻳﺎ ﻟﺒﻨﻴﺔ‪ ،‬ﺣﻠﻴﺐ اﻟﺒﻘﺮة‪.‬‬
Introduction
L’allergie alimentaire, dont la fréquence est en constante augmentation (4,6%de la
population pédiatrique générale d’après Rancé et al.2005 ; Deschildre et al., 2006)
constitue un problème de santé publique. L’allergie au protéine du lait de vache est classée
la première allergie alimentaire chez le nourrisson et l’allergène le plus incriminé est la βlactoglobuline (protéine de lactosérum bovin).
Les investigations récentes ont mis en évidence le rôle crucial que joue la
microflore intestinale dans le maintien et l’amélioration de la santé. Certains de ces travaux
ont montré que les animaux conventionnels pourvus d’une microflore intestinale complète
sont plus résistants aux infections que les animaux axéniques dépourvus de microflore
(Perdigon et al., 2001; Lima-Filho et al., 2004). En outre, certains travaux de recherche ont
suggéré que la flore intestinale pourrait être un facteur indispensable pour rétablir
l'équilibre entre les cellules immunitaires Th1 et Th2 qui jouent un rôle pivot dans le
processus d’immunomodulation.
Récemment, Asahara et al., 2004, ont démontré que la consommation de produits
alimentaires enrichis en probiotiques produit plusieurs effets favorables sur l’organisme
tels que l’amélioration des mécanismes de la réponse immunitaire, le rétablissement de
l’équilibre microbien dans le colon, le traitement de certaines infections intestinales et urogénitales, la réduction des risques d’allergie, de cancer et d’ulcère.
Les microorganismes à effets probiotique sélectionnés en alimentation humaine
sont représentés essentiellement par les bactéries lactiques, particulièrement celles
appartenant au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Saito, 2004). Aujourd’hui, ces
deux genres bactériens sont largement utilisés dans la fabrication de produits laitiers
fermentés.
La tolérance orale est une réponse immunitaire menant à un état de faible réponse
immunologique vis-à-vis d’un antigène ingéré (Niggemann et al., 2006) . Trois
mécanismes principaux sont à l’origine de la tolérance orale : la délétion clonale, l’anergie
clonale et la suppression active. La suppression active se caractérise par l’inhibition de
l’activité des lymphocytes T, spécifiques ou non de l’antigène, sous l’action des cytokines
suppressives IL-10 et TGF-β. L’anergie clonale se caractérise par l’arrêt de la prolifération
des lymphocytes T spécifiques, alors que la délétion clonale correspond à un état de
destruction sélective des lymphocytes T spécifiques. De nombreux facteurs influencent
l’induction de la tolérance orale ; la dose et la fréquence d’administration de l’antigène,
l’âge de l’hôte et l’état de sa microflore intestinale sont des exemples.
1
Introduction
Le présent travail a pour objectif principal d’étudier l’induction de la tolérance
orale chez des souris femelles conventionnelles de race BALB/c, in vivo, par une
colonisation de l’intestin par Lactobacillus plantarum pendant 18 jours, suivie d’un gavage
par deux laits fermentés par des bifidobactéries et des lactobacilles. Il vise à élucider
certain mécanisme d’action par lesquels les probiotiques stimulent le phénomène
immunitaire. Deux modes d’action sont proposés :
Le premier mode d’action est que les bactéries probiotiques stimulent l’induction
de la tolérance orale en dégradant la β- lactoglobuline.
Le deuxième mode d’action est que les bactéries probiotiques stimulent l’induction
de la tolérance orale en inhibant la prolifération lymphocytaire.
2
Rappels bibliographiques
1. Ecosystème gastro-intestinal :
1.1 Description générale :
Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux microorganismes
exogènes. De par sa surface totale (muqueuse) estimée à 200-300 m2, il représente la plus
grande surface du corps en contact avec l’environnement (Holzapfel et al., 1998).
L’écosystème gastro-intestinal est généré par une alliance stable entre l’épithélium gastrointestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne. Si l’un des trois
composants de l’écosystème est défaillant, l’alliance est altérée et par conséquent diverses
pathologies s’y installent (McCracken & Lorenz, 2001). De plus, le tractus gastro-intestinal
renferme entre 1013 et 1014 cellules microbiennes représentant 400 à 500 espèces et sous
espèces. Cette microflore représente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps
humain (Björkstén, 2004).
Pour préserver l’homéostasie, la muqueuse doit développer des stratégies de défense
afin d’empêcher les antigènes intestinaux de pénétrer dans le compartiment systémique. Cette
protection est assurée par des mécanismes de défenses non spécifiques, tels que des facteurs
physiques (péristaltisme), chimiques (métabolites antimicrobiens, acidité stomacale) et par des
mécanismes de défenses spécifiques avec, entre autres, la production d’anticorps sécrétoires et
l’activation du système immunitaire associé à la muqueuse (Silbernagl & Despopoulos, 1992;
Salminen et al., 1998).
1.2. La microflore intestinale :
Du point de vue microbiologique, comme le montre la Figure 1, l’environnement
gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent des conditions très différentes
pour la survie des microorganismes. Dans le premier compartiment, l’estomac, la prolifération
microbienne est fortement réduite par la présence d’oxygène apporté par la déglutition et une
forte acidité. De ce fait, l’estomac héberge sélectivement les microorganismes acidotolérants
et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles, les streptocoques et les levures. Dans le
deuxième compartiment qui est l’intestin grêle, la microflore est constituée essentiellement de
bactéries anaérobies facultatives tels que les lactobacilles, les streptocoques
3
Rappels bibliographiques
Figure1 : Schéma simplifié décrivant les compartiments de l’appareil digestif de l’homme et
leurs microflores. Adapté et modifié par Ouwehand & Vesterlund (2003).
4
Rappels bibliographiques
les entérobactéries et les bactéries anaérobies strictes notamment les bifidobactéries, les
bactéroides et les clostridies. Dans le dernier compartiment qui est le colon (dépourvu
d’oxygène), le transit digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante,
représentant 35 à 50 % du volume du contenu du colon humain (Cummings et al., 1989;
Gounier-Château et al., 1994).
La charge microbienne dans les différents compartiments a été estimée à environ : 104,
103-4, 105-7, 107-8 et 1010-11 colonies formant unité (cfu/g) dans l’estomac, le duodénum, le
jéjunum, l’iléon et le colon respectivement (Ouwehand & Vesterlund, 2003; Isolauri et al.,
2004). Les bifidobactéries et les lactobacilles, certains entérocoques, E. coli, streptocoques et
bactéroides se distinguent par leurs effets bénéfiques sur la santé de l’hôte, comme :
1. L’amélioration de la maturation et de l’intégrité de l’intestin.
2. L’antagonisme contre les pathogènes.
3. La modulation de la fonction immunitaire (Gibson & Roberfroid, 1995; Schiffrin & Blum,
2002; Rastall, 2004).
1.3 Les facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale :
La composition et les fonctions de la microflore du tractus gastro-intestinal sont
influencées par divers facteurs (Tableau 1) liés au changement des conditions physiologiques
de l’hôte (âge, état de santé,...), de la composition du régime alimentaire et des circonstances
environnementales (contamination par les pathogènes, antibiothérapie, chimiothérapie, climat,
stress, hygiène ...) (Mitsuoka, 1989; Hopkins et al., 2002). Selon Holzapfel et al. (1998), les
facteurs majeurs influençant la microflore gastro-intestinale sont cités dans le tableau 1, ils
peuvent perturber l’équilibre de l’écosystème intestinal en favorisant des espèces particulières
par rapport à d’autres. Dans certains cas, ce déséquilibre peut être très favorable à la
prolifération de microorganismes opportunistes pathogènes pouvant compromettre la santé et
le bien-être de l’hôte. Il serait donc impératif de rechercher des solutions alternatives
permettant la restauration de l’équilibre de la microflore intestinale de l’hôte. L’utilisation de
probiotiques et/ou de prébiotiques (préparations microbiennes ou à base de certaines
substances) s’est avérée une alternative prometteuse.
5
Rappels bibliographiques
Tableau 1. Les principaux facteurs influençant la composition et la fonction de la microflore
intestinale. Adapté par Holzapfel et al. (1998).
Facteurs médiés par l’hôte
Facteurs microbiens
- pH, secrétions (immunoglobulines, bile,
- Adhésion.
sels, enzyme).
- Mobilité.
- Mobilité (péristaltisme).
- Flexibilité nutritionnelle.
- Physiologie (variable selon les
- Spores, capsules, enzymes, composants
compartiments).
antimicrobiens.
- Cellules détachées, mucines, exsudats de
- Temps de génération.
tissus.
Interactions microbiennes
Synergie
Antagonisme/ stimulation
-Coopération métabolique.
- Acides gras de courte chaîne, amines.
-Excrétion de vitamines et facteurs de
- Changement de Eh, pH et tension d’O2.
croissance.
- Composants antimicrobiens.
-Changement de Eh (potenteil d’oxydo-
- Besoin nutritionnel.
réduction), pH et tention d’O2.
Régime alimentaire
Composition, fibres non digestibles, drogues, etc
6
Rappels bibliographiques
1.4. Les organes lymphoïdes :
Le système lymphoïde est constitué de tissus et organes qui abritent les cellules
immunocompétentes. Il se présente sous forme d’organes, ayant une architecture encapsulée,
ou de tissu lymphoïde plus ou moins diffus. En effet, on distingue deux organes lymphoïdes ;
les organes lymphoïdes primaires (thymus, mœlle osseuse) où les cellules T et B doivent
entreprendre une partie de leur maturation dans ces tissus avant de migrer vers les tissus
lymphoïdes secondaires pour accomplir leur maturation (rate, ganglions lymphatiques et
tissus lymphoïdes associés aux muqueuses). Les cellules qui méditent l’immunité sont
représentées par les lymphocytes et les cellules accessoires tels que les macrophages, les
cellules présentatrices d’antigènes et dans certains cas les cellules épithéliales. Les
lymphocytes se trouvent dans le système lymphoïde constitué d’organes primaires (thymus et
mœlle osseuse) et secondaires (rate, ganglions lymphoïdes...). La rate produit une réponse
contre les antigènes venant du sang, alors que les nodules lymphoïdes agissent contre les
antigènes provenant de la lymphe. Les antigènes sont principalement absorbés via la peau ou
les muqueuses. Le tissu lymphoïde associé à la muqueuse (plaques de Peyer, tissu lymphoïde
urogénital) répond aux antigènes franchissant la barrière mucosale (Erickson & Hubbard,
2000).
1.5. Le système immunitaire de la muqueuse intestinale :
La muqueuse intestinale est le centre immunologique du corps ; elle héberge 80 % de
la population des leucocytes. Ces derniers sont indispensables pour l’homéostasie du corps
avec l’immense population bactérienne de l’intestin. La dérégulation de cette homéostasie
entraîne de nombreux désordres, notamment les maladies de l’inflammation de l’intestin
comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn (Schiffrin & Blum, 2002 ; Velazquez et al.,
2004).
En effet, le maintien de l’intégrité de l’intestin et de sa fonction digestive dépend en
partie de la capacité du système immunitaire de sa muqueuse, à faire la distinction entre les
antigènes offensifs et inoffensifs et de produire une réponse appropriée: une immunité active
ou une tolérance (Brandzaeg, 1996).
Le système immunitaire de la muqueuse intestinale, à l’instar des autres muqueuses, est
doté de deux armes de défense contre les antigènes ou agents pathogènes (Brandzaeg, 2002):
7
Rappels bibliographiques
a) l’exclusion de l’antigène à l’aide d’anticorps sécrétoires IgA et IgM en modulant ou en
inhibant la colonisation de l’hôte par les microorganismes et la pénétration d’antigènes
solubles dangereux.
b) les mécanismes de suppression de la réponse immunitaire afin d’éviter une réaction
locale ou périphérique excessive (hypersensibilité) contre des substances inoffensives
atteignant la surface de la muqueuse. La suppression de la réponse induite par des antigènes
alimentaires via l’intestin est désignée sous le nom de ‘‘tolérance orale’’.
Du point de vue anatomique, le système lymphoїde de l’intestin comprend les plaques de
Peyer ou les follicules isolés, la Lamina propria enrichie en cellules plasmatiques (cellules
dendritiques...), les ganglions lymphatiques mésentériques et les plaques cryptiques. Ces
compartiments constituent les sites d’induction et effecteurs de l’immunité intestinale. La
figure 2, montre une description schématique générale du système immunitaire de l’intestin.
Les voies d’entrée de l’antigène au niveau intestinal sont: les cellules épithéliales intestinales
(jonctions) via l’interaction des cellules dendritiques de la Lamina propria, les cellules
épithéliales et les cellules M (Spahn & Kucharzik, 2004).
Selon Monteleone et al. (2002), la distribution phénotypique des cellules T CD4 + et CD8 +
est similaire à celle des lymphocytes du sang périphérique avec la prédominance des cellules
CD4
+
et αβTcR+. Les lymphocytes B sont très abondants dans la muqueuse intestinale,
particulièrement dans les follicules isolés et les plaques de Peyer ; Ils méditent la première
réponse immunitaire de type humorale protégeant l’organisme des microorganismes
pathogènes entériques ou autres organismes infectieux. Une des propriétés remarquables des
lymphocytes B est la maturation des cellules B productrices des IgM en cellules productrices
des IgA.
En outre, une hypothèse récente suggère que les lymphocytes B jouent un rôle clé dans
la régulation de l’homéostasie immunitaire intestinale et la prévention des maladies de
l’inflammation de l’intestin. Leur rôle immunorégulateur consisterait à activer les cellules
tueuses (NK) et à favoriser la migration des cellules régulatrices CD4+CD8+ au site effecteur.
8
Rappels bibliographiques
Figure 2 : Description schématique générale du système immunitaire associé à la muqueuse
intestinale. Adapté par Spahn & Kucharzik (2004).
A, B et C : voies d’entrée de l’antigène: (A), les cellules épithéliales intestinales ; (B)
interaction des cellules dendritiques et cellules épithéliales; (C) cellules M. Flèches : sens de
drainage lymphatique des plaques de Peyer et de Lamina propria des villosités (vers les
nodules lymphatiques mésentériques).
9
Rappels bibliographiques
Cependant, le rôle des cellules NK et CD4+CD8+ dans la production de l’IL-10 demeure moins
clair (Velazquez et al., 2004).
2. La tolérance orale :
2.1. Définition de la tolérance orale :
La régulation de la réponse immunitaire intestinale joue un rôle primordial dans la
pathogenèse puisque de nombreuses observations indiquent que celle-ci est perturbée dans le
diabète de type 1 (Akerblom et al., 2002). La tolérance orale est dépendante de l’homéostasie
immunologique et d’une maturation normale de l’intestin. Ces deux éléments sont influencés
par des facteurs de croissance et les cytokines du lait maternel, une colonisation par une flore
bactérienne physiologique, des infections et le régime alimentaire (Wasmuth & Kolb, 2000).
Les infections à rotavirus ou entérovirus ont une action néfaste sur la perméabilité
intestinale et peuvent accélérer le déclanchement de l’allergie en catalysant le développement
d’une auto-immunité liée aux cellules T (Serreze et al., 2000). Ainsi une augmentation de la
perméabilité intestinale peut abolir la tolérance orale et induire une réponse immunitaire
exagérée vis-à-vis d’auto-antigènes ou d’antigènes alimentaires pouvant présenter des
réactions croisées avec des constituants cellulaires (Vahasalo et al., 1996). Des concentrations
élevées en anticorps IgG et IgA contre les protéines du lait (albumine bovine, βlactoglobuline) et l’ovalbumine sont observées chez des enfants adolescents souffrant de
diabète de type 1 par rapport à des sujets sains (Kohno et al., 2002 ; Savilathi et al., 1993).
2.2. Mécanismes cellulaires de la tolérance orale :
Plusieurs mécanismes cellulaires semblent être impliqués dans l’induction et le
maintien de la tolérance orale. Initialement, il a été suggéré qu’une déviation immunitaire des
cellules Th1 vers les cellules Th2 soit à la base de la tolérance, mais des travaux récents ont
démontré que ces cellules ne sont pas les seules impliquées (Shi et al., 1999). Les mécanismes
cellulaires impliqués sont l’anergie clonale (Melamed & Friedman, 1993), la délétion clonale
(Chen et al., 1995) et l’immunosuppression active (Lundin et al., 1999).
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Rappels bibliographiques
2.2.1 La délétion clonale :
La délétion des lymphocytes spécifiques (apoptose après activation par l’antigène,
avortement clonal) requerrait une forte exposition à l’antigène (Dessaint 2006). Ce mécanisme
est certainement à l’origine du maintien de la tolérance au cours du temps (Bu et al., 2001).
Les mécanismes de la mort par apoptose sont encore mal connus, mais la délétion clonale
semble dépendre de la voie du Fas/FasL (Marth et al., 1999) en présence de TGF-β (Chen et
al., 2001a). Les cellules Th1 et Th2 sont susceptibles à la mort par apoptose médiée par Fas,
mais les cellules Th1 sont plus sensibles (Zhang et al., 1997). Cette observation explique
pourquoi la réponse spécifique de type Th1 est plus facilement réprimée suite à
l’administration orale d’ovalbumine chez la souris (Sudo et al., 1997). Il semblerait également
que la délétion en périphérie soit la mort des cellules ayant subi l’anergie clonale.
2.2.2. L’anergie clonale :
L’anergie clonale est un état de non réponse lymphocytaire caractérisé par une absence
de prolifération et une faible production d’IL-2 (Schwartz, 1990). Deux mécanismes sont
proposés pour expliquer l’anergie clonale : l’absence de molécules de co-stimulation (B7.1 et
B7.2) à la surface des cellules présentatrices d’antigènes et la liaison de B7.2 au CTLA-4 qui
génère un signal inhibiteur aux cellules T activées.
Au niveau mucosal, les cellules de l’épithélium intestinal et les cellules dendritiques
sont les principales cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules de l’épithélium présentent
les antigènes aux cellules TCD8+ et TCD4+ de la lamina propria, mais elles sont incapables de
les stimuler en raison de l’absence de molécules de co-stimulation à leur surface (Hershberg &
Mayer, 2000). Les cellules TCD8+ semblent avoir un rôle important au niveau mucosal
puisque l’administration orale d’un antigène induit une faible réponse IgA en périphérie mais
pas au niveau mucosal chez des souris TCD8+ (Grdic et al., 1998). Parallèlement, les cellules
dendritiques jouent un rôle central, car une augmentation de leur nombre dans l’intestin et les
organes lymphoïdes améliore l’induction de la tolérance (Viney et al., 1998). La majorité des
cellules dendritiques localisées dans les muqueuses sont immatures à cause de
l’environnement riche en IL-10. Ceci signifie qu’elles ont la faculté de capturer et présenter
très efficacement les antigènes aux cellules TCD4+ naïves, mais qu’elles sont incapables de les
11
Rappels bibliographiques
stimuler en raison de la faible expression des molécules B7.1 et B7.2 (Lipscomb & Masten,
2002).
En périphérie, les cellules dendritiques induisent l’anergie clonale des cellules T
activées suite à l’engagement des molécules B7.2 au CTLA-4 (Perez et al., 1997). Les cellules
de l’épithélium intestinal agissent en périphérie, par la formation de petites particules
(tolérosomes) présentant des fragments antigéniques via le CMHII, mais n’exprimant pas les
molécules de co-stimulation (Karlsson et al., 1999).
Hormis leur phénotype immature et l’engagement avec le CTLA-4, les cellules
dendritiques jouent un rôle dans l’induction de la tolérance orale grâce à leur faculté de
sécréter des cytokines immunosuppressives, impliquées dans le troisième mécanisme de la
tolérance orale qui est l’immunosuppression active (Bilsborough et al., 2003).
2.2.3. L’immunosuppression active :
Cette voie fait intervenir des cellules TCD4+ régulatrices (Tr1 et Th3) spécifiques de
l’antigène qui secrétent des cytokines suppressives comme le TGF-β et l’IL-10 (Weiner,
2001a & b; Zhang et al., 2001). L’effet de ces cytokines est non spécifique puisqu’elles
suppriment la prolifération lymphocytaire dans le microenvironnement proche des cellules
dendritiques ayant pris en charge l’antigène (effet ‘bystander’), c’est-à-dire au niveau des
plaques de Peyer et de la lamina propria (Strober et al., 1998). Les cellules régulatrices
générées au niveau mucosal peuvent migrer dans les organes lymphoïdes périphériques et
supprimer la réponse en inhibant la génération de cellules T spécifiques effectrices
(MacDonald, 1982). Les mécanismes cellulaires générés par le TGF-β et l’IL-10 sont
différents.
Le TGF-β (Transforming Growth Factor-β), principalement secrété par les
lymphocytes Th3 (Weiner, 2001a & b), induit la commutation isotypique produisant des IgA
(Van Vlasselaer et al., 1992), supprime la prolifération des cellules Th1 et Th2 et stimule les
cellules Th3 (Takeuchi et al., 1998; Weiner 2001a & b). Les mécanismes impliqués sont
l’altération de l’expression des molécules accessoires (CD40) sur les cellules présentatrices
d’antigènes (Takeuchi et al., 1998), et une augmentation de l’expression du CTLA-4 sur les
lymphocytes T (Chen et Wahl, 2003). Les cellules productrices de TGF-β sont
particulièrement nombreuses au niveau du GALT, où l’environnement cytokinique est de type
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Rappels bibliographiques
Th2 (IL-4, IL-10), contrairement à la rate où les cellules Th1 sont principalement stimulées
(Everson et al., 1997). Ces cellules Th3 jouent un rôle important dans l’induction de la
tolérance orale, car un lien a récemment été établi entre le faible niveau de cellules Th3 dans la
lamina propria et le développement des allergies chez les enfants (Pérez-Machado et al.,
2003).
Dans le cas de l’IL-10, principalement secrétée par les lymphocytes Th2 et les cellules
T régulatrices (Tr1) (Wakkach et al., 2000), elle est la principale cytokine immunosuppressive
qui inhibe l’activation et la prolifération des lymphocytes Th0, Th1 et Th2 (Wakkach et al.,
2000). Cette inhibition résulte du blocage de la maturation des cellules dendritiques
(Steinbrink et al., 1997) et de l’induction de l’anergie locale, mais durable (Groux et al.,
1996).
Les lymphocytes T régulateurs (Tr1) sont des cellules principalement localisées au
niveau des muqueuses produisant de grandes quantités d’IL-10, ayant une faible capacité de
prolifération (Roncarolo, 2001) et inhibant la réponse Th2 spécifique (Cottrez et al., 2000).
Récemment, il a été démontré que leur différenciation est induite par une sous
population de cellules dendritiques, hautement productrice d’IL-10. Ces cellules dendritiques
sont capables d’induire la tolérance orale à l’ovalbumine chez la souris en stimulant
spécifiquement les cellules Tr1 (Wakkach et al., 2003).
2.3. Interactions entre les différents mécanismes :
Bien que les mécanismes de la délétion, de l’anergie et de l’immunosuppression active
aient été présentés séparément, leur implication in vivo peut être conjointe ou coopérative
(Pecquet et al., 1999; Jutel et al., 2003), en particulier grâce au TGF-β. En effet, hormis son
effet immunosuppresseur, le TGF-β joue un rôle important dans l’induction de la mort par
apoptose (Chen et al., 2001a) et dans l’induction de l’anergie en stimulant l’expression du
CTLA-4 (Chen & Wahl, 2003). De plus, les cellules mourant par apoptose peuvent libérer du
TGF-β qui contribue au développement de l’immunosuppression active (Chen et al., 2001b).
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Rappels bibliographiques
3. Allergies et intolérances alimentaires :
3.1. Les allergies alimentaires :
L’allergie alimentaire correspond à des manifestations cliniques apparaissant après
l’ingestion d’un allergène alimentaire (appelé trophallergène) impliquant un mécanisme IgE
dépendant. La prévalence actuelle est de 4.7% (Rancé et al.,2005 ; Dutau & Rancé, 2006).
Dans 50% des cas, l’allergie se manifeste avant l’âge de 1 an et dans 92% des cas avant l’âge
de 5 ans (Wood, 2003). L’allergie alimentaire comprend d’autres types de mécanismes
immunologiques qui peuvent cependant être impliqués. La classification établie par Gell et
Coombs différencie 4 types de réaction :
1. L’hypersensibilité de type I (immédiate, à médiation IgE).
2. L’hypersensibilité de type II (cytotoxique et cytolytique).
3. L’hypersensibilité de type III (semi-tardive, à complexes immuns).
4. L’hypersensibilité de type IV (retardée, à médiation cellulaire).
Les réactions de type I sont largement les plus fréquentes ; l’hypersensibilité de type II
n’intervient que de manière exceptionnelle dans les réactions immunitaires déclenchées par les
aliments ; les réactions de type III peuvent théoriquement intervenir vis à vis des aliments et
ont été principalement décrites à propos de l’intolérance au lait de vache ; l’hypersensibilité de
type IV, est probablement le mécanisme responsable des formes entéropathiques d’intolérance
aux protéines de lait de vache.
L'allergie aux protéines du lait de vache (APLV) correspond à une hypersensibilité
immunologique aux protéines du lait de vache. Il s'agit de la première allergie alimentaire chez
le nourissons; elle a un début précoce, souvent avant l'âge de 6 mois (Sigurs, 1992). Sa
fréquence est en constante augmentation, soit 4.6% de la population pédiatrique générale selon
Rancé et al., 2005 ; Deschildre et al., 2006, elle constitue un probléme de santé publique.
L'incidence de l'APLV dans la population générale varie de 0,3 à 7,5% selon les études
(Halker, 1993). Elle serait de 22,9 à 24% chez les enfants atopiques (McCann, 1995). La
prévalence dans la population générale est évaluée chez l’enfant ainsi que chez l’adulte : elle
est éstimée à 8,5% chez l’enfant d’âge préscolaire (Rancé & Bidat., sans date). L'APLV Le
lait contient plus de trente protéines, toutes potentiellement allergisantes (Hide, 1994). Les
caséines et la β-lactoglobuline sont le plus souvent en cause, mais toutes les protéines peuvent
être incriminées (Schrander, 1992).
14
Rappels bibliographiques
Toutefois, l’allergie au lait est une maladie infantile transitoire, car les symptômes
d’allergies disparaissent avant l’âge de trois ans dans 80% des cas (Rancé & Bidat, 2000).
Evaluée jusqu’à maintenant de façon très incertaine entre 1,9 % et 7,5 %, l’incidence des
allergies et/ou intolérances aux protéines du lait de vache (APLV/IPLV) à l’âge de deux ans et
demi a été estimée à 1,1 % par Eggesbo et al. (2001).
3.2. L’intolérance alimentaire :
Une réponse inappropriée vis-à-vis des protéines alimentaires, due à une rupture de
l'équilibre des mécanismes immunomodulateurs et immunosuppresseurs, est à l'origine
d'immunopathologies telles que l’hypersensibilité alimentaire, les pathologies inflammatoires
intestinales « inflammatory bowel disease » et les maladies auto-immunes (Mowat & Viney,
1997; Strobel, 2002). L’intolérance alimentaire n’implique pas une réaction immunoallergique
et ne met pas le pronostic vital du patient en jeu (Hermans, 2005). Elle touche 2.5% des
nourrissons avant 2 ans. Les intolérances non IgE-dépendantes (40% des cas) disparaissent
dans les trois premières années de vie alors que les allergies IgE-dépendantes sont plus
fréquentes (60% des cas) ; leur guérison est obtenue dans 80 à 85% des cas à l’âge de 3-4 ans
(Host & Halken, 1990 ; Juchet et al., 2003).
L'intolérance peut être induite par une concentration et une présentation inappropriée
des antigènes alimentaires lorsque la perméabilité de l'intestin grêle est augmentée. La
perméabilité intestinale varie constamment au cours de la vie d'un individu ; elle peut être
accrue sous l'effet d'une réponse immunitaire exagérée due à l'activation massive de
populations de cellules immunocompétentes par des concentrations excessives en antigènes et
une surproduction d'interleukines et de cytokines.
3.2.1. Mécanismes impliqués :
A côté de l'agression directe des entérocytes par une infection invasive de la muqueuse
intestinale ou la libération de toxines, les infections gastro-intestinales agissent comme
adjuvant et induisent une réponse immunitaire (priming) à l'encontre d'un antigène protéique
soluble auparavant toléré (Nagler-Anderson & Shi, 2001). D'autre part la réponse immunitaire
entraîne une réaction inflammatoire avec libération de cytokines qui ont un effet délétère sur la
muqueuse intestinale.
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Rappels bibliographiques
En effet, l'interféron γ (IFN-γ) et le tumor necrosis factor-α (TNF-α) présents en
concentrations élevées en réponse à un stimulus inflammatoire, perturbent la perméabilité
intestinale en augmentant l'absorption paracellulaire des antigènes par altération de la
perméabilité des « tight junctions » et leur transcytose à travers la barrière intestinale (Heyman
& Desjeux, 2000). Par exemple, au cours d'une infection à Helicobacter pylori la
concentration d'antigènes mise en contact avec le système immunitaire intestinal est nettement
augmentée par inhibition de la dégradation lysosomiale des protéines par les entérocytes. La
tolérance alimentaire est de ce fait abolie par une présentation inappropriée (p. ex.
macromolécules incomplètement digérées) et une concentration excessive d'antigènes
alimentaires.
Un autre effet secondaire d'un taux élevé de TNF α est une mort cellulaire programmée
(apoptose) et le détachement des entérocytes avec comme conséquence une atrophie des
villosités intestinales. Cet effet a pu être démontré chez la souris et serait dû à l'induction de
caspases (Piguet et al., 1999). Les caspases constituent un groupe de médiateurs de l'apoptose
et sont des protéases spécifiques de l'asparate. La caspase-3 constitue le médiateur clé de
l'apoptose des cellules de mammifères.
Dans le cas de l'intolérance alimentaire, il s'agit d'une stimulation continue du système
immunitaire et la réaction inflammatoire est soutenue par l'ingestion répétée et continue des
aliments à risque.
Cette chronicité conduit à des lésions et des inflammations chroniques dans certains
tissus et à l'apparition de maladies inflammatoires, auto-immunes ainsi qu’à des phénomènes
d'allergie et d'hypersensibilité.
Parmi les protéines les plus allergisantes on site la β-lactoglobuline bovine.
3.3. La β-lactoglobuline bovine (β-Lg) :
La β-Lg bovine est la plus abondante des protéines du lactosérum; elle représente
environ 50% des protéines totales du lactosérum et fait partie des protéines les plus
allergisantes du lait de vache. Il s’agit d’une protéine globulaire de structure compacte,
composée de 162 résidus d’acides aminés et dont la masse moléculaire relative est de 18,36
kDa (Massol, 1998 ; Amiot, 2002).
Plusieurs variants génétiques ont été mis en évidence (9 au total). Cependant, les plus
couramment présents dans le lait de vache sont les variants A et B, (Hambling et al., 1992).
16
Rappels bibliographiques
Ces variants diffèrent par la substitution de deux résidus d’acides aminés; Gly64 et Ala118
dans le variant B sont remplacés par Asp64 et Val118 dans le variant A (Wal, 2001 ; Amiot,
2002). La β-Lg renferme deux ponts disulfures (S-S) aux positions 66-160 et 106-121 ou 106119 (Papiz et al., 1986; Monaco et al., 1987), et un groupement thiol libre en position 121 ou
119 (McKenzie et al., 1972; Kinsella, 1988). La position du groupement thiol varie en
fonction des réactions d’échange SH/S-S, lesquelles sont influencées par le pH et la
température du milieu.
La structure secondaire de la β-Lg est composée d’environ 15% d’hélice α, 51% de
feuillet β, 17% de courbures β et 17% de structure désordonnée (Creamer et al., 1983; Casal
et al., 1988). La quantité importante de feuillets β serait responsable des interactions entre les
monomères, pouvant mener jusqu’à l’agrégation et la gélification de la protéine (Sawyer &
Kontopidis, 2000).
La structure tertiaire de la β-Lg semble stable, même à des températures allant jusqu’à
75-80°C (Edwards et al., 2002). Sa structure se compose principalement de feuillets β qui
délimitent une cavité hydrophobe. Cette structure, dite en tonneau-β, est commune à la famille
de protéines nommée lipocaline (Sawyer & Kontopidis, 2000). La plupart des membres de
cette famille sont des transporteurs de petits ligands hydrophobes. La molécule de β-Lg
comprend 9 feuillets β antiparallèles situés aux positions 15-24 (brin A), 35-44 (brin B), 49-56
(brin C), 65-74 (brin D), 82-85 (brin E), 91-97 (brin F), 102-111 (brin G), 116-124 (brin H) et
145-150 (brin I). L’hélice-α est localisée en position 131-140, alors que les courbures β se
situent aux positions 28-31, 45- 48, 61-64, 98-101, 112-113 et probablement 74-82 et 125-130.
En solution, les brins les plus hydrophobes (A, E, F, G et H) seraient cachés à
l’intérieur de la molécule. Le feuillet formé par les brins G-H serait le plus stable en raison de
la présence d’un pont disulfure et de certaines interactions hydrophobes spécifiques. La région
hydrophobe de l’hélice-α principale est adjacente à ce feuillet, alors que sa région hydrophile
est exposée au solvant ce qui contribuerait à la stabilité de la structure de la protéine en
solution.
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Rappels bibliographiques
Figure 3 : Position des acides aminés substitués dans les variants A et B de la β-Lg
(Botelho et al., 2000).
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Rappels bibliographiques
Le feuillet β-I est impliqué dans des interactions intermoléculaires, notamment lors de
la dimérisation de la protéine (Sakai et al., 2000; Sakurai et al., 2001).
Les structures tertiaires des variants génétiques A et B de la β-Lg sont semblables
(Figure 3). En fait, les substitutions des résidus Gly64 et Ala118 dans le variant B par Asp64
et Val118 dans le variant A se trouvent respectivement sur une boucle extérieure mobile (CD)
et dans la cavité hydrophobe de la molécule (Qin et al., 1999; Sawyer & Kontopidis, 2000).
Cette structure tertiaire lui confère une bonne résistance à l’hydrolyse acide et à la pepsine
gastrique (Reddy et al., 1988 ; Asselin et al., 1989). La β-Lg est alors adsorbée au niveau de
l’intestin à l’état natif ou légèrement hydrolysée, ce qui explique, en partie, sa forte
allergénicité (Schmidt et al., 1995).
3.4. Stratégies de prévention des allergies aux protéines du lait de vache :
3.4.1. Allaitement maternel et régime d’éviction des protéines du lait de vache :
L’allaitement prolongé au-delà de six mois est la meilleure stratégie pour prévenir les
allergies au lait de vache chez le nouveau-né (Saarinen & Kajosaari, 1995). En effet, les
enfants ne développent pas d’allergies vis-à-vis du lait maternel. De plus, durant la période
d’allaitement, le système immunitaire du nouveau-né se développe et la perméabilité
intestinale diminue, ce qui lui permet de tolérer les protéines allergéniques à un âge plus
avancé (Morein et al., 2002).Récemment, Kull et al., 2005 ont prouvé que l’allaitement
maternel prévient le développement d’une dermatite atopique. Toutefois, des traces de
protéines bovines dans le lait maternel peuvent induire une sensibilisation (Restani et al.,
1999; Järvinen et al., 1999). Si une allergie via le lait maternelle est prouvée, il faut modifier
le régime de la mère ou proposer au nourrisson un lait de régime (Zeiger, 2003 ; Kramer,
2003). Pour une prévention efficace il faut commencer par un régime d’éviction strict. Le
patient et sa famille devront éviter, non seulement l’aliment « visible », mais aussi l’allergène
rencontré dans des aliments préparés industriellement (Eigenmann & Rancé, 2003).
19
Rappels bibliographiques
Quand le lait maternel n’est pas possible, ce dernier peut être remplacé par des formules
infantiles à base de lait de vache, mais certains enfants y sont allergiques (Exl, 2001). Dans ce
cas, la méthode la plus efficace pour prévenir les symptômes d’allergies est l’éviction totale de
toutes sources de protéines laitières, mais cette approche peut engendrer des retards de croissance
(Isolauri et al., 1998).Le régime d’éviction doit s’accompagner d’autres mesures de prévention,
comme la mise en place d’une trousse d’urgence, la discussion d’un projet d’accueil individualisé
en milieu scolaire et préscolaire ainsi que des mesures d’éducation (Rancé & Bidat, 2006). Il est
important de limiter le régime afin d’éviter la création de néophobie alimentaire (Rigal et al.,
2005). L’utilisation de formules infantiles hypoallergéniques est alors une alternative
intéressante. Pour produire ces formules, les épitopes allergéniques doivent être détruits ou
modifiés. Les méthodes traditionnelles sont le traitement thermique et l’hydrolyse enzymatique,
mais cette dernière est la plus utilisée et la plus efficace (Besler et al., 2001).
3.4.2. Hydrolyse des allergènes par des enzymes digestives :
L’hydrolyse enzymatique consiste à couper les protéines en plusieurs fragments de
faibles poids moléculaires. Ces coupures détruisent la structure tertiaire des protéines et
dissocient les épitopes conformationnels et linéaires. L’hydrolyse de la β-Lg par la
chymotrypsine, seule ou associée à la trypsine, et l’hydrolyse par la pepsine suivie de la
chymotrypsine, diminuent de façon significative l’allergénicité de la β-Lg mais sans la réduire
totalement (Asselin et al., 1988 et 1989). Un traitement thermique de la β-Lg avant l’hydrolyse
enzymatique améliore la réduction de l’allergénicité (Bonomi et al., 2003). Toutefois, bien que
l’hydrolyse déstabilise certains épitopes allergéniques, il a été démontré que les IgE de certains
patients allergiques se fixaient plus efficacement à la β-Lg hydrolysée qu’à la β-Lg native
(Haddad et al., 1979). Ceci suggère que l’hydrolyse enzymatique dissocie les épitopes
conformationnels et démasque des épitopes initiallement enfouis dans la cavité hydrophobe.
Cependant, il a été observé que plus le degré d’hydrolyse des protéines est élevé, plus
l’allergénicité résiduelle est faible (Oldaeus et al., 1999; Giampietro et al., 2001; Fritsché, 2003).
Basée sur cette observation, de nombreuses formules hypoallergéniques à base de protéines
laitières hydrolysées ont été développées. Différents degrés d’hydrolyse génèrent des formules
plus ou moins hypoallergéniques (Lombardo et al., 1998; Moneret-Vautrin et al., 2001;
Giampietro et al., 2001).
20
Rappels bibliographiques
Dès leur plus jeune âge, les enfants sont classés dans trois catégories suivant leur aptitude
à développer des allergies aux protéines du lait de vache. Ces trois catégories sont : les enfants
sains, les enfants classés à risque (enfants ayant des antécédents familiaux allergiques) et les
enfants sensibilisés. Différentes formules infantiles sont administrées à ces enfants. Pour prévenir
les allergies chez les enfants sensibilisés, des formules fortement hydrolysées ou à base d’acides
aminés libres sont prescrites. Les formules fortement hydrolysées contiennent 85% de peptides
ayant un poids moléculaire inférieur à 1500 Da (Rancé & Bidat, 2000). De nombreuses études
cliniques démontrent que ces formules sont tolérées par plus de 90% des patients allergiques,
alors que les formules partiellement hydrolysées sont tolérées par moins de 55% d’entre eux
(Besler et al., 2001). Cependant, quelques réactions sévères, type choc anaphylactique, ont aussi
été rapportées avec ces formules (Besler et al., 2001), alors que les formules à base d’acides
aminés libres n’induisent aucune réaction de ce type (Isolauri et al., 1995). Les formules
partiellement hydrolysées, sont recommandées aux enfants classés à risque d’allergie aux
protéines du lait de vache (Exl, 2001). Dans ces formules, les peptides ont des poids moléculaires
supérieurs à 8 kDa (Lombardo et al., 1998). Bien que l’utilisation de ces formules soit encore
controversée, la dernière étude clinique rapporte un effet protecteur de celles-ci dans la
prévention des allergies chez les enfants à risque (Von Berg et al., 2003).
Les principales enzymes, utilisées à l’échelle commerciale pour produire les formules
hypoallergéniques, sont la trypsine et la chymotrypsine d’orgine porcine (Fritsché, 2003). Ces
deux enzymes sont synthétisées par les cellules acineuses du pancréas et secrétées dans le
duodénum; la trypsine étant deux fois plus abondante que la chymotrypsine (Goldberg et al.,
1973). Elles ont un poids moléculaire similaire, avoisinant 24 kDa. La trypsine hydrolyse les
liens peptidiques du coté C-terminal au niveau de la lysine (Lys) et de l’arginine (Arg) ; la
chymotrypsine hydrolyse principalement les liens peptidiques du coté C-terminal des acides
aminés aromatiques phénylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) et tryptophane (Trp) avec parfois des
coupures après la méthionine (Met) et la leucine (Leu). L’analyse de la structure primaire de la βLg révèle 52 sites de coupures théoriques pour ces deux enzymes, mais seulement 30 peptides ont
été détectés expérimentalement (Groleau et al., 2003).
Des enzymes d’origine bactérienne et fongique sont de plus en plus utilisées pour la
production de formules infantiles (Fritsché, 2003). Dans ce contexte, les enzymes bactériennes
sont utilisées à l’état purifié. Cependant, l’activité protéolytique des bactéries lactiques au cours
21
Rappels bibliographiques
des procédés de fermentation est une autre voie importante pour la dégradation des protéines du
lait de vache.
3.4.3. Hydrolyse des allergènes par des enzymes bactériennes :
Au cours des procédés de fermentation, les protéines laitières sont hydrolysées par les
enzymes des bactéries lactiques. Le système protéolytique des bactéries lactiques se compose de
protéases membranaires, qui hydrolysent les protéines du milieu environnant et libèrent des
peptides et des peptidases intra-cytoplasmiques qui dégradent les peptides. Les peptidases
peuvent être des endopeptidases (site de coupure intra-chaîne) ou des exopeptidases (site de
coupure en extrémité de chaîne). On distingue les carboxypeptidases, les aminopeptidases qui
coupent du coté C- et N-terminal, respectivement. Ces enzymes peuvent libérer un, deux ou trois
acides aminés d’où l’appellation de di- ou tri-peptidyl carboxypeptidases ou aminopeptidases
(Kunji et al., 1996). La majorité des peptidases sont intracellulaires, mais une certaine activité
aminopeptidasique a été mesurée à l’extérieur des cellules (Shihata & Sha, 2000).
L’activité protéolytique des lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son importance
dans la fabrication fromagère et le développement d’arômes (Bintsis et al., 2003). Le contenu
intracellulaire en peptidases est spécifique de chaque souche bactérienne (Kunji et al., 1996).
Cependant, plusieurs souches de L. paracasei ssp. paracasei montrent le même profil d’activité
protéolytique
(Bintsis
aminopeptidasique
et
sont
al.,
faibles
2003);
et
leurs
activités
inférieures
aux
endopeptidasique
activités
et
dipeptidyl
carboxypeptidasique,
aminopeptidasique et dipeptidasique (Bintsis et al., 2003 ; Chekroun et al., 2006).
L’activité protéolytique des bifidobactéries a été peu étudiée. Toutefois, elle semble assez
faible et inférieure à celle observée avec les lactobacilles (Shihata & Sha, 2000). Leur
caractéristique générale est une activité aminopeptidasique, bien que des activités dipeptidasique,
tripeptidasique et carboxypeptidasique aient été observées (El-Soda et al., 1992).
De nombreuses études mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers fermentés,
mais peu d’auteurs précisent si cet effet est relié à l’hydrolyse des épitopes allergéniques des
protéines du lait, ou à une modulation de la réponse immune par les bactéries lactiques à l’origine
de la fermentation (Cross et al., 2001). De nombreux cas d’allergies ont été rapportés suite à
l’ingestion de différents fromages faits à partir de lait de vache, de chèvre ou de brebis
(Umpierrez et al., 1999 ; Besler et al., 2001), mais aucune étude n’a été réalisée sur la
22
Rappels bibliographiques
modification de l’allergénicité des protéines laitières au cours de la fabrication fromagère. Par
contre, (Jedrychowski & Wróblewska, 1999 ; Chekroun, 2005) ont rapporté que la fermentation
du lait de vache par des bactéries lactiques mésophiles et thermophiles induit une diminution
significative de l’antigénicité de l’α-lactalbumine et de la β-lactoglobuline, alors qu’elle n’affecte
pas l’allergenicité mesurée par des tests sous cutanés. La diminution de l’allergénicité par
l’hydrolyse bactérienne a également été réalisée de façon indirecte, en mesurant la production
d’IL-4, in vitro, en présence d’hydrolysat. Ainsi, Sütas et al. (1996) ont rapporté une suppression
de la synthèse d’IL-4 par les cellules mononuclées du sang, en présence de caséine hydrolysée
par les enzymes intracytoplasmiques de Lactobacillus rhamnosus GG.
La diminution de l’allergénicité des protéines du lait par l’hydrolyse enzymatique
constitue une stratégie intéressante pour la prévention des allergies aux protéines du lait de vache.
Cependant, l’apparition des symptômes d’allergie dépend de nombreux autres facteurs dont la
prédisposition génétique, des facteurs environnementaux (tabac, animaux domestiques etc.) et le
système immunitaire des individus. Il est maintenant admis que les allergies alimentaires
apparaîssent quand la tolérance orale n’est pas induite ou maintenue dans le temps. Ainsi, en
stimulant l’induction de la tolérance orale, on peut prévenir le développement des allergies.
4. Les laits fermentés :
Les produits laitiers fermentés sont les meilleurs véhicules alimentaires pour la
consommation de probiotiques (formules infantiles, yaourts…). Le Japon est le leader mondial
pour la diversité des produits probiotiques, avec plus de 50 variétés (Gomez & Malcata, 1999).
Les caractéristiques idéales des souches probiotiques pour l’alimentation humaine sont : une
origine humaine, une bonne résistance aux conditions acides et au milieu intestinal, une bonne
adhérence à la muqueuse intestinale, une non toxicité, de bonnes propriétés technologiques et des
effets bénéfiques sur la santé (Ouwehand et al., 1999; Ishibashi & Yamazaki, 2001). Toutefois,
certains de ces critères sont maintenant remis en question, comme les propriétés d’adhérence
(Apostolou et al., 2001b; Melmed et al., 2003).
Les propriétés des laits fermentés sont déterminées par la composition chimique du
produit alimentaire (source de carbone, degré de l’hydrolyse des protéines et des matières grasses
du lait et accessibilité des acides aminés essentiels et des acides gras), et les caractéristiques des
espèces microbiennes présentes dans le produit (Jelen & Lutz, 1998 ; Thibault et al., 2004 ;
23
Rappels bibliographiques
Chekroun, 2005). L’interaction entre le produit et les espèces probiotiques est plus importante si
les cultures probiotiques participent à la fermentation (Heller, 2001).
4.1. Les bactéries lactiques :
Les
bactéries
lactiques
sont
des
cellules
procaryotes,
hétérotrophes
et
chimioorganotrophes. Elles ont une coloration de gram, généralement immobiles, asporulées et
ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides, les vitamines,
les sels minéraux, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al., 1994). Il est
possible de les classer suivant la nature des produits du métabolisme bactérien obtenus à partir
des glucides. En effet les bactéries homolactiques strictes produisent uniquement de l’acide
lactique, alors que les bactéries hétérolactiques peuvent produire de l’acide acétique, de l’éthanol
et du CO2 en plus de l’acide lactique. Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des
bactéries lactiques : Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et Vagococcus. Les
bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques
typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière.
Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre de produits
d’origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont les ferments les plus utilisés des industries
laitières et surtout dans la fermentation lactique des produits laitiers en Amérique du Nord
(Champagne, 1998). Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique
qui influence la texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. L’abaissement du pH
limite aussi la croissance des bactéries indésirables (Gilliland, 1985a). Enfin, la production
d’acide lactique intervient également sur le goût des produits fermentés, soit directement dans les
produits frais, soit indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant l’affinage.
Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop grandes
teneurs peuvent leur être néfastes. Ceci peut probablement être relié au peroxyde d’hydrogène
(H2O2) qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le H2O2 doit être éliminé sinon son
accumulation devient toxique. Le système le plus efficace d’élimination du H2O2 est une enzyme
nommée catalase dont les bactéries lactiques sont déficientes. Les bactéries lactiques possèdent
plutôt une peroxydase, moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactéries lactiques
24
Rappels bibliographiques
n’éliminent pas facilement le peroxyde, elles sont considérées comme micro-aérophiles. Les
bactéries lactiques aromatisantes comme Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis
produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût des produits frais et à la
production de CO2 responsable d’ouvertures dans le fromage. Enfin, certaines bactéries lactiques
produisent des exopolysaccharides qui influencent l’aspect et la texture des produits fermentés,
ainsi que du peroxyde d’hydrogène et des bactériocines inhibant la croissance de bactéries
indésirables.
4.2. Les ferments à effet probiotiques :
Bien que le premier lait fermenté par des bifidobactéries ait été mis sur le marché il y a
près de 50 ans, le domaine des aliments probiotiques ne s’est développé que dans les années 1970
(Tamime et al., 1995). En 1997, plus de 70 produits laitiers industriels tels que des laits
fermentés, du fromage blanc, du babeurre et des desserts surgelés contenaient des bactéries
probiotiques, dont plus de la moitié au Japon (Shah, 1997). Aujourd’hui, les marques LC1
(Nestlé), Vifit (Campina Melkunie), Actimel (Danone) et Yakult ont émergé comme des chefs de
fil dans les yaourts et laits fermentés probiotiques (Stanton et al., 2001). Par ailleurs, les laits
fermentés ‘AB milk’ et ‘Cultura’ contenant L. acidophilus et B. bifidum sont très populaires au
Danemark (Tamime et al., 1995). D’autres produits comme les yaourts acidophilus-bifidus
contenant L. acidophilus et B. bifidum, ou B. longum et les ferments du yaourt ( L. bulgaricus et
S. thermophillus), les laits ‘Bifidus’ (B. bifidum ou B. longum), ‘Biogarde’ (L. acidophilus, B.
bifidum et S. thermophilus), ‘Biomild’ (L. acidophilus et Bifidobacterium spp.) en Allemagne et
les laits ‘Diphilus’ (L. acidophilus et B. bifidum) et ‘Ophilus’ (L. acidophilus, B. bifidum, et S.
thermophilus, ou L. acidophilus, B. bifidum, et L. cremoris) en France ne sont que quelques
exemples de l’utilisation variée des bifidobactéries comme bactéries probiotiques dans des
ferments mixtes en combinaison avec L. acidophilus ou les ferments du yaourt (L. bulgaricus et
S. thermophilus) (Tamime et al., 1995). Les bifidobactéries peuvent être utilisées seules mais sont
souvent associées à des bactéries lactiques pour des raisons organoleptiques et technologiques
(Saloff-Coste, 1997). De plus, la présence de bactéries protéolytiques, en particulier L.
bulgaricus, favorise la croissance des bifidobactéries.
Cependant, pour la production du ferment mixte probiotique, les bifidobactéries ne
peuvent pas être propagées conjointement aux bactéries lactiques en raison de leur faible
25
Rappels bibliographiques
compétitivité en culture mixte. Ainsi, pour assurer une quantité de bactéries probiotiques
suffisante dans les produits fermentés, les ferments à effet probiotiques commerciaux consistent
en des cultures pures de bifidobactéries mélangées aux cultures lactiques au moment de la
fabrication du produit ou encore directement ajoutées au produit fermenté à la concentration
finale recherchée. Cette limite économique et matérielle justifie le développement d’une nouvelle
technologie de production de culture mixte contenant des souches plus ou moins compétitives.
4.2.1. Les bactéries probiotiques :
En fermentant dans le gros intestin, les fibres alimentaires favorisent la croissance des
bactéries et produisent ainsi de la biomasse. Certaines de ces bactéries ont des effets
physiologiques et cliniques bénéfiques à la santé du consommateur : ce sont les probiotiques, du
grec “ pro : en faveur de ” et “ bios : vie ”. Les probiotiques sont donc des microorganismes
vivants qui exercent un effet bénéfique sur l’hôte en améliorant son écosystème intestinal. Ces
bactéries agissent en empêchant le développement de bactéries pathogènes, en rééquilibrant la
flore après une antibiothérapie, en produisant des vitamines et en augmentant les défenses
immunitaires de l’hôte.
Les souches ou espèces probiotiques sont des composants normaux de la flore intestinale
(Dunne et al., 2001). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus utilisés comme
probiotiques sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Berg, 1998). Par contre, en
alimentation animale de nombreux genres bactériens et fongiques sont utilisés, comme
Lactobacillus,
Bifidobacterium,
Bacillus,
Streptococcus,
Pediococcus,
Enterococcus,
Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis (Tannock, 1997).
Actuellement, les mécanismes par lesquels ces bactéries peuvent avoir ces effets sont mal
compris mais des recherches sont en cours sur les relations existants entre ces organismes et la
physiologie intestinale. Il existe deux manières d’augmenter le taux de ces bactéries probiotiques
dans le tube digestif :
¾ soit en les introduisant directement dans l’alimentation, mais il semble que ce moyen est
peu efficace car la plupart des bactéries ne survivent pas au cours de leur passage dans
l’estomac et l’intestin grêle,
26
Rappels bibliographiques
¾ soit en favorisant leur développement dans le côlon en apportant les substrats nécessaires
à leur métabolisme. Certaines fibres alimentaires, telles que les fructo-oligosaccharides,
qu’on trouve dans les artichauts et les oignons, augmentent la prolifération de ces
bactéries probiotiques ; on appelle ces glucides : des aliments prébiotiques. Une étude
récente de Bartosch et al. (2005) réalisée sur un groupe de volontaires âgés (> 62 ans)
dont le contenu intestinal en bifidobactéries est fortement réduit par l’âge, a démontré que
l’ingestion d’un symbiotique à base de Bifidobacterium bifidum BB-02 et
Bifidobacterium lactis BL-01 (probiotiques) et de l’inuline (prébiotique) a augmenté
significativement la taille et la diversité des populations de bifidobactéries dans les
matières fécales par rapport au groupe contrôle et groupe placebo.
4.2.1.1. Les bifidobactéries :
Les bifidobactéries ont été découvertes dans les fèces d'enfants par Henri Tissier en
1900. Leur premier nom fut Bacillus bifidus communis (Tissier, 1900). Les bifidobactéries sont
des bâtonnets à Gram positif aux formes variées, non mobiles, non sporulants et en général
anaérobes strictes qui composent la presque totalité (85 à 99%) de la flore intestinale d’un enfant.
Ces bactéries jouent un rôle majeur dans l’équilibre et la stabilité de la flore intestinale, d’où
l’appellation de culture probiotique (Hekmat & McMahon, 1992). Une diminution des
bifidobactéries au profit des clostridies, des lactobacilles, des streptocoques et des
entérobactéries est cependant observée tout au long de la vie. De plus, les espèces et les
biovariétés typiques de l’adulte remplacent celles de l’enfant. Ces modifications seraient en
partie imputables à l’évolution du régime alimentaire (Gournier-Château et al., 1994).
Parmi les 32 espèces de bifidobactéries répertoriées, 10 sont considérées comme étant
d’origine humaine, alors que les autres sont isolées dans les matières fécales d’animaux divers
(Curk et al., 1994). B. longum, B. bifidum, B. infantis et B. breve ont été les plus étudiées à cause
de leur aptitude à fermenter le lait ou à être incorporées dans les aliments (Modler et al., 1990;
Hekmat & McMahon, 1992; Blanchette et al., 1996; Shah, 1997; Gobetti et al., 1998; Rosenthal
& Bernstein, 1998; Stanton et al., 1998 ;Chekroun, 2006). Les conditions optimales de croissance
des bifidobactéries se situent à des températures comprises entre 37°C et 41°C, et à des valeurs
de pH comprises entre 6.5 et 7. Aucune croissance n’est observée à des températures inférieures à
27
Rappels bibliographiques
25°C et supérieures à 45°C et à des valeurs de pH inférieures à 4.5 ou supérieures à 8.5. Les
bifidobactéries produisent de l’acide acétique et de l’acide lactique dans un ratio molaire
théorique de 3 : 2 en métabolisant une grande variété d’hexoses par le cycle du fructose-6phosphate (Scardovi, 1986).
4.3. Critères de sélection des souches probiotiques :
Alors que les bactéries lactiques sont principalement sélectionnées pour leurs activités
acidifiantes et protéolytiques dans les ferments classiques, d’autres propriétés doivent être
étudiées dans le cas des probiotiques (fig 4). Pour exercer leur effet bénéfique sur la santé, les
probiotiques doivent, comme pour les ferments classiques, survivre en grand nombre au procédé
de fabrication, à la lyophilisation éventuelle et à l’entreposage qui s’en suit. Il est en effet
généralement admis qu’un nombre minimal de 107 cellules viables par gramme de produit est
nécessaire pour exercer un effet probiotique (Ishibashi & Shimamura, 1993).
Cependant, la stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés
nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées. De plus, ces
souches devraient être viables sans se multiplier pour ne pas provoquer d’effet indésirable sur le
goût ou l’arôme du produit ni augmenter l’acidité (Mattila-Sandholm et al., 2002). Par ailleurs,
plusieurs études ont démontré que des cellules en phase stationnaire de croissance, plus tolérantes
aux stress environnementaux que des cellules en phase exponentielle, devraient être privilégiées
pour la confection de produits contenant des probiotiques en grand nombre (Kolter, 1993; Hartke
et al., 1994; Rallu et al., 1996; Heller, 2001). Les interactions possibles entre bactéries lactiques
et probiotiques devraient également être prises en compte pour sélectionner la meilleure
combinaison de souches afin d’optimiser le procédé et la survie cellulaire dans le produit
entreposé (Vinderola et al., 2002 ; Chekroun et al., 2006).
Enfin, ces bactéries probiotiques devraient être capable de survivre en grand nombre aux
conditions acides de l’estomac et aux sels biliaires de l’intestin lors de la consommation du
produit, puis d’adhérer aux cellules épithéliales de l’intestin afin de produire les effets bénéfiques
désirés le plus longtemps possible (Tamime et al., 1995).
28
Rappels bibliographiques
Figure 4 : Propriétés et critères de sélection des probiotiques. Adapté par Salminen et al. (1998).
29
Rappels bibliographiques
5. Les probiotiques et le système immunitaire :
5.1. Effet des probiotiques sur le système immunitaire :
L’effet, in vivo, des probiotiques sur la réponse immunitaire est peu documenté.
Toutefois, quelques bonnes études, in vitro et in vivo, rapportent certains effets (Tableau 2).
Cependant, les effets observés dépendent des souches utilisées et les études réalisées, in vitro,
demandent à être confirmées in vivo.
Grâce au développement de modèles expérimentaux animaux reproduisant des états
pathologiques, des données récentes mettent en évidence l’intervention de la flore intestinale
résidente et des probiotiques dans certaines pathologies : maladies inflammatoires du tube
digestif (McCarthy et al., 2003), maladies auto-immunes et réponses immunitaires de type
allergique.
De nombreuses études cliniques confirment les résultats observés dans ces modèles
animaux, en particulier pour le développement des allergies aux protéine du lait de vache.
5.2. Les probiotiques et leurs effets bénéfiques sur la santé :
Plusieurs effets bénéfiques sur la santé ont été associés à la consommation des
probiotiques. La Figure 5, illustre la diversité des effets bénéfiques sur la santé. Les mécanismes
d’action potentiellement impliqués dans l’effet bénéfique des probiotiques sont nombreux faisant
intervenir la baisse du pH intestinal par la digestion du lactose résiduel, la production de
polyamines qui ont un rôle trophique sur la muqueuse, l’inhibition de l’adhésion bactérienne, la
synthèse de composés qui inhibent voire détruisent les microorganisme pathogènes, la
stimulation de la réponse immunitaire et la consommation compétitive de certains nutriments
empêchant, par ce biais, la prolifération des microorganismes pathogènes (Vanderhoof & Young,
1998).
Un certain nombre d’études randomisées, versus placébo, a montré une efficacité sur la
durée de la diarrhée avec Saccharomyces boulardii (Celina-Sauri & Sierra Basto, 1994) surtout
Lactobacillus GG (Shornikova, 1997a; Guandalini et al., 2000) et Lactobacillus reuteri
(Shornikova et al., 1997b), associés à une diminution du nombre des selles à partir du 3ème jour
pour Lactobacillus GG, notamment dans les diarrhées à Rotavirus (Guandalini, 2000). Cet effet
semblait par ailleurs dose dépendante (Shornikova, 1997b).
30
Rappels bibliographiques
Tableau 2 : Principaux effets des probiotiques sur la réponse immunitaire.
Principaux effets rapportés sur le système immunitaire Références
Stimulation de la production d'IgA
Fukushima et al., 1998
Stimulation de la prolifération lymphocytaire
Kirjavainen et al., 1999
Stimulation des cellules tueuses NK
Nagao et al., 2000
Stimulation de la prolifération des cellules épithéliales
Banasaz et al., 2002
Modulation de la maturation des cellules dendritiques
Christensen et al., 2002
31
Rappels bibliographiques
Figure 5 : Les principaux effets bénéfiques attribués aux probiotiques. Adapté par
Mercenier et al. (2002).
32
Rappels bibliographiques
Récemment, une étude récente menée par Pulmmer et al. (2004) a démontré que la
consommation, des probiotiques Lactobacillus acidophilus et Bifidobacterium bifidum
simultanément à un traitement antibiotique, prévient l’apparition des diarrhées liées à Clostridium
difficile chez des personnes âgées.
Wang et al. (2004); Myllyluoma et al. (2007) ont démontré l’effet des probiotiques sur les
infections gastro-intestinale en prouvant que la consommation régulière de yaourt, additionné de
Lactobacillus acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis Bb12, induit une suppression
effective de l’infection due à H. pylori.
Des études cliniques et épidémiologiques suggèrent que les probiotiques jouent un rôle
dans la prévention primaire des manifestations atopiques (Pessi et al., 2000; Rosenfeldt et
al.,2003).
Medici et al. (2004) a démontré que les probiotiques B. bifidum, L. acidophilus et L.
paracase peuvent influencer la réponse immunitaire de la souris au niveau intestinal ; Cette
modulation du système immunitaire va dans un sens favorable à la santé.
Des études préliminaires ont révélé que la consommation de yaourt ou de lait fermenté
contenant des probiotiques entraînent une diminution du taux de cholestérol dans le sang et par
conséquent, la réduction des risques d’hypercholestérolémie responsable des maladies
coronariennes. Par exemple, Bukowska et al. (1998) ont mis en évidence une diminution du taux
de cholestérol sanguin chez des sujets soumis à un régime supplémenté avec Lactobacillus
plantarum 299 v.
5.3. Probiotiques et tolérance orale :
Les travaux récents de Prioult et al. (2003) ont mis en évidence l’effet des probiotiques
sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la β-lactoglobuline bovine chez la souris
conventionnelle. L’effet observé au niveau humoral et cellulaire dépendait de la souche
probiotique utilisée. Lactobacillus paracasei s’est avéré plus efficace que Bifidobacterium lactis
et L. johnsonii. Kankaanpa et al. (2003) ont mentionné que Lactobacillus GG, Bifidobacterium
Bb-12 et L. acidophilus inhibent la prolifération des cellules mononuclées du sang périphérique
humain ainsi que l’expression des marqueurs cellulaires CD25, CD69 et de HLA-DR (système
CMH-Antigène humain) sur les lymphocytes T stimulés avec les phytohémagglutinines et la
production de IL2 et IL4.
33
Rappels bibliographiques
Par ailleurs, Ulisse et al. (2001) et Morita et al. (2002) ont démontré que des souches
probiotiques appartenant au genre Lactobacillus induisent, in vitro et in vivo, une production
significative de cytokines anti-inflammatoires notamment IL-10.
De même, Jijon et al. (2004) ont démontré que l’ADN des bactéries probiotiques réduit, in
vitro et in vivo, les réponses inflammatoires au niveau de l’épithélium intestinal. Ils ont étudié
l’effet de l’ADN issu d’un mélange de 8 souches probiotiques (L. acidophilus MB 443, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus MB 453, L. casei MB 451, L. plantarum MB 452, B. longum Y10,
B. infantis Y1, B. breve Y8 et S. salivarius subsp . thermophilus MB 455) sur des mono couches
de cellules épithéliales HT-29, des segments de colon, des splénocytes murins et des souris
déficientes en IL-10, en présence de stimulus pro-inflammatoires. Ils ont observé une réduction
de la sécrétion de IL-8 par les cellules épithéliales HT-29, une inhibition des mécanismes proinflammatoires (protéine kinase, facteur kappa B) et la sécrétion de IFN-γ dans le colon et par les
splénocytes. Une diminution de la production de TNF-α et IFN-γ au niveau de la muqueuse et
une amélioration de l’état histologique des souris ont été également constatées.
5.4. Probiotiques et allergies :
De nombreux travaux de recherches sont actuellement focalisés sur les maladies
allergiques à cause de l’augmentation de la prévalence de ces dernières observées
particulièrement dans les pays occidentaux. L’émergence de ces maladies s’explique, en partie,
par l’hypothèse d’hygiène qui diminue l’exposition du corps aux agents infectieux en réduisant
l’activité du système immunitaire et augmentant les risques d’apparition des désordres
allergiques atopiques (Sheikh & Strachan, 2004). Les études rapportées ont démontré l’effet antiprolifération des souches probiotiques sur les cellules immunitaires impliquées dans les réactions
allergiques (dermatite et allergies alimentaires), l’expression des récepteurs et la production de
cytokines.
En effet, une étude clinique de Mastrandrea et al. (2004), effectuée sur des sujets humains
âgée de 6 à 48 ans, présentant des symptômes cliniques d’asthme et/ou conjonctivite, rhinite,
urticaire, dermatite atopique, allergie alimentaire et le syndrome de l’intestin irrité, a montré les
effets positifs des probiotiques dans le traitement des maladies allergiques. Selon cette étude, une
administration quotidienne d’un mélange (1x109 bactéries vivantes) de Lactobacillus acidophilus
, L. delbrueckii et Streptococcus thermophilus permet de réduire significativement le taux de
34
Rappels bibliographiques
précurseurs circulants de lymphocytes CD34+ impliqués dans l’inflammation allergique
systémique.
Wang et al. (2004) ont rapporté que l’ingestion de lait fermenté contenant Lactobacillus
paracasei -33 ( 2 x 109 ufc/pot) pendant 30 jours, permet d’améliorer la qualité de vie chez des
patients souffrant d’une rhinite allergique.
Kukkonen et al. (2007) ont montré que l’association des probiotiques et plus précisément
les lactobacilles et les bifidobactéries avec les galacto-oligosaccharides (prébiotiques) joue un
rôle dans la prévention des maladies atopiques (exemple de l’eczéma).
5.5. Mécanismes d’interaction entre les probiotiques et les cellules immunitaires :
Le processus de modulation immunitaire est amorcé grâce à l’interaction entre le composé
bactérien actif et des récepteurs cellulaires de signal bactérien se trouvant sur les cellules
immunitaires. Ces récepteurs sont appelés Toll like receptors (TLR)s. Comme le montre la Figure
6, cette interaction génère un signal qui est transmis au noyau de la cellule immunitaire en
induisant la transcription du gène codant pour la synthèse des cytokines. Selon Mastrandrea et al.
(2004), les bactéries et leurs produits sont capables de stimuler le processus de sécrétion des
cytokines par activation des récepteurs cellulaires spécifiques et par conséquent la translocation
nucléaire des facteurs de transcription. Les TLRs influencent le développement de la réponse
immunitaire adaptative par activation des cellules CPA et jouent un rôle crucial dans l’induction
des réponses de type Th1 et Th2 (Dabbagh & Lewis, 2003).
Environ dix récepteurs de signaux bactériens, de nature protéique, ont été répertoriés chez
les cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles, macrophages) (Medzhitov et al., 1997;
Chaudhary et al., 1998; Wang et al., 2003). Par exemple, les TLR2, TLR4 et TLR9 reconnaissent
les signaux provenant des composants de la paroi et du cytoplasme de bactéries Gram-positive
(Saito, 2004). Cependant, le TLR4 reconnaît également le signal induit par le composant de la
paroi de bactéries Gram-négative (LPS), alors que TLR2 et TLR6 agissent ensemble contre les
particules de paroi de bactéries Gram-positives et celles des levures (Takeuchi et al., 2000;
Echchannaoui et al., 2002). Selon une étude menée chez des souris, une stimulation au
lypopolysaccharide entraîne la production d’IFN-γ qui est stimulée par d’autres cytokines telle
que l’IL-12, libérée par les macrophages et les cellules dendritiques (Gerosa et al., 2002 ;
35
Rappels bibliographiques
Figure 6 : Schéma illustrant l’interaction entre les composants bactériens (Lactobacillus
grasseri) et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor. Adapté par Saito (2004).
36
Rappels bibliographiques
Kambayashi et al., 2003). Ishii et al. (2004) ont rapporté que l’ADN des bactéries contient des
motifs CpG interagissant avec le TLR9 des cellules immunitaires en induisant la production de
cytokines, de chémokines et d’immunoglobulines. Chez l’humain, l’expression de la protéine
TLR2 est prédominante sur les monocytes et les neutrophiles et non sur les cellules T, les cellules
B ou les cellules NK (Flo et al., 2001).
En effet, Hosono et al. (1997) ont démontré qu’un composant polysaccharidique, isolé de
la membrane cellulaire de Bifidobacterium adolescentis, induit une forte prolifération des
lymphocytes. De même, Kitazawa et al. (2000) ont souligné qu’un phosphopolysaccharide
extracellulaire neutre, produit par Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL 1073R-1,
stimule la fonction phagocytaire des macrophages in vivo et in vitro .
Le deuxième mécanisme, basé sur l’activité métabolique de la microflore a été beaucoup
moins étudié. Cependant, il a été démontré que l’hydrolyse des protéines laitières par des
bactéries probiotiques modifie leurs propriétés immunomodulantes. En effet, Ng & Griffiths
(2002) ont montré que du lait fermenté avec différentes bactéries probiotiques (dont B. lactis
Bb12 et L. paracasei ssp. paracasei) et dépourvu de tout extrait bactérien après fermentation,
induisait une stimulation, in vitro, de la production d’IL-6 par des macrophages, bien que la
stimulation était moindre avec le lactobacille. L’immunoactivation a été attribuée à des composés
de nature protéique isolés par chromatographie. De plus, du lait fermenté avec Lactobacillus
rhamnosus GG ainsi que certaines fractions peptidiques issues du lait fermenté, ont montré un
pouvoir immunosuppresseur in vitro (Sütas et al., 1996) ; Ceci démontre que l’activité
métabolique des bactéries probiotiques dégrade les protéines alimentaires et libère des composés
immunomodulants (Rokka et al., 1997).
37
Matériels et méthodes
1. Provenance des bactéries :
Les bactéries utilisées dans ce protocole proviennent d’isolements réalisés au Laboratoire
de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l’Université d’Oran. Ce sont:
-
Lactobacillus acidophilus (La)
- Lactobacillus plantarum (Lb pl),
- Bifidobacterium longum (BL),
- Bifidobacterium bifidum (BB).
Ces quatre espèces bactériennes ont été isolées à partir de selles de nourrissons et à partir du
lait commercial pour nourrisson "Bifilac".
2. Lait :
2.1. Ecrémage :
Le lait de vache cru est fraîchement collecté dans une ferme de la région d’Oran. Il est
préalablement écrémé à 4°C par une centrifugeuse ( SIGMA 4 K 10) à 3500 trs/min pendant
20 min ; cette opération est destinée à éliminer la matière grasse, source potentielle de
radicaux libres; le lait est ensuite stérilisé à 105°C pendant 10 minutes.
3. Caractérisation morphologique des bactéries :
3.1. Purification des bactéries :
La purification des bactéries se fait sur 2 milieux de cultures spécifiques permettant
d’isoler les lactobacilles et les bifidobactéries. Il s’agit du MRS acidifié pour la culture des
lactobacilles (Tableau 3; De Man et al., 1960) et du MRS cystéiné pour la culture des
bifidobactéries (Tamine et al.,1995).
L’isolement des espèces est réalisé par la méthode des quadrants sur milieux solides
appropriés. Cette méthode permet l’obtention des colonies isolées, pures après 24 à 48 heures
d’incubation à 37°C pour toutes nos espèces bactériennes (Ayad et al., 2004; Bensoltane et
al., 2004, Chekroun et al., 2006).
38
Matériels et méthodes
Tableau 3 : Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) (De Man et al.,
1960).
Composition
Polypeptone
Extrait de levure
Extrait de viande
Acétate de sodium
Citrate de sodium
Glucose
KH2PO4
MgSO4
MnSO4
Tween 80
Agar-agar
Eau distillée
Quantité
10
g
5
g
10
g
5
g
2
g
20
g
2
g
0,25 g
0,05 g
1
ml
15
g
qsp 1000 ml
Après avoir ajusté le pH à 6,2, le milieu est stérilisé à 120°C pendant 20 minutes en autoclave.
39
Matériels et méthodes
3.2. Etude microbiologique :
3.2.1. Caractérisation morphologique des bactéries :
L’authenticité des espèces étudiées est vérifiée par les tests suivants :
3.2.1.1. Identification morphologique :
3.2.1.1.1 Etude macroscopique :
Cette étude nous a permis d’identifier les caractères culturaux, intégrant à la fois la
morphologie (ronde, plate, à bord régulier...), l’aspect de la culture ( lisse, rugueux…) et la
pigmentation des colonies (couleur blanchâtre, jaunâtre…).
3.2.1.1.2. Etude microscopique :
3.2.1.1.2.1. Coloration de Gram (Larpent & Laprent, 1990; Ventura & Zink, 2002) :
Après séchage et fixation des frottis, nous recouvrons la lame avec le violet de
gentiane pendant une minute, puis nous jetons le colorant et la préparation est recouverte de
lugol pendant 30 secondes, nous jetons le réactif ; la préparation est recouverte d’éthanol à
95° pendant 10 secondes afin de décolorer les bactéries à Gram négatif. Après lavage à l’eau
distillée, nous déposons sur la lame quelques gouttes d’un deuxième colorant appelé fuchsine
de ziehl et nous laissons agir pendant une minute. Enfin, nous lavons la lame avec de l’eau
distillée, puis nous observons, après séchage, à l’immersion à l’aide d’un microscope
biloculaire LEITZ équipé d’un dispositif de microphotographique ORTHOMAT automatisé.
Les bactéries à Gram négatif apparaissent roses et les bactéries à Gram positif violettes.
3.2.2. Identification physiologique des bactéries :
Nous avons procédé à l’identification physiologique des bactéries à l’aide des tests
suivants:
3.2.2.1. Recherche de l’enzyme catalase :
Cette méthode consiste à émulsionner une partie de la colonie de bactéries avec une
goutte d’eau oxygénée; une réduction positive est révélée par le dégagement de bulles
gazeuses (Marchal et al., 1991).
40
Matériels et méthodes
3.2.2.2. Recherche du type respiratoire et fermentaire :
Cette recherche est réalisée en faisant croître chaque bactérie sur un milieu liquide
contenant une cloche de Durham (Marchal et al., 1991). La présence de gaz dans la cloche de
Durham indique un métabolisme lactofermentaire. Le test permet de définir les espèces
bactériennes en fonction de la production d’acide lactique seul (homofermentaires), ou de la
production
concomittante
d’acide
lactique
et
d’éthanol,
d’acétate
et
de
CO2
(hétérofermentaires). L’acide acétique est produit par les bifidobactéries (Ventura & Zink,
2002).
3.2.2.3. Mobilité ou non des bactéries :
Elle est déterminée par simple observation au microscope photonique (Ayad et al.,
2004).
4. Préparation des ferments :
Pour l’étude des caractéristiques d’intérêt technologique des bactéries utilisées, nous
avons procédé, dans une première étape, à la préparation de l’inoculum et des ferments pour
chaque espèce utilisée. Ce travail nécessite du lait de vache stérile supplémenté en cystéineHCl à la concentration de 0,08% qui agit comme antioxydant pour la culture des
bifidobactéries qui sont anaérobies strictes (Dubey & Mistry, 1996).
4.1. Préparation de l’inoculum :
Les précultures, en milieu lait, sont réalisées à partir de cultures cellulaires âgées de 24
heures. Les espèces de bifidobactéries (une ou 2 colonies) sont repiquées dans le lait de vache
écrémé, supplémenté par 0,5% d’extrait de levure et par 0,08% de cystéine-HCl (Frank et al.,
1993; Dubey & Mistry, 1996) et incubées à 37°C sous conditions d’anaérobiose. Pour les
lactobacilles le repiquage se fait seulement dans du lait écrémé stérile. La température
d’incubation est de 37°C pour les lactobacilles et les bifidobactéries. Les précultures ou
inoculums obtenues sont utilisées pour la préparation des cultures pures ou ferments.
4.2. Préparation des ferments :
Pour chaque espèce bactérienne, la culture pure est obtenue en ensemençant le lait
avec 1% de l’inoculum correspondant. Pour les bifidobactéries, le lait écrémé stérile est
supplémenté en cystéine-HCl à raison de 0,08 % (Ventura & Zink, 2002).
41
Matériels et méthodes
5. Protocoles de préparation des différents laits fermentés :
Le lait écrémé stérile est ensemencé par une culture mixte, âgée de 18 heures, à la
concentration de 10%. L’ensemble est homogénéisé et incubé à 45°C jusqu’à coagulation du
lait.
Les cultures mixtes nous ont permis de préparer les laits fermentés suivants:
- Lactobacillus acidophilus (La) + Bifidobacterium bifidum (B bif)
- Lactobacillus acidophilus (La) +Bifidobactérium longum (B long)
Pour l’analyse statistique, chaque opération a été répétée 5 fois, permettant ainsi
d’obtenir pour chaque association 5 échantillons de laits fermentés.
6. Caractérisation des cultures mixtes au cours de la fermentation du lait :
6.1. Profil fermentaire des bactéries :
6.1.1. Mesure de la production d’acide :
Le taux de production d’acide est considéré comme le reflet de l’activité du ferment
(Stadhouders, 1986).
6.1.1.1. Principe de mesure :
L’expression "acidité titrable" désigne l’acidité mesurée par la méthode classique de la
réaction acide-base selon la méthode décrite par Accolas et al., (1977). Cette méthode permet
de neutraliser l’acide produit par la fermentation par une solution de NaOH (N/9) en présence
de phénolphtaléine (à 1% dans de l’alcool). La solution d’hydroxyde de sodium (NaOH)
utilisée est dite soude dornic.
La mesure de l’acidité titrable est faite au début de la fermentation du lait (t=0) puis
toutes les heures jusqu’à coagulation du lait. Les mesures sont effectuées dans le lait
fermenté, par les cultures prises en association.
6.1.1.2. Procédure :
A 10 ml de lait, contenant la culture mixte, sont ajoutées 5 gouttes de phénophtaléine.
Puis, à l’aide d’une burette graduée et sous agitation, nous ajoutons de la soude dornic jusqu’à
ce que la couleur blanche vire au rose. Le volume (V) de la soude utilisé est noté.
Les résultats sont exprimés en utilisant la relation :
Acidité = Vx10,
1 °D = 0,1g d’acide lactique produit dans un litre de lait.
42
Matériels et méthodes
Lait fraîchement collecté
Centrifugation à 3500 tours / min
pendant 20 min.
Ecrémage
Lait écrémé
Stérilisation
105 °C pendant 10 min
Lait stérile
Fermentation
45°C pendant 4h
Sans bactérie
Lait stérile sans bactérie
(Témoin)
Avec (La + BL)
Lait fermenté (La+ BL)
(LF1)
Avec (La+BB)
Lait fermenté (La+ BB)
(LF2)
-72°C pendant
Congélation
Lyophilisation
Lait stérile sans bactérie
(LS) lyophilisé
Lait fermenté (La+ BL)
(LF1) lyophilisé
Lait fermenté (La+ BB)
(LF2) lyophilisé
Figure 7 : Différentes étapes de préparation des échantillons de lait de vache au
Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire (Université d’Oran).
6.1.2. Mesure de la cinétique de variation du pH :
43
Matériels et méthodes
Le pH, indice de l’acidité développée dans le lait au cours du processus de
fermentation, est mesuré en fonction du temps à l’aide d’un pH mètre (Kika Laboretechnik).
7. Caractérisation biochimique des laits fermentés :
7.1. Préparation des échantillons :
Après obtention des différents laits fermentés, nous avons procédé à leur
caractérisation biochimique selon la procédure suivante.
7.1.1. Constitution des échantillons de laits fermentés :
Chaque lait fermenté, constitué de 5 échantillons, est homogénéisé, congelé à -72°C,
déshydraté par lyophilisation à l’aide d’un lyophilisateur (Speed Vac Concentator 100H) et
conservé pour les dosages ultérieurs.
7.2. Mesure de l’activité protéolytique des bactéries :
7.2.1. Dosage des protéines totales (Lowry et al. 1951) :
La détermination des teneurs en protéines totales dans les laits fermentés est effectuée
par la technique de Lowry et al. (1951).
Le principe consiste en l’addition successive, à une solution protéique diluée, d’un sel
de cuivre en milieu alcalin, puis d’un réactif de phénol de folin-cieucalteus (Merck) qui
donne une coloration bleue qui résulte de la réduction de l’acide phospho-tungsto-molybdique
(réactif de Folin) par la tyrosine, le tryptophane et la cystéine contenues dans les protéines. Il
se développe une coloration bleue dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de
protéines de l’échantillon. La composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines
totales figure dans le tableau 4.
7.2.1.1. Procédure :
Le dosage des protéines s’effectue sur les échantillons de laits fermentés après dilution
dans de l’eau distillée. Nous prenons 1ml de chaque échantillon, puis nous ajoutons 0,5ml de
réactif C, bien agiter et laisser agir à la température ambiante pendant 30minutes.
44
Matériels et méthodes
Tableau 4: Composition des solutions utilisées pour le dosage des protéines totales selon la
technique de Lowry et al., 1951.
Solution A
NaCO3 anhydre
2% dans la solution de la soude 0,1 N
Solution B1
CuSO4
5%
Solution B2
Tartrate de K et de Na anhydre
10%
Solution à préparer extemporanément :
Solution B : 1 ml de la solution B1 + 1 ml de la solution B2 + 8 ml d’eau distillée.
Solution C : 1 ml de la solution B + 50 ml de la solution A.
Solution E : Réactif de Folin dilué au demi (V/V) dans de l’eau distillée.
La lecture se fait au spectrophotomètre (JASCO V-530), dans une cuve en quartz à une
longueur d’onde de 750 nm.
45
Matériels et méthodes
La concentration en protéines totales est calculée en référence à une courbe étalon
obtenue avec la sérum albumine bovine.
8. Etude de l’antigénicité résiduelle des laits fermentés :
8.1. Model animale :
Nous avons utilisé 40 souris femelles de souche BALB/cByJlco (BALB/c) d’un poids
moyen de 16 g, âgées de 3 et 5 semaines. Cette souche est caractérisée par une bonne réponse
immunitaire aux différents antigènes. Les animaux sont acquis auprès de l’Institut Pasteur
d’Alger. Ils sont maintenus, pendant toute la durée de l’expérimentation, dans des conditions
d’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Sécurité Alimentaire ; ils sont
maintenus dans des cages appropriées munies chacune d’un biberon et d’une mangeoire et
sont nourris ad libbitum avec des granulés (aliment conventionnel) et de l’eau supplémentée
de polyvitamine (Groupe SAIDAL). Les manipulations sur les animaux sont effectuées en
respectant le bien-être de l’animal, excluant tout état de stress susceptible d’interférer avec les
résultats.
8.2. Adjuvants :
8.2.1. Hydroxyde d’aluminium :
L’hydroxyde d’aluminium ou alun (Merck) est préparé à partir d’une solution
contenant 40 mg d’hydroxyde d’aluminium et 2mL de PBS. L’alun est un adjuvant utilisé
pour la vaccination chez l’homme et chez les animaux.
8.3. Immunisation des animaux à la β-Lg :
8.3.1. Répartition des lots:
Les 40 souris BALB/c femelles sont réparties en 4 lots de 10 dont 3 expérimentaux et
un lot témoin.
Le premier lot :
La colonisation du tube digestif des 10 souris se fait avec une bactérie pure de
Lactobacillus plantarum. Une colonie de cette bactérie est prélevée sur le milieu de culture
approprié puis diluée dans 9 ml d’une solution saline; 0,3 ml de cette solution sont introduits
dans le tube digestif de l’animal pendant 18 jours.
Après le 18èmejours (J1), les animaux subissent un gavage avec du lait de vache
fermenté par l’association de Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longumt lyophilisé
46
Matériels et méthodes
puis dilué dans une solution saline à raison de 120 mg/ml; 0,3 ml de cette solution sont
introduits par intubation intragastrique.
2ème lot expérimentale :
Il est composé de 10 souris qui subissent une colonisation du tube digestif avec une
bactérie pure: Lactobacillus plantarum pendant 18 jours comme décrit précédemment.
Après le 18ème jour (J1), le gavage est fait avec du lait de vache fermenté par
l’association de Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum lyophilisé puis dilué
dans une solution saline à raison 120 mg/ml; 0,3 ml de cette solution sont introduits par
intubation intagastrique.
3ème lot expérimentale :
Il est composé de 10 souris qui ne reçoivent ni bactéries pour la colonisation de
l’intestin ni du lait fermenté pour le gavage. Ce dernier se fait avec une solution de NaCl 9%°
à raison de 0,3 ml pendant 18jours.
4ème lot témoin :
Il est composé de 10 souris ne recevant aucun agent sensibilisant particulier.
8.3.2. Protocole d’immunisation :
Les immunisations sont faites en présence d’alun. La solution injectable est préparée à
partir d’une solution contenant 5mg de β-Lg dissous dans 0,5 ml de PBS. A 20µl de cette
solution, sont ajoutés 2 ml de PBS + 40 mg d’oxyde d’aluminium (Al (OH)3) ( Merck ).
Chaque souris reçoit par voie sous cutanée 100µl de cette solution. Les immunisations ont
lieu au 5ème jour après le dernier gavage, pour tous les groupes expérimentaux (groupes de
souris sacrifié au 28ème jours et groupes de souris sacrifié au 50ème jour), selon la répartition
indiquée dans la figure 8:
Chaque lot est réparti en deux groupes de 5 souris chacun.
- Groupe sacrifié au 28ème jour.
-Groupe sacrifié au 50ème jour ; durant cette période il reçoit deux rappels supplémentaires à la
β-Lg au 21ème et au 35ème jour.
47
Matériels et méthodes
18 jours
Colonisation
bactérienne
(G)
1er jour
Induction de
la tolérance
(G)
5ème jour
Injection
(SC)
28ème jour
50ème jour
5 souris
Sacrifice
10 La
plantarum
LF1
β-Lg
SC au 21ème jour
5 souris
SC au 35ème jour
Sacrifice
5 souris
Sacrifice
30
souris
10 La
plantarum
LF2
β-Lg
SC au 21ème jour
5 souris
Sacrifice
SC au 35ème jour
5 souris
Sacrifice
10. Solution
saline
Solution saline
β-Lg
SC au 21ème jour
SC au 35ème jour
Sacrifice
5 souris
Figure 8 : Protocole de sensibilisation et de gavage des souris.
G : gavage ; Sc : immunisation sous cutanée ; β-Lg : β-lactoglobuline ;
LF1 :Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum ;
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
8.3.3. Prélèvements des échantillons sanguins :
48
Matériels et méthodes
A J0 (avant la colonisation bactérienne) et au jour de sacrifice des animaux, le sang est
prélevé à l’aide d’une pipette pasteur, par le sinus orbitale de l’œil. Le sang prélevé est
centrifugé à 3500 trs /min pendant 15 min à 4°C. Le surnageant correspondant au sérum est
séparé du culot, mis en parties aliquotes puis conservé à -20°C pour le dosage des
immunoglobulines spécifiques IgG.
9. Evaluation du degré de sensibilisation des animaux :
9.1. Titrage des anticorps IgG sériques anti β-Lg par dosage immunoenzymatique :
Afin d’évaluer le degré de sensibilisation des animaux à la β-Lg native (Merck), la
technique immunoenzymatique ELISA a été utilisé, selon un procédé non compétitif en
mesurant les anticorps de type IgG anti- β-Lg .
9.1.1. Principe :
Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à doser
réagissent dans un premier temps avec l’antigène immobilisé par adsorption sur une phase
solide. Dans un deuxième temps, la quantité d’anticorps fixé par l’antigène est mesurée à
l’aide d’un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline).
Dans le cadre de notre travail nous avons utilisé des plaques de microtitration en
polystyrène (NUNC Maxisorb, 96 puits à fond plat), qui permettent d’adsorber la plupart des
antigènes dilués en phase alcaline. Après dépôt de l’immunosérum contenant les anticorps
spécifiques, la phase solide est lavée et nous révèlons la présence de ces anticorps par
l’addition d’un conjugé qui correspond à des anti-IgG de souris (Sigma) suivi d’un ligand
spectravidin peroxydase (Sigma). La dernière étape correspond au dosage de l’enzyme
marqueur et cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de molécules d’enzymes que
nous pourrons détecter dépendra le seuil de sensibilité.
Le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde d’hydrogène
(H2O2).Au cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, nous
ajoutons à la solution un chromogène, l’Orthophènylène Diamine (OPD).
9.1.2. Mode opératoire :
49
Matériels et méthodes
ƒ
Les microplaques sont sensibilisées par 10 μg/ml de β-Lg diluée dans du PBS 0,01M
(tampon phosphate salin) à pH 7,4 et sont incubées pendant au moins une nuit à +
4°C.
ƒ
Après un lavage avec du PBS- Tween 20, 0,05% (PBS/Tw 20), 200µL de PBS-BSA
3% (pour la β-Lg) sont déposés dans les puits et la plaque est incubée à 37°C pendant
1 heure pour saturer les sites non spécifiques.
ƒ
La plaque est ensuite rincée avec du PBS/Tw 2O et les échantillons de sérum de
souris immunisées à la β-Lg, sont diluées dans du PBS BSA 1% Tween 0,05%
(tampon de dilution) à raison de 10-2 à 10-7 sont déposés dans les puits (100µl par
puits). La plaque est incubée à 37°C pendant 2 heures.
Un autre lavage est effectué avec du
PBS/Tw20 avant le dépôt
de l’anticorps
(anticorps polyclonal B 9904 Sigma pour les IgG totales spécifiques).
Les microplaques sont incubées pendant 1 heure à + 37°C.
ƒ
Après lavage avec du PBS/Tw20, la Streptavidine peroxydase E-2886 (Sigma) est
diluée au 1/5000 et déposée à raison de 100µl par puits ; la plaque est incubée à 37°C
pendant 30 min.
ƒ
Après lavage avec le PBS/Tw20, l’eau oxygénée (H2O2) associé à un chromogène :
l’orthophénylène diamine (OPD), dans du tampon citrate de sodium (0,05M à pH 5,1)
est déposé à raison de 200µL/puits.La réaction colorée se développe en 30 minutes à
température ambiante et à l’abri de la lumière. L’ajout de H2SO4 2N a permis de
stopper la réaction (Tableau 5 et 6).
ƒ
L’intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l’aide d’un lecteur
(ELx 800).
ƒ
Des témoins positifs et négatifs sont inclus dans chaque plaque afin de contrôler la
spécificité et la sensibilité de chaque mesure.
10. Etude histologique de l’intestin de souris sensibilisé par voie parentérale à la β-Lg
:
Cette étude a pour but de vérifier l’existence d’une infiltration lymphocytaire au
niveau de la muqueuse intestinale ainsi que la présence d’une atrophie villositaire en réponse
à l’immunisation des souris par la β-Lg native. Les souris ont subit une colonisation
bactérienne et un gavage avec un lait fermenté probiotique.
Tableau 5 : Composition du tampon phosphate salin PBS, 1 M, pH =7,4 x10.
50
Matériels et méthodes
Solutions
Quantités
Na2HPO4,12 H2O
29 g
KH2PO4
2g
NaCl
80 g
Kcl
2g
Thymérosal
1g
Eau ultra pure
1000 ml
Nous effectuons une dilution de 1/10 ème de cette solution pour obtenir à la fin une solution de
phosphate salin PBS (0,01M) pH = 7,4.
Tableau 6 : Composition des solutions tampons d’ELISA.
Tampons
Produits
Tampon de capture
NaHCO3 (0,1 M)
Tampon de lavage
PBS
Tween 20
Tampon de saturation
PBS
BSA
Tampon de dilution
PBS
pH=9,6
(0,01M) pH = 7,4
0,05 %
(0,01M) pH = 7,4
3%
(0,01 M) pH = 7,4
BSA
3%
Tween 20
0,1 %
L’étude histologique est faite sur des fragments isolés d’intestin des souris composant
les lots suivants:
51
Matériels et méthodes
-Sensibilisées à la β-Lg et ayant subit une colonisation bactérienne suivit d’un gavage avec le
1er lait fermenté.
- Sensibilisées à la β-Lg et ayant subit une colonisation bactérienne suivit d’un gavage avec le
2ème lait fermenté.
-Sensibilisées à la β-Lg et gavées avec une solution saline.
-Non sensibilisées pris comme témoins.
Le jéjunum est récupéré le jour de sacrifice de chaque groupe (28ème et 50ème jour)
10.1. La fixation :
La fixation a pour but essentiel d’assurer une immobilisation des constituants
cellulaires ou tissulaires dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant (Nzelof, 1972).
C’est une phase importante ; son but est de ne pas endommager les composants du tissu que
nous voulons fixer telles que les cellules immunitaires.
Les fragments intestinaux sont étudiés selon le protocole suivant :
Dés leur prélèvement, les fragments de jéjunum sont mis directement dans du ringer
glacé. Ils sont rincés puis découpés en petits morceaux et mis pendant 24h dans du phormol à
10% tamponné avec du CaCl2 à raison de 1%.Les solutions de formaldéhyde sont les fixateurs
les plus répandus. On les utilise fréquemment à des concentrations variants de 10% à 20%. Le
formaldéhyde a de nombreuses qualités : il pénètre rapidement, conserve bien les structures et
n’entraîne pas de durcissement excessif ni de rétrécissement notable des tissus. Par contre, le
stockage prolongé des échantillons provoque une rigidité excessive des échantillons, une
faible coloration du noyau ainsi que la formation d’un pigment brun dû à la dégradation de
l’hémoglobine.
10.2. Inclusion et coupe des tissus :
10.2.1. Les procédés d’inclusion :
En technique d’histologie courante, les tissus fixés ne sont pas coupés tels quels, mais
après inclusion dans un milieu solide qui maintient les structures, leur donne une consistance
qui empêche la fragmentation des tissus lors de la coupe et assure l’obtention de sections très
fines, régulières et homogènes. Le plus couramment utilisé de ces milieux est la paraffine,
mais il en existe d’autres.
52
Matériels et méthodes
Chimiquement, les paraffines sont des mélanges d’hydrocarbures solides à poids
moléculaire élevé; ces substances sont en effet caractérisées par leur indifférence aux agents
chimiques.
Elles se présentent sous forme de substances blanches, légèrement translucides,
inodores, onctueuses au toucher.
10.2.2. Inclusion à la paraffine :
Les paraffines n’étant pas solubles dans l’eau, il n’est pas possible d’y plonger un tissu
fixé. Toujours très chargé d’eau, il est donc nécessaire d’effectuer au préalable une
déshydratation à l’alcool absolu. La déshydratation permet l’élimination de l’eau du fragment
d’intestin en plongeant celui-ci dans de l’alcool choisi (alcool éthylique) pendant un temps
suffisant d’ordre croissant : alcool à 70°, 90° et alcool absolu 99,9%. La durée de la
déshydratation est fonction du volume des fragments tissulaires, les paraffines n’étant pas
solubles dans les alcools.
La déshydratation complète du fragment d’intestin a suivi les étapes suivantes :
•
Bain d’alcool à 70° pendant 25 minutes.
•
Bain d’alcool à 90° pendant 25 minutes.
•
Bain d’alcool à 100° pendant 25 minutes.
•
Bain de toluène pendant 10 minutes.
•
Bain de toluène pendant 15 minutes.
Il faut ensuite passer le fragment déshydraté dans un milieu intermédiaire, soluble à la
fois dans l’alcool et la paraffine (par exemple : toluène, xylène, chloroforme….).
10.2.2.1. Imprégnation par la paraffine :
Elle s’effectue dans un bain de paraffine à l’état liquide durant une heure dans une
étuve dont la température est réglée légèrement au dessus de son point de fusion soit 56°.
Etant donné que la qualité des coupes est en grande partie fonction de l’absence de
toute trace de solvant dans la paraffine de la coupe, nous imprégnons les fragments d’intestins
dans 2 bains successifs de paraffine : le premier bain dure une heure et le deuxième bain dure
2 heures. Ces bains doivent être fréquemment changés car ils se chargent progressivement de
solvant. La persistance de toluène abaisse le point de fusion de la paraffine rendant donc
celle-ci plus molle et moins propre à la coupe.
53
Matériels et méthodes
A la sortie du dernier bain de paraffine, l’échantillon est déposé dans la paraffine
fondue vierge que nous coulons dans un moule constitué par des barres métalliques (barres de
Leuckart) disposées sur une lame de verre ; on peut utiliser également des moules tous
préparés en plastique.
Le refroidissement à la température ambiante de cette paraffine amène sa solidification
en un bloc prêt à être coupé.
Remarque :
Les blocs obtenus peuvent se conserver durant de très longues périodes.
10.2.3. Microtomisation et étalement des coupes :
Les échantillons d’intestin sont coupés à l’aide d’un microtome. Les coupes obtenues
ont une épaisseur de 4 µm. Le microtome comporte :
•
Un support de rasoir,
•
Un porte-objet où sera inséré le bloc,
•
Un système d’avance mécanique permettant le déplacement de l’objet en direction du
rasoir fixé et dont l’angle de coupe est vertical.
•
Un bouton gradué de 0 à 20 µm pour régler l’épaisseur de la coupe.
L’étalement des coupes se fait sur une lame de verre qui est recouverte d’une solution
d’albumine (2g d’albumine + 50 ml de glycérine dans 1000 ml d’eau distillée). Cette lame est
placée sur une plaque chauffante réglée à une température convenable, inférieure à celle du
point de fusion de la paraffine. L’ensemble coupe lame de verre est retiré de la platine,
égoutté et mis à sécher pendant au moins une heure avant d’être coloré ou conservé à l’étuve à
température ambiante jusqu’au moment de la coloration.
10.3. Coloration :
Avant de procéder à la coloration des coupes, il faut déparaffiner et réhydrater
l’échantillon.
10.3.1. Déparaffinage :
Pour déparaffiner les coupes, il suffit de les placer sur une plaque chauffante à 56°C et
les mettre ensuite dans 2 bains successifs de toluène durant 2 minutes pour chaque bain.
10.3.2. Réhydratation :
L’hydratation de l’échantillon se fait dans 3 bains successifs d’alcool éthylique d’ordre
décroissant (100°, 95°, 70°) durant 2 minutes par bain ; le rinçage de la coupe se fait à l’eau
courante.
54
Matériels et méthodes
10.3.3. Technique de coloration :
10.3.3.1. Coloration nucléaire :
Les colorations nucléaires que nous avons utilisées sont simples. La plupart sont
progressives mais certaines colorations par l’hématoxyline nécessitent une différenciation.
Les colorants nucléaires les plus utilisés en histologie courante sont les hématoxylines
qui colorent les noyaux en bleu-noir, brun-noir ou noir.
L’hématoxyline est une matière colorante naturelle extraite à l’éther de certains bois
d’Amérique du Sud qui ne se trouvent que dans la zone tropicale.
Les propriétés colorantes de l’hématoxyline n’apparaissent qu’après une oxydation par
l’oxygène atmosphérique ou par adjonction d’un agent oxydant (eau oxygénée, Permanganate
de potassium,…).
L’hématéine, substance colorante de l’hématoxyline, ne peut colorer correctement les
noyaux des fragments d’intestins de nos souris que si elle est additionnée d’alun de potassium
ou d’alun de fer ; l’hématéine possède une forte charge positive et se comporte comme un
puissants colorants basiques.
10.3.3.2. Coloration topographique générale :
Coloration à l’hémalun-éosine :
Nos lames ont été colorées à l’hémalunéosine : c’est la plus simple des colorations
« combinées ». Nous avons fait agir successivement un colorant nucléaire « basique »
l’hématéine et un colorant cytoplasmique « acide », l’éosine. La coloration du noyau est bleunoir et le cytoplasme rose à rouge.
L’hématoxyline de Harris (Hould, 1984) est utilisée pour colorer les noyaux. La
préparation de ce produit se fait comme suit :
•
Dissoudre 5g d’hématoxyline dans 50 ml d’éthanol
•
Dissoudre 100g d’alun de potassium dans 1000 ml d’eau distillée en chauffant
légèrement et retirer la solution du feu.
•
Mélanger les 2 solutions
•
Faire bouillir le mélange, le retirer du feu.
•
Ajouter avec précaution, par petites quantités 2,5 g d’oxyde mercurique
•
Chauffer de nouveau jusqu’à ce que la solution acquiert une couleur pourpre foncée
•
Retirer immédiatement du feu et refroidir aussitôt dans un grand récipient rempli
d’eau.
55
Matériels et méthodes
•
Filtrer avant usage.
•
Ajouter, si nécessaire avant usage, 2 à 4% d’acide acétique glacial pour augmenter la
précision de la coloration de nos lames comme suit :
•
Mettre les lames dans l’hématoxyline de Harris durant 2 à 3 minutes.
•
Laver les lames à l’eau ordinaire.
•
En cas de surcoloration, les lames sont trempées légèrement dans l’alcool
chlorhydrique (100 ml d’alcool à 95° + 5 gouttes d’HCl à 1%) pendant quelques
secondes.
•
Bleuir dans une solution aqueuse saturée de carbonate de lithium (rinçage).
•
Laver les lames à l’eau ordinaire.
•
Mettre les lames dans un bain d’alcool éthylique 1 à 2 minutes.
•
Colorer les lames à l’éosine alcoolisée (2 g d’éosine dans 100 ml d’alcool éthylique)
pendant 5minutes.
•
Rinçage des lames dans 2 bains successifs d’alcool éthylique à 70° puis à 95°.
•
Mettre les lames dans du toluène pendant 1 minute.
•
Mettre entre lame et lamelle une goutte de baume de Canada ou d’eukitt.
•
Laisser sécher puis observer au microscope.
10.3.4. Mesure des villosités :
Le relief villositaire au niveau du jéjunum est apprécié suivant différents critères,
essentiellement la hauteur des villosités.
10.3.4.1. Principe de la mesure :
Les mensurations des hauteurs des villosités sont effectuées sous un microscope
optique muni d’un micromètre oculaire. Pour déterminer le nombre de microns correspondant
pour chaque objectif, nous plaçons sous le microscope un micromètre objectif qui est une
sorte de lame présentant des graduations. Nous déterminons le nombre de divisions sur le
micromètre objectif. Ce nombre correspond à un nombre précis de microns. Nous avons
utilisé un micromètre à 200 divisions qui correspondent à 2 mm.
Le micromètre oculaire comporte 100 divisions. Ces 100 divisions correspondent à
128 divisions sur le micromètre pour l’objectif (x10).
Puisque les 200 divisions sur le micromètre objectif correspondent à 2000 µm, donc les 128
divisions correspondent à 1280 µm.
56
Matériels et méthodes
Tableau 7 : Composition du colorant à l’hématoxyline de Harris (Hould, 1984)
Hématoxyline
5g
Ethanol
50ml
Alun de potassium
100ml
Eau distillée
1000ml
Faire bouillir le mélange
Oxyde mercurique
2,5g
Chauffer la solution et filtrer avant usage.
57
Matériels et méthodes
Les 100 divisions du micromètre oculaire correspondent à 1280 µm, donc une division
correspond à 12,8 µm pour l’objectif (x10). Le même principe de calcul est appliqué pour les
autres objectifs.
10.3.4.2. Calcul :
Nous procédons aux calculs des moyennes des hauteurs villositaires des échantillons
d’intestin des 4 lots de souris.
10.3.5. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux :
Nous utilisons la méthode préconisée par Rouquette (1980) que nous adaptons à la souris.
Pour chaque tissu, nous réalisons 3 comptages en procédant, dans un premier temps, à une
numération de 100 entérocytes, et nous déterminons le nombre de lymphocytes intraépithéliaux (LIE). Cette méthode est la plus souvent utilisée chez le rat et le lapin. Le
dénombrement des lymphocytes dans 100 entérocytes recouvre une étendue épithéliale
suffisamment importante.
Pour obtenir un comptage fiable des (LIE), 2 conditions doivent être réunies :
•
Effectuer la rénumération sur 100 entérocytes contigus.
•
Renouveler ce comptage sur 3 champs différents et si possible sur des fragments
d’intestins différents.
Remarque :
Ce comptage permet de comparer le nombre des (LIE) dans les échantillons d’intestin.
10.4. Analyse statistique :
Les différents tests utilisés :
Le seuil de signification p retenu est 0,05.
Les comparaisons de deux moyennes sont réalisées en moyen d’un test de t de student.
Les comparaisons de plusieurs moyennes sont réalisées par l’analyse de variance (ANOVA).
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard.
Les différentes données sont analysées à l’aide d’un logiciel STATISTICA version 6,0.
58
Résultats
1. Etude microbiologique :
1.1. Caractérisation morphologique des ferments :
1.1.1. Aspect macroscopique et microscopique des bactéries :
L’identification des bactéries qui nous a permis de vérifier l’authenticité des
espèces étudiées, a donné les résultats suivants :
1.1.1.1. Les lactobacilles :
1.1.1.1.1. Lactobacillus acidophilus :
Les bactéries Lactobacillus acidophilus (La) (Fig 9 A et B), se présentent sous
forme de bâtonnets de différents types. Elles sont anaérobie facultative ou microaérobie.
Ces bactéries son sensibles à l’acide nalidixique et au lithium chloride : ce sont des
lactobacilles.
Les tests réalisés montrent que toutes les bactéries sont Gram positif, non mobiles,
non sporulés; leur croissance est favorisée en anaérobie.
1.1.1.1.2. Lactobacillus plantarum :
Les bactéries Lactobacillus plantarum (Lb pl) (Fig 10 A et B) se présentent sous
forme de courts bâtonnets en chaînettes et en paires. Elles sont Gram positif, non mobiles,
non sporulées; leur croissance est favorisée en anaérobie.
1.1.1.2. Les bifidobactéries :
Les espèces Bifidobacterium bifidum (BB) (Fig 11 A et B), Bifidobacterium longum
(BL), (Fig 12 A et B) se présentent sous forme de bifides (V, Y), courts bâtonnets à
extrémité arrondie et souvent sous formes spatulées de différents types ce qui fait le
principal caractère des bifidobactéries (polymorphisme cellulaire).
L’observation macroscopique montre que les colonies de Bifidobacterium bifidum
sont plus grandes que celles de Bifidobacterium longum.
Les tests réalisés montrent que toutes les bactéries sont Gram positif, non mobiles,
non sporulées; leur croissance est favorisée en anaérobie, catalase et nitrate négative; elles
sont anaérobies strictes.
Les résultats des études macroscopiques et microscopiques des bactéries étudiées
sont représentés dans le tableau 8.
59
Résultats
A
Aspect macroscopique des colonies de La.
B
Aspect microscopique de La (Gx 100).
Figure 9: Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La, sur milieu MRS
acidifié, après coloration de Gram.
A
Aspect macroscopique des colonies de Lb pl.
B
Aspect microscopique de Lb pl (Gx100).
Figure 10 : Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La pl, sur
milieu MRS, après coloration de Gram.
60
Résultats
A
Aspect macroscopique des colonies de BB.
B
Aspect microscopique de BB (Gx100).
Figure 11: Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BB, sur milieu
MRS cystéiné, après coloration de Gram.
A
Aspect macroscopique des colonies de BL.
B
Aspect microscopique de BL (Gx100).
Figure 12: Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BL, sur milieu
MRS cystéiné, après coloration de Gram.
61
Résultats
Tableau 8: Résultats des différents aspects macroscopiques et microscopiques des souches
étudiées.
Souches Milieu
BL
Aspect
Aspect microscopique
d’isolement
macroscopique
MRS c
Petites
colonies Courts
blanchâtres,
regroupés
Gram
bâtonnets +
ou
isolés
à
visqueuses, bombées à extrémités arrondies, avec
contour régulier.
BB
MRSc
des rares bifurcations (V).
Colonies blanchâtres, Bâtonnets
à bord régulier.
extrémités
courts
à +
arrondies,
forme bifide(Y,V).
La
MRSa
Petites
colonies Longs
blanchâtres
bacilles
en +
bacilles,
en +
et chaînettes.
visqueuses.
Lbpl
MRS
Colonies blanchâtres, Courts
à bord régulier.
chaînettes ou en paires.
62
Résultats
2. Etude biochimique des laits fermentés :
2.1. Cinétique de production de l’acide par les associations de lactobacilles et
bifidobactéries :
La courbe d’évolution en fonction du temps de l’acidité titrable produite par les 2
associations des lactobacilles et bifidobactéries sont illustrés dans la figure 13. Les
résultats obtenus sont comparés à ceux de lait stérile pris comme témoin.
Nos résultats montrent une augmentation régulière de l’acidité produite en fonction
du temps d’incubation dans les deux types de laits (LF1 et LF2). Au temps initial la quantité
d’acide produite est de : 21,8 ± 0,33 D°, 21,2 ± 0,37 D°, 18 ± 0,09 D° respectivement pour
le lait LF1, LF2 et LS. Après 4h d’incubation, la quantité d’acide produite atteint 36 ±
0,63°D pour le lait LF1 et 34,8 ± 0,37 D° pour le lait LF2. La quantité d’acide dans les deux
laits fermentés est significativement élevée (p ≤ 0,001) par rapport à celle du lait stérile
18,4 ± 0,24 D°. Nous n’avons pas noté une différence significative entre le lait LF1 et le
lait LF2.
Les résultats obtenus, à la fin de l’incubation, montrent une augmentation de la
production d’acide hautement significative (p ≤ 0,001) dans le lait LF1 par rapport au début
de la fermentation. Dans le LF2 l’augmentation de la production d’acide est très
significative (0,001≤ p ≤ 0,01). Dans le lait stérile, la quantité d’acide reste stable et
aucune différence significative n’est établie entre le début et la fin d’incubation.
2.2. Cinétique de variations du pH au cours de la fermentation du lait par les
associations de lactobacilles et de bifdobactéries :
Les cinétiques d’abaissement du pH du lait de vache fermenté par les associations
d’espèces bactériennes ont été suivies au cours de la fermentation à 45°C (Figure14) et
sont comparées avec le lait de vache stérile. Les résultats montrent une baisse du pH dans
les deux laits fermentés qui traduit l’activité métabolique des espèces utilisées.
Au temps initial d’incubation, les valeurs du pH sont de 6,27 ± 0,04 ; 6,31 ±
0,07 et 6,63 ± 0,02 respectivement pour le lait LF1, LF2 et LS. Les résultats obtenus après
4h d’incubation montrent une baisse significative du pH dans les deux types de laits
fermentés et les valeurs sont de 5,32 ± 0,09 (p ≤ 0,001), 5,92 ± 0,1 (p ≤ 0,001)
respectivement pour le lait LF1 et LF2, alors que le pH de lait stérile reste stable (6,62 ±
0,06) (diminution non significative).
Nos résultats montrent que, après 4h d’incubation, le pH du lait LF1 a baissé d’une
façon très significative (p ≤ 0,001) par rapport au lait stérile (témoin) et par rapport au lait
63
Résultats
Acidité titrable
(°Dornic)
40
₤₤₤
***
35
**
$$$
30
25
20
15
10
Temps (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
Figure 13: Cénitique de production de l’acide au cours de la fermentation du lait de vache
à 45°C (LF1, ♦; LF2, ■ ; LS, ▲).
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait stérile de vache sans ferment (témoin).
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
*** : LF1 (t0) vs LF1 (t240) (p ≤ 0,001).
**: LF2 (t0) vs LF2 (t240) (0,001≤ p ≤ 0,01).
₤₤₤ :LF1vsLS à t240 (p ≤ 0,001).
$$$ :LF2vsLS à t240 (p≤ 0,001).
Nous notons qu’il n’y pas de différence significative entre t0 et t240 dans LS.
Nous notons qu’il y a une différence non significative entre LF1 et LF2 à la fin de
l’incubation.
La différence est significative entre le début et la fin de l’incubation dans deux laits
fermentés.
64
Résultats
pH
7
6,5
***
₤₤₤
6
¥¥¥
$$$
5,5
5
4,5
4
0
30
60
90
120
150
180
210
240
Temps (min)
Figure 14 : Cinétique de variations du pH au cours de la fermentation de lait de vache à
45°C (LF1, ♦ ; LF2, ■ ; LS, ▲).
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait stérile de vache sans ferment (témoin).
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
n :nombre d’échantillon
$$$ : LF1 à t0 vs LF1 à t240 (p≤0,001).
***: LF2 à t0 vs LF2 à t240 (p≤0,001).
¥¥¥ : LF1 vs LS à t240 (p≤0,001).
₤₤₤ : LF2 vs LS à t240 (p≤0,001).
Nous notons qu’il n’y pas de différence significative entre t0 et t240 dans le lait stérile.
Nous notons qu’il y a une différence hautement significative (p≤0,001) entre LF1, LF2 et
LS à la fin de la fermentation.
La différence est hautement significative (p≤0,001) entre le début et la fin de l’incubation
dans les deux laits fermentés.
65
Résultats
LF2 (p ≤ 0,001). Nous avons noté une diminution très significative du pH de lait LF2 (p ≤
0,001) par rapport au lait stérile.
2.3. Evaluation de la quantité de protéines totales dans les laits fermentés comparée à
celle du lait stérile :
La caractérisation physiologique des bactéries après fermentation du lait est réalisée
grâce à l’évaluation de la protéolyse par la quantification des teneurs en protéines totales.
Pour assurer leur croissance, les bactéries dégradent obligatoirement les protéines
du lait en peptides et acides aminés qu’elles utilisent comme source d’azote au cours de la
fermentation grâce à leurs enzymes spécifiques (exopeptidases et endopeptidases).
2.3.1. Teneurs en protéines totales des laits fermentés par Lactobacillus
acidophilus (La) associé à des bifidobactéries :
Les teneurs en protéines totales (µg/mg) des laits fermentés (LF1 et LF2) comparées
à celles du lait stérile (témoin) sont reportées dans la figure 15. Nos résultats montrent une
diminution régulière de la teneur en protéines totales au cours de l’incubation dans les
deux laits fermentés. Nous n’avons constaté aucune diminution de la teneur en protéines
dans le lait stérile.
Au temps initial de l’incubation, les teneurs en protéines totales sont de 287,85 ±
4,42 µg/mg ; 298,88 ± 4.32 µg/mg ; 302,09 ± 1,79 µg/mg respectivement pour le lait LF1,
LF2 et LS. Après 4h d’incubation, nous avons noté une diminution significative dans les
deux laits fermentés: 215,89± 5,68µg/mg (p≤0,001) dans le lait LF1et 242,44 ± 6,34µg/mg
(p≤0,001) dans le lait LF2. Dans le lait écrémé stérile (témoin) nous n’avons remarqué
aucune différence entre le début et la fin de l’incubation (301,86 ± 3,19 µg/mg).
Nous notons que la diminution de la teneur en protéines totales est significative
dans le lait LF1 par rapport au lait LF2 (p≤0,001).
En conclusion, les résultats montrent que les associations bactériennes testées
dégradent différemment les protéines du lait et que c’est l’association (La + B longum) qui
donne le meilleur profil protéolytique (p≤0,001) par rapport au lait LF2 et au témoin (LS)
(p≤0,001).
66
Résultats
Protéines totales
(µg/mg)
350
300
¥¥¥
₤₤₤
$$$
250
200
€€€
***
150
100
50
Temps (min)
0
30
60
90
120 150
180
210 240
Figure 15 : Teneur en protéines totales (µg/mg) dans les laits (LF1, ♦ ; LF2, ■ ; LS, ▲) au
cours de la fermentation à 45 °C.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait stérile de vache sans ferment (témoin).
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
n :nombre d’échantillon.
*** : LF1 à t0 vs LF1 à t240 (p≤0,001).
$$$ : LF2 à t0 vs LF2 à t240 (p≤0,001).
€€€: LF1 vs LS à t240 (p≤0,001).
₤₤₤: LF2 vs LS à t240 (p≤0,001).
¥¥¥ : LF2 vs LF1 à t240 (p≤0,001).
Nous ne notons aucune différence significative entre t0 et t240 de LS.
Nous notons une diminution significative de la teneur en protéines totales dans le lait LF1
par rapport au lait LF2.
67
Résultats
3. Titrage des anticorps IgG sériques anti –β-Lg :
Une technique de dosage spécifique des anticorps a été utilisée pour mesurer la réponse
immunologique des animaux après sensibilisation par voie parentérale à la β-Lg. Il s’agit
de la méthode ELISA qui permet d’évaluer la réponse immune systémique par la mesure
des titres en IgG spécifiques dirigées contre l’antigène sensibilisant, la β-Lg.
3.1. Contrôle de l’immunisation chez les souris sacrifiées au 28ème jours:
Les animaux sacrifiés au 28ème jour ont différents titres en IgG sériques anti-β-Lg.
Les titres en IgG sériques anti-β-Lg sont de 1/100ème et de 1/460ème chez les groupes
gavés au lait LF1 et LF2 respectivement et sont de 1/4600ème chez le groupe gavé avec une
solution saline (Fig.16).
La figure 16 monte également que les titres en IgG sériques anti-β-Lg du groupe
gavé au lait LF1 sont significativement diminués (p ≤ 0,001) par rapport au groupe gavé
avec une solution saline (témoin positif). De même, nous constatons une diminution
hautement significative des titres en IgG sériques anti-β-Lg chez le groupe gavé au lait
LF2 (p ≤ 0,001) par rapport au groupe gavé avec la solution saline.
Par ailleurs, nous ne notons aucune différence significative des titre en IgG entre le
groupe (LF1+β-Lg ) et le groupe (LF2+β-Lg ).
Les résultats montrent que les IgG sériques anti-β-Lg ne sont pas détectables chez
les animaux non sensibilisés (témoins) (Fig. 16).
68
Résultats
IgG
Log (1/ Titre)
5
4,5
4
3,5
3
€€€
2,5
₤₤₤
2
1,5
1
0,5
0
Témoin
SS + β-Lg
LF1+β-lg
LF2+β-lg
Souris
Figure 16 : Titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez les souris sensibilisées
à la β-Lg (n=5) par voie sous cutanée et chez les souris témoins (n=5) sacrifiées au 28ème
jour.
n : nombre d’animaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
β-Lg : Betalactoglobuline.
Titre : le plus faible taux d’anticorps qui détecte l’antigène sensibilisant après différentes
dillutions.
₤₤₤ : (SS+ β-Lg) vs (LF1 + β-Lg) ((p ≤0,001).
€€€ : (SS+ β-Lg) vs (LF2 + β-Lg) (p ≤0,001).
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
Nous notons que les IgG sériques anti-β-Lg ne sont pas détectables chez les
animaux non sensibilisés (Témoin). Les titres des IgG spécifiques atteignent, au moment
du sacrifice, des titres significatifs (p≤0,001) chez les souris gavées avec une solution
saline puis immunisées à la β-Lg (témoin positif) par rapport aux groupes de souris gavées
aux laits fermentés. Nous ne notons pas de différence significative en titres IgG sériques
anti-β-Lg entre les deux groupes colonisés avec Lactobacillus plantarum et gavés aux laits
fermentés.
69
Résultats
3.2. Contrôle de l’immunisation chez les souris sacrifiées au 50ème jour :
Au 50ème jour, après avoir subit deux rappels à la β-Lg par voie parentérale, les
titres en IgG sériques anti-β-Lg sont de 1/280ème chez le groupe gavé au lait LF1, 1/640ème
chez le groupe gavé au lait LF2 et 1/64000ème chez le groupe gavé avec une solution saline
(Fig.17).
Nous constatons que les IgG sériques anti-β-Lg ne sont pas détectables chez les
animaux non sensibilisés (témoins négatifs) (Fig. 17). Nous ne notons aucune différence
significative entre les deux groupes gavés aux laits fermentés (LF1 et LF2).
D’autre part, nous constatons que les titres en IgG anti-β-Lg, dans les sérums des
groupes de souris gavées aux laits LF1 et LF2, sont significativement diminués (p ≤ 0,001)
par rapport au groupe gavé avec une solution saline.
Nos résultats indiquent également des titres élevés en anticorps anti-β-Lg chez les
animaux gavés avec une solution saline et immunisés à la β-Lg. Chez les témoins, la
recherche des anticorps anti-β-Lg est négative.
3.3. Etude comparative de l’induction de la tolérance orale à la β-Lg :
Après la colonisation bactérienne de l’intestin et le gavage des souris au lait LF1,
les résultats (Fig 18) montrent qu’il n’y a aucune différence significative entre les titres en
IgG anti-β-Lg dans les sérums des souris sacrifiées au 28ème jour et des sérums de souris
sacrifiées au 50ème jour.
Chez les souris ayant subit une colonisation puis gavées au lait LF2, aucune
différence significative n’est établie entre les titres en IgG sériques anti-β-Lg chez les
groupes sacrifiés au 28ème jour et les groupes sacrifiés au 50ème jour.
Par contre, nous constatons qu’il y a une différence hautement significative (p
≤0,001) entre les IgG sériques anti-β-Lg des groupes qui ont été gavés avec une solution
saline suivie d’une immunisation à la β-Lg puis sacrifiés au 28ème jour par rapport aux
groupes sacrifiés au 50ème jour.
Nous concluons de ses résultats que les deux laits fermentés par les associations :
Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum et Lactobacillus acidophilus +
Bifiidobacterium longum ont un effet positif sur l’induction de la tolérance orale.
70
Résultats
IgG
Log (1/Titre)
5
4,5
4
3,5
€€€
3
¥¥¥
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Souris
Témoin
SS + β-Lg
LF1+β-lg
LF2+β-lg
Figure 17 : Titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez des souris sacrifiées
au 50ème jour et sensibilisées à la β-Lg (n=5) par voie sous cutanée comparés à celui des
souris non sensibilisées (n=5) (témoins négatif).
n: nombre d’animaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
β-Lg : Betalactoglobuline.
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
¥¥¥ : SS+ β-Lg vs LF1 (p ≤0,001).
€€€ : SS+ β-Lg vs LF2 (p ≤0,001).
Nous notons que les IgG sériques anti-β-Lg ne sont pas détectables chez les
animaux non sensibilisés (Témoin). Chez les souris gavées avec une solution saline puis
immunisées à la β-Lg, le titre des IgG spécifiques atteint au moment du sacrifice des
valeurs élevées estimées à 1/64000ème; il est significativement élevé par rapport aux
groupes gavés au lait fermenté (p ≤0,001).
Nous ne notons aucune différence significative entre les deux groupes gavés aux
laits fermentés.
71
Résultats
IgG
Log (1/Titre)
5
₤₤₤
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SS + β-Lg
LF1+β-Lg
J28
LF2+β-Lg
Souris
J50
Figure 18 : Comparaison des titres en anticorps IgG sériques anti-β-Lg mesurés chez des
souris gavées puis sensibilisées à la β-Lg par voie sous cutanée, sacrifiées au 28ème jour et
au 50ème jour.
n: nombre d’animaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
β-Lg : Betalactoglobuline.
J28 : jour de sacrifice des souris.
J50 : jour de sacrifice des souris.
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
₤₤₤ : J28 vs J50 (p ≤0,001).
Nous notons une différence significative entre les titres en IgG sériques anti-β-Lg
des groupes de souris sacrifiées au 28ème jour et les groupes de souris sacrifiées au 50ème
jour (SS+ β-Lg) (p ≤0,001). La comparaison de moyennes des titres en IgG sériques dans
les deux groupes de souris gavées aux laits fermentés
ne montre aucune différence
significative.
72
Résultats
4. Etude histologique de l’intestin des souris immunisées comparé à celui des témoins:
Cette partie de notre travail a pour but de vérifier les conséquences de
l’immunisation parentérale sur la structure de l’épithélium intestinal, particulièrement au
niveau de l’architecture des villosités ainsi que sur la composition en lymphocytes intraépithéliaux.
4.1. Effet de la sensibilisation et du gavage sur la structure intestinale des souris
sacrifiées au 28ème jour :
Les résultats de l’effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités
des souris sacrifiées au 28ème jour sont reportés dans le tableau 9 et la figure 19.
4.1.1.
Aspect
des
muqueuses
intestinales
des
souris
témoins
au
faible
grossissement (Gx10):
Observée au microscope optique, la muqueuse intestinale d’une souris témoin
apparaît formée de nombreuses projections en doigts de gant ; il s’agit des villosités
séparées par des sillons intervilleux communiquant et dans le fond desquels s’ouvrent les
glandes de Lieberkühn (Fig 20).
Dans la figure 21, la muqueuse intestinale d’une souris ayant subi une colonisation
bactérienne pendant 18 jours suivit d’un gavage avec le lait LF1 montre qu’il n’existe
aucune différence dans la structure du point de vue histologique. Les valvules conniventes
recouvertes de villosités longues et fines (v) possèdent une seule couche d’entérocytes et
une musculaire muqueuse (MM) fine et sous jacente aux microvillosités. La sous
muqueuse (S) forme des évaginations formant le cœur des valvules conniventes et
constitue le siège des glandes. La surface péritonéale de la musculeuse se confond avec les
tissus conjonctifs lâches de la séreuse (SR).
4.1.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris témoins au fort grossissement
(Gx40):
La figure 24 et la figure 26 représente une observation au fort grossissement des
villosités du jéjunum de souris témoins et de souris ayant subi une colonisation bactérienne
suivie d’un gavage aux laits fermentés respectivement.
Nos résultats indiquent qu’il n’y a pas de différences dans la structure de la
muqueuse intestinale. Sur le plan structural, ces villosités sont longues fines et bordées par
un épithélium simple, unistratifié, cylindrique. Il est formé essentiellement de hautes
cellules à plateau strié possédant des noyaux réguliers
en positions basales qui
correspondent aux entérocytes.
73
Résultats
Tableau 9 : Effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités intestinales
des souris (J28).
Groupe d’animaux
Mesure de la hauteur des villosités (µm)
TNGNS (n=5)
55,04 ± 0,9
GLF1S (n=5)
54,78 ± 1,42€€€
GLF2S (n=5)
54,53 ± 0,82¥¥¥
GSS (n=5)
46,08 ± 2,02₤₤₤
n : nombre d’animaux sacrifiés au 28ème jour.
GLF1S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (1) puis stimulés à la β-Lg.
GLF2S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (2) puis stimulés à la β-Lg.
GSS : Tissus des souris gavées avec une solution saline puis stimulés à la β-Lg (témoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris témoins non gavées et non stimulés à la β-Lg (témoin négatif).
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus +Bifidobactérium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Les valeurs reportées sont des moyennes et leur erreur standard (n=5).
₤₤₤ : GSS vs TNGNS (p≤0,001).
€€€: GLF1S vs GSS (p≤0,001).
¥¥¥: GLF2S vs GSS (p≤0,001).
Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosités intestinales
des souris gavées avec une solution saline puis immunisées à la β-Lg (p≤0,001) par rapport
aux groupes de souris témoins.
Nous ne notons aucune différence significative de la hauteur des villosités dans les
groupes de souris gavées avec les laits fermentés puis immunisés à la β-Lg (p>0 ,05) par
rapport au groupe témoin négatif.
74
Résultats
Hauteur des
villosités (µm)
60
€€€
55
50
¥¥¥
₤₤₤
45
40
35
30
25
20
TNGNS
GSS
GLF1S
GLF2S
Souris
Figure 19: Effet du gavage et de la sensibilisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités
des fragments de jéjunum des souris sacrifiées au 28ème jour comparé aux souris non
sensibilisée (témoin négatif).
n= nombre d’animaux.
GLF1S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (1) puis stimulés à la β-Lg.
GLF2S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (2) puis stimulés à la β-Lg.
GSS : Tissus des souris gavées avec une solution saline puis stimulés à la β-Lg (témoin positif).
TNGNS : Tissus des souris témoins non gavées et non stimulées à la β-Lg.
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
₤₤₤: GSS vs TNGNS (p≤0,001).
€€€: GLF1S vs GSS (p≤0,001).
¥¥¥: GLF2S vs GSS (p≤0,001).
Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosités intestinales
chez les souris témoins positifs (p≤0,001) par rapport aux souris témoins négatifs. Cette
diminution est significative par rapport aux souris gavées au lait LF1 et aux souris gavées
au lait LF2 (p≤0,001).
Nous ne notons aucune différence significative des hauteurs des villosités entre le
groupe de souris gavées au lait LF1 et le groupe de souris gavées au lait LF2.
75
Résultats
Figure 20 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin.
V : villosité intestinale.
Chez le groupe témoin l’épithélium est unistratifié et les villosités sont longues et fines.
Figure 21 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée avec une solution saline et immunisée à la β-Lg et
sacrifiée au 28ème jour ( témoin positif).
Chez le groupe témoin positif, la villosité jéjunale est élargie. Le décollement du chorion
de l’épithélium est très accentué. L’infiltrat lymphocytaire est dense.
76
Résultats
Le chorion est d’aspect fibreux et apparaît polymorphe possédant divers éléments
mononuclés, peu abondants et qui correspondent à des cellules du système immunitaire :
les lymphocytes.
La hauteur des villosités chez les muqueuses témoins varie de 52,48 µm à 57,6 µm
avec une moyenne de 55,04 ± 0,9 µm.
4.1.3. Aspect des muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une
solution saline et immunisées à la β-Lg :
Les muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une solution saline
et immunisées à la β-Lg présentent une atrophie partielle (Fig. 21 et 25). Nous constatons
un léger élargissement des villosités jéjunales ainsi qu’un décollement partiel de
l’épithélium du chorion.
Nous notons une diminution significative des hauteurs des villosités qui sont de
46,08 ± 2,02µm chez les souris
ayant subit un gavage avec une solution saline et
immunisées à la β-Lg par rapport à celles des souris témoins (55,04 ± 0,9 µm) et des
deux autres groupes expérimentaux (54,78 ± 1,42 µm et 54,53 ± 0,82 µm pour LF1 et LF2
respectivement).
4.1.4. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF1 :
La hauteur des villosités des muqueuses jéjunales de souris immunisées et gavées
au lait LF1 est de 54,78 ± 1,42 µm ; cette hauteur comparée à celle des muqueuses témoins
ne montre aucune différence significative. Les figures 22 et 26 indiquent très clairement
l’unistratification de l’épithelium avec des villosités longues et fines. L’infiltrat
lymphocytaire est peu marqué.
4.1.5. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF2:
Chez les souris ayant subit une colonisation bactérienne, gavées au lait LF2 et
immunisées à la β-Lg (Fig 27), la muqueuse intestinale est comparable à celle des souris
ayant été gavées au lait LF1 (Fig.26). Nous constatons que les villosités sont longues, fines
( Fig 23) et l’infiltration lymphocytaire est peu marquée (Fig. 27), leur hauteur est de 54,53
± 0,82 µm. La comparaison des moyennes ne montre aucune différence significative par
rapport au témoin négatif.
77
Résultats
A la lumière de ces résultats, la structure des muqueuses intestinales montre qu’il
n’existe aucune différence significative entre les hauteurs des villosités des groupes gavés
Figure 22 : Observation microscopique(Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème
jour.
Figure 23 : Observation microscopique(Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème
jour.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gavé au LF1 et le groupe gavé au LF2, les villosités jéjunales sont longues
et fines.
78
Résultats
La hauteur des villosités chez le groupe gavé au LF1 et le groupe gavé au LF2 est
comparable à celle du groupe témoin.
Figure 24 : Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin négatif.
Chez le groupe témoin négatif l’épithélium est unistratifié et l’infiltrat lymphocytaire est
peu marqué.
Figure 25 : Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée avec une solution saline et immunisée à la β-Lg et
sacrifiée au 28ème jour ( témoin positif).
79
Résultats
Chez le groupe témoin positif, l’épithélium est décollé du chorion. L’infiltrat
lymphocytaire est dense.
Figure 26 : Observation microscopique(Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème
jour.
Chez le groupe gavé au LF1, l’infiltrat lymphocytaire est peu marqué.
Figure 27 : Observation microscopique(Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 28ème
jour.
80
Résultats
Chez le groupe gavé au LF2, l’infiltration lymphocytaire est plus au moins marquée par
rapport au groupe témoin négatif.
avec les laits fermentés et le groupe témoin. Ces résultats suggèrent que la sensibilisation
des souris par la β-Lg et le gavage par les laits (LF1 et LF2) fermentés par des bactéries
probiotiques reste sans effet sur la structure de l’épithélium intestinal.
4.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris gavées avec une solution saline puis
immunisées à la β-Lg et sacrifiées au 50ème jour :
Les résultats de l’effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités
des souris sacrifiées au 50ème jour sont reportés dans le tableau 10 et figure 28.
Au 50ème jour, nous avons sacrifié les autres groupes de souris et nous avons
prélevé la partie jéjunale de l’intestin sur laquelle nous avons effectué des coupes
histologiques.
Nous constatons (Fig 30) chez le groupe de souris gavées avec une solution saline,
une atrophie partielle des villosités; ces villosités sont élargies et bordées par un épithélium
pseudostratifié.
Au niveau des villosités, nous constatons que le décollement du chorion de
l’épithélium est très accentué et l’infiltration des lymphocytes inta-épithéliaux est très
prononcée par rapport à celle des souris témoins.
La hauteur des villosités des souris gavées avec solution saline et immunisées à la
β-Lg est de 42,75 ± 2,2 µm. Comparée à celle des témoins négatifs (55,04 ± 0,9), cette
hauteur réduite traduit une atrophie partielle (Fig 34).
4.2.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunisées à la β-Lg et gavées au
lait LF1 :
Nos résultats (Fig 30 et 34) montrent que les souris gavées au lait LF1 puis
immunisées à la β-Lg, ont des villosités fines et longues dont l’épithélium est unistratifié.
L’infiltrat lymphpcytaire est peu marqué.
La hauteur des villosités intestinales de ce groupe est de 54,01 ± 1,1 µm ; cette
valeur est non significative comparée à celle des témoins négatifs.
4.2.2. Aspect des muqueuses et des villosités intestinales des souris immunisées à la βLg et gavées au lait LF2:
Les résultats obtenus chez ce groupe de souris (Fig 32 et 36), montrent que les
villosités jéjunales sont longues avec un léger élargissement et bordées d’un épithélium
81
Résultats
unistratifié. Les lymphocytes sont plus ou moins marqués par rapport aux lymphocytes
intraépithéliaux des souris témoins (Fig 29 et 33).
Tableau 10: Effet du gavage et de l’immunisation sur la hauteur des villosités intestinales
des souris (J50).
Groupe d’animaux
Mesure de la hauteur des villosités (µm)
TNGNS (n=5)
55,04 ± 0,9
GLF1S (n=5)
54,01 ± 1,1 €€
GLF2S (n=5)
53,76 ± 1,67¥¥
GSS (n=5)
45,05 ± 2,57₤₤
Les valeurs rapportées sont des moyennes et leur erreur standard.
n : nombre d’animaux sacrifiés au 50ème jour.
GLF1S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (1) puis stimulés à la β-Lg.
GLF2S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (2) puis stimulés à la β-Lg.
GSS : Tissus des souris gavées avec une solution saline puis stimulés à la β-Lg (Témoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris témoins non gavées et non stimulés à la β-Lg.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus +Bifidobactérium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
₤₤ : GSS vs TNGNS (0,001≤ p ≤0,01).
€€: GLF1S vs GSS (0,001≤ p ≤0, 01).
¥¥: GLF2S vs GSS (0,001≤ p ≤0, 01).
Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosités des souris
gavées avec une solution saline puis immunisé à la β-Lg (p≤0,001) par rapport aux groupes
témoins.
Nous ne notons aucune différence significative de la hauteur des villosités chez les
souris gavées avec les laits fermentés puis immunisés à la β-Lg (p>0 ,05) par rapport aux
groupes de souris témoins négatifs.
82
Résultats
Hauteur des
villosités (µm)
60
€€
55
¥¥
50
₤₤
45
40
35
30
25
20
Souris
Témoin
GSS
GLF1S
GLF2S
Figure 28 : Effet du gavage et de la sensibilisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités
de fragments de jejunum des souris sacrifiées au 50ème jour comparée aux souris non
sensibilisées (témoin).
n= nombre d’animaux.
GLF1S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (1) puis stimulés à la β-Lg.
GLF2S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (2) puis stimulés à la β-Lg.
GSS : Tissus des souris gavées avec une solution saline puis stimulés à la β-Lg (témoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris témoins non gavées et non stimulés à la β-Lg.
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
₤₤ : GSS vs TNGNS (0,001≤p≤0,01).
€€: GLF1S vs GSS (0,001≤p≤0, 01).
¥¥: GLF2S vs GSS (0,001≤p≤0, 01).
Nous notons une diminution très significative de la hauteur des villosités jéjunales
du groupe (GSS) par rapport au groupe témoin et aux groupes (GLF1S) et (GLF2S)
(p<0,001). Nous ne constatons aucune différence significative entre les groupes (GLF1S) et
(GLF2S).
83
Résultats
Figure 29 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin.
Chez le groupe témoin négatif l’épithélium est unistratifié et les villosités sont longues et
fines.
84
Résultats
Figure 30 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin positif, sacrifiée au 50ème jour.
Chez le groupe témoin positif, la villosité jéjunale est élargie. Le décollement du chorion
de l’épithélium est très accentué. L’infiltrat lymphocytaire est très dense.
Figure 31 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF1 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème
jour.
85
Résultats
Figure 32 : Observation microscopique (Gx10) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF2 et immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème
jour.
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gavé au LF2, nous notons un léger élargissement des villosités jéjunales.
La hauteur des villosités chez le groupe gavé au LF1 et le groupe gavé au LF2 est
comparable à celle de groupe témoin.
Figure 33: Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin.
86
Résultats
Figure 34: Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris témoin positif, sacrifiée au 50ème jour.
Chez le groupe témoin l’épithélium est unistratifié et l’infiltrat lymphocytaire est peu
marqué.
Chez le groupe témoin positif, la villosité jéjunale est élargie et raccourcie. L’épithélium
est décollé du chorion. L’infiltrat lymphocytaire est très dense.
Figure 35 : Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF1, immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème
jour.
87
Résultats
LF1 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
Chez le groupe gavé au LF1, l’infiltrat lymphocytaire est peu marqué.
Figure 36 : Observation microscopique (Gx40) d’un fragment de jéjunum coloré à
l’hémalun-éosine d’une souris gavée au LF2, immunisée à la β-Lg puis sacrifiée au 50ème
jour.
LF2 : Lait fermenté par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gavé au LF2, nous notons un léger élargissement des villosités jéjunales
ainsi qu’une infiltration lymphocytaire plus au moins marquée.
La hauteur des villosités est de 53,76 ± 1,67 µm ; cette valeur est non significative par
rapport à celle des souris non sensibilisées (témoins).
La comparaison des moyennes montre qu’il n’y a aucune différence significative
des hauteurs des villosités entre les deux groupes gavés aux laits fermentés. Concernant les
villosités jéjunales du groupe de souris gavées avec une solution saline puis immunisées à
la β-Lg et des deux groupes de souris gavées aux laits (LF1 et LF2) puis immunisées à la
β-Lg., la comparaison des moyennes montre une différence significative (p≤0,001).
4.2.4. Etude comparative de la hauteur des villosités des souris sacrifiées au 28ème jour
et des souris sacrifiées au 50ème jour :
L’aspect et la hauteur des villosités jéjunales sont deux paramètres cruciaux dans
l’interprétation de l’effet de la sensibilisation à la β-Lg des souris gavées avec du lait de
vache fermenté avec différentes associations de bactéries lactiques et bifidobactéries
choisis au départ comme étant des bactéries probiotiques. La figure 36 résume les résultats
concernant l’évaluation de l’effet de l’immunisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités
88
Résultats
de fragments de jéjunum dans différents groupes expérimentaux. Les valeurs obtenues
n’évoquent aucune différence significative dans tous les groupes et nous constatons que
les rappels de l’immunisation à la β-Lg au 21ème et au 35ème jour du protocole n’ont pas
modifié la hauteur des villosités.
Nous avons constaté également que les villosités jéjunales du groupe gavé avec
une solution saline et immunisé à la β-Lg sont plus élargies avec une importante infiltration
lymphocytaire et un décollement du chorion de l’épithélium plus accentué chez les souris
sacrifiées au 50ème jour comparées à celles des souris sacrifiées au 28ème jour.
Chez les souris gavées au lait LF1, immunisées à la β-Lg et sacrifiées au 50ème jour,
nous avons noté une légère différence de la structure, de l’aspect et de la hauteur des
villosités par rapport aux souris sacrifiées au 28ème jour.
Nos résultats montrent que chez les souris gavées au lait LF2 et immunisées à la βLg puis sacrifiées au 50ème jour, l’infiltration lymphocytaire est plus ou moins marquée par
rapport aux souris sacrifiées au 28ème jour.
Les résultats de l’étude histologique de la muqueuse intestinale suggèrent que
l’induction de la tolérance orale à la β-Lg est évidente chez les souris ayant subit une
colonisation avec Lactobacillus plantarum suivit d’un gavage au lait LF1 (Lactobacillus
acidophilus +Bifidobactérium longum).
89
Résultats
Hauteur des
villosités (µm)
60
55
50
45
40
35
30
25
20
Souris
GSS
GLF1S
J28
GLF2S
J50
Figure 37 : Evaluation de l’effet de l’immunisation à la β-Lg sur la hauteur des villosités
de fragments de jéjunum entre les groupes sacrifiés au 28ème jour et les groupes sacrifiés au
50ème jour.
n= nombre d’animaux.
J28 : groupe de souris sacrifiées aux 28ème jour.
J50 : groupe de souris sacrifiées aux 50ème jour.
GLF1S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (1) puis stimulés à la β-Lg.
GLF2S : Tissus des souris gavées au lait fermenté (2) puis stimulés à la β-Lg.
GSS : Tissus des souris gavées avec une solution saline puis stimulés à la β-Lg (témoin
positif).
Les valeurs indiquées sont des moyennes ± erreur standard. (n=5).
Nous notons qu’il n’existe aucune différence significative des hauteurs des villosités entre
les groupes sacrifiés le 28ème jour et le 50ème jour.
90
Résultats
5. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux (LIE) :
Le dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux qui permet de comparer le
nombre de ces derniers dans les différents échantillons d’intestin c’est avéré difficile sur
nos coupes histologiques et montrent qu’il y a une grande différence dans la structure
entre les intestins de lapin ou de rat par rapport aux souris utilisées dans notre protocole.
Le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux (en pourcentage) a été estimé dans les
différents tissus et nous avons comparé ce nombre (%) à celui des tissus de souris témoin
négatif.
5.1. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au
28ème jour:
Les lymphocytes sont normalement présents dans l’épithélium de surface ainsi que
dans le chorion. Sur l’ensemble de nos figures, nous remarquons clairement l’infiltration
lymphocytaire, mais celle-ci varie selon la nature des solutions de gavage et les fragments
jéjunaux mis en contact ou non avec l’antigène sensibilisant.
Nous notons que le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux de souris gavées avec
une solution saline puis immunisés à la β-Lg est de 50% par rapport au nombre des
lymphocytes de souris témoins négatifs.
Chez le groupe de souris stimulées à la β-Lg et gavées avec le lait LF1 le nombre
des lymphocytes intra-épithéliaux est proche de celui des souris témoins, soit 2% de plus
ce qui signifie qu’il n’y a pas de différence entre ces deux groupes.
Chez les souris gavées au lait LF2 suivit d’une immunisation à la β-Lg, le nombre
de lymphocytes est peu abondant ; il y a 5% de plus de LIE infiltrés par rapport aux
lymphocytes des souris témoins négatifs.
5.2. Dénombrement des lymphocytes intra-épithéliaux chez les souris sacrifiées au
50ème jour:
L’immunisation ainsi que le gavage des souris avec une solution saline provoque
non seulement une atrophie partielle des villosités mais également une augmentation
considérable de lymphocytes intra-épithéliaux soit 80% de LIE supplémentaires comparée
aux lymphocytes des groupes témoins négatifs (Fig.33). Nous avons remarqué également
qu’il existe une différence dans le nombre des LIE dans les tissus des groupes de souris
immunisées et gavées aux laits (LF1, LF2) et les tissus des groupes de souris immunisées et
gavées avec une solution saline.
91
Résultats
Nous remarquons que le nombre des lymphocytes des souris gavées au lait LF1 et
immunisées à la β-Lg est voisin des lymphocytes des souris non sensibilisées (témoins),
soit 2% de LIE supplémentaires.
Le nombre de lymphocytes intra-épithéliaux des souris gavées au lait LF2 et
immunisées à la β-Lg est augmenté de 8% par rapport aux lymphocytes des souris non
sensibilisées.
92
Discussion
Le présent travail a pour objectif principal d’étudier l’induction de la tolérance orale,
in vivo, induite par des souches de bactéries probiotiques implantées par gavage dans
l’intestin de souris pour sa colonisation durant la période déterminée dans le protocole suivit
d’un gavage par deux laits fermentés. Il vise à élucider certains mécanismes d’action par
lesquels les probiotiques stimulent le phénomène immunitaire. Deux modes d’action sont
retenus :
Le premier mode d’action est que les bactéries probiotiques stimulent l’induction de la
tolérance orale en dégradant la β- lactoglobuline.
Le deuxième mode d’action est que les bactéries probiotiques stimulent l’induction de
la tolérance orale en inhibant la prolifération lymphocytaire.
L’étude microbiologique maître que les bifidobactéries utilisées sont des bactéries
Gram positif, de différentes formes cellulaires (bifides, spatulées). Nos résultats sont en
accord avec ceux obtenus par Boudine, 2005 et Hadadji et al., 2005. Ce polymorphisme est
dû principalement à la composition du milieu de culture (Tamine et al., 1995).
Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par Guessas & Kihal (2004) qui ont
montré que les lactobacilles sont à métabolisme hétérofermentaire. Elles sont Gram positif ;
ce sont de longs bâtonnets (Lactobacillus acidophilus) ou de courts bâtonnets (Lactobacillus
plantarum) et anaérobiques.
D’après Bensoltane et al (1997), les bifidobactéries se développent à 42°C en culture
mixte. Il a été montré par Hadadji & Bensoltane (2006) que les bifidobactéries se développent
à 37°C comme elles peuvent se développer à 45°C. Les bifidobactéries ont une production
maximale d’acide à 45°C en culture mixte associées à Lactobacillus acidophilus et cela est dû
aux facteurs bifidogènes.
Au cours de la fermentation du lait à 45°C, des différences de l'acidité titrable et du pH
sont observées entre les laits LF1 et LF2 comparés au lait stérile (témoin). Les quantités
d'acide produites sont différentes tout au long de la fermentation et à la fin de celle-ci, la
production d’acide dans le lait témoin demeure significativement inférieure à celle des laits
LF1 et LF2. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Chekroun, 2005, sachant que
la production d’acide est étroitement liée à la présence des bactéries lactiques dans le lait.
92
Discussion
Ces cultures utilisent le lactose du lait comme source d’énergie pour assurer leur
croissance. Ces bactéries transforment le lactose en glucose et galactose puis le glucose est
tout de suite transformé en deux molécules d’acide lactique et acide acétique (Tamine et al.,
1995). Cette transformation du lactose est due à l’action d’enzymes provenant des
microorganismes des levains. La quantité d’acide produite exprimée en degré dornic par litre
de lait (°D/l) intervient comme facteur de coagulation du lait; elle est le reflet de l’acidité du
ferment (Stadhouders, 1986).
Le pH des laits fermentés est diminué au cours du temps de fermentation comparé a
celui du lait stérile sans ferment ; cette baisse du pH est expliqué par la croissance des
cultures bactériennes utilisées comme ferments qui hydrolysent le lactose en acide lactique
et/ou acide acétique pour leur énergie. Nous avons constaté que la baisse du pH est
significative dans le lait LF1 comparé au lait LF2 et le lait stérile.
La production d’acide entraîne une diminution du pH du lait qui a un effet modulateur
sur la croissance des bactéries au cours de la fermentation et limite la croissance des germes
pathogènes (Gilliland, 1985b ; Payne et al., 1999 ; Boudine, 2005 ; Rouissat & Bensoltane,
2006) comme E. coli, Staphylococcus aureus et Bacillus cereus.
1. Evaluation de l’activité protéolytique des bactéries au cours de la fermentation :
D’une manière générale, l’activité protéolytique des bactéries au cours de la
fermentation montre que les deux associations bactériennes sont douées d’un pouvoir
protéolytique des protéines du lait de vache et que ce dernier est spécifique de chaque
association qui possède une aptitude propre à dégrader la protéine intacte.
La meilleure protéolyse des protéines est obtenue par Lactobacillus acidophilus
associé à Bifidobactérium longum (LF1) ; cette protéolyse peut s’expliquer par l’existence
d’une synergie entre Bifidobacterium longum et Lactobacillus acidophilus (Tamine,1995 ;
Abu-Tarabuche et al., 1998 ; Gomes, 1998 ; Payne et al., 1999).
La stérilisation à 105°C ne réduit pas le taux des protéines du lait. Selon Lorient,
2001 ; Pougheon, 2001 ; Chekroun, 2005, il n’y a pas de différence entre le taux de protéines
du lait cru et celui du lait stérile.
L’activité protéolytique des lactobacilles est de plus en plus étudiée pour son
importance dans la fabrication fromagère et le développement d’arômes (Bintsis et al., 2003).
93
Discussion
Cependant, plusieurs souches de Lactobacillus paracasei ssp. paracasei montrent le même
profil d’activité protéolytique (Bintsis et al., 2003).
D’autre part, des enzymes d’origine bactérienne sont utilisées pour la production de
formules infantiles (Fritsché, 2003). Cependant, l’activité protéolytique des bactéries lactiques
au cours de la fermentation est une voie importante pour la dégradation des protéines du lait.
2. Evaluation de la sensibilisation des souris à la β-Lg par voie parentérale:
Nous avons choisi la souris, comme modèle d’étude, car elle est caractérisée par un
complexe majeur d’histocompatibilité relativement proche de celui de l’homme et par une
balance Th1/Th2 plus nette et plus facile à mettre en évidence que chez l’homme (Magnan &
Vervloet, 1997).
De nombreux modèles animaux sont cités dans la littérature pour induire la tolérance
orale. Le modèle (souris BALB/c conventionnelle), utilisé dans ce présent travail, a été étudié
par Prioult, 2003.
L’étape initiale a consisté à induire une tolérance à la β-Lg chez des souris BALB/c
sensibilisées à cette protéine et gavées avec différents laits fermentés. Nous avons évalué le
degré d’immunisation de ces animaux par dosage ELISA qui a révélé des titres IgG sériques
anti-β-Lg très élevés chez le groupe de souris gavées avec une solution saline et sensibilisées
à la β-Lg par rapport aux groupes de souris ayant subi une colonisation de l’intestin par
Lactobacillus plantarum suivi d’un gavage par un lait fermenté (souris sacrifiées au 28ème
jour). Nos résultats témoignent d’une réponse immunitaire systémique prononcée chez les
souris BALB/c prises comme modèle animal d’induction à la tolérance orale et sont en accord
avec les données de la littérature (Prioult et al., 2003) sachant que les IgG ont une préférence
pour les épitopes conforme à la β-Lg (Duchateau et al., 1998).
Jedrychowski & Wróblewska (1999), Chekroun, 2005, ont rapporté que la
fermentation du lait de vache à 45°C par des bactéries lactiques mésophiles et thermophiles
induit une diminution significative de l’antigénicité vis à vis l’α-lactalbumine, la βlactoglobuline et la SAB.
94
Discussion
De nombreuses études mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers
fermentés, mais peu d’auteurs précisent si cet effet est lié à l’hydrolyse des épitopes
allergéniques des protéines laitières, ou à une modulation de la réponse immune par les
bactéries lactiques à l’origine de la fermentation (Cross et al., 2001).
Au 50ème jours, nous avons sacrifié les autres groupes qui ont reçu deux rappels avec la
β-Lg. L’évaluation des titres en IgG sériques anti-β-Lg chez les souris gavées avec une
solution saline et sensibilisées à la-β-Lg a montré une importante augmentation du taux des
IgG sériques anti-β-Lg par rapport a celui obtenu au 28ème jour. Nous n’avons constaté aucune
différence significative des taux en IgG sériques anti-β-Lg chez les souris colonisés avec
Lactobacillus plantarum et gavées avec du lait fermenté puis sensibilisé à la-β-Lg (sacrifiées
au 28ème jour) par rapport aux souris qui ont reçu deux rappels avec la β-Lg et sacrifiées au
50ème jour.
Une meilleur induction de tolérance orale est observée chez le groupe de souris gavées
au lait LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifidobactérium longum) ; ce dernier a produit des
taux bas en IgG sériques anti-β-Lg. Ces résultats sont en accord avec les données de la
littérature (Prioult et al., 2003 ; Tanaka & Ishikawa, 2004) et montrent que les probiotiques
stimulent l’induction de la tolérence orale et préviennent les allergies en dégradant la βlactoglobuline. En effet, Moreau & Gaboriau-Routhiau (1996) rapportent qu’une faible
production d’IgG et d’IgE anti-ovalbumine a été maintenue chez des souris conventionnelles
pendant plus de trois mois, alors qu’une augmentation significative du titre en IgG antiovalbumine a été observée trois semaines après l’induction de la tolérance chez des souris
axéniques. Par contre, un faible titre en IgE anti-ovalbumine a été maintenu chez les souris
axéniques durant plus de 60 jours après la tolérisation.
Il a été montré que l’induction d’une réponse allergique est dépendante de la dose
d’antigène induite par l’adjuvant. Cependant, l’adjuvant est nécessaire pour l’obtention d’IgE
détectables et modifie également la réponse IgG spécifique (Lifrani et al., 2006) ; même si
l’alun augmente le taux d’IgE, la réponse spécifique reste dépendante de l’antigène (Newman,
1998).
95
Discussion
3. Aspect histologique des muqueuses intestinales en réponse à l’immunisation à la β-Lg,
à la colonisation de l’intestin et au gavage par un lait fermenté par des probiotiques :
L’épithélium gastro-intestinal constitue la première ligne de défense de l’hôte (Basset
et al., 2003). Les mucines sécrétées à sa surface par les cellules caliciformes sont variables à
la fois dans leur quantité mais aussi dans leur nature.
L’aspect et la hauteur des villosités jéjunales sont deux paramètres cruciaux dans
l’interprétation de l’effet de la sensibilisation à la β-Lg des souris gavées avec des laits
fermentés et des souris gavées avec une solution saline.
Les résultats obtenus montrent qu’en présence de l’antigène sensibilisant, la β-Lg
modifie considérablement la structure de la muqueuse intestinale des animaux gavés avec une
solution saline et immunnisés à la β-Lg, par rapport aux animaux témoins. Ces résultats sont
en accord avec ceux obtenus par Addou et al., 2004. Chez les animaux immunisés, les coupes
histologiques présentent une atrophie partielle des villosités avec une importante infiltration
lymphocytaire au niveau du chorion et du l’épithélium. Selon Phillips et al., 1987, le nombre
des lymphocytes intra-épithéliaux augmente dans l’intestin grêle des enfants intolérants aux
protéines du lait de vache de façon significative par rapport aux enfants témoins intolérants au
gluten. Lorsque l’antigène sensibilisant est éliminé de l’alimentation des 2 groupes d’enfants,
il a été constaté une diminution des lymphocytes intra-épithéliaux (Kaczmarski et al., 1989).
Nos résultats sont en accord avec ces auteurs qui justifient que l’augmentation des
lymphocytes intra-épithéliaux serait caractéristique de l’intolérance à la β-Lg.
Chez le groupe de souris colonisées avec Lactobacillus plantarum et gavées avec du
lait fermenté puis sensibilisées à la-β-Lg, l’aspect et la structure des villosités n’ont pas été
modifiés d’une façon considérable. Nos résultats sont en accord avec ceux obtenus par
(Simon et al., 2003 ; Dalloul et al., 2003; Jijon et al., 2004) qui ont monté que
l’administration de bactéries probiotiques influence l’établissement des lymphocytes T dans la
muqueuse intestinale chez différentes espèces animales.
Des sous populations de lymphocytes T, appelées cellules T régulatrices
(CD4+CD25+), comme Tr et Th3, ont été récemment décrites (Allez & Mayer, 2004; van
Amelsfort et al., 2004; Rook & Brunet, 2005). Le rôle des lymphocytes T régulateurs
(CD4+CD25+), en particulier, semble intéressant dans la tolérance orale. Ces lymphocytes
96
Discussion
sécrètent des cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10 et le TGF-β qui ont la
particularité de diminuer les réponses Th1 et Th2 (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005).
L’aspect et la structure des villosités intestinales des souris témoin positif ont changé
au 50
ème
jour. Nous avons constaté une atrophie importante des villosités par rapport au
témoin négatif, avec une dense infiltration lymphocytaire dûe à une réaction immunitaire visà-vis de la β-Lg . Chez les souris gavées avec du lait LF1, l’immunisation à la β-Lg n’a pas
d’effet sur la structure et la hauteur des villosités intestinales comparées avec celles des souris
témoins négatif. Il est admis que l’intolérance à la β-Lg, chez l’enfant, se caractérise par une
perméabilité intestinale élevée à la protéine (Saïdi et al., 1995; Heyman et al., 2000;Molkou
,2002).
Selon Prioult et al., 2003, la composition de la flore intestinale, en particulier la
présence de bactéries du genre Bifidobacterium, joue un rôle primordial dans la prévention
des allergies ; l’administration orale de certaines souches bactériennes probiotiques semble
avoir un effet bénéfique sur l’induction de la tolérance orale à la β-Lg, protéine majeur
incriminée dans l’APLV .
La composition de la microflore intestinale des enfants allergiques diffère
quantitativement et qualitativement de celle des enfants sains (Björksten et al., 2001 ;
Kalliomaki et al., 2001; Kirjavainen et al., 2002 ; Watanabe et al., 2003). La flore des enfants
allergiques contient moins de bifidobactéries et plus de clostridies que les enfants sains, et
cette différence se maintient jusqu’à l’âge adulte (Apostolou et al.,2001a). De plus, la souche
de B. adolescentis, caractéristique de la flore des adultes, est majoritairement retrouvée dans
la flore des enfants allergiques alors que B. bifidum prédomine dans la flore des enfants sains
(He et al., 2001).
Hormis l’effet observé sur la prévention des allergies, quelques études cliniques
rapportent l’effet bénéfique des probiotiques pour le traitement des allergies. En effet,
l’administration de Lactobacillus rhamnosus GG ou Bifidobacterium lactis Bb12 à des jeunes
enfants manifestant des symptômes d’eczéma atopique durant l’allaitement maternel, diminue
significativement la sévérité de l’eczéma après deux mois de traitement (Isolauri et al., 2000).
L’effet bénéfique de Lactobacillus rhamnosus GG a été confirmé par une récente étude
clinique effectuée par le même groupe de recherche (Kirjavainen et al., 2003). Ces effets sont,
en partie, expliqués par une diminution de la production d’IL-4 (Sütas et al., 1996), la
stimulation de l’IL-10 (Pessi et al., 2000), l’augmentation de la production de TGF-β dans le
lait maternel (Rautava et al., 2002), la diminution de la réponse inflammatoire chez les
97
Discussion
patients allergiques (Pelto et al., 1998) et la suppression de la prolifération lymphocytaire en
présence de Lactobacillus rhamnosus GG (Pessi et al., 1999). Enfin, la combinaison de deux
lactobacilles (L. rhamnosus et L. reuteri) a également permis de diminuer de façon
significative l’eczéma chez des enfants allergiques (Rosenfeldt et al., 2003). Ces résultats
obtenus, in vivo, peuvent être en partie expliqués par une étude réalisée in vitro, démontrant la
capacité de nombreux lactobacilles à réduire la sécrétion de cytokines de type Th2 par les
cellules mononuclées de patients allergiques (Pochard et al., 2002).
Ces résultats montrent que l’administration, de certaines bactéries probiotiques,
améliore la réponse immunitaire vis-à-vis des antigènes alimentaires. Cependant, leurs effets
sur l’induction de la tolérance orale aux protéines du lait de vache ont été peu étudiés.
98
Conclusion
La partie microbiologie de notre travail nous a permis de purifier et de ré-identifier
l’authenticité des souches de Bifidobacterium et Lactobacillus utilisées, appartenant à la
collection du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle. Nos résultats montrent
que :
•
Les bifidobactéries présentent un polymorphisme dû à la composition du milieu. Par
contre, les lactobacilles ne se présentent que sous la forme de bâtonnets.
•
L’évolution de l’acidité au cours du temps de la fermentation du lait montre que les
bactéries lactiques acidifient le milieu ce qui mène à la diminution du pH. Les
bactéries utilisées présentent un pouvoir protéolytique élevé et la meilleure protéolyse
des protéines du lait est obtenue par Lactobacillus acidophilus associé à
Bifidobactérium longum.
L’induction de la tolérance orale, in vivo,chez des groupes de souris BALB/c dont
l’intestin a été colonisé par Latobacillus plantarum et gavées par deux laits fermentés par
l’association de 2 souches de bactéries probiotiques montre que :
•
Les groupes gavés aux laits fermentés produisent un taux bas en IgG sériques anti-βLg par rapport au groupe gavé avec une solution saline et immunisé à la β-Lg; cela
confirme que nos laits fermentés LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium
longum) et LF2 (Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum) ont un effet
probiotique et stimulent l’induction de la tolérance orale en dégradant la β-Lg du lait
de vache.
•
L’étude histologique nous a montré que la meilleure induction de la tolérance orale est
obtenue chez les souris colonisées par Lactobacillus plantarum puis gavées au lait
LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifidobactérium longum). Les lymphocytes intraépithéliaux sont peu marqués et les villosités sont longues et fines.
99
¾ Etudier l’effet de combinaisons de souches probiotiques afin de formuler des mélanges
efficaces pour l’induction de la tolérance.
¾ Etudier d’une manière approfondie l’activité métabolique des souches probiotiques
afin de sélectionner les meilleures souches qui hydrolysent les épitopes allergéniques
sur différents allergènes alimentaires.
¾ Etudier les caractéristiques des souches stimulant la tolérance orale.
Références bibliographiques
Abu-Tarabush HM, Al-Dagal MM et Royli MA. Growth, variability and proteolytic
activity of bifidobacteria in whole camel milk. J Dairy Sci, 1998; 84: 759-768.
Accolas JP, Bloquel R et Regnier J. Propriétés acidifiantes des bactéries lactiques
thermophiles en relation avec la fabrication du yaourt. Le Lait, 1977; 67 : 1-23.
Addou S, Tomé D, Kheroua O et Saidi D. Parenteral immunisation to β-lactoglobulin
modifies the intestinal structure and mucosal electrical parameters in rabbit. Int
immunopharmacol, 2004; 4: 1559-1563.
Akdis M, Blaser K et Akdis CA. T regulatory cells in allergy: novel concepts in the
pathogenesis, prevention, and treatment of allergic diseases. J Allergy Clin Immunol, 2005;
116: 961-968; quiz 969.
Akerblom HK, Vaarala O, Hyoty H, Llonen J et Knip M. Environmental factors in the
etiology of type 1 diabetes. Am J Med Genet, 2002; 115: 18-29.
Allez M & Mayer L. Regulatory T cells: peace keepers in the gut. Inflammatory
Bowel Diseases, 2004; 10: 666-676.
Amiot J. Composition, propriétés physico-chimiques, valeur nutritive, qualité
technologique et technique d’analyse du lait. In : Vignola CL. Science et technologie du
lait : transformation du lait. Ecole polytechnique édition, Montréal, 2002; 5-17.
Apostolou E, Pelto L, Kirjavainen PV, Isolauri E, Salminen SJ et Gibson GR.
Differences in the gut bacterial flora of healthy and milk-hypersensitive adults, as
measured by fluorescence in situ hybridization. FEMS Immunol Med Microbiol, 2001a;
30: 217-221.
Apostolou E, Kirjavainen PV, Saxelin M, Rautelin H, Valtonen V, Salminen SJ et
Ouwehand AC. Good adhesion properties of probiotics: a potential risk for bacteremia.
FEMS Immunol Med Microbiol, 2001b; 31: 35-39.
Asahara T, Shimizu K, Nomoto K, Hamabata T, Ozawa A et Takeda Y. Probiotic
bifidobacteria protect mice from lethal infection with Shiga toxin-producing Escherichia
coli O157:H7. Infection and Immunity, 2004; 7: 2240-2247.
Asselin J, Amiot J, Gauthier SF, Mourad W et Hebert J. Immunogenicity and
allergenicity of whey protein hydrolysates. J Food Sci, 1988; 53: 1208-1211.
Asselin J, Hebert J, Amiot J. Effects of in vitro proteolysis on the allergenicity of major
whey proteins. J Food Sci, 1989; 54: 1037-1039.
Ayad EHE, Nashat S, El-Sadek N, Metwaly H et El-Soda M. Selection of wild lactic
acid bacteria isolated from traditional Egyptian dairy products according to production and
technological criteria. Food Microbiology, 2004; 21: 715-725.
Banasaz M, Norin E, Holma R et Midtvedt T. Increased enterocytes production in
gnotobiotic rats mono-associated with Lactobacillus rhamnosus GG. Applied Environ
Microbiol, 2002; 68: 3031-3034.
100
Références bibliographiques
Bartosch S, Woodmansey EJ, Paterson JC, McMurdo ME et Macfarlane GT.
Microbiological effects of consuming a synbiotic containing Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium lactis, and oligofructose in elderly persons, determined by real-time
polymerase chain reaction and counting of viable bacteria. Clinical Infectious Diseases,
2005; 40: 28-37.
Basset C, Holton J, O’Mahony R et Roitt I.Innate immunity and pathogen-host
interaction. Vaccine, 2003; 21 (suppl 2): S12-23.
Bensoltane A, Bennama R, Hadadji M et Kihal M. Etude bibliographique sur la
caractérisation des Bifidobaterium sp. Annal de l’université d’Oran. 1997 ; 5-31.
Bensoltane A, Yagoubi A, Mahi M et Cheriguene A. Characterization of lactic acid
bacteria isolated from traditional Algerian butter. Egypt J Appl Sci, 2004; 19 (11B): 604614.
Berg R. D. Probiotics, prebiotics or ‘’conbiotics’’. Trends in Microbiology, 1998; 6: 8992.
Besler M, Steinhart H et Paschke A.Stability of food allergens and allergenicity of
processed foods. J Chromato, 2001 ; 756: 207-228.
Bilsborough J, George TC, Norment A et Viney JL. Mucosal CD8alpha+ DC, with a
plasmacytoid phenotype, induce differentiation and support function of T cells with
regulatory properties. Immunol , 2003; 108: 481-492.
Bintsis T, Vafopoulou-Mastrojiannaki A, Litopoulou-Tzanetaki E et Robinson RK.
Protease, peptidase and esterase activities by lactobacilli and yeast isolates from Feta
cheese brine. J Applied Microbiol, 2003; 95: 68-77.
Björkstén B, Sepp E, Julge K, Voor T et Mikelsaar M. Allergy development and the
intestinal microflora during the first year of life. J Allergy Clin Immunol, 2001; 108: 516520.
Björkstén B. Effects of intestinal microflora and the environment on the development of
asthma and allergy. Springer Seminras in Immunopathology, 2004; 25: 257-270.
Blanchette L, Roy D, Bélanger G et Gauthier S. Production of cottage cheese using
dressing fermented by bifidobacteria. J Dairy Sci, 1996; 79:8-15.
Bonomi F, Fiocchi A, Frokiaer H, Gaiaschi A, Iametti S, Poiesi C, Rasmussen P,
Restani P et Rovere P. Reduction of immunoreactivity of bovine beta-lactoglobulin upon
combined physical and proteolytic treatment. J Dairy Res, 2003; 70: 51-59.
Botelho MM, Valente-Mesquita VL, Oliveira KMG, Polikarpov I et Ferreira ST.
Pressure denaturation of β-lactoglobulin, different stabilities of isoforms A and B, and an
investigation of the Tanford transition. European Journal of Biochemistry, 2000; 267:
2235-2241.
101
Références bibliographiques
Boudine N. Caractérisation des bifidobactéries isolées à partir des selles de nouveaux nés.
Mémoire de magister, Unnivesité d’Es Sénia, Oran, Algérie, 2005.
Brandtzaeg P. History of oral tolerance and mucosal immunity. Annals of the New York
Academy of Sciences; 1996; 778: 21-27.
Brandtzaeg P. Current understanding of gastrointestinal immunoregulation and its relation
to food allergy. Annual of New York Academy of Sciences, 2002; 964: 13-45.
Bu P, Keshavarzian A, Stone DD, Liu J, Le PT, Fisher S et Qiao L. Apoptosis: one of
the mechanisms that maintains unresponsiveness of the intestinal mucosal immune system.
J Immunol, 2001; 166: 6399-6403.
Bukowska H, Pieczul-Mroz J, Jastrze¸bska M, Chełstowski K et Naruszewicz M.
Decrease in fibrinogen and LDL-cholesterol levels upon supplementation of diet with
Lactobacillus plantarum in subjects with moderately elevated cholesterol. Atherosclerosis,
1998; 137: 437–438.
Casal HL, Kohler U et Mantsch HH. Structural and conformational changes of βlactoglobulin B: an infrared and spectroscopic study of the effect of pH and temperature.
Biochemica et Biophysica Acta, 1988; 957: 11-20.
Celina-Sauri G & Sierra Basto G. Evaluation thérapeutique de Saccharomyces boulardii
chez des enfants souffrant de diarrhée aiguë. Ann Pediatr (Paris), 1994; 41: 397-400.
Champagne CP. Production de ferments lactiques dans l’industrie laitière. La Fondation
des Gouverneurs et Edisem (ed), Sainte-Hyacinthe, Canada, 1998.
Chatila TA. Role of regulatory T cells in human diseases. J Allergy Clin Immunol, 2005;
116: 949-959; quiz 960.
Chaudhary PM, Ferguson C, Nguyen V, Nguyen O, Massa HF, Eby M, Jasmin Trask
A, BJ, Hood L et Nelson PS. Cloning and characterization of two Toll/Interleukin-1
receptor-like genes TIL3 and TIL4: evidence for a multi-gene receptor family in humans.
Blood, 1998; 9: 4020-4027.
Chekroun A. Valorisation diététique des protéines du lait de vache par la fermentation
lactique: rôle des bactéries lactiques et des bifidobactéries. Thèse de doctorat d’état,
Unnivesité d’Es Sénia, Oran, Algérie, 2005.
Chekroun A, Bensoltane A, Kheroua O et Saidi D. Biotechnological characteristics of
fermented milk by bacterial association of the strains Streptococcus, Lactobacillus and
Bifidobacteria. J Appl Sci, 2006; 21 (2B): 583- 598.
Chen YH, Inobe JI, Marks R, Gonnella P et Kuchroo VK. Weiner HL. Peripheral
deletion of antigen-reactive T cells in oral tolerance. Nature, 1995; 376: 177-180.
102
Références bibliographiques
Chen W, Jin W, Tian H, Sicurello P, Frank M, Orenstein JM et Wahl SM.
Requirement for transforming growth β1 in controlling T cell apoptosis. J Exp Med, 2001a;
4: 439-453.
Chen W, Frank ME, Jin W et Wahl SM. TGF-β released by apoptotic T cells
contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity, 2001b; 14: 715-725.
Chen W & Wahl SM. TGF-beta: the missing link in CD4+CD25+ regulatory T
cellmediated immunosuppression. Cytokine Growth Factor. Rev, 2003; 14: 85-89.
Christensen HR, Frokiaer H et Pestka JJ. Lactobacilli differentially modulate
expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells. J
Immunol, 2002; 168: 171-178.
Cottrez F, Hurst SD, Coffman RI et Groux H. T regulatory cells 1 inhibits a Th2specific response in vivo. J Immunol, 2000; 165: 4848-4853.
Creamer LK, Parry DAD et Malcolm GN. Secondary structure of bovine βlactoglobulin B. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1983; 227 (1): 98-105.
Cross ML, Stevenson LM et Gill HS. Anti-allergy property of fermented foods: an
important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria? Int Immunopharmacol,
2001; 1: 891-901.
Cummings JH, Gibson GR et Macfarlane G. T. Quantitative estimates of fermentation
in the hind gut of man. Acta Veterinaria Scandinavica, 1989; 86: 76-82.
Curk MC, Boeufgras JM, Decaris B, Gavini F, Kersters K, Larpent P, Le Bourgeois
P, Renault P, de Roissart H et Rouvier C. Méthodes d’identification des bactéries
lactiques. Dans: Bactéries lactiques. De Roissart H et Luguet FM (ed). Lorica:Uriage,
1994; 1:141-168.
Dabbagh K & Lewis DB. Toll-like receptors and T-helper-1/T-helper-2 responses.
Current Opinion in Infectious Diseases, 2003; 16: 199-204.
Dalloul RA, Lillohoj HS, Shellemt TA et Doerr JA. Enhanced mucosal immunity
against Elimeria acervulina in broliers fed a Lactobacillus based probiotic. Poult Sci,
2003; 82: 62-66.
Dellaglio F, de Roissard H, Torriani S, Curk MC et Janssens D. Caractéristiques
générales des bactéries lactiques. Dans : Bactéries lactiques. De Roissard H et Luquet FM
(ed.). Lorica: Uriage, 1994 ; 1: 25-116.
De Man JC, Rogosa M et Sharpe ME. A medium for cultivation of Lactobacilli. J Appl
Bacteriol, 1960; 23: 130-135.
Deschildre A, Rancé F et al. Actualités en allergie alimentaire : pourquoi développer des
recommandations pour la pratique des tests de provocation orale chez l’enfant ?. J Allergy
clin Immunol, 2006 ; 46 (3): 164- 166.
103
Références bibliographiques
Dessaint JP. Tolérance ou réactivité aux allergènes. Rev Fr Allergol, 2006; 46 (3):125127.
Dubey UK & Mistry VV. Growth characteristics of bifidobacteria in infant formulas. J
Dairy Sci, 1996; 79 (7): 1146-55.
Duchateau J, Michils A, Lambert J, Gossart B, Casimir G- Anti-betalactoglobulin IgG
antibodies bind to a specific profile of epitopes when patients are allergic to cow’s milk
proteins. Clin Exp Allergy, 1998; 28: 824-33.
Dunne C, O'Mahony L, Murphy L, Thornton G, Morrissey D, O'Halloran S., Feeney
M, Flynn S, Fitzgerald G, Daly C, Kiely B, O 'Sullivan GC, Shanahan F, et Collins J.
K. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo
findings. American Journal of Clinical Nutrition, 2001; 73: 386-392.
Dutau G & Rancé F. Histiore de l’allergie alimentaire: des précurseurs à l’histoire
contemporaine . Rev Fr Allergol, 2006; 46 (3): 312-323.
Echchannaoui H, Frei K, Schnell C, Leib SL, Zimmerli W et Landmann R. Toll-like
receptor 2-deficient mice are highly susceptible to Streptococcus pneumoniae meningitis
because of reduced bacterial clearing and enhanced inflammation. Journal of Infectious
Dieases, 2002; 186: 798-806.
Edwards PJB, Jameson GB, Palmano KP et Creamer LK. Heat-resistant structural
features of bovine β-lactoglobulin. A revealed by NMR H/D exchangeobservations.
Intrnational Dairy Journal, 2002; 12: 331-344.
Eggesbo M, Botten G, Halvorsen R et Magnus P. The prevalence of CMA/CMPI in
young children : the validity of parentally perceived reactions in a population-based study.
Allergy, 2001; 56: 393-402.
Eigenmann PA & Rancé F. Prévention du choc anaphylactique au cours de l’allergie
alimentaire. J Allergy Clin Immunol, 2003; 43: 533-536.
El-Soda M & Macedo A. Olson NF. The peptide hydrolyse system of Bifidobacterium
species. Milchwissenschaft; 1992; 47: 87-90.
Erickson KL & Hubbard NE. Probiotic immunomodulation in health and disease.
Journal of Nutrition, 2000; 130: 403-409.
Everson MP, Lemak DG, McGhee JR et Beagley KW. FACS-sorted spleen and Peyer’s
patch dendritic cells induce different responses in Th0 clones. Adv Exp Med Biol, 1997;
417: 357-362.
Exl BM. A review of recent developments in the use of moderately hydrolyzed whey
formulae in infant nutrition. Nutr Research, 2001; 21: 355-379.
104
Références bibliographiques
Flo TH, Halaas O, Torp S, Ryan L, Lien E, Dybdahl B, Sundan A et Espevik T.
Differential expression of Toll-like receptor 2 in human cells. Journal of Leukocyte
Biology, 2001; 69: 474-481.
Franck AMK, Kegma F et Weerkamp HA. Growth and survival of Bifidobacteria in
milk. Neth Milk Dairy J, 1993; 47: 151-164.
Fritsché R. Animal models in food allergy: assessment of allergenicity and preventive
activity in infant formulas. Toxicol Lett, 2003; 140-141: 303-309.
Fukushima Y, Kawata Y, Hara H, Terada A et Mitsuoka T. Effect of a probiotic
formula on intestinal immunoglobulin A production in healthy children. Int J Food
Microbiol, 1998; 42: 39-44.
Gerosa F, Baldani-Guerra B, Nisii G, Marchesini V, Carra G et Trinchieri G.
Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells. J Exp
Med, 2002; 195: 327-333.
Giampietro P, Kjellman NIM, Oldaeus G, Wouters-Wesseling W et Businco L.
Hypoallergenicity of an extensively hydrolyzed whey formula. Pediatr Allergy Immunol,
2001; 12: 83-86.
Gibson GR & Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota:
introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, 1995; 12: 1401-1412.
Gilliland SE. Concentrated starter culture. In: Bacterial starter cultures for food. Gilliland
SE (ed). CRC Press Inc., Boca Raton, USA, 1985a; 145-157.
Gilliland SE. Role of starter culture bacteria in food preservation. In: Bacterial starter
cultures for food. Gilliland SE (ed). CRC Press Inc., Boca Raton, USA, 1985b; 175-185.
Gobbetti M & Rossi J. Continuous fermentation with free-growing and immobilized
multistarters to get a kefir production pattern. Microbiol. Alim. Nutr, 1998; 11:119-127.
Goldberg DM, Sale JK et Wormsley KG. Ratio of chymotrypsin and trypsin in human
duodenal aspirate. Digestion, 1973; 8: 101-109.
Gomes AM, Malcata FX et Klaver FA. Growth enhacement of Bifidobacterium lactis Bo
Lactobacillus acidophilus Ki by milk hydrolysates. J Dairy Sci, 1998; 81: 281-85.
Gomez AMP & Malcata FX. Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus:
biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as
probiotics. Trends Food Sci Technol, 1999; 10: 139-157.
Gournier-château N, Larpent JP, Castillanos MI et Larpent J. L. Les probiotiques en
alimentation animale et humaine. Édition Technologie et documentation Lavoisier pp. 1192, Paris, France(1994).
105
Références bibliographiques
Grdic D, Hörnquist E, Kjerrulf M et Lycke NY.Lack of local suppression in orally
tolerant CD-8 deficient mice reveals a critical regulatory role of CD8+ T cells in the normal
gut mucosa. J Immunol, 1998; 160: 754-762.
Groleau PE, Gauthier SF et Pouliot Y. Effect of residual chymotryptic activity in a
trypsin preparation on peptide aggregation in a β-lactoglobulin hydrolysate. Int Dairy J,
2003; in press.
Groux H, Bigler M, de Vries J et Roncarolo MG. Interleukin-10 induces a long-term
antigenspecific anergic state in human CD4+ T cells. J Exp Med, 1996; 184: 19-29.
Guandalini S, Pensabene L, Zikri MA, Dias JA, Casali LG et Hoekstra H.
Lactobacillus GG administered in oral rehydratation solution to children with acute
diarrhea : a multicenter European trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2000; 30: 54-60.
Guessas B & Kihal M. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Algerian arid
zone raw goats’ milk. Afr J Biotechnol, 2004; 3 (6): 339-342.
Hadadji M,Benama R, Saidi N, Henni DE et Kihal M. Identification of cultivable
Bifidobacterium species isolated from breast-fed infants faeces in West-Algeria. Afr J
Biotechnol, 2005; 4(5): 422-430.
Hadadji M & Bensoltane A. Growth and lactic acid production by Bifidobacterium
longum and Lactobacillus acidophilus in goat’s milk. Afr J Biotechnol, 2006; 5(6): 505509.
Haddad ZH, Vin Karla FACA et Verma S. IgE antibodies to peptic and peptic-tryptic
digests of betalactoglobulin: significance in food hypersensitivity. Ann Allergy, 1979; 42:
368-371.
Halker S, Host A, Hansen LG, Osterballe O. Safety of a new, ultrafiltrated whey
hydrolysate formula in children with cow milk allergy: a clinical investigation. Pediatr
Allergy Immunol, 1993; 4: 53-9.
Hambling SG, McAlpine AS et Sawyer L. Milk proteins: molecular, physical, chemical
and biological aspects. In: Advanced Dairy Chemistry-1. Fox, P. F. (ed.); Elsevier Appl
Sci: New-York, 1992.
Hartke A, Bouché S, Gansel X, Boutibonnes P et Auffray Y. Starvation-induced stress
resistance in Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403. Appl Environ Microbiol, 1994 ; 60:
3474-3478.
He F, Ouwehand AC, Isolauri E, Hashimoto H, Benno Y et Salminen S. Comparison
of mucosal adhesion and species identification of bifidobacteria isolated from healthy and
allergic infant. FEMS Immunol Med Microbiol, 2001; 30: 43-47.
Hekmat S & McMahon DJ. Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium
bifidum in ice cream for use as a probiotic food. J Dairy Sci, 1992; 75:1415-1422.
106
Références bibliographiques
Heller KJ. Probiotic bacteria in fermented foods: Product characteristics and starter
organisms. Am J Clin. Nutr, 2001; 73: 374-379.
Hermans D. Aspects cliniques de l’allergie alimentaire du jeune enfant. Pediatrics, 2005;
124: S214-219.
Hershberg RM & Mayer LF. Antigen processing and presentation by intestinal epithelial
cells-polarity and complexity. Immunol Today, 2000; 21: 123-128.
Heyman M; Ducroc R; Desjeux JF et Morgat JL. Horseradish peroxydase transport
across adult rabbit jejunum in vitro. Am. J. Physiol, 2000; 242 (5): G558- G564.
Hide DW & Grant C. Hypo allergenic formulae. Have they a therapeutic role? Clin Exp
Allergy, 1994; 24: 3-5.
Holzapfel WH, Haberer P, Snel J, Schillinger U et Huis in’t Veld JHJ. Overview of
gut flora and probiotics. International. Journal of Food Microbiology, 1998; 41: 85-101.
Hopkins MJ, Sharp R et Macfarlane GT. Variation in human intestinal microbiota with
age. Digestive and Liver Diseases, 2002; 34: 12-18.
Hosono JL, Amenati A, Natsume M, Hirayama M, Adachi T et Kaminogawa S.
Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with immunopotentiating
activity from Bifidobacterium adolescentis M101-4 . Bioscience, Biotechnology and
Biochemistr, 1997; 61: 312-316.
Host A & Halken SA. A prospective study of cow milk allergy in Danish infant during the
first 3 years of life. Allergy, 1990; 45: 587-96.
Hould R. Techniques d’histopathologie et de cytopathologie. Paris Montrèal, MaloineDècarie, 1984; Chap II, 147-156.
Ishibashi N & Shimamura S. Bifidobacteria: Research and development in Japan. Food
Technol, 1993; 47:126-135.
Ishibashi N & Yamazaki S. Probiotics and safety. Am J Clin Nutr, 2001; 73 (Suppl):
465S- 470S.
Ishii KJ, Gursel I, Gursel M et Klinman DM. Immunotherapeutic utility of stimulatory
and suppressive oligodeoxynucleotides. Current Opinion in Molecular Thermodynamic,
2004; 6: 166-174.
Isolauri E, Sütas Y, Mäkinen-Kiljunen S, Oja SS, Isosomppi R et Turjanmaa K.
Efficacy and safety of hydrolyzed cow milk and amino acid-derived formulas in infants
with cow milk allergy. J Pediatr, 1995; 127: 550-557.
Isolauri E, Sütas Y, Salo MK, Isosomppi R et Kaila M. Elimination diet in cow’s milk
allergy: risk for impaired growth in young children. J Pediatrics, 1998; 132: 1004-1009.
107
Références bibliographiques
Isolauri E, Arvola T, Sütas Y, Moilanen E et Salminen S. Probiotics in the management
of atopic eczema. Clin Exp Allergy, 2000; 30: 1604-1610.
Isolauri E, Salminen S et Ouwehand AC. Probiotics. Best Practice & Research Clinical
Gastroenterology, 2004; 18: 299-313.
Järvinen KM, Mäkinen-Kiljunen S, Suomalainen H. Cow’s milk challenge through
human milk evokes immune responses in infants with cow’s milk allergy. J Pediatr, 1999;
135: 506-512.
Jedrychowski L & Wróblewska B. Reduction of the antigenicity of whey proteins by
lactic acid fermentation. Food Agri Immunol, 1999; 11: 91-99.
Jijon H, Backer J, Diaz H, Yeung H, Thiel D, McKaigney C, De Simone C et Madsen
K. DNA from probiotic bacteria modulates murine and human epithelial and immune
function. Gastroenterology, 2004; 26: 1358-1373.
Jelen P & Lutz S. Functional milk and dairy products. In : Functional foods. Biochernical
& Processing Aspect. Mazza, G. (ed.). Technornic publication, Pennsylvania, 1998; p:
357-374.
Juchet A, Chabbert-Broué A, Micheau P, Piot M et Brémont F. Évolution naturelle de
l’allergie alimentaire chez l’enfant. Rev Fr Allergol, 2003; 43 (3):186-191.
Jutel M, Akdis M, Budak F, Aebischer-Casaulta C, Wrzyszcz M, Blaser K et Akdis
CA. IL-10 and TGF-β cooperate in the regulatory T cell responses to mucosal allergens in
normal immunity and specific immunotherapy. Eur J Immunol, 2003; 33: 1205-1214.
Kackzmarski M, Semeniuk J et Taraszkiewicz LF. Gluten intolerance as a didease of
children and adult. Pediatr Pol, 1989; 64(8-9): 571-8.
Kalliomäki M, Kirjavainen P, Eerola E, Kero P, Salminen S et Isolauri E. Distinct
pattern of neonatal gut microflora in infants in whom atopy was and was not developing. J
Allergy Clin Immunol, 2001; 107: 129-134.
Kambayashi T, Assarson E, Lukacher AE, Ljunggren HG et Jensen PE. Memory
CD8+ T cells provide and early source of IFN-gamma. J Exp Immunol, 2003; 170: 23992408.
Kankaanpa P, Sutasb Y, Salminena S et Isolaurib E. Homogenates derived from
probiotic bacteria provide down-regulatory signals for peripheral blood mononuclear
cells. Food Chemistry, 2003; 83: 269-277.
Karlsson M, Lundin S, Dahlgren U, Kahu H, Pettersson I et Telemo E. “Tolerosomes”
are produced by intestinal epithelial cells. Eur J Immunol, 2001; 31: 2892-2900.
108
Références bibliographiques
Kinsella, JE. Protein modification: effects on functional properties and digestibility. In:
Milk proteins: nutritional, clinical, functional and technological aspects. Barth, CA &
Schilmme E. (Eds.); Springer-Verlag: New York, 1988.
Kirjavainen P.V, El-Nezami H.S, Salminen S.J, Ahokas J.T et Wright PFA. The effect
of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte
proliferation. FEMS Immunol Med Microbiol, 1999; 26: 131-135.
Kirjavainen PV, Arvola T, Salminen SJ et Isolauri E. Aberrant composition of gut
microbiota of allergic infants: a target of bifidobacterial therapy at weaning? Gut, 2002;
51: 51-55.
Kirjavainen PV, Salminen SJ et Isolauri E. Probiotic bacteria in the management of
atopic disease: underscoring the importance of viability. J Pediatr Gastroenterol Nutr,
2003; 36: 223-227.
Kitazawa H, Ishii Y, Uemura J, Kawai Y, Saito T, Kaneko T, Noda K et Itoh T.
Augmentation of macrophage functions by an extracellular phosphopolysaccharide from
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Food Microbiology, 2000; 17: 109-118.
KohnoT, Kobashiri Y, Sugie Y, Takai S, Watabe K, Kaino Y et Kida K. Antibodies to
food antigens in Japanese patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Proct,
2002; 55: 1-9.
Kolter R. The stationary phase of the bacterial life cycle. Annu. Rev. Microbiol, 1993; 47:
855-874.
Kontopidis G, Holt C et Sawyer L. The ligand-binding site of bovine β- lactoglobulin:
evidence for a function. Journal of Molecular Biolog, 2002; 318: 1043-1055.
Kramer MS & Kakuma R. Maternal dietary antigen avoidance during pregnancy and/or
lactation for preventing or treating atopic disease in the child (Cochrane Review). In: The
Cochrane Library, Issue 4. Chichester, UK: John Wiley & Sons, 2003.
Kukkonen K, Savilahti E, Haahtela T, Juntunen-Backman K, Korpela R, Poussa T,
Tuure T et Kuitunen M. Probiotics and prebiotic galacto-oligosaccharides in the
prevention of allergic diseases: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J
Allergy Clin Immunol, 2007; 119 (1):192-8.
Kull I, Bohme M, Wahlgren CF, Nordvall L, Perchgen G, Wickman M. Breast-feeding
reduces the risk for childhood eczema. J Allergy Clin Imminol, 2005; 116: 657-61.
Kunji ERS, Mierau I, Hagting A, Poolman B et Konings WN. The proteolytic systems
of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 1996; 70: 187-221.
Larpent JP & Larpent MG. Memento technique de microbiologie. Second Ed technique
et documentaire Lavoisier, 1990; 417-420.
109
Références bibliographiques
Lifrani A. Etude du risque allergique à différentes protéines alimentaires. Mise au point de
modèle de souris allergiques à l’arachide, à l’albumine, à la caséine et à la colle de poisson.
Thèse de doctorat, Institut National Agronomique, Paris-Grignon, 2006.
Lima-Filho JV, Vieira LQ, Arantes R. M et Nicoli JR. Effect of the Escherichia coli
EMO strain on experimental infection by Salmonella enterica serovar Typhimurium in
gnotobiotic mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2004; 37: 10051013.
Lipscomb MF & Masten BJ. Dendritic cells: Immune regulators in health and disease.
Physiol Rev, 2002; 82: 97-130.
Lombardo G, Barberio G, Pajno GB, La Rosa M et Barberi I. Nutritional adequacy of
cow’s milk substitutes. Allergy, 1998; 53 (Suppl 46): 118-121.
Lorient D. Influence des traitements technologiques sur les propriétés nutritionnelles du
lait. Chapitre 3. In : Lait, nutrition et santé. Edition Tec & Doc Lavoisier, Paris, 2001; 193207.
Lowry OH, Rouserbrough NH, Fan AL et Randal RI. Protein mesurment with folin
phenol reagent. J Biol Chem, 1951; 193: 265-75.
Lundin BS, Karlson MR, Svensson LA, Hanson LA, Dahlgren UIH et Telemo E.
Active suppression in orally tolerized rats coincides with in situ transforming growth
factorbeta (TGF-β) expression in the draining lymph nodes. Clin Exp Immunol, 1999; 116:
181-187.
MacDonald T. Immunosuppression caused by antigen feeding. I: Evidence for the
activation of a feedback suppressor pathway in the spleens of antigen-fed mice. Eur J
Immunol, 1982; 12: 767-773.
Magnan A & Vervloet D. Allergies: determinants of T2 lymphocyte polarization and
desensitization mechanisms. Rev Mal Respir, 1997; 14(3): 173-81.
Marchal N, Bourdon JL et Richard CL. Les milieux de culture pour l’isolement et
l’identification biochimique des bactéries. Ed Doin, 1991; p: 65- 149.
Marth T, Zeitz M, Ludviksson BR, Strober W et Kelsall BL. Extinction of IL-12
signaling promotes Fas-mediated apoptosis of antigen-specific T cells. J Immunol, 1999;
162: 7233-7240.
Massol M. Allaitement maternel et lait de vache. Rev Aesculape, 1998 ; p:10.
Mastrandrea F, Coradduzza G, Serio G, Minardi A, Manelli M, Ardito S et Muratore
L. Probiotics reduce the CD34+ hemopoietic precursor cell increased traffic in allergic
subjects. Allergy and Immunology (Paris), 2004; 36: 118-122.
Mattila-Sandholm T, Myllarinen P, Crittenden R, Mogensen G, Fonden R et Saarela
M. Technological challenges for future probiotic foods. Int Dairy J, 2002; 12:173-182.
110
Références bibliographiques
McCann SA, McCann ML. Suddens infant death syndrome (SIDS) from cow milk
allergy. J Allergy Clin Immunol, 1995; 95: 330.
McCarthy J, O'Mahony L, O'Callaghan L, Sheil B, Vaughan EE, Fitzsimons N,
Fitzgibbon J, O'Sullivan GC, Kiely B, Collins JK et Shanahan F. Double blind,
placebo controlled trial of two probiotic strains in interleukin 10 knockout mice and
mechanistic link with cytokine balance. Gut, 2003; 52: 975-980.
McCracken VJ & Lorenz RG. The gastrointestinal ecosystem: a precarious alliance
among epithelium, immunity and microbiota. Cellular Microbiology, 2001; 3: 1-11.
McKenzie HA. beta-lactoglobulins. In: Milk proteins: Chemistry and molecular biology.
Academic press: New-York, 1972; p. 257-330.
Medici M, Vinderola CG et Perdigon G. Gut mucosal immunomodulation by probiotic
fresh cheese. Int Dairy J, 2004; 14: 611-618.
Medzhitov R, Preston-Hurlburt P et Janeway CA Jr. A human homologue of the
Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature, 1997; 388: 394397.
Melamed D & Friedman A. Direct evidence of anergy in T lymphocytes tolerized by oral
administration of ovalbumin. Eur J Immunol, 1993; 23: 935-942.
Melmed G, Thomas LS, Lee N, Tesfay SY, Lukasek K, Michelsen KS, Zhou Y, Hu B,
Arditi M et Abreu MT. Human intestinal epithelial cells are broadly unresponsive to
Toll-like receptor 2-dependant bacterial ligands: implications for host-microbial
interactions in the gut. J Immunol, 2003; 170: 1406-1415.
Mercenier A, Pavan S et Pot B. Probiotics as biotherapeutic agents: Present knowledge
and future prospects. Current Pharmaceutical Design, 2002; 8: 99-110.
Mitsuoka T. Microbes in the intestine. Ed. Yakult Honsha Co., Tokyo, Japan, 1989.
Modler HW, McKellar RC, Yaguchi M (1990) Bifidobacteria and bifidogenic factors.
Can Inst Food Sci Technol J, 1990; 23:29-41.
Molkou P. Allergie alimentaire chez l’enfant. Encyclopédie Med Chir. Editions
Scientifiques et Médicales Elsevier, Paris, AKOS Encyclopédie pratique de médecine 80319 : 1-12.
Monaco HL., Zanotti G, Spadon P, Bolognesi M, Sawyer L et Eliopoulos EE.
Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with
retinol at 2.5 Å resolution. Journal of Molecular Biology, 1987; 197: 695-706.
Moneret-Vautrin DA, Hatachet R et Kanny G. Hydrolysats de protéines: laits
hypoallergéniques et formules extensivement hydrolysées. Bases immunologiques de leur
utilisation dans la prévention et le traitement de l’allergie au lait. Arch Pediatr, 2001; 8:
1348-1357.
111
Références bibliographiques
Monteleone I, Vavassori P, Biancone L, Monteleone G et Pallone F. Immunoregulation
in the gut: success and failures in human disease. Gut; 2002; 50: 60-64.
Moreau MC & Gaboriau-Routhiau V. The absence of gut flora, the doses of antigen
ingested and aging affect the long-term peripheral tolerance induced by ovalbumin feeding
in mice. Res Immunol, 1996; 147: 49-59.
Morein B, Abusugra I et Blomqvist G. Immunity in neonates. Vet Immunol
Immunopathol, 2002; 87: 207-213.
Morita H, He F, Fuse T, Ouwehand AC, Hashimoto H, Hosoda M, Mizumachi K et
Kurisaki JI. Cytokine production by the murine macrophage cell line J774.1 after
exposure to lactobacilli. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2002; 66:19631966.
Mowat AM & Viney JL. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunol Rev,
1997; 156: 145- 166.
Myllyluoma E, Ahlroos T, Veijola L, Rautelin H, Tynkkynen S et Korpela R. Effects
of anti-Helicobacter pylori treatment and probiotic supplementation on intestinal
microbiota. Int J Antimicrob Agent, 2007; 29(4): 66-72.
Nagao F, Nakayama M, Muto T et Okumura K. Effects of fermented milk drink
containing Lactobacillus casei strain Shirota on the immune system in healthy human
subjects. Biosci Biotechnol Biochem, 2000; 64: 2706-2708.
Nagler-Anderson C & Shi HN. Peripheral nonresponsiveness to orally administered
soluble protein antigens . Crit Rev Immunol, 2001; 21: 121-131.
Newman MJ. Preface. Adv Drug Deliv Rev, 1998; 32(3): 153-154.
Ng KY & Griffiths MW. Enhancement of macrophages cytokine release by cell-free
fractions of fermented milk. Milchwissenschaft, 2002; 57: 66-70.
Niggemann B, Staden U, Rolinck-Werninghaus C et Beyer K. Specific oral tolerance
induction in food allergy. J Compilation, 2006; 61: 808–811.
Nzelof N. Technique microscopique. Ed Flammarion Medecine Sciences, 1972; p: 1-3-3570.
Oldaeus G, Björksten B, Jenmalm MC et Kjellman NI. Cow’s milk IgE and IgG
antibody responses to cow’s milk formulas. Allergy, 1999; 54: 352-357.
Ouwehand AC, Kirjavainen PV, Shortt C et Salminen S. Probiotics: mechanisms and
established effects. Int Dairy J, 1999; 9: 43-52.
Ouwehand AC & Vesterlund S. Health aspects of probiotics. Drugs, 2003; 6: 573- 580.
112
Références bibliographiques
Papiz, MZ, Sawyer L, Eliopoulos EE, North ACT, Findlay JBC, Sivaprasadarao R,
Jones TA, Newcomer ME et Kraulis PJ. The structure of β-lactoglobulin and its
similarity to plasma retinol-binding protein. Nature, 1986; 324: 383-385.
Payne JF, Morris AEJ, Peers P. Evolution of selective media for the enumeration of
Bifidobacterium sp in milk. J appl Microbiol, 1999; 86: 353-358.
Pecquet S, Pfeifer A, Gauldie S et Fritsché R. Immunoglobulin E suppression and
cytokine modulation in mice orally tolerized to β-lactoglobulin. Immun, 1999; 96: 278285.
Pelto L, Isolauri E, Lilius E-M, Nuutila J et Salminen S. Probiotic bacteria downregulate the milk-induced inflammatory response in milk-hypersensitive subjects but have
immunostimulatory effect in healthy subjects. Clin Exp Allergy, 1998; 28: 1474-1479.
Perdigon G, Fuller R et Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune
system. Current Issues Intestinal Microbiology, 2001; 2: 17-42.
Perez VL, van Parijs L, Biuckians A, Zheng XX, Strom TB et Abbas AK. Induction of
peripheral T cell tolerance in vivo requires CTLA-4 engagement. Immunity, 1997; 6: 411417.
Pérez-Machado A, Ashwood P, Thomson MA, Latcham F, Sim R, Walker-Smith JA
et Murch SH. Reduced transforming growth factor-β1-producing T cells in the duodenal
mucosa of children with food allergy. Eur J Immunol, 2003; 33: 2307-2315.
Pessi T, Sütas Y, Saxelin M, Kallioinen H et Isolauri E. Antiproliferative effects of
homogenates derived from five strains of candidate probiotic bacteria. Appl Environ
Microbiol, 1999; 65: 4725-4728.
Pessi T, Sutas Y, Hurme M et Isolauri E. Interleukin-10 generation in atopic children
following oral Lactobacillus rhamnosus GG. Clin Exp Allergy, 2000; 30 (12):1804-8.
Philips TE; Philips TL, Neutra MR. Macromolécules can pass the rough occluding
junctions of rat ileal epithelium during cholinergic stimulation. Cell tissues. Res, 1987;
247: 547-554.
Piguet PF, Vesin C, Donati Y, Barazzone C. TNF-induced enterocyte apoptosis and
detachment in mice : induction of caspases and prevention by a caspase inhibitor, ZVADfmk. Lab Invest, 1999; 79 (4): 495-500.
Plummer S, Weaver MA, Harris JC, Dee P et Hunter J. Clostridium difficile pilot
study: effects of probiotic supplementation on the incidence of C. difficile diarrhoea. Int
Microbiol, 2004; 7(1): 59-62.
Pochard P, Gosset P, Grangette C, Andre C, Tonnel AB, Pestel J et Mercenier A.
Lactic acid bacteria inhibit Th2 cytokine production by mononuclear cells from allergic
patients. J Allergy Clin Immunol, 2002; 110: 617-623.
113
Références bibliographiques
Pougheon S. Le lait et ses constituants: caractéristiques physico-chimiques. Le lait,
nutrition et santé. Edition Tec & Doc Lavoisier, Paris, 2001; 21-22.
Prioult G. Effet des probiotiques sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la βlactogllobuline chez la souris et étude de leurs mécanismes d’action- Thèse de doctorat,
Université Laval, Québec, 2003.
Prioult G, Fliss I et Pecquet S. Effect of probiotic bacteria on induction and maintenance
of oral tolerance to β-lactoglobulin in gnotobiotic mice. Clinical Diagnostic and
Laboratory Immunology, 2003; 10: 787-792.
Qin BY, Bewley MC, Creamer LK, Baker EN et Jameson GB. Functional implications
of structural differences between variants A and B of bovine β- lactoglobulin. Protein
Science, 1999 ; 8 : 75-83.
Rallu F, Gruss A, Maguin E. Lactococcus lactis and stress. Antonie Van Leeuwenhoek,
1996; 70: 243-251.
Rancé F & Bidat E. Toutes les allergies alimentaires ne se ressemblent pas. Allergie
alimentaire chez l’enfant (Chap 5). Rancé F and Bidat E (Eds). Médecine & Hygiène,
Genève, 2000; p.210.
Rancé F & Bidat E. Allergie alimentaire chez l’enfant. Genève : Médecine & Hygiène,
Médecine & enfance ; ISBN : 2-88 049, 149-154.
Rancé F & Bidat E. Les régime d’éviction : pour qui, comment ?. Rev Fr Allergol, 2006 ;
46 : 221- 226.
Rancé F, Grandmottet X et Grandjean H. Prevalence and main caracteristics of school
children diagnosed with food allergies in France. Clin Exp Allergy, 2005; 35: 167-72.
Rastall R A. Bacteria in the gut: Friends and foes and how to alter the balance. Journal of
Nutrition, 2004; 134: 2022-2026.
Rautava S, Kalliomaki M et Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding
might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant. J Allergy
Clin Immunol, 2002; 109: 119-121.
Reddy IM, Kella NKD et Kinsella JE. Structural and conformational basis of the
resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 1988; 36: 737-741.
Restani P, Gaiaschi A, Plebani A, Beretta B, Velonà T, Cavagni G, Poiesi C, Ugazio
AG, Galli CL. Evaluation of the presence of bovine proteins in human milk as a possible
cause of allergic symptoms in breast-fed children. Ann Allergy Asthma Immunol, 1999; 84:
353- 360.
Rigal N, Reiter F, Morice C, de Boissieu D et Dupont C. Impact du régime d’éviction
sur la néophobie dans le cadre d’une allergie alimentaire chez l’enfant : étude exploratoire.
Arch Pediatr, 2005; 12: 1714-20.
114
Références bibliographiques
Rokka T, Syväoja EL, Tuominen J, Korhonen H. Release of bioactive peptides by
enzymatic proteolysis of Lactobacillus GG fermented UHT milk. Milchwissenschaft, 1997;
52: 675-677.
Roncarolo MG. Type 1 T regulatory cells. Immunol Rev, 2001; 182: 68-79.
Rook GA & Brunet LR. Microbes, immunoregulation, and the gut. Gut, 2005; 54: 31720.
Rosenfeldt V, Benfeldt E, Nielsen SD, Michaelsen KF, Jeppesen DL, Valerius NH et
Paerregaard A. Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis.
J Allergy Clin Immunol, 2003; 111(2): 389-95.
Rosenthal I & Bernstein S. The survival of a commercial culture of bifidobacteria in milk
products. Milchwissen, 1998; 53: 441-443.
Rouissat L & Bensoltane A. Physico-chemical, microbiological a biotechnological
studies of lactic a flora isolated from ewe’s milk of Algerian two breeds (Ouled djellal and
El hamra).J Appl Sci, 2006; 21 (2B): 557-582.
Rouquette P. Maladie coeliaque, intolérance aux protéines du lait de vache. Problème de
diagnostic différentiel et intérêt de la numération des lymphocytes intraépithéliaux. Thèse,
1980.
Saarinen UM & Kajosaari M. Breastfeeding as prophylaxis against atopic disease:
prospective follow-up study until 17 years old. Lancet, 1995; 346: 1065-1069.
Saidi D, Heyman M, Kheroua O, Boudraa G, Bylsma P, Kerroucha R, Chekroun A,
Maragi JA, Touhami M et Desjeux JF. « Jejunal response to β−lactoglobuline in infants
with cow's milk allergy."Réponse intestinale à la β-lactoglobuline dans l'allergie aux
protéines du lait de vache chez l'enfant". C.R.Acad. Sci.Paris, Sciences de la vie/ Life
sciences, 1995; 318: 683-9.
Saito T. Selection of useful probiotic lactic acid bacteria from the Lactobacillus
acidophilus group and their applications to functional foods. Animal Science Journal,
2004; 75: 1-13.
Sakai K, Sakurai K, Sakai M, Hoshino M et Goto Y. Conformation and stability of
thiol-modified bovine β-lactoglobulin. Protein Science, 2000; 9: 1719-1729.
Sakurai K, Oobatake M et Goto Y. Salt-dependent monomer-dimer equilibrium of
bovine β-lactoglobulin at pH 3. Protein Science, 2001; 10: 2325-2335.
Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault M-C, Cummings JH, Franck A, Gibson GR,
Isolauri E, Moreau M-C, Roberfroid M et Rowland I. Functional food science and
gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr, 1998; 80 (Suppl 1): S147-S171.
Saloff-Coste CJ. Bifidobactéries. Danone World Newsl. Danone, Le Plessis- Robinson,
France, 1997; p:16.
115
Références bibliographiques
Savilathi E, Sankkonen TT, Virtala ET, Tuomiletho J et Akerblom HK. Increased
levels of cow’s milk and betalactoblobin antibodies in yung children with newly diagnosed
IDDM. The childhood diabetes in Finland study group. Diabetes Care, 1993; 16: 984-989.
Sawyer L & Kontopidis G. The core lipocalin, bovine β-lactoglobulin. Biochimica et
Bionphysica Acta, 2000; 1482: 136-148.
Scardovi V. Genus Bifidobacterium. Dans Bergey’s manual of systematic bacteriology. 9
ème édition. Vol 2. Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG (ed). Williams and
Wilkins. Publ. Baltimore, 1986; 1418-1434.
Schiffrin EJ & Blum S. Interactions between the microbiota and the intestinal mucosa.
European Journal of Clinical Nutrition, 2002; 56: 60-64.
Schmidt DG, Meijer RJGM, Slangen CJ et van Beresteijn ECH. Raising the pH of the
pepsincatalysed hydrolysis of bovine whey proteins increases the antigenicity of the
hydrolysates. Clin Exp Allergy, 1995; 25: 1007-1017.
Schrander JJP, Oudsen S, Fofget PP et Kuijten RH. Follow-op study of cow's milk
protein in tolerant infants. Eur J Pediatr, 1992; 151: 783-5.
Schwartz RH. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990; 248:
1349-1356.
Serreze DV, Ottendofer EW, Ellis TM, Gauntt CJ et Atkinson M. Acceleration of
type1 diabetes by a coxsackievirus infection requires a preexisting critical mass of
autoreactive T-cells in pancreatic islets. Diabetes, 2000; 49: 708-711.
Shah NP. Bifidobacteria: Characteristics and potential for application in fermented milk
products. Milchwissen, 1997; 52:16-21.
Sheikh A & Strachan D. The hygiene theory: fact or fiction?. Current Opinion in
Otolaryngology & Head & Neck Surgery, 2004; 12: 232-236.
Shi HN, Grusby MJ et Nagler-Anderson C. Orally induced peripheral
nonresponsiveness is maintained in the absence of functional Th1 and Th2 cells. J
Immunol, 1999; 162: 5143- 5148.
Shihata A & Shah NP. Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria. Int Dairy J,
2000; 10: 401-408.
Shornikova AV, Isolauri E, Burkanova L, Lukovnika S et Vesikari T. A trial in the
Karelian Republic of oral rehydratation and Lactobacillus GG for treatment of acute
diarrhea. Acta Paediatr, 1997a; 86: 460-5.
Shornikova AV, Casas IA, Mykkänen H, Salo E et Vesikari T. Bacteriotherapy with
Lactobacillus reuteri in rotavirus gastroenteritis. Pediatr Infect Dis J, 1997b; 16: 1103.
116
Références bibliographiques
Sigurs N, Hattevig G et Kjellman B. Maternal avoidance of eggs, cow's milk, and fish
during lactation: effect on allergic manifestations, skin-prick tests, and specific IgE
antibodies in children at age 4 years. Pediatrics, 1992; 89: 735-9.
Silbernagl S & Despopoulos A. Atlas de poche de physiologie. 2ème édition. Silbernagl S
and Despopoulos A (Eds). 1992; p366.
Simon O, Vahjen W et Scharek L. Micro-organism as feed additives-Probiotics. In
Proceeding of the 9th international symposium on digestive physiology in pigs. Banff,
Canada. R O Ball(ed). Publ University of Alberta, 2003; 1: 295-318.
Spahn TW & Kucharzik T. Modulating the intestinal immune system: The role of
lymphotoxin and galt organs. Gut, 2004; 53: 456-465.
Stadhouders J. The control of chease starter activity. Neth Milk Daity J, 1986; 40: 155173.
Stanton C, Gardiner G, Lynch PB, Collins K, Fitzgerald G, Ross RP. Probiotic cheese.
Int. Dairy J, 1998; 8: 491-496.
Steinbrink K, Wolfl M, Jonuleit H, Knop J et Enk AH. Induction of tolerance by IL-10treated dendritic cells. J Immunol, 1997; 159: 4772-4780.
Strobel S & Mowat AM. Immune responses to dietary antigens: oral tolerance. Immunol
Today, 1998; 19: 173-181.
Strobel S. Oral tolerance, systemic immunoregulation and autoimmunity. Ann Y Acad Sci,
2002; 958: 47- 58.
Sudo N, Sawamura S-A, Tanaka K, Aiba Y, Kubo C et Koga Y. The requirement of
intestinal bacterial flora for the development of an IgE production system fully susceptible
to oral tolerance induction. J Immunol, 1997; 159: 1739-1745.
Sütas Y, Hurme M et Isolauri E. Down-regulation of anti-CD3 antibody-induced IL-4
production by bovine caseins hydrolysed with Lactobacillus GG-derived enzymes. Scand J
Immunol, 1996; 43: 687-689.
Takeuchi M, Alard P et Streilein JW. TGF-beta promotes immune deviation by altering
accessory signals of antigen-presenting cells. J Immunol, 1998; 160: 1589-1597.
Takeuchi O, Hoshino K et Akira S. Cutting edge: TLR2-deficient and MyD88- deficient
mice are highly susceptible to Staphylococcus aureus infection. Journal of Immunology,
2000; 165: 5392-5396.
Tamime AY, Marshall VME et Robinson RK. Microbiological and technological
aspects of milks fermented by bifidobacteria. J Dairy Res, 1995; 62:151-187.
Tanaka K & Ishikawa H. Role of intestinal bacterial flora in oral tolerance induction.
Histology and Histopathology, 2004; 19: 907-914.
117
Références bibliographiques
Tannock GW. Probiotic properties of lactic-acid bacteria: plenty of scope for fundamental
R & D. Trends in Biotechnology, 1997; 15: 270-274.
Thibault H, Aubert-Jacquin C et Goulet O.Effects of long-term consumption of a
fermented infant formula (with Bifidobacterium breve c50 and Streptococcus thermophilus
065) on acute diarrhea in healthy infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2004; 39(2):14752.
Tissier H. Recherches sur la flore intestinale (état normal et pathologique) des nourrissons.
Thèse de doctorat, Université de médecine, Paris, France, 1900.
Ulisse S, Gionchetti P, D’Alo S, Paola Russo F, Pesce I, Ricci G, Rizzello F, Helwig U,
Grazia Cifone M, Campieri M et De Simone C. Expression of cytokines, inducible
nitric oxide synthase, and matrix metalloproteinases in pouchitis: Effects of probiotic
treatment. The americain Journal of Gastroenterolog, 2001; 96: 2691-2699.
Umpierrez A, Quirce S, Maranon F, Cuesta J, Garcia-Villamuza Y, Lahoz C et Sastre
J. Allergy to goat and sheep cheese with good tolerance to cow cheese. Clin Exp Allergy,
1999; 29: 1064-1068.
Vahasalo P, Petays T, Knip M, Micttinen A, Sankkonen T, Karjalainen J, Savilathi E
et Ackerblom HK. Relation between antibodies to islet cell antigene, other auto antigens
and cow’s milk prpteins in diabetic children and unaffected siblings at the clinical
manifestation of IDDM. The childhood diabetes in Finland Study Group. Autoimmunity,
1996; 23:165-174.
Van Amelsfort JM, Jacobs KM, Bijlsma JW, Lafeber FP et Taams LS. CD4+CD25+
regulatory T cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence, phenotype, and
function between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis Rheumatism, 2004; 50:
2775-2785.
Vanderhoof JA & Young RJ. Food hypersensitivity in children. Curr Opin Clin Nutr
Metb Care, 1998; 1: 419-422.
Van Vlasselaer P, Punnonen J et de Vries JE. Transforming growth factor-beta directs
IgA switching in human B cells. J Immunol, 1992; 148: 2062-2067.
Velazquez P, Wei B et Braun J. Surveillance B lymphocytes and mucosal
immunoregulation. Springer Seminars in Immunopathology, Dec 18 (Epub ahead of print),
2004.
Ventura M & Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic
classification of Bifidobacterium lactis. Appl Environ Microbiol, 2002; 68: 6429-6434.
Vinderola CG, Mocchiutti P et Reinheimer JA .Interactions among lactic acid starter
and probiotic bacteria used for fermented dairy products. J Dairy Sci, 2002; 85:721-729.
118
Références bibliographiques
Viney JL, Mowat AM, O’Malley JM, Williamson E et Fanger NA. Expanding dendritic
cells in vivo enhances the induction of oral tolerance. J Immunol, 1998; 160: 5815-5825.
Von Berg A, Koletzko S, Grübl A, Filipiak-Pittroff B, Wichmann H-E, Peter Bauer
C, Reinhardt D et Berdel D.The effect of hydrolyzed cow’s milk formula for allergy
prevention in the first year of life: the german infant nutritional intervention study, a
randomized double blind trial. J Allergy Clin Immunol, 2003; 111: 533-540.
Wakkach A, Cottrez F et Groux H. Can interleukin-10 be used as a true
immunoregulatory cytokine? Eur Cyto Network, 2000; 11: 153-160.
Wakkach A, Fournier N, Brun V, Breittmayer JP, Cottrez F et Groux H.
Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell
differentiation in vivo. Immunity, 2003; 18: 605-617.
Wal JM. Structure and function of allergens. Allergy, 2001; 56 (suppl 67): 35-8.
Wang JE, Dahle MK, McDonald M, Foster SJ, Aasen AO et Thiemermann C.
Peptidoglycan and lipoteichoic acid in gram-positive bacterial sepsis: receptors, signal
transduction, biological effects, and synergism. Shock, 2003; 20: 402-414 .
Wang MF, Lin HC, Wang YY et Hsu CH. Treatment of perennial allergic rhinitis with
lactic acid bacteria. Pediatric Allergy and Immunology, 2004; 15: 152-158.
Wasmuth HE & Kolb H. Cow’s milk and immune-mediated diabetes. Proc Nutr Soc,
2000; 59: 573-579.
Watanabe S, Narisawa Y, Arase S, Okamatsu H, Ikenaga T, Tajiri Y et Kumemura
M. Differences in fecal microflora between patients with atopic dermatitis and healthy
control subjects. J Allergy Clin Immunol, 2003; 111: 587-591.
Weiner HL. Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-βsecreting regulatory cells. Microbes Infect, 2001a; 3: 947-954.
Weiner HL. Induction and mechanism of action of transforming growth factor-β-secreting
Th3 regulatory cells. Immunol Rev, 2001b; 182: 207-214.
Wood RA. The natural history of food allergy. Pediatrics, 2003; 111:1631-1637.
Zeiger RS. Food allergen avoidance in the prevention of food allergy in infants and
children. Pediatrics, 2003; 111: 1662-71.
Zhang X, Brunner T, Carter L, Dutton RW, Rogers P, Bradley L, Sato T, Reed JC,
Green D et Swain SL. Unequal death in T helper cell Th1 and Th2 effectors: Th1, but not
Th2, effectors undergo rapid Fas/FasL-mediated apoptosis. J Exp Med, 1997; 185: 18371849.
Zhang X, Izikson L, Liu L et Weiner HL. Activation of CD25+CD4+ regulatory T cells
by oral antigen administration. J Immunol, 2001; 167: 4245-4253.
119