Dosage des acides organiques par GCxGC-MS

UNIVERSITÉ PARIS-SUD
ÉCOLE DOCTORALE 470 :
CHIMIE DE PARIS SUD
Laboratoire : LETIAM, Unité Universitaire Interdisciplinaire Lip (Sys)2
THESE DE DOCTORAT
CHIMIE
Par
Naira PEREZ VASQUEZ
Date de soutenance : 10/04/2015
Composition de jury :
Directeur de thèse : Fathi MOUSSA PU (Université Paris Sud)
Rapporteurs : Marie-Claude MENET MCU-HDR (Université Paris Descartes)
Didier THIEBAUT D.R.CNRS (ESPCI ParisTech)
Examinateurs : Pedro ALMEIDA-DE-OLIVEIRA PU (Université Paris Sud)
Thierry BILLETTE DE VILLEMEUR PU-PH (AP-HP / Université Paris 6)
Myriam BONOSE MCU ( Université Paris Sud)
Rémy COUDERC Dr. HDR (AP-HP)
Sophie ROBIN Dr. (Société BIOEXIGENCE)
CONTRIBUTION AU PROFILAGE DES ACIDES ORGANIQUES
URINAIRES, CHEZ L’ENFANT

RESUME
La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse simple
quadripolaire (GC-qMS) est la technique la plus utilisée dans l’exploration des acides
organiques urinaires dans le cadre du diagnostic des aciduries organiques (AO).
Cependant, après analyse par GC-MS de plus de 1000 échantillons d'urines recueillis
auprès d'enfants atteints de troubles neurologiques, moins de 0,5% d'entre eux ont
reçu un diagnostic positif. Ceci témoigne de l’urgence de rechercher de nouveaux
biomarqueurs dans le domaine des troubles neurologiques associés à des erreurs innées
du métabolisme (EIM).
L'objectif principal de cette thèse a été de développer une nouvelle méthode
d’analyse des échantillons urinaires par chromatographie bidimensionnelle couplée à la
spectrométrie de masse (GCxGC-qMS) et d'évaluer son apport dans le profilage
métabolique de ces échantillons. Par ailleurs, dans le cadre du diagnostic des AO, dans
un objectif de simplification de la procédure de préparation de l’échantillon, nous avons
évalué une autre approche d’analyse directe en temps réel couplée à la spectrométrie de
masse « DART-MS » des acides organiques urinaires.
La première étape de notre travail a été de développer un protocole de
préparation de l’échantillon compatible avec une méthode de séparation
bidimensionnelle. Puis, grâce à l’étude systématique des différentes conditions de
séparation, nous avons développé une méthode par CGxCG-qMS parfaitement adaptée à
la séparation des composés extraits.
Après validation analytique, la méthode proposée a été ensuite évaluée par le
profilage des composés organiques présents dans des échantillons urinaires prélevés
chez des volontaires sains. Par rapport aux profils obtenus par une méthode par GC-
qMS classique, optimisée, les profils chromatographiques obtenus par la méthode
proposée présentent une sensibilité et une résolution nettement plus élevées. Ceci se
traduit par la détection en GCxGC-qMS de nombreux composés supplémentaires, jusqu’à
92, selon les échantillons. Parmi les composés supplémentaires détectés et caractérisés,
certains sont d’un intérêt diagnostic reconnu.
Malgré les difficultés liées à l’étape de préparation de l’échantillon et au
traitement des données, l’ensemble des résultats obtenus par la méthode proposée sur
de nombreux échantillons urinaires a confirmé les potentialités et la nécessité d’utiliser
la chromatographie bidimensionnelle dans le domaine de la découverte de candidats
biomarqueurs. Il s’agit maintenant de poursuivre l’identification des composés
supplémentaires détectés dans les échantillons urinaires étudiés et d’appliquer la

méthode proposée à un plus grand nombre d’échantillons témoins et pathologiques afin
d’essayer d’identifier des candidats biomarqueurs.
Enfin, les essais préliminaires par la technique DART-MS , effectués dans un
laboratoire de la Direction des Applications Militaires (DAM) du CEA, ont été axés sur
la détection d’un panel d’acides organiques représentatifs des différentes anomalies
rencontrées lors des AO. Malgré les effets de suppression ionique qui restent à
éliminer, les résultats obtenus montrent que cette approche mérite d’être approfondie.

ABSTRACT
Among inherited metabolic diseases, organic acidemia (OA) or organic aciduria is
characterized by urinary excretion of abnormal amounts or types of organic acids. OA
is mostly associated with genetic conditions resulting in a specific step of amino acid
catabolism dysfunction. Such alterations can produce disease states that range from
mild to lethal neurological involvement.
Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) remains the most
used analytical technique for detecting specific urinary organic metabolites related to
OA. However, after analyzing more than 1,000 urine samples collected from children
with neurological disorders, by this technique less than 0.5% of them were positive.
Thus, the discovery of new biomarker candidates for other metabolic diseases is
urgently needed.
The main objective of this thesis was to evaluate a new method using two-
dimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry (GCxGC-MS) for the
both qualitative and quantitative metabolic profiling of children’s urine. As compared to
GC-MS, GCxGC-MS shows great resolution power and high peak capacity. For this
purpose, we first developed a GCxGC-MS method with an appropriate sample
preparation protocol for urinary organic acids profiling. Applied to urine samples of
healthy children and children with neurological disorders, the proposed method showed
high sensitivity and peak capacity thus opening new possibilities for the
characterization of new biomarker candidates. For instance, by this technique, we were
able to detect in urines samples more than ninety additional compounds, which are not
detected by a conventional GC-MS method. However, taken together the obtained
results show that while the GCxGC technique has unmatched power to separate
compounds in a complex mixture, the sample preparation protocol remains a limiting step
for the precise quantification of the detected compounds.
On another hand, in order to reduce the sample preparation step, we evaluated
the direct analysis in real time (DART) method for the urinary organic acids screening.
The obtained results are very promising.

A ti PAPITO,
A mon père,
Mon ange qui me protège toujours depuis le ciel, je suis sûre qu’il est très fier de moi.
A ti MAMITA,
A ma mère,
Sans ton aide, ni ton courage je n'aurais pas pu venir en France pour faire mes études,
c’est grâce à tes efforts que j’en suis arrivée là. TE AMO MAMITA BELLA, tu es ma
force et mon courage.
A ti ÑAÑITA y a ti TIITA,
A ma sœur et ma tante,
Pour votre amour, votre compréhension, et vos encouragements qui me donnent l’ énergie
de continuer. Vous êtes mon inspiration et je serais toujours là pour vous.
A ti mi CORAZONCITO,
A mon petit cœur,
Pour ton amour, ta patience, ton aide et ton soutien surtout pendant ces derniers mois.
Je suis heureuse avec toi à mes côtés. Je t’aime !