Extraction d`ADN bactérien

2010
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Plan de travail :
Introduction
Schéma
Objectif
Matériel nécessaire
Protocole
conclusion

Extraction de l’ADN Bactérien
♠ Introduction : L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler
l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé
pour des recherches de biologie moléculaire, telles que le séquençage, la PCR
ou le clonage. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent
approximativement le même schéma de principe :
.
. • lyse des céllules bactérienne
. • Elimination des protéines
.
• Elimination des autres acides nucléiques (ARN...)
• Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool

♠ Objectif du TP :
 Extraction et purification du DNA bactérien
 Préparation du DNA pour d’autre études approfondies on biologie
moléculaire (séquençage, restriction, PCR…)
♠ Matériel nécessaire :
1) Les réactifs :
 SDS : utilisé comme un détergent pour dissoudre les
phospholipides de la membrane cytoplasmique et la rendre
perméable, ce qui provoque l’éclatement de la cellule et
libération des constituants
 Le phénol : provoque la dénaturation des protéines
 L’éthanol : pour la précipitation du DNA
2) Verreries :
 Tubes à essais stériles
 Micropipette
 Becher
 Eppendorf
3) Culture bactérienne pure : ex bouillon nutritif ensemencé par
Escherichia coli
♠ Protocole :
 pour commencer on met 5ml de la culture bactérienne dans un tube à
essai stérile, on centrifuge à 6000 RPM pendant 5 min pour séparer la
biomasse bactérienne du surnageant (riche en métabolites
secondaires).
 Pour libérer les acides nucléiques on doit rompre la membrane
cytoplasmique, cette dernière est lysée par l’ajout du SDS qui va
dissoudre la couche de phospholipides.
NB :certaines bactérien à Gram positive possède une paroi épaisse
c’est pourquoi on traite la paroi avec des lysozymes (enzymes qui
dégradent la liaison B1-4) ou un broyage mécanique .
 le DNA ainsi libéré il va rendre la solution visqueuse.
 On ajoute le phénol pour dénaturer les protéines qui se trouvent en
solution.
 Le DNA est insoluble dans l’alcool, Cette propriété physicochimique
est utilisée pour le précipiter on ajoutant de l’éthanol.
 Le DNA insoluble va apparaitre sous forme de méduse blanchâtre.
 Pour augmenter le degré de pureté on effectue une dialyse pour
éliminer les traces de phénol

♠ Contrôle de l'extraction :
a) Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut analyser la présence et
la taille des acides nucléiques contenus dans la préparation. Ceux-ci
sont révélés par le bromure d'éthidium, un colorant dont la
fluorescence augmente très sensiblement quand il interagit avec
l'ADN. Dans le cas d'une préparation d'ADN plasmidique, on observe
sous UV une ou plusieurs bandes colorées discrètes dans le gel,
correspondant à l'ADN du plasmide. Dans le cas d'ADN
chromosomique, on observe un continuum de bandes, correspondant
aux fragments d'ADN issus de la coupure statistique du chromosome
résultant des traitements mécaniques lors de l'extraction.
b) Par spectrophotométrie : mesure de l'extinction dans l'UV au moyen
d'un spectrophotomètre. L'ADN possède un maximum d'extinction à
254 nm. 1 unité d'absorbance à 254 nm correspond à environ 50 μg
d'ADN double-brin.
♠ Conclusion : l’extraction du DNA est une étape primordiale car c’est elle
qui permet de pousser des études en biologie moléculaire :
 Réaction de polymérisation en chaine
 Clonage
 Southern blot
 Séquençage