1. Observation microscopique. 2. Type respiratoire. 2.1. Oxydase

- les microorganismes pour qui l’O2 est toxique et qui ne se développent qu’en son
absence. Ce sont les anaérobies stricts.
1. Observation microscopique.
-- Je dispose de cultures pures sur GN en pente.
- Prélever un peu de culture sur la pente.
- Etaler dans une goutte d’eau sur la lame.
- Sécher et fixer.
- Effectuer une coloration de Gram.
- Observer au microscope.
2.1. Oxydase / catalase.
2. Type respiratoire.
-- Tous les métabolismes cellulaires ont besoin d’une molécule capable de
capter les électrons libérés aux cours des réactions (cours de terminale). On
l’appelle l’accepteur final. Il en existe plusieurs types :
- O2. C’est l’accepteur final de tous les eucaryotes et d’un grand nombre de
bactéries. Le métabolisme est appelé respiration aérobie. Les microorganismes
sont qualifiés d’aérobies.
-----> Certains microorganisme ne peuvent se développer qu’en présence d’une
faible concentration d’O2. On les appelle des micro-aérobies. Les fortes
concentrations sont toxiques.
- autres accepteurs. Les bactéries sont adaptées à leur milieu et à la nature des
accepteurs présents. Le métabolisme est appelé respiration anaérobie. Les
microorganismes sont qualifiés d’anaérobies.
-
NO2
2-
SO3
NO3
SO4
CO2 + 4.H2
-
N2
2-
S (H2S)
2-
CH4 + 2.H2O
2.1.1. Oxydase.
Les bactéries qui possèdent un métabolisme respiratoire, contiennent une
enzyme particulière, la cytochrome c oxydases. On met cette enzyme en évidence
par l’utilisation d’un réactif coloré, le N, N, N ', N' tétraméthyl- pphénylènediamine (TMPD) ou N, N de p la phénylènediamine (DMPD) qui devient
bleu lorsqu’il est oxydé par le cytochrome.
DMPD
- On prélève une colonie pure avec la pointe d’une pipette Pasteur ou d’un fil
platine.
- On l’écrase sur un disque de papier imprégné de réactif.
- On observe la coloration au bout d’une minute.
2.1.2. Catalase.
La catalase catalyse la transformation du peroxyde d'hydrogène en eau et
dioxygène:
2.H2O2
O2 + 2.H2O
- molécules produites par le métabolisme. Dans ce cas, le substrat n’est pas
dégradé entièrement. On parle de fermentation. Celle-ci ne nécessite pas d’O2 est
anaérobie.
-----> Il existe trois types d’organismes anaérobies :
- les microorganismes possédant des voies métaboliques aérobie et anaérobie. Ce
sont les aéro-anérobies.
- les microorganismes indifférents à l’O2. Ce sont les anaérobies aéro-tolérants.
-----> en pratique on a du mal à différencier ces deux types que l’on regroupe
sous le terme aéro-anérobie.
- Sur une lame de verre propre, on dépose une goutte de H2O2,
- On la met en contact avec une colonie isolée, prélevée directement avec une
pipette pasteur boutonnée ou une anse plastique à usage unique.
-----> le platine de l’oese réagit avec l’eau oxygénée et donne de faux-positifs.
-----> Si des bulles se forment, la bactérie possède la catalase.
-----> Si rien n'est observable, la bactérie ne possède pas l'enzyme.
-----> Il est déconseillé de faire ce test à partir d'un bouillon de culture
ensemencé, car le résultat est moins net.
-- La recherche de la catalase n’est pas systématique :
- Du fait de la production de dioxygène par la catalase, elle est absente chez les
bactéries anaérobies strictes.
- La plupart des bactéries à Gram négatif possèdent une catalase (catalase +).
La recherche de la catalase sur ce type de bactéries ne présente donc aucun
intérêt,
-- On réserve ce test aux bactéries Gram positif. Il permet de différencier :
- les bactéries des genres Staphylococcus et Micrococcus (catalase +)
- des bactéries des genres Enterococcus, Streptococcus (catalase -)
2.2. VF.
2.2.1. Caractéristiques du milieu.
-- Le bouillon Viande-Foie permet de déterminer le comportement de la
bactérie vis à vis de l’O2.
-- Par quel principe ?
-- Le secret est dans la forme du
tube, long et étroit. La surface du milieu
est très faible et limite les échanges
gazeux. Ainsi l’O2 pénètre uniquement
dans le haut de la gélose. Tout le bas en
est dépourvu.
-- Et alors ?
Les
bactéries
qui
se
développent dans la partie
supérieure sont dépendantes de
l’O2, ce sont des aérobies stricts.
- celles qui se développent
uniquement
dans
la
partie
inférieure sont tuées par l’O2, ce
sont des anaérobies stricts.
- Celles qui se développent sur
toute la hauteur sont des aéroanaérobies facultatives.
- Enfin, celles qui forment des
colonies à un centimètre de la
surface sont des micro-aérobies.
La présence de bulles
indique la production de gaz.
2.2.2. Mode d’utilisation.
- Régénération :
Le tube est placé au bain-marie 20 minutes, puis
conservé à 45°C (surfusion)
-----> la régénération permet d’éliminer les gaz
dissous dans le milieu.
2.3. Tryticase -Soja.
-- C’est un milieu adapté aux souches exigeantes.
-1
Hydrolysat trypsique de caséine
peptone de soja
Chlorure de sodium
Agar
pH
 Ensemencement :
- on prélève une colonie au bout d’une pipette
bouchée
- on la pique jusqu’à un centimètre du fond
- on le remonte en décrivant une spirale.
 Ensemencement :
On effectue une simple strie.
-----> Un quart de boîte suffit pour ensemencer une souche : on peut donc
ensemencer les 4 souches sur une seule boîte. En pratique on ensemence
deux boîtes identiques.
 Incubation :
Le tube est placé à l’étuve bouchon non bloqué.
-1
base viande-foie
Glucose
Agar
pH
g.L
15
5
5
15
7,3
g.L
30
2
6
7,4
 Incubation :
Une boîte est incubée en aérobiose
Une boîte est incubée en anaérobiose. Elle est placée dans une boîte
hermétique où l’on allume une bougie. La flamme consomme tout l’O 2 présent.
 Lecture :
Si la souche se développe sans O2, elle est anaérobie.
3. Métabolisme glucidique.
-- Le métabolisme glucidique relâche des acides dans le milieu. Ceux-ci sont
mis en évidence grâce à des indicateurs de pH. Le principe est simple, si au cours
de l’incubation, le milieu change de couleur, c’est qu’il s’acidifie. Donc, la souche
consomme le sucre disponible dans le milieu. L’interprétation dépend de
l’environnement (aérobiose ou anaérobiose).
- on la pique jusqu’à un centimètre du fond
- on le remonte en décrivant une spirale.
 - Incubation :
Le tube est placé à l’étuve bouchon non serré.
3.1.2. Lecture.
3.1. Voie d’attaque du glucose.
-- On utilise le milieu de Hugh et Leifson. Il contient du bleu de bromothymol
qui permet la mise en évidence du métabolisme glucidique. Ce test obéit au même
principe que le VF. Un tube long et fin limite les échanges gazeux et crée un
gradient d’O2. Si le glucose est consommé en aérobiose, il s’agit d’une respiration,
s’il l’est en anaérobiose, c’est une fermentation.
-- Le bleu de bromothymol réagit
en fonction du pH. La coloration jaune
indique la présence de métabolisme
glucidique.
n grammes par litre d'eau distillée
Extrait de levures
1
Peptone pancréatique de caséine
2
NaCl
5
K2HPO4
0
,3
Agar
3
Bleu de bromothymol (solution aqueuse à
1
0,2g %)
5mL
Eau distillée (qsp)
3.1.1. Mode d’utilisation.
 Régénération :
Le tube est placé au bain-marie 20 minutes, puis
conservé à 45°C (surfusion)
-----> la régénération permet d’éliminer les gaz
dissous dans le milieu.
 - Ensemencement :
- on prélève une colonie au bout d’une pipette
bouchée ou d’un fil droit.
1
L
-- Il existe trois cas principaux :
- la souche métabolise le glucide uniquement en présence d’O2. Elle est aérobie.
- la souche métabolise le glucide uniquement en absence d’O2. Elle est anaérobie.
- le métabolisme de la souche est indifférent à l’O2, elle est aéro-anaérobie
facultative.
-----> Si la souche n’utilise pas le glucide elle laisse le tube entièrement vert.
-----> Si la souche utilise préférentiellement les peptones, le tube tourne au
bleu (alcalinisation du milieu).
3.2. Utilisation du lactose.
-- Le milieu de Kligler-Hajna est un milieu de culture permettant la recherche
simultanée de :
-1
- L'utilisation du lactose
g.L
- La fermentation du glucose
Peptone
15
- La production d'H2S
Extrait de viande
3
- La production de gaz
Extrait de levure
3
- La -galactosidase pour les bactéries
Peptone pepsique de viande
5
lactose - (test ONPG).
Glucose
1
Lactose
10
C’est une demi-pente qui
25 mg
Rouge de phénol
présente :
Chlorure de sodium
5
- une pente
Sulfate ferreux
0,2
Thiosulfate de sodium
0,3
- un culot
Agar
11
- Dans un premier temps, les bactéries glucose + consomment le glucose et
acidifient le milieu. Pente te culot vire au jaune-oranger.
- A cause de sa faible concentration, le glucose est rapidement (une ou deux
heures) épuisé.
Si la bactérie est lactose+ : le métabolisme glucidique continue et le milieu
reste jaune.
-----> pente jaune = lactose +
Si la bactérie est lactose- : le métabolisme des peptones alcalinise le milieu.
Sur la pente l’élimination du CO2 par échange gazeux accélère le processus.
HCO3 -------> H2CO3 ------> CO2 + H2O
Tandis qu’il reste lent dans le culot.
-----> pente rouge = lactose Dans le cas des bactéries lactose-, on confirme ce caractère par le test de
l’ONPG. On dépose une colonie sur un disque imprégné d’ONPG. Si la bactérie
possède la  galactosidase, le disque devient noir.
 Production de gaz.
On détermine également la présence de gaz par apparition des bulles ou
d’un décollement de la gélose.
3.2.1. Ensemencement.
-- On pique dans le culot avec un fil droit et on le retire en faisant une strie sur
la pente.
3.2.2. Lecture.
 Métabolisme glucidique.
Le rouge de phénol indique la présence d’un métabolisme glucidique
(glucose et/ou lactose)
Les bactéries
 galactosidase.
consomment
le
lactose
grâce
à
une
enzyme,
la
 Production de H2S.
La production de sulfure d’hydrogène est mise en évidence grâce à la
formation d’un précipité noir.
3+
Le sulfure d'hydrogène réagit avec les ions fer III (Fe ) du citrate de fer pour
former un précipité de sulfure de fer noir. Ainsi :
- Bactéries H2S + : précipité noir ;
- Bactéries H2S - : pas de précipité noir.
3.3. Produits de fermentation du glucose.
3.3.1. Principe.
-- Les entérobactéries dégradent le glucose par deux voies fermentaires
particulières qui conduisent à des catabolites différents :
 Voie des « acides mixtes »
-----> acide formique, acide acétique,... qui abaisse le pH sous 4,5
 Voie du « butane-diol »
-----> acétoïne (acétyl-méthyl-carbinol), et autres en quantités moindres.
-1
Peptone
Phosphate dipotassique
Glucose
pH
g.L
5
5
5
7,5
-----> Une souche RM+ est automatiquement VP- et réciproquement.
3.3.2. Ensemencement.
-- On prélève une colonie avec une œse et on ensemence le milieu.
3.3.3. Tests RM
- On prélève 2 mL de milieu de Clark et Lubs que l’on verse dans un tube à
hémolyse.
- On ajoute 1 à 2 gouttes de rouge de méthyl.
-----> si le milieu vire au rouge (pH < 4,2), la réaction est positive (RM+).
-----> si le milieu vire au jaune (pH > 6,3), la réaction est négative (RM-).
3.3.4. Test VP.
- On prélève 1 mL de milieu.
- On ajoute 0,5 mL d’-naphtol et 05 mL de soude 16%.
-----> La présence d’acétoïne se traduit par une coloration rouge en surface
(VP+)
4. Fermentation du mannitol.
 Le milieu (mannitol-mobilité).
-- Le milieu mannitol mobilité est un milieu combiné. Il est utilisé
pour la détermination de trois caractères : fermentation du mannitol,
mobilité de la souche et présence de la nitrate réductase.
-1
Hydrolysat trypsique de caséine
Nitrate de potassium
Mannitol
Rouge de phénol 1%
Agar
pH
g.L
10
1
7,5
0,04
3,5
7,5
-----> Ce milieu est faiblement gélosé. Si avant ensemencement, le culot est
disloqué, il faut le faire fondre au bain marie puis le reprendre en masse dans
l’eau froide verticalement.
 Ensemencement :
On l’ensemence par piqure centrale jusqu’au fond.
 Lecture.
Fermentation du mannitol.
- Si la souche fermente le mannitol, le milieu vire au
jaune (mannitol+)
- Si la souche ne fermente pas le mannitol, le milieu
reste rouge (mannitol -)
Mobilité.
- Si la souche est immobile, elle se développe
uniquement le long de la strie (mobilité+)
- Si la souche est mobile, le trouble s’étend autour de la
strie (mobilité+), parfois dans l’ensemble du milieu
(mobilité++).
Nitrate réductase.
Les nitrates sont réduits en nitrites par la nitrate réductase. Chez certaines
souches la réduction peut se poursuivre jusqu’au stade azote ou
ammoniac.
Nitrate réductase
NO3 -----> NO2 -----> N2 -----> NH3
nitrate
nitrite
La présence de nitrite est mise en évidence par addition au
milieu de 3 gouttes d’acide sulfanilique puis de 3 gouttes d’naphtylamine.
- en présence de nitrite, le milieu devient rouge (nitrate réductase+)
- Si le réactif reste incolore, on ajoute une pincée de poudre de zinc
qui réduit les nitrates
- si le milieu devient rouge, c’est que les nitrates sont présents
mais non réduit par l’enzyme (nitrate réductase-).
- si le milieu reste incolore, c’est que les nitrates ont été réduit par l’enzyme et
que la réduction a continué au-delà (nitrate réductase +).
Pour finir, on tente une première identification parmi les 6 souches
proposées.
5. Protocole.
Chacun binôme dispose de deux souches sur GN en pente.
Chacun procède :
- à l’observation microscopique des deux souches.
- effectue les tests biochimiques sur les deux souches
- remplit le tableau récapitulatif suivant.
E.coli
Salmonella
Klebsiella
Serratia
Proteus
Providencia
Gram
B-
B-
B-
B-
B-
B-
Oxydase
catalase
+
+
+
+
+
+
type
resp
AAF
AAF
AAF
AAF
AAF
AAF
gaz
+
+
+
+/-
+
-
voie
d’attaque
fermentatif
aérobie
fermentatif
aérobie
fermentatif
aérobie
fermentatif
aérobie
fermentatif
aérobie
fermentatif
aérobie
glu
+
+
+
+
+
+
lact
+
-
+
-
-
-
H2S
-
+
-
-
+
-
RM
+
+
-
-
lact
VP
-
-
+
+
H2S
mannitol
+
+
+
+
-
-
mobilité
+
+
-
+
++
+
NR
+
+
+
+
+
+
A
Gram
Aspect
microscopique
Oxydase
catalase
VF
B
VF
TS
type resp
HL
gaz
TS
aspect
macroscopique
HL
voie d’attaque
Kligler
glu
CL
RM
VP
MMN
mannitol
mobilité
NR
Kligler
CL
MMN