AKT ERK
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Interactions neurone-glie dans la chorée de Huntington Etude génétique chez la drosophile Jean-Charles Liévens NICN - Institut Jean Roche Equipe Catherine Faivre-Sarrailh Marseille Chorée de Huntington 1692 : Procès des sorcières de Salem 1872 : George Huntington maladie familiale 1993 : Huntington’s Disease Collaborative Research Group > 35 CAG exon 1 du gène huntingtine > 35 résidus glutamine = polyQ 1996 : Premier modèle transgénique murin – Souris R6 (G.P. Bates) 1998 : Premier modèle drosophile – (G. Jackson) Chorée de Huntington patient - 6 000 patients en France - SCA 1, 2, 3, 6, 7, 17 / DRPLA / SBMA - déficits moteurs, troubles cognitifs normal - décès : 15-20 années - début : 40-55 ans mais lié au nombre de répétitions CAG - dysfonctionnement neuronal précoce - perte tardive et sélective des neurones du striatum et cortex cérébral Chorée de Huntington Huntingtine humaine ≈ 3144 aa (349 kDa), protéine cytoplasmique et nucléaire Protéine neuronale et gliale I- Forme native caspases 6-35 polyQ aa 500-600 NH2 COOH II- Forme pathogène caspases > 36 polyQ NH2 > 36 polyQ NH2 Fragment NH2-terminal répétition de glutamines COOH accumulation et toxicité Lignée murine R6/2 Transgène ≈160 CAG (polyQ) 2 kb Promoteur htt Huntingtine Exon 1 Transgène dans tout le tissu cérébral sous le contrôle du promoteur de htt Mortalité Dégénérescence neuronale Déficits moteurs et cognitifs Dysfonctionnement neuronal Inclusions intranucléaires 4 6 8 10 12 14 16 Semaines Lignée murine R6/2 striatum R6/2 (S830) Liévens and Birman, 2003, Med. Sci. glia neuron A : Striatum R6/2 B-D : Cortex R6/2 Shin et al., 2005, J. Cell Biol. Lignée murine R6/2 RotaRod 350 300 250 Témoin 200 R6/2 150 * 100 50 ** 0 4 sem. 8 sem. 12 sem. Lignée murine R6/2 Activité locomotrice spontanée Activité verticale 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 * 8 sem. 12 sem. Témoin R6/2 Interruption x 1000 Interruption x 1000 Activité horizontale 0.8 0.6 0.4 * * 0.2 0 8 sem. 12 sem. Bases cellulaires des déficits comportementaux ? Dysfonctionnement neuronal : oui Dysfonctionnement glial ? Cellules gliales Système nerveux central - astrocyte = composition du milieu extracellulaire, support trophique des neurones, régule la transmission synaptique -oligodendrocyte = entoure les axones, rôle trophique - microglie = macrophage Système nerveux périphérique - cellule de Schwann = entoure les axones, rôle trophique, régule la transmission JNM Fonction gliale : élimination du glutamate extracellulaire Terminaison glutamatergique Astrocyte Glutamate EAAT R Gl u lu RG Glutamate R Glu neurone postsynaptique R Glu Récepteur au glutamate EAAT Transporteur du glutamate Mammifère : 5 EAATs EAAT2 (astroglial) Drosophile : dEAAT1 (glial) La fonction des cellules gliales est affectée dans la lignée R6/2 Témoin 12 sem R6/2 12 sem Densité optique A- ARNm EAAT2 40 Striatum Cortex cérébral 30 ** 20 ** 10 0 4 8 Témoin ** * * 12 14 sem R6/2 4 8 12 14 sem *p<0,05, **p<0,01 B- Protéine EAAT2 Striatum T R6/2 Cortex T R6/2 C- Activité de capture du glutamate Activité de capture du glutamate sur synaptosomes + DHK (bloque EAAT2) aucune modification Liévens et al., 2001, Neurobiol. Dis. Conclusion 1 - La fonction des astrocytes est altérée dans les modèles murins de la chorée de Huntington. Cette altération précède la mort neuronale dans ces modèles et apparaît en absence d’une perte massive des cellules astrocytaires (Shin et al., 2005, J. Cell Biol.). - Chez les patients, l’expression du transporteur EAAT2 est diminuée malgré une prolifération importante des cellules astrocytaires (Arzberger et al., 1997, J. Neuropathol. Exp. Neurol.). Le fonctionnement des astrocytes est compromis dans la chorée de Huntington R6/2 striatum glie neurone Shin et al., 2005, J. Cell Biol. Modèles chez la drosophile Modèles chez la drosophile Peu encombrant, peu coûteux, temps de génération court Forte conservation des fonctions physiologiques et des mécanismes moléculaires avec les vertébrés Peu ou pas de redondance génétique Organisme-modèle simple Outils génétiques puissants - lignées mutantes et transgéniques - expression spatio-temporelle de gènes Identifier la fonction d’un gène dans un type cellulaire Tester des hypothèses in vivo dans un système génétiquement connu Réaliser des cribles génétiques pour identifier des protéines ou des voies de signalisation modificatrices d’un phénotype Identifier des cibles thérapeutiques potentielles et les valider par des approches génétiques et pharmacologiques Modèles de la chorée de Huntington chez la drosophile 2 lignées transgéniques 20 polyQ - Httex1p Q20 : Exon 1 Htt + 20 CAG - Httex1p Q93 : Exon1 Htt + 93 CAG Système UAS-GAL4 Promoteur GMR-GAL4 Cellules de l’oeil NH2 93 polyQ NH2 GAL4 ELAV-GAL4 Neurones UAS Transgène REPO-GAL4 cellules gliales Phénotype ? mHtt est toxique dans la rétine 5 jours A GMR-GAL4 42 jours GMR-GAL4, Httex1p Q93 GMR-GAL4 GMR-GAL4, Httex1p Q93 B Œil de drosophile Elav-GAL4 10 jours Témoin ~ 800 ommatidies Expression dans rétine Httex1p Q93 L’expression de mHtt dans les neurones ou la glie diminue la durée de survie des drosophiles Mouches vivantes (en %) 100 elav-GAL4 (neurone), 80 Témoi Httex1p Q93 60 repo-GAL4 (glie), *** 40 témoi 20 Httex1p Q93 0 0 4 8 12 16 20 24 Age après l’éclosion (en jour) Expression dans les neurones ou la glie 28 Test de géotaxie négative Drosophiles atteignant le haut ou restant en bas Score locomoteur = ½(ntotal + nhaut – nbas)/ntotal) B Score locomoteur A Nombre de drosophiles (%) L’expression de mHtt dans les neurones ou la glie induit des déficits locomoteurs 100 ** 80 Témoin 60 40 * 20 0 Haut Bas Httex1p Q93 *** Haut Bas repo-GAL4 elav-GAL4 1 0.8 0.6 0.4 * ** * * * *** Témoin Httex1p Q93 0.2 0 4 d 8 d 12 d elav-GAL4 Expression dans les neurones ou la glie 4 d 8 d 12 d repo-GAL4 La présence de mHtt dans les neurones induit une dégénérescence neuronale Témoin Elav-GAL4 12 jours SNC Httex1p Q93 Immunomarquage Elav Expression dans les neurones La présence de mHtt dans les neurones induit une dégénérescence neuronale Témoin Elav-GAL4 12 jours SNC Httex1p Q93 Immunomarquage Elav Corps pédonculés Témoin Httex1p Q93 Elav-GAL4 13 jours γ lobes α β Immunomarquage Fascicline II Expression dans les neurones La présence de mHtt dans la glie n’induit pas de dégénérescence des cellules gliales dEAAT1-GAL4, UAS-GFP-S65T Br OL cellules par mm2 150 Témoin 100 Httex1p Q20 Httex1p Q93 50 0 21 jours Expression dans la glie La présence de mHtt dans la glie n’induit pas de dégénérescence des cellules gliales repo-GAL4 Contrôle Httex1p Q93 Expression dans la glie dEAAT1-GAL4, UAS-dEAAT1-GFP A Httex1p Q20 2 jours Contrôle Httex1p Q93 Densité optique (%) mHtt réduit l’expression du transporteur du glutamate dEAAT1 dans la glie 100 *** 75 *** 50 25 0 5 jours 2 jours 5 jours B 14 jours n Co Expression dans la glie Contrôle Httex1p Q20 Httex1p Q93 125 le trô 14 jours 20 93 Q Q 1p 1p tex tt ex t H H dEAAT1 Western blot Elav Conclusion 2 - L’expression neuronale n’induit pas de perte massive des neurones. La perte neuronale est restreinte à certaines structures du système nerveux (rétine de l’oeil, corps pédonculés ...) - L’expression gliale n’induit pas de dégénérescence des cellules gliales mais un dysfonctionnement, ie une réduction de l’expression génique de gènes cruciaux pour le fonctionnement du SNC tel que dEAAT1 Huntingtine mutée dans la glie dysfonctionnement de la glie Le fonctionnement des cellules gliales est altéré par mHtt in vitro - L’expression de mHtt dans la glie favorise la mort de neurones pourtant sains - La présence d’astrocytes sains en co-culture dégénérescence des neurones exprimant mHtt retarde Implication de la glie dans la chorée de Huntington la Mécanismes conduisant au dysfonctionnement de la glie ? L’expression de dEAAT1 est régulée par EGFR et la voie ERK EGF récepteur EGF ERK AKT MKP3 dEAAT1 Expression de dEAAT1 Témoin Egfr Erk MKP3 AKT 14 jours Expression dans la glie Liévens et al., 2005, Hum. Mol. Genet. La Huntingtine mutante inhibe la voie EGFR en amont de ERK EGF récepteur EGF ERK AKT Huntingtine mutante dEAAT1 Httex1p Q93 Httex1p Q93 + Egfr 15 jours Expression dans la glie Httex1p Q93 + Erk Fluorescence (%) Expression de dEAAT1 en présence de la protéine Huntingtine mutante 300 250 200 150 100 50 0 *** Httex1p Q93 Httex1p Q93 + Egfr Httex1p Q93 + Erk Liévens et al., 2005, Hum. Mol. Genet. L’expression de polyQ inhibe la voie EGFR dans l’œil de drosophile B- 18°C, 5 days A- 25°C, 5 days GMR-GAL4 Egfract not viable Q48-myc Egfract Q48-myc + Egfract Light microscopy control Q48-myc Q48-myc + Egfract SEM Light microscopy Light microscopy GMR-GAL4 Liévens et al., 2005, Hum. Mol. Genet. Conclusion 3 GF récepteur facteur de croissance Ras PI3K ERK AKT ? ? ? Huntingtine mutée Dysfonctionnement des cellules gliales AKT et ERK, deux cibles thérapeutiques dans la chorée de Huntington ? Effets de AKT et ERK in vivo ? AKT et ERK, deux cibles thérapeutiques dans la chorée de Huntington ? Crible génétique Crible génétique sur les modèles drosophiles de la chorée de Huntington Protéines chaperons HSP70, HSP40, MRJ… rétine Protéines régulant l’apoptose Apaf1, P53, IAP … SNC AKT et ERK, deux cibles thérapeutiques dans la chorée de Huntington ? Objectif : Comparer les effets protecteurs induits par - AKT et ERK = Voies de signalisation anti-apoptotiques - Protéine chaperon HSP70 La co-expression de AKT réduit la toxicité dans la rétine GMR-GAL4, GFP GMR-GAL4, ERK GMR-GAL4, AKT 42 jours GMR-GAL4 1 2 GMR-GAL4, Httex1p Q93 + GFP GMR-GAL4, Httex1p Q93 + ERK 4 GMR-GAL4, Httex1p Q93 + AKT 42 jours GMR-GAL4, Httex1p Q93 3 6 Expression dans la rétine 7 8 9 La co-expression de AKT réduit la toxicité dans la rétine Œil de drosophile A Httex1p Q93 Httex1p Q93 + AKT Httex1p Q93 + ERK Elav-GAL4 10 jours Contrôle ~ 800 Ommatidies (%) B 100 80 60 40 20 0 1 jour 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Photorécepteurs par ommatidie elav-GAL4, Httex1p Q93 Httex1p Q93 + AKT 9 jours 0 1 2 3 4 5 6 7 Photorécepteurs par ommatidie P<0.001 Mann-Whitney U test Expression dans la rétine La co-expression de HSP70 réduit la toxicité dans la rétine A Httex1p Q93 + HSP70 GMR-GAL4 Httex1p Q93 elav-GAL4 Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 Ommatidie (%) B 100 elav-GAL4, Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 80 60 9 jours 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Photorécepteurs par ommatidie Expression dans le rétine La co-expression de HSP70 mais pas de AKT réduit la toxicité dans le SNC A elav-GAL4 Témoin Httex1p Q93 Httex1p Q93 + ERK Httex1p Q93 + AKT Densité optique (%) γ lobes 120 100 80 60 40 20 0 elav-GAL4, Témoi Httex1p Q93 Httex1p Q93 + AKT Httex1p Q93 + ERK B elav-GAL4 Témoin Httex1p Q93 γ lobes Expression dans les neurones Httex1p Q93 + HSP70 Densité optique (%) 10 jours 120 100 80 60 40 20 0 ** 10 jours elav-GAL4, témoin Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 La co-expression de AKT n’allonge pas la survie des drosophiles A Mouches vivantes (en %) Expression dans les neurones 100 elav-GAL4, 80 Httex1p Q93 Httex1p Q93 + AKT Httex1p Q93 + ERK Témoi AKT ERK 60 40 20 0 B 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Age après l’éclosion (en jour) Mouches vivantes (en %) Expression dans la glie 100 repo-GAL4, 80 Httex1p Q93 Httex1p Q93 + AKT Httex1p Q93 + ERK Témoi AKT ERK 60 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Age après l’éclosion (en jour) La co-expression de AKT dans la glie améliore le comportement locomoteur des drosophiles A Nombres de mouches (%) 12 jours 100 80 Httex1p Q93 Haut Bas ** 60 40 * 20 0 elav-GAL4 Httex1p Q93 + AKT haut Bas repo-GAL4 Score locomoteur B 1 ** 0.8 0.6 Httex1p Q93 0.4 Httex1p Q93 + AKT 0.2 0 elav-GAL4 Expression dans les neurones et la glie repo-GAL4 La co-expression de HSP70 allonge la survie des drosophiles A Mouches vivantes (%) Expression dans les neurones 100 elav-GAL4, Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 Témoi HSP70 80 60 *** 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Age après l’éclosion (en jour) B Mouches vivantes (%) Expression dans la glie 100 repo-GAL4, 80 60 *** 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Age après l’éclosion (en jour) Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 Témoi HSP70 La co-expression de HSP70 dans les neurones ou la glie améliore le comportement locomoteur des drosophiles Score locomoteur 12 jours 1 *** 0.8 *** 0.6 Httex1p Q93 0.4 Httex1p Q93 + HSP70 0.2 0 elav-GAL4 Expression dans les neurones et la glie repo-GAL4 Témoin Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 CB OL B dEAAT1-GAL4, dEAAT1-GAL4, Httex1p Q93 + HSP70 Httex1p Q93 Anti-Httex1p (S830) Expression dans la glie Anti-Repo 12 jours merged Densité optique (%) A dEAAT1-GAL4, dEAAT-GFP La co-expression de HSP70 prévient les altérations gliales 10 jours 120 100 80 *** *** 60 40 20 0 Cerveau Lobe optique dEAAT1-GAL4, dEAAT1-GFP control Httex1p Q93 Httex1p Q93 + HSP70 Conclusion 4 - AKT et HSP70 ont des effets bénéfiques similaires dans la rétine - Protection par AKT ou HSP70 diffère dans le SNC Sauvetage dans la rétine n’est pas toujours corrélé avec des effets bénéfiques dans le SNC Conclusion 4 - AKT et HSP70 ont des effets bénéfiques similaires dans la rétine - Protection par AKT ou HSP70 diffère dans le SNC Sauvetage dans la rétine n’est pas toujours corrélé avec des effets bénéfiques dans le SNC - mHtt altère le fonctionnement neuronal et glial - AKT dans la glie améliore le comportement locomoteur AKT agit de manière « cell type-specific » Conclusion 4 - AKT et HSP70 ont des effets bénéfiques similaires dans la rétine - Protection par AKT ou HSP70 diffère dans le SNC Sauvetage dans la rétine n’est pas toujours corrélé avec des effets bénéfiques dans le SNC - mHtt altère le fonctionnement neuronal et glial - AKT dans la glie améliore le comportement locomoteur AKT agit de manière « cell type-specific » - mHtt exprimée dans la glie induit une paralysie suite à un choc mécanique « bang-sensitivity » - AKT réduit ce phénotype La pathologie gliale résulte en partie d’une altération du métabolisme énergétique Conclusion 4 - AKT et HSP70 ont des effets bénéfiques similaires dans la rétine - Protection par AKT ou HSP70 diffère dans le SNC Sauvetage dans la rétine n’est pas toujours corrélé avec des effets bénéfiques dans le SNC - mHtt altère le fonctionnement neuronal et glial - AKT dans la glie améliore le comportement locomoteur AKT agit de manière « cell type-specific » - mHtt exprimée dans la glie induit une paralysie suite à un choc mécanique « bang-sensitivity » - AKT réduit ce phénotype La pathologie gliale résulte en partie d’une altération du métabolisme énergétique Neurogenetics, Guy’s hospital, London Gillian P Bates Ben Woodman Anj Mahal IC2N, Marseille Lydia Kerkerian-Le Goff Denise Samuel Génétique de de la Neurotransmission, IBDML, Marseille Serge Birman Marie-Thérèse Besson INSERM U114, Paris Magali Iché Hervé Chneiweiss Thomas Rival Hélène Coulom Microscopie, IBDML, Marseille Jean-Paul Chauvin Ce travail a été financé par Interactions neurone-glie, NICN, Marseille Catherine Faivre-Sarrailh Monique Laval Christophe Bel Christophe Pitaval
