Étude d`un récepteur orphelin apparenté aux récepteurs aux

Université Libre de Bruxelles
Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Étude d'un récepteur orphelin
apparenté aux récepteurs aux
hormones glycoprotéiques : LGR4
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Grégory VAN SCHOORE
Promoteur : Pr Gilbert Vassart
Année Académique 2007 - 2008
i
Remerciements
Après un peu plus de sept années maintenant, cette thèse a fini par aboutir. Ce ne fut
pas une mince affaire et les obstacles furent multiples, et si j'a i su les franchir (parfois les
contourner) c'est avant tout grâce à une série de personnes que je voudrait remercier.
En premier lieu, mon promoteur Gilbert Vassart qui, un beau jour de printemps 2001,
a recueilli dans son équipe deux jeunes doctorants perdus sans collier, sans projets et sans
labo. Il leur a offert sur un plateau un projet, un labo et surtout une dose de confiance en soi
et d'o ptimisme que leur récente expérience avait su ébranler. Merci donc, de nous avoir
permis de repartir, Laurent et moi vers de nouveau horizons. Merci aussi d'avoir eu en
permanence cette foultitude d'idées qui ont permis de maintenir à flot le groupe LGR au
cours de ces années et parfois de le faire repartir lorsque le sort (et aussi AJ Hsueh) semblait
s'a charner sur nous.
Ensuite, les membres successifs du très restreint groupe LGR : Sylvie tout d'a bord, qui
a lancé le projet LGR et qui m'a formé à toute une série de techniques (la culture cellulaire
mais aussi et surtout l'étiquetage multicolore des Eppendorf et la gestion au quotidien d'un
iMac caractériel). Puis Fernando qui – entre le pôle sud et l'A rgentine – a fait une escale de
quelques années à l'IRI. Son optimisme débordant et ses cocolitos ont certainement
contribué à une atmosphère détendue mais néanmoins productive. Nos longues séances de
tatouage de doigts de souris resteront des moments extrêmement marquants. Marie-Isabelle
qui aujourd'hui a repris le flambeau et qui – j'espère – finira par mettre la main sur ce satané
ligand qui nous tient en haleine depuis tout ce temps. Ensuite, il y a tous ceux qui ont
participé d'un peu plus loin au projet LGR : Patrick, notre Monsieur souris (et chinchin les
jours de drink), puis Marie-Alexandra qui contre vents et marées a fini par placer l'article 3D, Roland Pochet, qui au prix de nombreuses heures passées devant un microscope m'a
patiemment appris à faire la différence entre une cellule épithéliale sur une coupe
histologique et une trace de doigt sur l'o bjectif du microscope ...
Et puis il y a tous les autres gens de l'IRI que je ne saurais jamais citer sans en oublier
les trois-quart. Allez, je vais quand même essayer (par ordre alphabétique) : Anne, Audrey
ii
D, Audrey S, Bernadette, Cathy, Cédric, Colette, Daniel, Danièle, Didier, Eneko, Françoise
Miot, Fred, Frédéric Libert, Guillaume, Isabelle, Jacques E. Dumont, Jean-Yves, Jing, Joëlle,
Lara, Laura, Marc Parmentier, Marie-Jeanne, Marielle, Milutin, Nicolas, Pïtou,
Sabine
Costagliola, Sébastien, Séverine, Valérie, Vanessa, Véro, Xavier, ...............................................
( je laisse des pointillés pour pouvoir compléter).
Une thèse c'est aussi une course de fond, on ne tient jusqu'à la ligne d'arrivée que si on
est ravitaillé tout au long du parcours et soutenu par son entourage. Ce soutient je l'a i trouvé
depuis le début, dans la famille tout d'a bord : mes parents qui bien que ne voyant pas
toujours bien l'intérêt de fabriquer des souris bleues m'o nt toujours soutenu ; mon père qui ne
connaîtra pas non plus la fin de cette histoire-ci ; ma p'tite Lara qui en plus de me supporter
depuis le début a réussi ces derniers mois à cumuler les rôles de femme de ma vie et de
lectrice-correctrice des très nombreuses versions du manuscrit de cette thèse ; et puis
Françoise (dite fp), promis la prochaine fois je ferai des souris oranges !
Viennent également les amis, dont la présence proche ou lointaine m'a souvent permis
de relativiser l'importance (certes fondamentale mais quand même pas tant que cela) de la
découverte de l'agoniste d'un récepteur orphelin par rapport au reste de l'existence. Avec une
mention très spéciale pour Lo, l'évadé du Ceria, le collègue, le témoin, le joueur de tarot mais
surtout l'a mi, Merci donc aussi à Zizo, Bruno, Florence, Michaël, Nico, Alice, Alex, Stef,
Dai, Gilles, David, Alessandro, Gentiane, Viviane, Christian, toute la clique de Clair-Vivre,
leurs moitiés et les pitchounes : Julie, Laurent, Manon, Eve, Pif, Stéphanie, Vincent, Sarah,
Mélanie, et encore plein d'autres que j'oublie sûrement de m'avoir permis de temps à autres de
redescendre un peu sur terre.
Finalement une dernière salve de remerciements à mes actuels collègues (de l'école),
qui m'ont pas mal encouragés ces derniers temps à persévérer et à boucler ce travail :
Myriam, Marianne, Robert, Chantal, Denis, Georges, Martine, Jacqueline, Benoît, JohnChris et les autres.
Greg
iii
Table des matières
Table des matières .............................................................................................................................. i
Abréviations ...................................................................................................................................... iv
Résumé .............................................................................................................................................. vi
Partie A - Introduction .............................................................................................. 1
1 Les récepteurs couplés aux protéines G ......................................................................................... 3
1.1 Fonction(s) .................................................................................................................................................................................................. 3
1.2 Structure(s) des RCPG ........................................................................................................................................................................ 7
1.1 Dimérisation des RCPG ........................................................................................................................................................................ 11
1.3 Classification des RCPG ..................................................................................................................................................................... 11
1.4 Pathologies associées aux RCPG et applications thérapeutiques ..................................................................................... 11
2 Un cas particulier : la rhodopsine .................................................................................................. 15
3 La famille LGR .................................................................................................................................. 17
3.1 Les LGR de type A ............................................................................................................................................................................... 21
3.1.1 Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSHr, LH/CGr et FSHr) ............................................................ 21
3.1.2 Ghra : un LGR de cnidaire .............................................................................................................................................................. 23
3.1.3 DLGR1 : L'homologue des RHG chez la drosophile ....................................................................................................... 23
3.1.4 nLGR : un LGR de nématode ...................................................................................................................................................... 25
3.2 Les LGR de type B ............................................................................................................................................................................. 25
3.2.1 DLGR2 : le récepteur au bursicon ............................................................................................................................................ 25
3.2.2 Cg-LGRB : un LGR d'huître ......................................................................................................................................................... 27
3.2.3 LGR4, LGR5 et LGR6 : les LGR orphelins de mammifères ....................................................................................... 29
3.2.4 LGR5 (GPR49 – HG38 – FEX) .................................................................................................................................................. 29
3.2.4.1 Expression de LGR5 dans des cellules cancéreuses ........................................................................................................................................................... 31
3.2.5 LGR6 .......................................................................................................................................................................................................... 31
3.3 Les LGR de type C ............................................................................................................................................................................. 33
3.3.1 LGR7 et LGR8 : les récepteurs à la relaxine ........................................................................................................................ 33
3.3.2 GRL101, un LGR de gastéropode ............................................................................................................................................... 35
3.3.3 DLGR3 et DLGR4, deux autres LGR de drosophile ....................................................................................................... 35
4 LGR4 ................................................................................................................................................. 37
4.1 Identification et clonage ..................................................................................................................................................................... 37
4.2 Structure du gène et du récepteur ............................................................................................................................................. 37
Partie B - Buts du travail ......................................................................................... 41
i
Partie C - Résultats ................................................................................................ 45
1 Cartographie de l'expression de LGR4 chez la souris ............................................................... 47
1.2 Introduction ............................................................................................................................................................................................ 47
1.3 Résultats ................................................................................................................................................................................................... 47
1.4 Discussion .............................................................................................................................................................................................. 49
1.5 Article ......................................................................................................................................................................................................... 51
2 Étude des caractéristiques phénotypiques des souris inactivées pour LGR4 .......................... 71
2.1 Introduction et résultats ..................................................................................................................................................................... 71
2.2 Discussion et données supplémentaires ................................................................................................................................. 73
2.3 Article ...................................................................................................................................................................................................... 77
3 Préparation d'outils moléculaires destinés à la recherche d'agoniste(s) naturel(s) de LGR4
95
3.1 Introduction ............................................................................................................................................................................................. 95
3.2 Clonage du récepteur LGR4 humain et sous-clonage dans différents vecteurs .................................................... 97
3.2.1 Construction du plasmide hLGR4/pCRII ............................................................................................................................... 97
3.2.2 Construction du plasmide hLGR4/pcDNA ........................................................................................................................ 97
3.2.3 Construction du plasmide hLGR4/pEFIN ............................................................................................................................. 97
3.3 Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine extracellulaire de LGR4 humain .............. 99
3.3.1 Immunisation génique et test des sérums ............................................................................................................................. 99
3.3.2 Préparation d'hybridomes ............................................................................................................................................................. 101
3.3.3 Immunodétection de LGR4 : optimisation des conditions expérimentales ...................................................... 101
3.4 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de détection de son agoniste ....................... 101
3.4.1 Principe ..................................................................................................................................................................................................... 101
3.4.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-SEAP-8his-GPI/pEFIN ............................................................................ 103
3.4.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la sonde LGR4-SEAP ..................................................... 103
3.4.4 Préparation d'une sonde LGR4-SEAP .................................................................................................................................. 105
3.4.5 Détection de l'agoniste de LGR4 sur coupes de tissus frais ................................................................................... 105
3.5 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de purification de son agoniste ................... 105
3.5.1 Principe .................................................................................................................................................................................................... 105
3.5.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-8his-GPI/pEFIN .......................................................................................... 105
3.5.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la construction ECD-hLGR4-8his ........................... 107
3.5.4 Préparation d'un greffon ECD-hLGR4-8his ....................................................................................................................... 107
3.6 Préparation de lignées cellulaires destinées à suivre la purification d'activités agonistes ................................. 107
3.6.1 Principe du test æquorine ............................................................................................................................................................ 107
3.6.2 Préparation de lignées cellulaires WTA11 ........................................................................................................................... 109
3.7 Utilisation des outils – expériences préliminaires .............................................................................................................. 109
3.7.1 Anticorps monoclonaux anti-LGR4 ........................................................................................................................................ 109
3.7.2 Sonde LGR4-SEAP ............................................................................................................................................................................. 111
ii
Partie D - Discussion générale – conclusions - perspectives ................................ 113
L'expression de Lgr4 chez la souris ................................................................................................................................................. 115
Effets de l'inactivation de Lgr4 chez la souris .............................................................................................................................. 119
Préparation à la recherche de l'agoniste de LGR4 ................................................................................................................... 123
L'identité de l'agoniste .......................................................................................................................................................................... 125
Conclusions - perspectives .............................................................................................................................................................. 133
Partie E - Bibliographie .......................................................................................... 137
Partie F - Annexes ................................................................................................. 157
1 Manuscrit d'un article supplémentaire :
Three dimensional reconstruction of efferent ducts in wild type and LGR4 knockout mice . . . 159
2 Membres du Jury de thèse ............................................................................................................. 191
3 Curriculum vitæ .............................................................................................................................. 193
4 Thèse annexe : résumé et références choisies ........................................................................... 195
iii
Abréviations
3-D
5-HT
7TM
8-his
tridimensionnel
5-HydroxyTryptamine ou sérotonine
à sept domaines TransMembranaires
8 histidines
a.a.
ACTH
ADN
ADNc
ADP
AMPc
ARNm
AT
acide aminé
Adreno CorticoTropic Hormone (hormone corticotrope)
Acide DésoxyriboNucléique
Acide DésoxyriboNucléique complémentaire
Adénosine DiPhosphate
Adénosine MonoPhosphate cyclique
Acide RiboNucléique messager
AngioTensine
BCIP
BMP
BSA
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
Bone Morphogenic Protein
Bovine Serum Albumine
C-ter
Cg-LGRB
CHO
CMV
extrémité carboxyterminale
Crassostrea gigas L G R de type B
Chinese Hamster Ovary (cellule d'ovaire de hamster chinois)
CytoMégaloVirus
Da
DAN
DLGR
Dalton
ECD
EDTA
EST
ECtoDomaine
FACS
FISH
FITC
FSH
FSHr
Fluorescence Analysis Cell Sorter
GABA
GDP
Ghra
GMP
GPCR
GPHR
GPI
GREAT
GPR
GTP
GTPase
Acide
HBSS
hCG
Hanks' Balanced Salt Solution
human Chorionic Gonadotropin (gonadotrophine chorionique)
Differential
screening-selected gene Aberrative in Neuroblastoma
Drosophila Leucine-rich G-protein-coupled Receptor
EthyleneDiamine Tetraacetic Acid
Expressed Sequence Tag
(acide éthylène-diamine-tétraacétique)
Fluorescence In Situ Hybridization
Fluoresceine IsoThioCyanate (isothiocyanate de fluorescéine)
Follicle Stimulating Hormone (hormone folliculo-stimulante ou gonadostimuline A)
Follicle Stimulating Hormone Receptor (récepteur à l'hormone folliculo-stimulante)
γ-AminoButyrique
Guanosine DiPhosphate
G protein-coupled hormone receptor from Anthopleura
Guanosine MonoPhosphate
G-Protein-Coupled Receptor (récepteur couplé aux protéines G)
Glycoprotein Hormone Receptor
GlycosylPhosphatidylInositol
G-protein-coupled REceptor Affecting Testis descent (LGR5)
G-Protein-coupled Receptor
Guanosine TriPhosphate
Guanosine TriPhosphate hydrolase
iv
(boucle intracellulaire)
IL
Inhba
INSL
IRES
ISH
Inner-Loop
kDa
KO
kiloDalton
KnockOut
lacZ
LGR
LH
LH/hCGr
LRR
gène de la β-galactosidase bactérienne
Leucine-rich G-protein-coupled Receptor
Luteinizing Hormone (hormone lutéinisante ou gonadostimuline B)
Luteinizing Hormone / Human Chorionic Gonadotropin Receptor
(récepteur à l'hormone lutéinisante et la gonadotrophine chorionique)
Leucine-Rich Repeat
N-ter
NBT
nLGR
extrémité aminoterminale
NitroBleu de Tétrazolium
nematode Leucine-rich G-protein-coupled Receptor
OCT
OL
ORF
Optimal Cutting Temperature
PAF
p.b.
PBS
PCR
PDGF
Pi-PLC
PLAP
PLC
pAraFormaldéhyde
paire de bases
Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate salin)
Polymerase Chain Reaction (réaction de polymérase en chaîne)
Platelet-Derived Growth Factor
PhosphatidylInositol-specific PhosphoLipase C
pLacental Alkaline Phosphatase (phosphatase alkaline placentaire)
PhosphoLipase C
RCPG
RHG
RT-PCR
RXFP
Récepteur Couplé
SEAP
sEcreted Alkaline Phosphatase
T3
T4
TGF
TM
TSH
TSHr
triiodothyronine
thyroxine
Transforming Growth Factor
Trans-Membrane (domain)
Thyroid-Stimulating Hormone (thyréotropine)
Thyroid-Stimulating Hormone receptor (récepteur à la thyréotropine)
X-gal
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
β-gal
β-galactosidase
Inhibin
βA
INSulin-Like
peptide
Internal Ribosome Entry Site
In Situ Hybridization
Outer-Loop
(site interne d'entrée de ribosome)
(boucle extracellulaire)
(phase ouverte de lecture)
Open Reading Frame
aux Protéines G
aux Hormones Glycoprotéiques
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
Relaxin Family Peptide Receptor
Récepteur
v
Résumé
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des
communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des
récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de
ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'o rphelins.
Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les
récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette
famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus.
Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue.
Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par
l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'a ctivité β-galactosidase d'un de ces
marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype
particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression
normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le
rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux.
Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces
souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont
stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules
efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'a ccumuler à la sortie du testicule,
dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'a llongent
pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une
quantité anormalement élevée de mésenchyme.
Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste
naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit : (1) d'a nticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du
récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine
extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique
constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette
construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'a ffinités devant permettre de purifier
le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant
permettre de détecter l'a ctivation de ce récepteur.
Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du
développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils
moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination
précise de la fonction de LGR4.
vi