Étude d`un récepteur orphelin apparenté aux récepteurs aux

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Université Libre de Bruxelles
Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Étude d'un récepteur orphelin
apparenté aux récepteurs aux
hormones glycoprotéiques : LGR4
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Grégory VAN SCHOORE
Promoteur : Pr Gilbert Vassart
Année Académique 2007 - 2008

Remerciements
Après un peu plus de sept années maintenant, cette thèse a fini par aboutir. Ce ne fut
pas une mince affaire et les obstacles furent multiples, et si j'ai su les franchir (parfois les
contourner) c'est avant tout grâce à une série de personnes que je voudrait remercier.
En premier lieu, mon promoteur Gilbert Vassart qui, un beau jour de printemps 2001,
a recueilli dans son équipe deux jeunes doctorants perdus sans collier, sans projets et sans
labo. Il leur a offert sur un plateau un projet, un labo et surtout une dose de confiance en soi
et d'optimisme que leur récente expérience avait su ébranler. Merci donc, de nous avoir
permis de repartir, Laurent et moi vers de nouveau horizons. Merci aussi d'avoir eu en
permanence cette foultitude d'idées qui ont permis de maintenir à flot le groupe LGR au
cours de ces années et parfois de le faire repartir lorsque le sort (et aussi AJ Hsueh) semblait
s'acharner sur nous.
Ensuite, les membres successifs du très restreint groupe LGR : Sylvie tout d'abord, qui
a lancé le projet LGR et qui m'a formé à toute une série de techniques (la culture cellulaire
mais aussi et surtout l'étiquetage multicolore des Eppendorf et la gestion au quotidien d'un
iMac caractériel). Puis Fernando qui – entre le pôle sud et l'Argentine – a fait une escale de
quelques années à l'IRI. Son optimisme débordant et ses cocolitos ont certainement
contribué à une atmosphère détendue mais néanmoins productive. Nos longues séances de
tatouage de doigts de souris resteront des moments extrêmement marquants. Marie-Isabelle
qui aujourd'hui a repris le flambeau et qui – j'espère – finira par mettre la main sur ce satané
ligand qui nous tient en haleine depuis tout ce temps. Ensuite, il y a tous ceux qui ont
participé d'un peu plus loin au projet LGR : Patrick, notre Monsieur souris (et chinchin les
jours de drink), puis Marie-Alexandra qui contre vents et marées a fini par placer l'article 3-
D, Roland Pochet, qui au prix de nombreuses heures passées devant un microscope m'a
patiemment appris à faire la différence entre une cellule épithéliale sur une coupe
histologique et une trace de doigt sur l'objectif du microscope ...
Et puis il y a tous les autres gens de l'IRI que je ne saurais jamais citer sans en oublier
les trois-quart. Allez, je vais quand même essayer (par ordre alphabétique) : Anne, Audrey
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D, Audrey S, Bernadette, Cathy, Cédric, Colette, Daniel, Danièle, Didier, Eneko, Françoise
Miot, Fred, Frédéric Libert, Guillaume, Isabelle, Jacques E. Dumont, Jean-Yves, Jing, Joëlle,
Lara, Laura, Marc Parmentier, Marie-Jeanne, Marielle, Milutin, Nicolas, Pïtou, Sabine
Costagliola, Sébastien, Séverine, Valérie, Vanessa, Véro, Xavier, ...............................................
(je laisse des pointillés pour pouvoir compléter).
Une thèse c'est aussi une course de fond, on ne tient jusqu'à la ligne d'arrivée que si on
est ravitaillé tout au long du parcours et soutenu par son entourage. Ce soutient je l'ai trouvé
depuis le début, dans la famille tout d'abord : mes parents qui bien que ne voyant pas
toujours bien l'intérêt de fabriquer des souris bleues m'ont toujours soutenu ; mon père qui ne
connaîtra pas non plus la fin de cette histoire-ci ; ma p'tite Lara qui en plus de me supporter
depuis le début a réussi ces derniers mois à cumuler les rôles de femme de ma vie et de
lectrice-correctrice des très nombreuses versions du manuscrit de cette thèse ; et puis
Françoise (dite fp), promis la prochaine fois je ferai des souris oranges !
Viennent également les amis, dont la présence proche ou lointaine m'a souvent permis
de relativiser l'importance (certes fondamentale mais quand même pas tant que cela) de la
découverte de l'agoniste d'un récepteur orphelin par rapport au reste de l'existence. Avec une
mention très spéciale pour Lo, l'évadé du Ceria, le collègue, le témoin, le joueur de tarot mais
surtout l'ami, Merci donc aussi à Zizo, Bruno, Florence, Michaël, Nico, Alice, Alex, Stef,
Dai, Gilles, David, Alessandro, Gentiane, Viviane, Christian, toute la clique de Clair-Vivre,
leurs moitiés et les pitchounes : Julie, Laurent, Manon, Eve, Pif, Stéphanie, Vincent, Sarah,
Mélanie, et encore plein d'autres que j'oublie sûrement de m'avoir permis de temps à autres de
redescendre un peu sur terre.
Finalement une dernière salve de remerciements à mes actuels collègues (de l'école),
qui m'ont pas mal encouragés ces derniers temps à persévérer et à boucler ce travail :
Myriam, Marianne, Robert, Chantal, Denis, Georges, Martine, Jacqueline, Benoît, John-
Chris et les autres.
Greg
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Table des matières
Table des matières .............................................................................................................................. i
Abréviations ...................................................................................................................................... iv
Résumé .............................................................................................................................................. vi
Partie A - Introduction .............................................................................................. 1
1 Les récepteurs couplés aux protéines G ......................................................................................... 3
1.1 Fonction(s) .................................................................................................................................................................................................. 3
1.2 Structure(s) des RCPG ........................................................................................................................................................................ 7
1.1 Dimérisation des RCPG ........................................................................................................................................................................ 11
1.3 Classification des RCPG ..................................................................................................................................................................... 11
1.4 Pathologies associées aux RCPG et applications thérapeutiques ..................................................................................... 11
2 Un cas particulier : la rhodopsine .................................................................................................. 15
3 La famille LGR .................................................................................................................................. 17
3.1 Les LGR de type A ............................................................................................................................................................................... 21
3.1.1 Les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSHr, LH/CGr et FSHr) ............................................................ 21
3.1.2 Ghra : un LGR de cnidaire .............................................................................................................................................................. 23
3.1.3 DLGR1 : L'homologue des RHG chez la drosophile ....................................................................................................... 23
3.1.4 nLGR : un LGR de nématode ...................................................................................................................................................... 25
3.2 Les LGR de type B ............................................................................................................................................................................. 25
3.2.1 DLGR2 : le récepteur au bursicon ............................................................................................................................................ 25
3.2.2 Cg-LGRB : un LGR d'huître ......................................................................................................................................................... 27
3.2.3 LGR4, LGR5 et LGR6 : les LGR orphelins de mammifères ....................................................................................... 29
3.2.4 LGR5 (GPR49 – HG38 – FEX) .................................................................................................................................................. 29
3.2.4.1 Expression de LGR5 dans des cellules cancéreuses ........................................................................................................................................................... 31
3.2.5 LGR6 .......................................................................................................................................................................................................... 31
3.3 Les LGR de type C ............................................................................................................................................................................. 33
3.3.1 LGR7 et LGR8 : les récepteurs à la relaxine ........................................................................................................................ 33
3.3.2 GRL101, un LGR de gastéropode ............................................................................................................................................... 35
3.3.3 DLGR3 et DLGR4, deux autres LGR de drosophile ....................................................................................................... 35
4 LGR4 ................................................................................................................................................. 37
4.1 Identification et clonage ..................................................................................................................................................................... 37
4.2 Structure du gène et du récepteur ............................................................................................................................................. 37
Partie B - Buts du travail ......................................................................................... 41
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Partie C - Résultats ................................................................................................ 45
1 Cartographie de l'expression de LGR4 chez la souris ............................................................... 47
1.2 Introduction ............................................................................................................................................................................................ 47
1.3 Résultats ................................................................................................................................................................................................... 47
1.4 Discussion .............................................................................................................................................................................................. 49
1.5 Article ......................................................................................................................................................................................................... 51
2 Étude des caractéristiques phénotypiques des souris inactivées pour LGR4 .......................... 71
2.1 Introduction et résultats ..................................................................................................................................................................... 71
2.2 Discussion et données supplémentaires ................................................................................................................................. 73
2.3 Article ...................................................................................................................................................................................................... 77
3 Préparation d'outils moléculaires destinés à la recherche d'agoniste(s) naturel(s) de LGR4 95
3.1 Introduction ............................................................................................................................................................................................. 95
3.2 Clonage du récepteur LGR4 humain et sous-clonage dans différents vecteurs .................................................... 97
3.2.1 Construction du plasmide hLGR4/pCRII ............................................................................................................................... 97
3.2.2 Construction du plasmide hLGR4/pcDNA ........................................................................................................................ 97
3.2.3 Construction du plasmide hLGR4/pEFIN ............................................................................................................................. 97
3.3 Préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine extracellulaire de LGR4 humain .............. 99
3.3.1 Immunisation génique et test des sérums ............................................................................................................................. 99
3.3.2 Préparation d'hybridomes ............................................................................................................................................................. 101
3.3.3 Immunodétection de LGR4 : optimisation des conditions expérimentales ...................................................... 101
3.4 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de détection de son agoniste ....................... 101
3.4.1 Principe ..................................................................................................................................................................................................... 101
3.4.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-SEAP-8his-GPI/pEFIN ............................................................................ 103
3.4.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la sonde LGR4-SEAP ..................................................... 103
3.4.4 Préparation d'une sonde LGR4-SEAP .................................................................................................................................. 105
3.4.5 Détection de l'agoniste de LGR4 sur coupes de tissus frais ................................................................................... 105
3.5 Utilisation du domaine extracellulaire de LGR4 comme agent de purification de son agoniste ................... 105
3.5.1 Principe .................................................................................................................................................................................................... 105
3.5.2 Construction du plasmide ECD-hLGR4-8his-GPI/pEFIN .......................................................................................... 105
3.5.3 Préparation des lignées cellulaires CHO exprimant la construction ECD-hLGR4-8his ........................... 107
3.5.4 Préparation d'un greffon ECD-hLGR4-8his ....................................................................................................................... 107
3.6 Préparation de lignées cellulaires destinées à suivre la purification d'activités agonistes ................................. 107
3.6.1 Principe du test æquorine ............................................................................................................................................................ 107
3.6.2 Préparation de lignées cellulaires WTA11 ........................................................................................................................... 109
3.7 Utilisation des outils – expériences préliminaires .............................................................................................................. 109
3.7.1 Anticorps monoclonaux anti-LGR4 ........................................................................................................................................ 109
3.7.2 Sonde LGR4-SEAP ............................................................................................................................................................................. 111
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