Biomarqueurs de la compétence embryonnaire – Biomarkers of

32 | La Lettre du Gynécologue • n° 355 - octobre 2010
DOSSIER La conférence Jean Cohen et les JTA 2010 : les temps forts
Biomarqueurs de
la compétence embryonnaire
Biomarkers of human embryo competence
S. Assou*, H. Dechaud*, J. de Vos*, S. Hamamah*
M
algré l'évolution des techniques d’assis-
tance médicale à la procréation (AMP)
telles que la fécondation in vitro (FIV)
classique ou l’injection d’un spermatozoïde dans
l’ovocyte (intracytoplasmic sperm injection [ICSI]),
les taux de succès de grossesses restent bas (25 %
par transfert) pour une moyenne de 2 embryons
replacés. En pratique, 2 cycles de FIV sur 3 soldées
par échec et plus de 8 embryons transférés sur
10 ne s’implantent pas. Ce faible taux de succès,
associé aux risques de grossesses multiples, rend
compte de la nécessité de mieux appréhender les
mécanismes qui sous-tendent l'infertilité afin d'en
améliorer la prise en charge. Il est à noter que plus de
50 % d’enfants nés par FIV sont issus de grossesses
multiples et que les accouchements précoces résul-
tant d’une grossesse multiple causée par une AMP
coûtent environ 890 millions de dollars au système
de soins des États-Unis. Actuellement, pour prévenir
les grossesses multiples, la diminution du nombre
d’embryons à transférer est devenue un impératif.
L’idéal serait un ovocyte donnant un embryon et
donnant une naissance. Mais, malheureusement,
c’est loin d’être le cas, en partie à cause de l’ab-
sence d’approche non invasive capable d’identifier
l’embryon compétent. Trente et un ans après la
première naissance par FIV, on ne sait toujours pas
prédire d’une manière fiable la qualité embryon-
naire. Il convient donc de s’intéresser aux méthodes
d’identification des embryons viables à fort potentiel
d’implantation afin d’augmenter les taux de succès
de FIV, de réduire le nombre d’embryons à transférer,
ainsi que les taux de grossesses multiples et les taux
de fausses couches précoces.
De nombreuses études portant sur la morphologie
embryonnaire ont d'ailleurs tenté de quantifier le
potentiel implantatoire de l'embryon en établissant
des scores fondés sur différents paramètres tels que
* Division AMP/DPI, Inserm U 847,
hôpital Arnaud-de-Villeneuve, 34000
Montpellier.
la taille et le nombre des blastomères, le degré de
fragmentation. Néanmoins, ces paramètres restent
très imparfaits pour guider le choix des embryons
à transférer. Au-delà de ces critères "morpholo-
giques", des nouvelles approches invasives ou non
s’appuyant sur la transcriptomique, la protéomique
et la métabolomique sont actuellement utilisées
dans le but d’identifier les embryons à fort potentiel
implantatoire. Ces approches dites "omics" portent,
d’une part, sur l’ovocyte ou l’embryon et, d’autre
part, sur leur environnement. Il s’agit de disposer
de biomarqueurs fiables de la qualité ovocytaire et
embryonnaire.
Omics et développement
embryonnaire préimplantatoire
L’insuffisance des critères morphologiques de sélec-
tion des embryons préimplantatoires est probable-
ment en partie responsable des faibles résultats
de la FIV. Il est important de pouvoir accéder aux
signatures moléculaires pour mieux comprendre le
développement ovocytaire et celui de l’embryon
préimplantatoire. Pour cela, il est nécessaire d’étu-
dier à la fois la régulation de l’expression des gènes,
mais également la régulation de l’expression des
protéines et des métabolites. Pendant les années
1980, on cherchait à rattacher une fonction biolo-
gique à un gène donné. On pensait pouvoir tout
expliquer une fois l'ensemble du génome décrypté.
Maintenant que l'ensemble du génome est iden-
tifié, tout n'est pas résolu. Les études du génome
comportent des limites, notamment liées au fait
qu’elles ne permettent pas à elles seules de saisir
toute la complexité du fonctionnement cellulaire.
Car plusieurs informations fondamentales pour la
compréhension des systèmes biologiques échap-
I. Comment peut-on évaluer
la compétence embryonnaire
au développement ?
II. Qu’est-ce qu’une approche
non invasive ?
III. Qu’apportent les
approches "omics"
par rapport aux approches
classiques ?
Quiz
Réponses :
I : Par son aptitude à évoluer,
s'implanter et donner une
grossesse.
II : C’est une approche indirecte
qui permet d’évaluer la
compétence embryonnaire
sans toucher à l’intégrité de
l’embryon.
III : Les approches omics
permettent d’obtenir une
vision qualitative, quantitative
et fonctionnelle sur le
développent embryonnaire.

La Lettre du Gynécologue • n° 355 octobre 2010 | 33
Résumé
Figure 1. Embryon humain âgé de 6 jours.
pent à leur champ d’investigation. Les recherches
portent alors de plus en plus sur la transcription
des gènes et sur leur traduction en protéines dans
une situation donnée. En plein développement, les
approches "omics" (transcriptomique, protéomique,
métabolomique…) sont essentielles à l'obtention
d'une vision d'ensemble qualitative, quantitative et
même fonctionnelle des ovocytes, des embryons et
de leur environnement.
L’établissement de signatures moléculaires, fondées
sur les microarrays, permet de déterminer le potentiel
implantatoire par l’étude moléculaire de l'ovocyte et
des cellules folliculaires, la signature génomique de
l'embryon, et l’analyse quantitative et qualitative de
l'expression génique. En effet, de plus en plus d’essais
cliniques incluent des projets utilisant des puces à
ADN pour identifier des profils d’expression spéci-
fiques. Ce sont des outils technologiques puissants
permettant au cours d'une seule expérience de quan-
tifier les niveaux d'expression de milliers de gènes
au sein d'une population cellulaire et de comparer
les signatures transcriptionnelles de différentes
populations cellulaires entre elles. Plusieurs études
récentes ont montré le potentiel de ces méthodes
d’analyse des profils d’expression génique dans des
études rétrospectives (1). Il est important de distin-
guer les approches non invasives qui pourraient être
accessibles en pratique clinique de celles qui sont
invasives et restent spécifiques du cadre recherche.
Approches non invasives
Les environnements ovocytaire et embryonnaire
font l’objet d’une attention particulière ces dernières
années, qu’il s’agisse de l’expression de certains
gènes ou protéines au niveau des cellules du cumulus
entourant l’ovocyte, ou de la présence de certaines
métabolites dans le milieu de culture de l’embryon.
Approches transcriptomiques
sur les cellules du cumulus
Dès les stades précoces de développement folli-
culaire, une collaboration étroite s’installe entre
l’ovocyte et les cellules folliculaires. Mais, c’est à
partir du stade secondaire préantral, lors de la diffé-
renciation des cellules en deux types – les cellules
de la granulosa (CG), qui tapissent le follicule et les
cellules de cumulus (CC), directement au contact de
l’ovocyte – que les relations se resserrent entre l’ovo-
cyte et son cumulus. Les CC vont créer un espace
clos autour de l’ovocyte, à l’intérieur duquel un véri-
table dialogue se met en place entre ces cellules et
l’ovocyte et où chacun va évoluer en relation avec
l’autre. Plusieurs études chez la femme ont rapporté
le transcriptome des cellules du cumulus. Le profil
d’expression génique de ces cellules met en évidence
une surexpression des gènes (PTGS2/COX2, PTX3,
ADAMTS1 et StAR).
La protéine PTGS2 (prostaglandin-endoperoxide
synthase 2) intervient dans la synthèse de pros-
taglandines, notamment PGE2 qui est important
au moment de l’ovulation. McKenzie et al. (2) ont
montré que l’expression de PTGS2 peut être reliée à
la fécondation et au développement embryonnaire
précoce. Zhang et al. (3) ont analysé l’expression
de PTX3 (pentraxin 3) dans les cellules du cumulus
humain. Ils ont ainsi observé que les cellules du
cumulus issus d’ovocytes fécondés ont entre 3 et
12 fois plus d’ARNm de PTX3 que ceux issus d’ovo-
cytes en échec de fécondation. La métalloprotéinase
ADAMST1 permet le clivage des facteurs EGF-like
(EREG et AREG) qui sont des médiateurs paracrines
et endocrines de la LH et qui participent à la matu-
ration ovocytaire et l’expansion du cumulus. Haouzi
et al. ont mis en évidence, par analyse microarray,
La première semaine du développement embryonnaire humain constitue l’étape clé de l’obtention et de l’évolution
de l’embryon. Cette période comporte une série d’événements qui transforme des cellules hautement spécialisées,
les cellules germinales, en des cellules indifférenciées au potentiel développemental extraordinairement vaste : la
masse cellulaire interne. La compréhension de ces événements est essentielle pour les progrès de l'assistance médicale
à la procréation. Notre connaissance des premiers stades du développement embryonnaire a beaucoup progressé
au cours des dernières années, mais des zones d'ombre importantes persistent. Jusqu'à présent, que ce soit dans
le cas de la fécondation in vitro classique ou dans celui de la micro-injection par ICSI, les ovocytes et les embryons
sont sélectionnés sur des critères exclusivement "morphologiques", et, par conséquent, subjectifs. L’émergence de
nouvelles technologies "omics" faisant référence à transcriptomique, protéomique, métabolomique ouvre l'ère d'un
nouveau défi à la génomique et offre la possibilité d’évaluer différents marqueurs simultanément. En se fondant
sur la génomique fonctionnelle, la "signature protéine/gène" pourrait ouvrir la voie au développement de facteurs
prédictifs de la qualité embryonnaire et grossesse permettant ainsi d’améliorer le taux de succès en FIV/ICSI.
Mots-clés
Ovocyte, embryon,
omics, biomarqueurs
Keywords
Oocyte
Embryo
Omics
Biomarkers

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DOSSIER La conférence Jean Cohen et les JTA 2010 : les temps forts
une surexpression de 2 600 gènes dans les cellules
du cumulus humain, parmi lesquels figurent StAR,
PTGS2/COX2 et PTX3, en comparaison avec les
gènes exprimés par l’ovocyte. StAR (steroidogenic
acute regulator) est une protéine impliquée dans
la synthèse des hormones stéroïdes en facilitant le
transport du cholestérol vers la membrane mito-
chondriale interne. C'est également une des cibles
lors de l'activation des EGF-R.
L'expression de StAR est donc importante lors de
la croissance folliculaire, surtout pour la synthèse
de progestérone. Ces gènes ne sont que quelques
exemples de gènes exprimés dans les cellules du
cumulus et ayant un rôle dans la maturation ovocy-
taire et/ou l'expansion du cumulus. Zhang et al. (3)
ont confirmé ces résultats et ont trouvé, par analyse
microarray, 160 gènes différentiellement exprimés
par les cellules du cumulus humain par rapport à
ceux exprimés par l’ovocyte, y compris StAR, COX2
et PTX3. Haouzi et al. ont montré (1) que le récepteur
commun à la LH et à l’hCG (LH/hCGR) est exprimé
par les cellules du cumulus (4) et, plus récemment,
que l’expression de la LH/hCGR était inversement
corrélée au taux d’estradiol et au nombre de folli-
cules matures le jour de l’administration de la hCG
pour ICSI. L’ensemble de ces études ont démontré
que l’expression de certains gènes dans les cellules
du cumulus est liée à la qualité embryonnaire et au
taux de grossesses (1).
◆Profil d’expression des gènes des CC en relation
avec la qualité embryonnaire et le pronostic de la
survenue d’une grossesse
Dans le follicule, les cellules du cumulus partagent
le même environnement folliculaire que l'oocyte
auquel elles sont étroitement associées. En effet,
l'analyse de l'expression de gène des cellules du
cumulus permet d’étudier le micro-environnement
dans lequel l'oocyte acquiert sa maturation. L'ap-
proche indirecte du profil d'expression des gènes du
cumulus permet d’évaluer les capacités d’un ovocyte
à donner un embryon évolutif susceptible de s'im-
planter et de donner une grossesse. Hamel et al. (5)
ont pu identifier 5 marqueurs folliculaires associés
à la qualité embryonnaire. Ces marqueurs sont :
FDX1 (Ferredoxin 1), CYP19A1 (cytochrome P450
aromatase), CDC42 (cell division cycle 42), SERPINE2
(serine proteinase inhibitor clade E member 2) et la
3βHSD1 (3-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1).
Plus récemment, en se fondant sur le taux de clivage
au cours du développement embryonnaire, l’étude
de van Montfoort et al. (6) a démontré que l’ex-
pression des gènes GPX3 (glutathione peroxidase 3),
CXCR4 (chemokine receptor 4), CCDN2 (cyclin D2) et
CTNND1 (catenin delta 1) dans les CC humaines a été
inversement corrélée avec la qualité embryonnaire.
Notre équipe a analysé le profil transcriptionnel des
CC de 50 ovocytes provenant de 30 patientes consi-
dérées comme normo-répondeuses : 5 CC provenant
d’ovocytes non fécondés, 11 CC provenant d’ovocytes
ayant donné un embryon avec fragmentation exces-
sive (grade 3-4) et 34 CC provenant d’embryons avec
une faible fragmentation (grade 1-2).
L’analyse supervisée à l’aide du logiciel SAM (signi-
ficance analysis of microarrays) incluant un seuil
de variation de 2 et un FDR (false discovery rate)
inférieur à 5 % montre que 2 605 gènes étaient
surexprimés dans le groupe des CC issues d’ovo-
cytes non fécondés, 2 739 dans le groupe des CC
issues d’ovocytes qui ont donné des embryons
de qualité moyenne et 2 482 dans celui des CC
issues d’ovocytes qui ont donné des embryons de
bonne qualité. À l’inverse, 4 270, 4 349 et 4 483
gènes étaient sous-exprimés respectivement dans
les différents groupes. Les CC ont été comparées
au regard du devenir évolutif de la grossesse. Une
analyse SAM a permis d’identifier une liste de 630
gènes "liés au pronostic de grossesse" dont le niveau
d’expression au sein des CC reflétait indirectement
la qualité embryonnaire de manière plus fiable et
permettait une discrimination entre les embryons
compétents ayant abouti à une grossesse et ceux
de bonne qualité morphologique n'ayant pas abouti
à une grossesse. Nous avons identifié deux gènes
marqueurs, BCL2L11 et PCK1, impliqués respecti-
vement dans l’apoptose et la gluconéogenèse et
surexprimés dans les CC, dont les ovocytes ont
abouti à la survenue d’une grossesse et le facteur
de transcription NFIB sous-exprimé dans les CC.
Cette étude propose des marqueurs au sein des CC,
reflétant indirectement la qualité embryonnaire et
permettant le choix d’embryon compétent, dans le
but de réduire à 1 le nombre d'embryons transférés,
afin d'éviter le risque de grossesse multiple. L’analyse
de l'expression de ces marqueurs le jour de la ponc-
tion ovocytaire, par une technique non invasive et
plus rapide (G-test : test génétique rapide), pourrait
guider le choix des embryons à replacer à J2 ou J3.
Approche transcriptomique
de l’embryon humain
Une méthode invasive, qui consiste à biopsier
l’embryon de blastomère, peut également être
une évaluation indirecte afin de connaître le statut

La Lettre du Gynécologue • n° 355 octobre 2010 | 35
DOSSIER
chromosomique et le transcriptome de l'embryon.
Cette méthode a été utilisée, entre autres, pour
sélectionner les embryons euploïdes à transférer
chez les patientes plus âgées, chez qui une moins
bonne qualité ovocytaire entraîne une augmentation
du pourcentage d'embryons aneuploïdes (pouvant
aller jusqu'à 100 % chez certaines patientes) et des
échecs d'AMP. Dobson et al. (7) ont examiné le profil
d’expression des gènes chez différents embryons
humains pendant les trois premiers jours du déve-
loppement embryonnaire suivant la fertilisation à
l’aide de microarrays. Cette étude montre la faisa-
bilité technique de l’utilisation des puces à ADN
dans l’analyse des ARN messagers embryonnaire
et ouvre la porte à une taxonomie exhaustive des
gènes mis en jeu dans le développement embryon-
naire précoce. La connaissance du transcriptome des
embryons permet d'avancer très rapidement dans
la compréhension des mécanismes de la pluripo-
tence. L'importance de cette recherche a d'ailleurs
été soulignée récemment par le développement du
domaine de la reprogrammation.
Approche transcriptomique
sur le trophoblaste
Cette approche est fondée sur la biopsie au niveau du
trophoblaste d’un blastocyste. En combinant cette
approche, la méthode microarray et la méthode de
marqueurs ADNs (DNA fingerprinting), Jones et al.
(8) ont pu identifier des gènes au niveau des cellules
trophoblastiques dont les niveaux d’expression sont
corrélés à la compétence embryonnaire. Ces gènes
sont impliqués dans l’adhésion cellulaire, le méta-
bolisme, la communication cellulaire et la réponse
au stimulus.
Conclusion et perspectives
Malgré le progrès de la pratique d’AMP depuis
quelques décennies, plus de 50 % des embryons
humains cultivés in vitro n’arrivent pas au stade de
blastocyste en raison de défauts de développement.
Une partie de ces échecs est imputée à des défauts
de maturation des ovocytes. La FIV génère un taux
élevé de grossesses multiples pouvant mettre en
péril la santé de la mère et des enfants à naître.
Une volonté se développe dans le monde pour
réduire la fréquence de ces grossesses multiples.
Les critères morphologiques, tant de l’ovocyte
que de l’embryon, sont imparfaits. Dans toutes
ces conditions, il se pose la question de l'appré-
ciation du potentiel implantatoire des embryons
obtenus. Ainsi, aujourd'hui, le biologiste en FIV doit
plus que jamais mettre en œuvre des critères perti-
nents prédictifs de l'implantation, critères issus de
moyens d'investigation non invasifs et applicables
en pratique quotidienne.
Bien que le développement embryonnaire précoce soit
encore mal connu au niveau moléculaire, l’utilisation
de l’omics devrait permettre une avancée majeure
dans la compréhension de la première semaine de la
vie humaine, la définition de la compétence ovocy-
taire et embryonnaire, ainsi que dans l’identifica-
tion d’indicateurs pertinents et fiables de la qualité
embryonnaire. Ces techniques devraient augmenter
le taux de succès des FIV, tout en diminuant les
risques de grossesse multiple en réduisant la néces-
sité d'implanter simultanément plusieurs embryons.
Ces nouvelles technologies "omics" pourront aussi
atténuer les problèmes éthiques et médicaux causés
par le transfert multiple d’embryons auxquels sont
confrontés les praticiens de la FIV et les parents qui
les consultent via les approches non invasives. ■
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