Imagerie Tissulaire Multispectrale ONCOTRANS 2017 Jean-Pierre MAQUIN Perkin Elmer Voir grand dans le très petit 1 © 2017 PerkinElmer Applications Immuno-oncologie Les intéractions cellulaires sont complexes. Il est capital de comprendre les différents mécanismes impliqués dans les voies de signalisation cellulaires qui activent ou désactivent les différent types de cellules immunes. Le seul moyen pratique pour extraire ces information est d’optimiser le multiplexage. Les marquages permettront de mesurer les différents niveaux d’expression quantitativement et spatialement. From: Ott, et al, 2013 Bases pour une bonne imagerie tissulaire Le Mantra Le Vectra Technologie OPAL Le Vectra Polaris inForm™ Logiciel Imagerie tissulaire Intelligence artificielle Stations d’analyse multi-spectrale Préparation de l’échantillon avec Opal Voir grand dans le très petit 4 © 2017 PerkinElmer Colorations séquentielles Le système OPAL nous permet d’utiliser des anticorps produit de la même espèce sur le même tissu (ou sur le même compartiment cellulaire) MW Tissue section Antigen A Antibody A (Rabbit) Antigen B Antibody B (Rabbit) Antigen C Antibody C (Rabbit) HRP-conjugated Anti-Rabbit IgG or Superpicture Fluorochrome – tyramide L’imagerie multi-spectrale Voir grand dans le très petit 6 © 2017 PerkinElmer Les avantages L’imagerie multispectrale permet d’acquérir des images à de nombreuses longueur d’ondes afin de déterminer avec précision la distribution de la fluorescences dans les cellules et les tissus. 420nm 490nm 720nm Monochrome Color (RGB) Multispectral Imagerie Multispectrale Liquid Crystal Tunable Filter (LCTF) Plage de longueurs d’ondes: FX: 420 à 720 nm (microscopie classique) Caractéristiques: – Qualité d’image exceptionnelle – aucun déplacement de pixels, aucun déplacement des éléments – Variabilité rapide – Qualité spectrale d’excellente qualité Pousser les limites de la séparation des couleurs Exemple: Rouge vs. Rouge vs. Rouge Liquid Permanent Red Vector Red AEC Sample courtesy of Chris van der Loos, University of Amsterdam On peut donc séparer autant de couleurs que de marqueurs présents dans l’échantillon Si les échantillons sont très autofluorescents ProstateSpecifc MembraneAntig en, in formalinfixed prostate tissue Label: 525-nm quantum dot RGB 525 nm (20-nm bandpass) Unmixed Composite image Enhanced sensitivity and accuracy Triple marquage d’un échantillon de foie Standard color image (three filter cubes) Autofluorescence Hoechst AF488 Composite image Cy3 Images courtesy Laszlo Komuves, Genentech Le logiciel InForm Voir grand dans le très petit 12 © 2017 PerkinElmer Les étapes dans l’interface inForm’s 1. Charger les images Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. 3. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Segmenter l’image Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. 3. 4. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Segmenter l’image Segmenter les cellules (noyau, cytoplasme, membrane) Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. 3. 4. 5. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Segmenter l’image Segmenter les cellules (noyau, cytoplasme, membrane) Quantifier (% pos) Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. 3. 4. 5. 6. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Segmenter l’image Segmenter les cellules (noyau, cytoplasme, membrane) Quantifier (% pos) Quantifier : 0/1+/2+/ 3+ Les étapes dans l’interface inForm’s 1. 2. 3. 4. 5. 6. Charger les images Dessiner les régions et former l’algorithme Segmenter l’image Segmenter les cellules (noyau, cytoplasme, membrane) Quantifier (% pos) Quantifier: 0/1+/2+/ 3+ Breast Cancer Example CD4, CD8, CD20, PD-L1, Foxp3, cytokeratin, DAPI Dr. Beth Mittendorf, MD Anderson Chichung Wang, Kristin Lane, Kent Johnson, and Cliff Hoyt, PKI 20 Breast Cancer Case #2: Unmixed composite image cyan = CK purple = cytotoxic T cell green = helper T cell red = B cell orange = PD-L1 yellow = Foxp3 Breast Cancer Case #2: tumor / stroma map and cell phenotypes Phenotype Counts Phenotypes tumor killer T helper T T-reg B cell other Tumor 1,810 Killer T 213 Helper T Regulator T 0 14 B cell 1,270 Other 2,160 Total 6,467 Breast Cancer Case #2: Spatial point pattern analysis 4% of tumor cells have a cytotoxic T cell within 25 microns distance Vectra Polaris " Le Vectra Polaris intègre l’imagerie multispectrale dans un Scanner de lames haut de gamme " System multimode utilisant à la fois la fluorescence et le Brightfield " Capacité de 80 lames à chargement continu " Excitation avec des LED et roue à filtres jusqu’à 10 filtres pour plus de flexibilité à l’émission. sCMOS Specifications Resolution 2.8 megapixel Readout noise 3 electrons (rms) Readout rate 45 frames/s Pixel size 3.63 µm x 3.63 µm Interface USB 3.0 Power <3W Optique optimisée pour l’intégration du multispectral Ø Microscope Infinity-Corrected Ø Platine XY Ultra-précise (< 0.1 micron) pour la reproductibilité Ø Technologie brevetée pour le focus Merci pour votre attention