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Imagerie Tissulaire
Multispectrale
ONCOTRANS 2017
Jean-Pierre MAQUIN
Perkin Elmer
Voir grand dans le très petit
1
© 2017 PerkinElmer
Applications Immuno-oncologie
Les intéractions cellulaires sont
complexes.
Il est capital de comprendre les
différents mécanismes impliqués
dans les voies de signalisation
cellulaires qui activent ou
désactivent les différent types de
cellules immunes.
Le seul moyen pratique pour
extraire ces information est
d’optimiser le multiplexage. Les
marquages permettront de
mesurer les différents niveaux
d’expression quantitativement et
spatialement.
From: Ott, et al, 2013
Bases pour une bonne imagerie tissulaire
Le Mantra
Le Vectra
Technologie OPAL
Le Vectra Polaris
inForm™ Logiciel Imagerie tissulaire
Intelligence artificielle
Stations d’analyse
multi-spectrale
Préparation de l’échantillon
avec Opal
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© 2017 PerkinElmer
Colorations séquentielles
Le système OPAL nous permet d’utiliser des anticorps produit
de la même espèce sur le même tissu (ou sur le même
compartiment cellulaire)
MW
Tissue section
Antigen A
Antibody A (Rabbit)
Antigen B
Antibody B (Rabbit)
Antigen C
Antibody C (Rabbit)
HRP-conjugated
Anti-Rabbit IgG
or Superpicture
Fluorochrome –
tyramide
L’imagerie multi-spectrale
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© 2017 PerkinElmer
Les avantages
L’imagerie multispectrale permet d’acquérir des images à de nombreuses
longueur d’ondes afin de déterminer avec précision la distribution de la
fluorescences dans les cellules et les tissus.
420nm
490nm
720nm
Monochrome
Color (RGB)
Multispectral
Imagerie Multispectrale
Liquid Crystal Tunable Filter (LCTF)
Plage de longueurs d’ondes:
FX: 420 à 720 nm (microscopie classique)
Caractéristiques:
–  Qualité d’image exceptionnelle – aucun déplacement
de pixels, aucun déplacement des éléments
–  Variabilité rapide
–  Qualité spectrale d’excellente qualité
Pousser les limites de la séparation des couleurs
Exemple: Rouge vs. Rouge vs. Rouge
Liquid Permanent Red
Vector Red
AEC
Sample courtesy of Chris van der Loos, University of Amsterdam
On peut donc séparer autant de
couleurs que de marqueurs
présents dans l’échantillon
Si les échantillons sont très autofluorescents
ProstateSpecifc
MembraneAntig
en, in formalinfixed prostate
tissue
Label: 525-nm
quantum dot
RGB
525 nm (20-nm bandpass)
Unmixed
Composite image
Enhanced
sensitivity and
accuracy
Triple marquage d’un échantillon de foie
Standard color image (three filter cubes)
Autofluorescence
Hoechst
AF488
Composite image
Cy3
Images courtesy Laszlo Komuves, Genentech
Le logiciel InForm
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© 2017 PerkinElmer
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
Charger les images
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
3. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Segmenter l’image
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
3. 
4. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Segmenter l’image
Segmenter les
cellules (noyau,
cytoplasme,
membrane)
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Segmenter l’image
Segmenter les
cellules (noyau,
cytoplasme,
membrane)
Quantifier (% pos)
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
6. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Segmenter l’image
Segmenter les
cellules (noyau,
cytoplasme,
membrane)
Quantifier (% pos)
Quantifier : 0/1+/2+/
3+
Les étapes dans l’interface inForm’s
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
6. 
Charger les images
Dessiner les régions
et former l’algorithme
Segmenter l’image
Segmenter les
cellules (noyau,
cytoplasme,
membrane)
Quantifier (% pos)
Quantifier: 0/1+/2+/
3+
Breast Cancer Example
CD4, CD8, CD20, PD-L1, Foxp3, cytokeratin, DAPI
Dr. Beth Mittendorf, MD Anderson
Chichung Wang, Kristin Lane, Kent Johnson, and Cliff Hoyt, PKI
20
Breast Cancer Case #2: Unmixed composite image
cyan = CK
purple = cytotoxic T cell
green = helper T cell
red = B cell
orange = PD-L1
yellow = Foxp3
Breast Cancer Case #2: tumor / stroma map and cell phenotypes
Phenotype Counts
Phenotypes
tumor
killer T
helper T
T-reg
B cell
other
Tumor
1,810
Killer T
213
Helper T
Regulator T
0
14
B cell
1,270
Other
2,160
Total
6,467
Breast Cancer Case #2: Spatial point pattern analysis
4% of tumor cells have a cytotoxic T
cell within 25 microns distance
Vectra Polaris
" Le Vectra Polaris intègre
l’imagerie multispectrale dans
un Scanner de lames haut de
gamme
" System multimode utilisant à la
fois la fluorescence et le
Brightfield
" Capacité de 80 lames à
chargement continu
" Excitation avec des LED et roue
à filtres jusqu’à 10 filtres pour
plus de flexibilité à l’émission.
sCMOS
Specifications
Resolution
2.8 megapixel
Readout noise
3 electrons (rms)
Readout rate
45 frames/s
Pixel size
3.63 µm x 3.63 µm
Interface
USB 3.0
Power
<3W
Optique optimisée pour l’intégration du multispectral
Ø  Microscope Infinity-Corrected
Ø  Platine XY Ultra-précise (< 0.1
micron) pour la reproductibilité
Ø  Technologie brevetée pour le
focus
Merci pour votre attention
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