The functional roles of PlexinD1 in chicken - ETH E

DISS. ETH No. 15930
The functional roles of PlexinD1 in chicken nervous system
during development
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
JOËLLE GEMAYEL
DEA “Metabolism, Endocrinologie et Nutrition” Université Claude Bernard-Lyon
born May 27, 1974
citizen of Lebanon
accepted on the recommendation of
Prof. Martin Schwab, examiner
Prof. Lukas Sommer, co-examiner
Dr. Matthias Gesemann, external supervisor
2005
Summary
A functional nervous system results from the coordinated generation and assembly of billions
of neural cells into highly structured and well organized networks. Building blocks for these
networks are neurons, which arise from neural progenitors that are deployed from specialized
neuroepithelia. These neuronal precursors migrate along specific pathways populating
different areas within the developing brain, spinal cord and peripheral nervous system. Once
correctly positioned, differentiated neurons send out axons along highly stereotypical
pathways, specifically linking neurons within different parts of the nervous system,
generating a high number of functional neuronal networks. The use of appropriate migratory
routes as well as directed axonal outgrowth along specific predetermined pathways is
achieved by specific receptor-ligand interactions that are characteristic for each subpopulation
of migratory cells or growing axons.
Several families of cell surface receptors and axon guidance cues involved in directing cell
migration and/or axonal outgrowth have been described over the last decade. One of the
largest families of axon guidance receptors is the plexin family. Plexins and their semaphorin
ligands have been shown to be involved in several aspects of axonal targeting and cell
migration. However, numerous studies describe also functional roles for plexins in the
development outside the nervous system, notably in the development of the cardiovascular
system. In this respect, PlexinD1 (PD1) has been extensively studied in vasculogenesis, and
several groups document its implication in heart development as well as in vessel patterning.
However, PD1 is also expressed in several regions of the developing brain, but no available
data describe its potential role in the nervous system.
Experiments in the first part of this thesis demonstrate that PD1 transcripts are not only found
in mouse brain but also in chicken spinal motor neurons during the period motor axons sort in
the limb plexus. PD1 knock down, using in ovo RNAi, results in motor axon misguidance in
the dorsal as well as the ventral crural nerve trunk, suggesting PD1 involvement in motor
axon guidance and/or sorting of the crural nerve. Interestingly, PD1 loss of function
experiments showed also unexpected defects in dorsal sensory root formation and
abnormalities in the area of motoneuron exit points. In PD1 knock down animals, dorsal roots
are less compact, and several axon bundles grow erroneously into neighboring segments
whereas motor exit points display a severely altered morphology appearing much broader
than usual, and the ventral motor roots show axons with aberrant courses.
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Summary
While the defects in the crural nerve could be easily explained by the lack of PD1 expression
in motoneurons, phenotypes observed in the dorsal and ventral roots support a role for PD1 in
either neural crest migration or the existence of a tight relation between intersomitic vessel
formation and dorsal root development. In the first case, PD1 loss of function in a
subpopulation of neural crest cells would lead to erroneous positioning of Schwann cells and
/or boundary cap cells resulting in outgrowth and defasciculation defects within the ventral
and dorsal roots. Alternatively, PD1 knock down might affect endothelial cells surrounding
the spinal cord, in particular the intersomitic vessels, leading to aberrant formation of these
vessels. Intersomitic vessels could form in close contact with sensory growing axons and
could play a role for correct axonal outgrowth. Their aberrant formation could result,
therefore, in axon guidance defects observed in the present study.
Experiments described in the second and third chapter of this thesis analyze the presence and
expression of semaphorins as well as plexins in the developing chicken spinal cord. Chicken
plexins and semaphorins display very complex, often complementary, but also overlapping
expression patterns that are highly regulated developmentally. These results suggest
multifunctional roles for these proteins, most likely exerting their activities in large
complexes containing intricate combinations of several members.
Résumé
Le bon fonctionnement du système nerveux dépend du correct assemblage de milliards de
cellules neurales générées pendant le développement embryonnaire afin de pouvoir former
des réseaux complexes et structurés.
Les précurseurs des cellules neurales se forment au niveau d’une structure bien spécialisée
appelée l’épithélium neuronal. Une fois générées, ces cellules entament leur migration tout le
long de parcours bien définis afin de former les différentes structures du système nerveux
central et périphérique. Par la suite les cellules neuronales projettent leurs axones tout le long
de voies bien définies, souvent à de très longues distances de leur corps cellulaire pour
finalement de se connecter à leur cible finale.
L’achèvement d’une migration cellulaire correcte ainsi que la navigation précise des axones
jusqu’à leur destination finale dans un système embryonnaire nécessite l’intégrité de familles
de protéines parmi lesquelles les plexines.
Les plexines ont été récemment identifiées et caractérisées; elles constituent une très grande
famille de protéines contenant environ 9 membres et exercent leur action en se liant à leur
ligands, les semaphorines. Plusieurs études décrivent l’implication de ces protéines dans le
développement du système nerveux central mais aussi dans la formation d’autre tissues
embryonnaires.
PlexinD1 appartient à la famille des plexines et a été intensivement décrite comme un facteur
majeur dans le développement du système vasculaire in vitro et in vivo. Bien que l’expression
de cette protéine ait été identifiée dans le cerveau de souris pendant le développement
embryonnaire, aucune étude ne décrit le rôle de plexinD1 dans le développement du système
nerveux central.
Pendant ce travail de thèse, nous avons souhaité investir le rôle potentiel de plexinD1 dans le
développement de la moelle épinière dans l’embryon de poulet. Nous avons établi que cette
protéine est bien exprimée pendant le développement par les neurones moteurs de la moelle
épinière et cette expression correspond au moment où ces neurones s’arrangent dans le plexus
à la base du pied.
Les outils moléculaires visant à bloquer l’expression de plexinD1 en utilisant une technique
appelée in ovo RNAi, ont pu démontrer que l’absence de plexinD1 dans les motoneurones
induit la malformation de certaines branches du nerf crural. De plus, nous avons observé des
anomalies au sein des fibres sensorielles résultant en la fusion des fibres entre elles, bien que
plexinD1 ne soit pas exprimée par les neurones sensorielles mais par les cellules endothéliales
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Résumé
entourant la moelle épinière et les ganglions de la racine dorsale. Afin de pouvoir expliquer
ces aberrations dans la formation des fibres sensorielles, nous avons proposé deux modèles.
Notre première hypothèse suppose que plexinD1 n’est pas exclusivement exprimée par les
cellules endothéliales mais aussi dans les cellules de Schwann et les boundary cap cells. Une
migration erronée de ces cellules menant à leur mauvais positionnement peut expliquer les
anomalies observées. Une seconde explication est que la malformation des fibres sensorielles
peut résulter d’une anomalie dans le développement des vaisseaux sanguins exprimant
plexinD1, en particulier les vaisseaux intersomitiques, qui normalement assistent et guident
les fibres sensorielles pendant leur élongation.
Nous avons également montré dans une deuxième partie de notre travail, l’expression de
toutes les semaphorines et plexines dans la moelle épinière du poulet au cours des différents
stades du développement. Nos résultats démontrent que les ARNm étudiés sont exprimés
d’une façon très complexe et dynamique suggérant l’existence de multiples fonctions exercées
par ces protéines qui très souvent doivent agir en synergie plutôt que séparément.