Résumé La capacité des spores de Penicillium roqueforti à utiliser

Résumé
La capacité des spores de Penicillium roquefortià utiliser sélectivement les acides Gras
de courtes et moyennes chaînes (C6, C8 et CIO) a été démontrée. En raison de leur
toxicite, l'expérience a montré que ces acides gras sont difficilement assimiles au delà
54 ppm par ces spores. Cependant lorsque le substrat est foumi sous forme de sel, les
spores sont capables d'utiliser des concentrationsélevées.
L'addition dans le milieu des substances activatrices (alanine, ethanol, glucose et
hydrolysat de caséine ) a montré que seul l'hydrolysat de caséine stimule l'utilisation du
substrat par les spores. Les acides aminés de cet hydrolysat de caséine sont utilisés à
des vitesses différentes. Seuls les acides aspartique et glutamique sont immédiatement
consommés fournissant de l'énergie aux spores alors que d'autres acides aminés
attendent un temps de latence ou sont peu consommés.
La fermentation aérobique du substrat dans un milieu organique a permis d'augmenter
la quantité de méthylcétones en raison de l'augmentation de la quantité d'oxygène
solubilisée. Cette fermentation doit être de courte durée ( 16 à 18h) pour éviter la
germination des spores, état physiologique non efficace pour l'utilisation des acides
gras.
L'expérience dans un milieu organique a été étendue au niveau de l'octane dans une
culture fed-batch avec un mélange d'air et de CO, à 5, 15 et 30%. Des grandes
concentrations d'acide gras (5 g1100 ml d'octane) ont pu être utilisées par les spores. A
15% de CO,, le système montre une haute stabilité avec un rendement de 64% à 8 h et
1,39 mmolelh de produit formé.
Halidi Ben Saida Ali
AVANT PROPOS
Ce projet a été réalisé sous la supervision du Dr J. Arul, directeur, de A. Boudreau, COdirecteur et de P. Angers, collaborateur. Je veux leur exprimer mes remerciements les
plus sincères pour leur support et leur patience. Je tiens à adresser un remerciement
particulier à Joseph Arul pour son soutien sur tous les plans. En particulier pour avoir
facilité le financement de ces travaux. Un grand merci à Paul Angers pour sa
disponibilité sans limite ainsi qu'à S. Davids pour avoir accepté de me prêter certains
matériels de laboratoire. Avant de terminer, je tiens à remercier l'équipe technique de
Monsieur Arul pour sa contribution.
TABLE DES MATlERES
Inuoduction générale ..............................................................................................................
1
Avant propos...............................................................................................................................
Table de Matières........................................................................................................................
Listes des tableaux et des figures.................................................................................................
ii
iii
Resumt? ..................................................................................................................1
.
V
Chapitre 1 Les conditions de production des methylcétones............................. 4
Résumé,......................................................................................................................................
5
1-Introduction
6
1.l.Métaboiiime de la fermentation méthylcétonique.................................................... 8
1.2. Les micro-organismes impliqués.................................................................................. 8
1.3. Les principaux panmètres influençant la fermentation
10
2.Matériel et Méthodes........................................................................................................ 15
2.1.Choix du matenel biologique........................................................................................ 15
2.2.Choiu des conditions expérimentales...................................................................... 16
2.2.1.Etudes sur les conditions de production des méthylcétones (chapitrel) ................ 16
2.2.2. Etude sur l'importance de la fermentûtion dans un milieu à deux phascs ............. 19
2.2.3. Etude de l'effet du CO2 sur la fermentation de 1' acide octanoique ...................... 77
en culture fed-batch dans un milieu octane-eau (chapiue3).......................................... 77
3.Résultats et Discussion ....................................................................................................... 77
3.1.Influence de La concentration en spores ........................................................................ 23
3.2.Nature et composition du milieu de fermentation........................................................ 23
3.2.1.Influence de la nature du substrat ........................................................................... 23
3.2.2. influence de la concentrationen substrat ............................................................... 24
32.3. Effet de l'utilisarion de l'acide occuioique et du sel d'acide pour la production en
heptanone......................................................................................................................... 25
3.2.4. Effet de l'utilisation des activateurs et inhibiteun ................................................ 26
3.2.5.Utilisation des acides aminés ..................................................................................30
4.Conclusions .......................................................................................................................... 42
5 Bibliographie ................................................................................................................... 44
----
.
Chapitre 2.Importance de la fermentation des acides gras dans un milieu à
deux phases...................................................................................................................... 48
Resumé .................................................................................................................................... 49
1.Introduction ....................................................................................................................50
1.1.Les méthodes de fermentation...................................................................................... 53
1.1.1Fermentation submergée .......................................................................................... 53
1.1.2.Production par spores encapsulées .........................................................................55
1.1.3. Production par spores immobilisées.................................................................. 56
2.Résultats et Discussion .................................................................................................. 57
2.1.Efficacité de la transformation en absence et en présence d'hexane.............................. 57
2.2.Effet de l'hexane sur le rendement en heptanone à différentes températures ................ 58
.2. 3.Effet de l'hexane su: la solubiiisa~onde l'oxygène et sur la vitessse de réaction. 59
2.4. Effet de la durée de fermentation sur la consommation en oxygène et siir le
6!
rendement en heptanone .................................................................................................
2.4.1. Effet de la durée sur la consommation en oxygSne par les spores inertes.............. 61
2.4.2. Effet de la durée sur le rendement en heptanone................................................... 62
2.4.3. Evolution du pH pendant la fermentation .............................................................. 63
2.5.Effet de l'hexane sur le rendement en biomasse et sur la dimunition de la toxicité ..........
des acides gras
65
3.Conclusions ..........................................................................................................................
75
4 Bibliographie .................................................................................................................. 76
....................................................................................................................
.
Chapitre 3.Effet du dioxyde de carbone sur la fermentation de l'acide ..........
octanoique par Penicilliirm roqueforti en culture fed-batch dans
un milieu octane-eau .................................................................................. 79
Resumé................................................................................................................................... 80
1.Introduction ................................................................................................................... 80
2.Résultats et Discussion ........................................................................................................ 82
2.1. Influence du CO? sur la production en methylcétones................................................. 82
2.2. Comportement des spores en mode discontinu et en mode Fed-bmch ......................... 84
2.3. Vitesse de production de l'heptanone ........................................................................ 85
3.Conclusions .......................................................................................................................... 90
4.Bibliographie .................................................................................................................... 91
Annexe.Valeurs numériques pour les tableaux et les figures ...................... 92
LISTE DES TABLEAUX ET DES FIGURES
Liste des tableaux.
CHAPITRE :
TABLEAU 1. EFFEï DE LA CONCENTRATION EN SPORES SUR LE RENDEMENT EN HEPTANONELM
TABLEAU 2. EFFET (8)DES ACIlVAïEURS SUR LA ïRANSFORMATION DE L'ACIDE GRAS.
35
TABLEAU 3 k ANALYSE DE VARIANCE: EFFET DES DTFFÉRENTS ACIlVAïEURS SUR LA
PRODUCnON DE L'HEPTANONE
36
CHAPITRE II
TABLEAU 4.EFFET DE L'HEXANE SUR LA BIOSYNTHÈSE DE L'HEPTANONE À DIFF~%NTE-S
TEhlPERATLJRES
66
TABLEAU 5. EFFET DE L'HEXANE SUR LE RENDEMENT EN BIOMASSE EN PRESENCE ET EN
67
ABSENCE D'HEXANE
CHAPITRE III
TABLEAU 6. EFFET DU CO?. SUR LA PRODUCTION DE L'HEPTANONE.
86
TABLEAU 7. EFFET DU TYPE DE FELVENïATION ET DU CO2 SUR LA PRODUCTNfIf
EN HEPTANONE
87
Liste des figures
CHAPITRE 1
14
FIGURE 1. SCHEMA DE BIOSYNTHESE DE L'HEPTANONE
20
FIGURE 2. SCHÉMA DE L ' I N S T A L M O N DU FERMENIZUR
FIGURE 3. EFFET DE LA LONGUEUR DES cHA~NE D'ACIDES GRAS SUR LA CONVERSION EN
37
MÉTHYLCÉTONES CORRESPONDANTES
FIGURE 4. EFFET DE LA CONCENTRATION EN ACIDE OCTANOIQUE SUR LE RENDEMENT EN
HEPTANONE
38
FIGURE 5. EFFET DE LA CONCENTRATION EN ACIDE OCTANOIQUE
FERMENTATION SUR LE RENDEMENT EN HEPTANONE
DU TEMPS
39
FIGURE 6. EFFET DE LA CONCENTRATION EN SEL D'ACIDE OCTANO'iQUE SUR LE RENDEMENT EN
HEPTANONE
39
FIGURE 7. ACflVATION DE L'OXYYATION DE L'OCTANOATE DE SODIUM PAR DIFFERENTES
ACTiVATEURS A DIFFERENTES CONCENTRATION D'ACIDE
40
FIGURE 8. UTILISATION DES ACIDES A M I P I ! PROVEh<ANT DE L'HYDROLYSAT DE
DURANT LA FERMENTATION DE L'OCTANOATE DE SODIUM PAR P.ROQUEFORTI.
CASEINE
41
CHAPITRE II
FIGURE 9A. EVOLUTION DE L'ACIDE XON UTILISÉ DURANT LA FERMENTATION
68
FIGURE 9B.EVOLUTION DE L'ACIDE UTILISÉ DURAhT LA FERMENTATION DANS UN
MILIEU AQUEUX ET ORGANIQUE.
68
FIGURE 9C. EVOLUTION DE L'HEPTANONE FORME DURANTLA FERMENTATION DANS
UN MILIEU AQUEUX ET ORGANQUE.
69
FIGURE 10. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE EN PRESENCE ET EN ABSENCE
D'HEXAh'E
70
FIGURE 11. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE DURANT LA FERIMENTATION EN
ABSENCE D'HEXANE
71
FIGURE 12. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE DURANT LA FERMENTAION EN
PRESNECE D'HEXANE
71
FIGURE 13. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION D ' O X Y G È ~PAR LES SPORES EN ABSENCE DE
SUBSTRAT
72
FIGURE 14. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE ET DU PH AU COURS DE LA
73
FERMENTATION DE L'OCTANOATE DE SODIUM
RGURE 15. EVOLUTION DE LA CONSOMMATION DE L'OCATANOATE DE SODIUM. DU PRODUIT ET
73
DE LA BIOMASSE. AU COURS DE LA FERMENTATION
FIGURE 16. EVOLUTION DU PH PENDANT LA FERMENTATION DE L'OCATANOATE DE SODIUM.74
CHAPITRE III
FIGURE 17. EFFET DE LA CONCENTRATION DU DIOXYDE DE CARBONE SUR LA PRODUCTION DE
L'HEPTANONE EN MODE FED-BATCH
88
FIGURE 18. EFFET DE LA CONCENTARTION DU DIOXYDE DE CARBONE AQUEUX SUR LA V m S S E
89
DE PRODUCTION DE L'HEPTPNONE AU COURS DE LA FERMEh'TATION
lntroductiori générale
Les acides gras saturés provenant de différentes sources en particulier du gras
animal fon:
l'objet
d'une attention particulière pour la population. Les
consommateurssont de plus en plus informés des cor,séquences souvent négatives
que le gras saturé cause à leur santé, par exemple, I'augnentation du taux de
cholestérol. Une des solutions pour valoriser ces matières premières conceme leur
transformation en méthylcétones, principaux actifs des saveurs du fromage.
En effet, la matière grasse joue un rôle important sur les qualités de saveur et
d'arôme des fromages. C'est ainsi que la lipolyse constitue l'un des phénomènes
majeurs de l'affinage et les acides qui en résultent contribuent directement à la
formation de la saveur typique de certains fromages . Une fraction de ces acides est
ensuite métabolisée par les micro-organismes. Certains de ces composés formés
peuvent participer à la détermination des caractères organoleptiques des pâtes.
Parmi les composés carbonylés, ce sont surtout les méthylcétones qui ont été mis
en évidence: l'acétone, la 2-pentanone, la Pheptanone et la 2-nonanone dans le
Roquefort et la 2-butanone dans le Bleu danois (Adda et Dumont,1974). Ces
auteurs ont mis en évidence la formation d'alcools secondaires (Bpentanol, 2heptanol et Pnonanol ), mais il semble que ceux-ci n'apparaissent que lorsque le
fromage contient une forte quantité de méthylcétones. Cependant dans une étude,
Kinderlerer(l987) a montré que la formation d'alcools secondaires est liée à la
limitation d'oxygène présent dans le milieu.
Dans le développement de la saveur et de l'arôme des fromages de type bleu, le
rôle des composés carbonylés et, notamment des méthylcétones, est bien connu.
Leur présence parmi lesquelles dominent la Pheptanone apparaît indispensable au
développement des caractères organoleptiquestypiques du fromage. La fabrication
de certaines soupes, salades, sauces et desserts nécessite l'utilisation de ces
composés présentant le goût de fromage. Ainsi la qualité de certains aliments
devient dépendante de la présence de ces arômes. Cette flaveur est principalement
obtenue par addition de méthylcétones telles que la 2-heptanone ou la 2undécanone. Ces composés sont obtenus par synthèse chimique en partant d'un
alcène terminal. Celui-ci subit une réaction d'hydratation en présence d'acide puis
une oxydation de l'alcool secondaire obtenu avec des métaux.
En raison du rejet croissant du consommateur vis à vis des composés de synthèse
chimiques ajoutés aux aliments, les industries alimentaires s'intéressent de plus en
plus aux saveurs d'origine biologique appelées naturelles ou biologiques. C'est pour
cela que les compagnies cherchent de plus en plus à maîtriser les procédés
biotechnologiques . Ces demiers trouvent dans les arômes des produits à valeur
ajoutée suffisante pour permettr: leur développement.
Certains de ces arômes sont obtenus par fermentation d'acide gras. Ce processus
met en jeu des spores dont l'activité peut être affectée par des conditions
environnementales (nature et concentration de substrat, pH, température,etc). Le
procédé est ainsi limité par la concentration du substrat en raison de sa toxicité à un
certain niveau, par sa faible solubilité dans le milieu aqueux et par la durée de
fermentation. Les coûts qui en résultent constituent l'élément principal qui
déterminera l'avenir commercial de ce procédé. En effet, les techniques actuelles de
fermentation utilisent des durées longues (quelques jours, voire des semaines)
incompatibles avec des exigences industrielles et économiques. La raison est liée à
la nature du substrat utilisé. L'utilisation des triglycérides demande une lipolyse
préalable pour libérer les acides gras précurseurs des méthylcétones. Or cette
réaction est trop lente. De plus, ces triglycérides sont des composés beaucoup
moins hydrosolubles que les acides gras eux mêmes. D'où le problème lié à la
disponibilité du substrat aux spores. Enfin, l'utilisation directe des acides gras
comme source de carbone pour la production des méthylcétones permet certes
d'éviter I'étape de la lipolyse et de
raccourcir la durée de fermentation mais ne résout pas le problème de la solubilité
(0,66g1100g d'eau pour l'acide octanoïque) ni celui lié à la toxicité. Cette inhibition
est fonction du pH du milieu , de la longueur de la chaîne et de la souche utilisée.
Cette inhibition a pour résultat la non consommation de l'oxygène, la non oxydation
du NADH au niveau de la chaîne respiratoire et la croissance du micro-organisme.
Une amélioration d'ensemble des performances de l'étape de fermentation puis de
la séparation apparaît susceptible de contribuer à la commercialisation. En fait, les
problèmes posés sont celui de l'identification des paramètres qui penettent de
contrôler la performance du micro-organisme, et celui de la sélectivité du substrat
pour améliorer la productivité. La performance passe par le choix et la sélection des
souches de moisissures capables d'effectuer la fermentation, ainsi que par la
maîtrise de l'état physiologique. L'évaluation de la performance du système de
fermentation doit prendre en compte les critères de concentration en acides, de
productivité, de rendement et de sélectivité. II est à noter que le rendement en
méthylcétones est relié à la sélectivité mais aussi à l'état physiologique de la
moisissure. Ces performances dépendent, d'une part, du choix de la moisissure et,
d'autre part, du mode de conduite de la fermentation. La sélection de souches
productrices ne fait pas l'objet de ce travail bien que son choix est déteninant sur
les performances.
Le travail de recherche sur la fermentation des acides gras à courtes et moyennes
chaînes en présence des spores de Penicilliurnroquefortise divise en trois parties :
1.Les conditions de production des methyicétones
2.lmportance de la fermentation des acides gras dans un milieu à deux
phases.
3.Effet du dioxyde de carbone sur la fermentation de l'acide octanoïque en
culture Fed-batch dans un milieu octane-eau.
CHAPITRE 1
Les conditions de production des methylcétones.
Résumé
L'évaluation des conditions de production des méthylcétones a été faite en
présence de spores de Penicillium roqueforti et d'acides gras (caproique, caprylique
et caprique).
L'analyse de la quantité de méthylcétones produites a montré que l'acide caprylique
était mieux utilisée que les autres substrats. Le reste du travail a donc été poursuivi
avec l'acide caprylique.
D'autres facteurs tels que la concentration en spores ont été examinés. A une
concentration inférieure à 106 spores ImL, il y a une très faible production en
méthylcétones. La concentration maximale en acide caprylique que les spores sont
capables de métaboliser est de 54 ppm. Au delà de cette concentration, une
répression catabolique se manifeste en raison de la toxicité des acides. Mais
lorsque le substrat est foumi sous forme de sel, ce dernier peut être métabolisé à
des concentrations supérieures. La toxicité semble annulée.
L'étude a aussi examiné la possibilité de stimuler le métabolisme des spores en
leur foumissant des substances dites activatrices (éthanol. glucose, alanine,
hydrolysat de caséine). Celles-ci fournissent de l'énergie aux spores et leur
permettent d'effectuer la dégradation de l'acide caprylique en heptanone. Les
résultats ont montré que lorsque les spores sont jeunes (7 jours), l'effet stimulateur
de ces activateurs ne s'est pas manifesté.
Parmi les substances testées, seul l'hydrolysat de caséine permettait aux spores
de mieux utiliser le substrat et de fournir un rendement plus élevé par rapport au
témoin. L'analyse cinétique de l'assimilation des acides aminés provenant de
l'hydrolysat de caséine a montré que les acides aspartique et glutamique sont
irnmédiatement consommés par les spores. Les acides aminés constituant ce
mélange ont donc été assimilés à différentes vitesses avec une prépondérance pour
l'acide glutamique et l'acide aspartique.
D'autres comme la tyrosine, la
phenylananine attendent un temps de latence avant d'être consommés alors que
l'alanine et l'histidine sont peu consommés.
1- Introduction
La production microbienne des arômes a été beauccup étudiée durant ces
demières années et certains procédés ont été exploités commercialement.
Cependant dans le cas des flaveurs comme les méthylcétones, le manque
d'information sur le métaboliàme du micro-organisme et le phénomène lié à la
toxicité du substrat constituent
les deux principeles barrières à la production
industrielle. Alors qu'une parfaite connaissance de la biochimie et de la physiologie
du micro-organisme sembie être la première chose à connaitre, seule une enzyme
de cet organisme, la p-décarboxylase, a été étudiée dans la dégradation du
précurseur direct ( Hwang et KinseIla,1975). Ainsi I'exploitation des voies
microbiennes pour la production des flaveurs naturelles s'est avérée faisable
techniquement et économiquement dans certains cas. La production des y-lactones
est un exemple. Le prix a diminué de 20,000s US!Kg en 1980 à 1200SUSIKg en
1995 à cause de la production microbienne(Fer0n et a1.,1996).
La production des méthylcétones par dégradation des acides gras s'avère
importante en raison de la forte multiplicité des produits alimentaires tels que les
salades, les soupes, les biscuits et les gâteaux dans lesquels l'addition des arômes
au goût de fromage semble stimulante ( Hwang et Kinsella,1976). Dans le fromage
bleu, les caractéristiques aromatiques sont principalement attribués aux composés
carbonylés parmi lesquels les méthylcétones (Dartey et Kinsella,l971). Ces
dernières sont formées sous l'action de P.roqueforti et de certaines autres
moisissures à partir des acides gras (C6-Cl$). L'oxydation des acides gras libres
par les spores a été étudiée depuis longtemps par Lawrence(l966) et par Dartey et
Kinsella (1973).
Les acides gras se sont révélés des composés toxiques à P. roquefcrti, le degré de
toxicité étant dépendant de la longueur de chaîne, de la concentration et du pH
(Lawrence et Hawke,1968). Et il a été suggéré que l'oxydation des acides gras est
un mécanisme de détoxification employé par la moisissure. Des concentrations de
32,5 mmoVL pour l'acide hexanoique, de 20,O mmol /L pour l'acide octanoique, de
10,O mmoVL pour I'acide décanoïque, et de 15,3 mmoVL pour I'acide dodécanoïque
sont inhibitrices à P. crustosum (Hatton et Kinderlerer,l991) tandis qu'une
concentration de 10 mM pour l'acide octanoïque est inhibitrice à P. roqueforti
(Creuly et a1.,1992). Les acides gras sont des agents antimicrobiens qui empëchent
leur croissance en inhibant le transport de certaines molécules comme les acides
aminés dans les cellules. Cet effet inhibiteur augmente lorsque le pH est abaissé à
partir de la neutralité, indiquant que le phénomène résulte des acides non dissociés
(Freese et al. ,1973). La vitesse de stimulation de l'acide octanoïque par les acides
aminés et les sucres chez les spores a été examinée par Lawrence et Bailey (1970).
L'effet stimulateur de ces composés est interprété comme des métabolites qui
agissent au niveau du cycle de I'acide citrique via I'acétylcoA. Cette conclusion est
appuyée par le fait que I'ATP exogène augmente la vitesse d'oxydation de I'acide
octanoïque. D'autre part, l'effet stimulateur de ces activateurs se manifeste
efficacement chez les spores âgées (Larroche et al. ,1988)
Dans cette étude, nous avons considéré la faisabilité d'utiliser des spores comme
biocatalyseurs pour la production des méthylcétones. Nous avons choisi trois acides
gras tels que I'acide caproïque, caprylique et caprique qui sont des courtes et
moyennes chaînes. Le reste du travail a Été poursuivi avec I'acide caproïque , bien
présent dans le gras laitier et la principale source de flaveurs provenant des acides
gras. L'autre raison est liée au souci d'éliminer les effets d'interactions avec les
autres acides et de contrôler un paramètre à la fois. Nous avons étudié les effets de
différents facteurs tels que l'âge et la concentration des spores ainsi que l'effet de
I'acide libre et sous forme de sel sur la productivité en méthylcétones. Enfin, nous
avons étudié l'influence de certains composés tels que l'alanine, le glucose,
l'éthanol et I'hydrolysat de caséine sur l'oxydation de I'acide octanoïque. Ce sont
des activateurs qui fournissent de l'énergie ou agissent comme source de
nutriments pour les spores de P. roqueforti. Ils influencent ainsi la perméabiiité du
substrat ou activent les enzymes nécessaires a la synthèse des méthylcétones.
Basé sur cette étude, une méthode de production des méthylcétones en utilisant un
solvant organique a été investiguée.
1.1.Métabolisme de la fermentation méthylcétonique
Les acides gras des courtes et moyennes chaînes sont oxydés par les spores ou le
mycélium de P. roqueforti (Dartey et Kinsella ,1973 ; Kinsella et Hwang , 1976b ;
Larroche et a1.,1988 ; Creuly et a1 .,1992) en methylcétones selon une une
p-
oxydation incomplète (voir schéma l ) .
Les facteurs qui vont influer sur le métabolisme sont d'ordre environnemental et
intrinsèque. Les facteurs intrinsèques incluent les enzymes des cellules, en
particulier la P-décarboxylase, et la perméabilité. L'incapacité des cellules à oxyder
le substrat peut être due soit à l'incapacité du substrat à pénétrer la membrane ou à
celle des enzymes à accomplir i'oxydation. Ces paramètres agissent sur la vitesse
de réaction au cours de laquelle une partie de l'acide gras est convertie en
acétylcoA et entre dans le cycle de Krebs. Celui-ci requiert la prosence de
molécules d'oxygène. La consommation de celle-ci est beaucoup active durant la
croissance du micro-organisme et faible lorsque les spores sont inertes. Les
facteurs externes qui influencent les réactions à I'intérieur des spores sont le pH, la
température, la pression de l'oxygène, le dioxyde de carbone et les nutriments. Ces
éléments sont l'objet de cette étude.
1.2. Les micro-organismes impliqués.
De nombreuses moisissures sont capables de produire des méthylcétones à partir
de la dégradation des acides gras libres ou des triglycérides. Certaines d'entre elles
sont plus performantes que d'autres, entre espèces et à l'intérieur d'une espèce. Et
il existe des différences marquées existant entre les souches
au niveau des concentrations, de la productivité et de la sélectivité.
Pour l'application semi-industrielle, le micro-organisme le plus intéressant, du moins
le plus utilisé est Penicillium roqueforti. Cependant, d'autres moisissures produisant
des méthylcétones ont été utilisées. Dans une étude menée sur 32 souches
sélectionnées, Yagi(1990b) a montré l'existence de deux catégories de souches.
Les unes capables d'accumuler des méthylcétones à partir des triglycérides naturels
provenant d'huile de palme (Fusarium et Trichoderma) et les autres actives sur un
triglycéride synthétique de tricaprine (Aspergillus, Cladosporium et Penicillium). De
même, Taylor (1995), après avoir travaillé sur huit cultures de Penicillium roqueforti,
a confirmé les résultats de Yagi sur la performance supérieure de Penicillium
decumbens I F 0 7091. D'autres souches de moisissures telles que Monascus
purpureus ( Kranz et al., 1992), Penicillium caseicolum (Lamberet et al., 1982) sont
capables d'une telle action.
II existe aussi un type de détérioration appelée rancidité cétonique (une production
" spontanée " de méthylcétones) présente dans certaines huiles telles que l'huile de
noix de coco (Coco nucifera
L .), l'huile de palme, le gras laitier tous riches en
acides hexanoïque, octanoïque, décanoïque, dodécanoïque . La formation de ces
produits est liée à la présence de moisissures xérophyliques (Euroticum
amtelodami, E.chevaleri, E. herbariorum et P. citrinum). Kinderler et Kellard(1984)
ont étudié ces moisissures dans des conditions de basse activité d'eau (Aw=0,76) et
de basse tension d'oxygène. Dans ces conditions, ce sont la Pheptanone et le 2heptanol qui sont les produits majoritaires parmi la Ppentanone, la Bnonanone et la
2-undécanone, excepté pour le cas de E. herbariorum qui produit 'a Phexanone, le
2-hexanol, le 2-octanol et le Boctanol. Les résultats ont montré aussi que certaines
moisissures peuvent croître sur l'huile de noix de coco dans les conditions similaires
sans causer une rancidité cétonique. II est ressorti de cetre étude que la formation
des méthylcétones dépend de la présence de courtes chaînes d'acides gras dans le
milieu ( certaines huiles comme l'arachide en sont dépourvu), d'une basse pression
partielle en oxygène et d'une basse activité de l'eau.
II existe également à l'intérieur d'une espèce compétente, certaines souches
incapables de produire des méthylcétones. C'est le cas de Aspergillus ruber. La
fermentation sur de l'huile de noix de coco pendant trois jours, a montré que seule
la souche 298309 de A. ruber était capable de produire des méthylcétones
(majoritairement de I'heptanone) alors que la souche 298306 en était incapable
(Kinderlerer,l987). La capacité pour certaines moisissures à synthétiser les
méthylcétones à partir des courtes chaînes peut être liée à la présence d'une
thiokinase qui existe dans certaines moisissures et qui est spécifique pour les
chaînes de 4 à 12 carbones (Gurr,1980).
1.3.Principaux paramètres influençant la fermentation.
La fermentation de l'acide octanoïque par P. roqueforti est influencée par certains
paramètres dont les principaux sont l'état physiologique, la composition du milieu et
la nature du substrat.
Etat physiologique.
L'état physiologique se manifeste de deux façons : d'une part l'âge des spores au
moment de la récolte (avant fermentation) et d'autre part l'état de développement
physiologique instantané durant la fermentation. Les spores âgées voient leur
capacité à oxyder l'acide octanoïque diminuer en raison de l'augmentation de
l'épaisseur de la paroi sporale qui résulte en une diminution de la perméabilité au
substrat (Kinsella et Hwang.1976b). La performance des spores est liée au stade de
développement physiologique dans lequel se trouve la moisissure. Fan et al. (1976)
ont observé à différentes concentrations d'acide octanoïque le niveau de
méthylcétones formées à différents stades de développement des spores inertes,
24h, 32h, etc. Le résultat de cette étude a montré que ce sont les spores inertes qui
étaient le plus capables de produire des méthylcétones. Cette capacité diminuait à
partir de 24h. Cette diminution est attribuable à une plus complète oxydation de
l'acide octanoique par la haute activité métabolique des spores germées. En outre,
l'augmentation de la concentration en acide octanoïque a révélé que les spores
inertes résistent mieux à son inhibition que les spores germées. Des observations
ultrastructurales au microscope ont montré des changements de l'épaisseur de la
paroi. Les spores germées présentent des parois plus perméables aux acides gras.
Composition du milieu.
La nature du milieu est un facteur important puisqu'il exerce une influence sur
l'activité et la performance des biocatalyseurs. Lawrence (1967) a récolté des
spores et les a suspendu dans du tampon phosphate pH 6.5. il a constaté que ce
lavage a diminué la capacité des spores à oxyder des triglycérides
. L'activité est
fortement augmentée lorsque le milieu est modifié par addition de casaminoacides
et d'acides aminés spécifiques. L'activité d'oxydation a été accompagnée par une
augmentation de l'oxygène consommée. Ces effets activateurs de ces substances
ont été confirmés plus tard par Larroche (1988). L'auteur a utilisé des spores lavées
et stockées à -12 OC pendant 12 à 67 jours. A cette température, les spores ont
manifesté une diminution de leur activité catalytique. Cette dernière est restaurée
lorsque le milieu est additionné de glucose ou d'éthanol. L'effet de ces substances
activatrices est dépendant de la souche et de l'âge des spores. L'importance de
l'oxydation des acides gras en méthylcétones dépend de l'âge des spores
(Larroche,l988) alors que l'étape hydrolytique préalable des triglycérides reste elle
indépendante de cet état physiologique (Lawrence,l966).
La fermentation est généralement conduite dans un milieu simple. Cependant,
certains auteurs (Yagi et a1.,1990a) ont utilisé un milieu riche en solutions minérales
et en vitamines en présence de Penicillium décumbens pour produire des
méthylcétones à partir de l'huile de palme.
Mais l'étude ne permettait pas
d'apprécier l'efficacité l e ce milieu par rapport à un milieu simple.
Le mycélium et les spores sont tous deux capables de synthétiser les
méthylcétones mais les spores jouent un rôle prédominant à la fin de la période de
maturation du fromage (Kinsella et Hwang ,1976b).Les spores présentent en plus
certains avantages liés à la facilité de stockage. En effet, lors de la
biotransformation, les spores résistent mieux au potentiel toxique des acides gras
que le mycélium (Fan et a1.,1976 ) et possèdent une activité de bioconversion trois à
dix fois plus élevée que celle du mycélium en terme de matière sèche (Maheva et
a1 .,1984). La récupération des produits qui en sont issus est plus aisée
contrairement à l'utilisation du mycélium en raison de sa prolifération dans le milieu
de fermentation (Moskowitz ,1979 ). Les spores
peuvent étre utilisées à I'é;at libre ou immobilisées (Larroche et a1.,1989 ) ou
encapsulées (Pannel et Olson ,1991). La qualité des spores est fonction de l'âge
(Lawrence ,1966 ), des conditions de stockage (Larroche et a1 .,1988 ) de culture,
(Larroche et a1 .,1989 ; Gervais et al., 1988), ou de traitements ultérieurs tels que
l'hydratation et la congélation (larroche et al., 1994).
Le pH du milieu influe sur le métabolisme des acides gras, et donc sur la quantité de
méthylcétones formées. Déjà, Lawrence (1968) en utilisant du mycélium a étudié
différentes valeurs de pH en relation avec la consommation de l'oxygène. II a trouvé
que la valeur pH à laquelle l'oxjrgène consommé est maximale, augmente avec la
concentration du substrat. Ces pH optima sont de 5 0 ,
respectivement 1, 3
5 5 et 6,5 pour
et 25 pmoles. II est possible également de changer les
préférences de P. roquefortipour différents précurseurs en baissant la valeur du pH.
C'est ainsi qu'à pH 6,8, la quantité de méthylcétones augmente de 2-butanone à 2octanone . Alors que le phénomène inverse est observé à pH 2,5 (Lawrence,l968).
L'enzyme responsable de la synthèse des méthylcétones, la p-décarboxylase a été
étudiée par Hwang et a1.,1976, en utilisant un extrait cellulaire de mycélium. En
présence de 2 mM d'acide laurique, ils ont trouvé que le pH optimum pour la
conversion en Pundécanone était 6,s-7. Ce dernier correspond également au pH
optimum de l'enzyme observé pour la production des méthylcétones à partir de
i'acide laurique par les spores en germination de P.roqueforti (Kinsella et
Hwang,1976a). La productivité est donc fortement dépendante de l'âge des spores
(Lawrence,l966 ) et du pH du milieu. Avec P.roqueforti, le pH optimal pour la
production des méthylcétones se situe entre 5 et 7(Kinsella et Hwang,1976b). Des
pH plus bas sont défavorables et la concentration de l'acide dans le milieu s'est
avéré être un important paramètre de la fermentation.
Nature du substrat
L'importance de la nature et de la taille de I'acide gras se manifeste en particulier au
niveau de la sélectivité. Celle-ci change en fonction de la souche et de l'espèce de
moisissure. L'acide hexanoïque est le substrat préféré par Monascus purpureus à
des concentrations de 1,O et 1 3 mM (Kranz et a1.,1992). Au contraire, en présence
de P. roqueforti, l'acide octanoique est le plus utilisé alors que l'acide hexanoique
l'est moins (Lawrence,l968). Mais lorsque ce même substrat est présenté en
mélange avec d'autres acides gras, il y a un changement de préférence. En oütre,
lorsque I'acide décanoique (1 mM) est en présence de différentes concentrations
d'acide octanoique, il y a formation exclusive de 2-nonanone. II a été suggéré une
inhibition de I'acide octanoique lors de la synthèse de 2-nonanone suivant la
concentration de I'acide octanoïque. La forte réactivité pour l'acide octanoique a
aussi été démontrée avec P.caseicolum où la 2-heptanone est également le
principal produit de la fermentation lorsque les acide octanoïque et décanoïque ont
été ajoutés séparément aux cultures (Lamberet,l982). Cette réactivité est fonction
du poids moléculaire. La vitesse de conversion diminue avec l'augmentation du
poids moléculaire (Kinderlerer,l987). Cependant l'utilisation de P.decumbens
IF07091 par Yagi (1990a) avec 1% d'huile de palme et à pH 8,2 a montré que c'est
l'acide laurique qui présentait le meilleur taux de conversion avec un rendement de
46,4% après 7 jours de culture.
CH -(C&)a-COSCOA+ H
FAD
2l
mm
Hexanoyl coA +
CHI- (C&)a-CH=CH-COScOA
I
1
-
AcetylcoA
CHI (C&)a -CHOH-CH-COSCOA
CHI- (C&)a-CO-CE-COScOA
CoAsH+ CH- (CIE)4 -CO-CB-COOH
I
.
.
a
.
.
-
f
2AcethylcoA
Cycle de Krebs
+
-----.---.-------.---.-..--.....
--------.-----------*
1
Figure 1. Biosynthèse de I'hepanone à partir de
0 2
l'acide octanoïque selca (Larroche, 1994; Kinsella, 1976; Knight, 1966)
2. Matériel et Méthodes
2.1.Choix du matériel bioloaiaue.
L'étude a porté sur des souches de Pénid!!um
roqueforti fournies sous forme
lyohilisée par l'institut Rosell de Montréal (QC, Csnada). Les essais ont été réalisés
sur les spores.
1-1)Préparation du milieu de culture.
Les spores sont cultivées sur Potato-Dextrose-Agar (PDA) en présence de 203.94 g
de glycéro1~1000g d'eau pour obtenir un meilleur milieu de sporulation ( Gervais et
al., 1988) et de maintenir l'activité des cellules lors de leur stockage. L'activité de
l'eau (Aw=0,96) est contrôlée par un appareil Novasina (NovasinaAG CH.8050
ZüricNSuisse).
Le milieu est stérilisé à 121°C, 20 min et 5 mL du milieu est versé dans chaque
boite de pétri.
1-2)Culture de spores.
Des essais préliminaires ont montré que le meilleur mélange pour obtenir une
meilleure sporulation était de 0.3 g de poudre de spores avec 70 mL d'eau stérile.
lnocculation de 4 à 5 mL du mélange dans chaque boîte de pétri. Après incubation
de 7 jours à température ambiante, les souches peuvent être stockées au
réfrigérateur à 4°C ou utilisées immédiatement.
1-3)Numérotation des spores
20 ml de solution Tween 80 à 1% sont ajoutés dans chaque boîte pour enlever les
spores. Après agitation modérée pour disperser les spores, ces derniers sont
récupérés à l'aide d'une anse de platine dans les conditions stériles. Les spores
retenues sur le filtre sont lavées 2 fois avec de l'eau distillée. La suspension est
ajustée à 10' spores/ml à l'aide d'un hématocymètre.
2.2.Choix des conditions exr~érimentales
2.2.1 .Études sur les conditions de production des méthylcétones (chapitrel)
L'étude des conditions de fermentation a été réalisée dans des vials en verre de
10 ml dans un agitateur thermostate (Lab-Line Orbit Environ-Shaker, Melrose Park,
USA). Cette étude permet de sélectionner les conditions optimales d'utilisation de
substrat, de durée et de milieu réactionnel pour la fermentation.
Les acides gras utilisés (acides hexanoïque, octanoïque et décanoïque) ont été
obtenus d'Aldrich (Milwauke, WI,USA) et les concentrations initiales ont été de 32
à 108 ppm. Le milieu réactionnel a été modifié ou non par addition de substances
énergétiques telles que le glucose à 1 mg/mL, alanine à 0,5 mg/mL et éthanol à 2
pVmL (Larroche et a1.,1988) et de I'hydrolysat de caséine à 0,lglmL (king et
Clegg.1980). De l'acide malonique à 0,001 g/L (inhibiteur de la succinate
déshydrogenase) a été utilisé pour vérifier l'hypothèse du fonctionnement du cycle
de Krebs durant la fermentation.
Le milieu a été additionné avec du tampon phosphate à pH 7. Toute fois dans les
conditions où l'acide
octanoïque est fourni sous ia forme de sel, des études
préliminaires ont mcntré dans ce cas que le tampon phosphate peut ne pas être
utilisé.
Les paramètres choisis ont été une température de 28 OC (Yagi et a1.,1990a), la
durée variant de 0.5 à 48 h. Après un minimum de trois expériences préliminaires, la
durée de la fermentation a été fixée de 1 à 16 h.
Bioréacteur
Le bioréacteur est un via1 en verre de 10 mL. II est fermé par un bouchon en raison
de la volatilité des méthylcétones et des acides gras.
Oxvdation des acides en méthvlcétones.
La capacité relative des spores à utiliser les acides gras est comparé en utilisant
des spores de même âge. Une quantité de 0,25 mL de chaque acide a été ajouté
avec une suspension donnée de spores. Le volume réactionnel a été ajusté à 8 mL.
A différents intervalles de temps, les échantillons sont enlevés de l'incubateur pour
la détermination des méthylcétones. Cette méthode a permis
de sélectionner les acides gras qui sont mieux utilisés par les spores. Le protocole
est poursuivi pour sélectionner la meilleure concentration d'acide gras, parmi celles
qui ont été utilisées ( 32 à 108 ppm).
Détermination des méthvlcétones.
-Extraction des méthylcétones et des acides gras libres.
Le milieu de fermentation a été acidifié avec de l'acide chlorhydrique afin d'extraire
les acides gras n'ayant pas réagi. Une quantité de standard interne (20 p l ) de
méthylcétones (200 PL d'acide haptanoïque,2-octanone et Poctanol 1100 ml
d'hexane) a été ajoutée. Après avoir vortexé l'échantillon, les acides gras libres
ainsi que les méthylcétones ont été extraits avec 5 mL d'hexane en trois étapes .
Puis le milieu a été séché avec du sulfate de sodium anhydre et filtré avant
analyse.
Quantification des méthylcétones et des acides gras libres.
L'extrait placé dans des vials a été utilisé pour l'identification en présence de
solutions standards externes de mélange d'acides gras (butanoïque, hexanoique,
heptanoïque, octanoïque, décanoïque et undécanoïque ), d'alcools (Bpropanol, 2butanol, 2-pentanol, 2-heptanol, Poctanol, 2-nonanol et Bundecanol )
et de
méthylcétones
et
(2-butanone, Pheptanone, Bnonanone, 2-octanone
2-
undécanone).
Dosage des methylcétones.
Les méthylcétones provenant de la phase organique ont été dosées par
chromatographie en phase gazeuse. L'appzeil est un chromatographe 5890A
Hewlett Packard (Palo Alko CA, USA) muni d'un détecteur à ionisation de flamme et
équipée d'une colonne FFAP (acide nitrotéréphtalique) d'une longueur de 25m,
d'un diamètre inteme de 0,20 mm et d'une épaisseur de film de 0,33 ym.
Les températures de l'injecteur, du détecteur et du four ont été de 240 OC. La
pression du gaz vecteur, l'hydrogene, est de 55 KPa (8psi) , les débit de l'air et de
l'hydrogene (pour la flamme ) étaient respectivement de 400 et de 40mVmin. Le
programme de température utilisé était le suivant: température initiale ,32 OC,
durée 4min; taux de chauffe : 4min. 60 "C/min; température finale 220°C; durée
finale, 25min.
L'acide heptanoique, la 2-octanone et le 2-octanol ont été utilisés comme standards
interne pcr: évaluer respectivement l'acide octanoique utilisé et non transformé, le
2-heptanone et le Pheptanol. Les temps de rétention des échantillons ont été
comparés avec ceux des standards.
Analyse statistique
Le logiciel statistique
-
statistical Analysis system 11 (SAS institute, Inc) était utilisé
pour l'analyse des effets des différents activateurs sur la production des
méthylcétones par les spores. Pour chaque activateur utilisé (glucose, alanine,
éthanol, hydrolysat de caséine), 3 répétitions ont été effectuées. Afin d'éliminer
toute source de variation autre que les effets à étudier, l'expérience est réalisée au
même moment avec les mêmes spores. Pour chaque composé, l'ensemble des
données était au préalable soumise à une analyse de variance afin de déterminer
s'il existe des différences significatives entre les traitements. C'est ainsi que le mode
PROC.GLM de SAS a été utilisé. Par la suite, des comparaisons simples entre
activateurs ont été effectuées par l'analyse des contrastes . Les test de différences
significatives sont évalués.
Dosage des acides aminés
On a mesuré l'utilisation des acides aminés libres de I'hydrolysat de caséine par la
chromatographie gazeuse après dérivation par du MTBSTFA (Méthylterbutyl
si/yItrifluoroacetamide). La méthode d'analyse des acides aminés consistait à
transformer ces derniers en molécules volatiles pour l'analyse en phase gazeuse.
Un mélange d'acides aminés AA-S-18 (obtenu de Sigma, St louis, MO, USA) à 2.5
ymoledmL dissous dans 0.1 N HCI a été utilisé pour préparer une courbe standard
en présence d'un standard inteme (Norleucine). Le tout est évaporé sous vide. Le
mélange évaporé a été mélangé avec 1 mL de DMF (Dimethyl Formamide) et 200
pL de MTBSTFA puis chauffé à 60 "C pendant 1 h. Après refroidissement du
mélange, 200 pL de chloroforme ont été additionnés.
Les échantillons prélevés à 4, 8, 12 et 16 h de la fermentation ont été utilisés pour
analyser la consommation des acides aminés libres provenant de i'hydrolysat de
caséine. Après que les échantillons eurent été lyophilisés, la même quantité de
standard interne de norleucine a été ajoutée (0.0016g) dans chaque échantillon
avec 1mL de DMF et 200 pL de MTBSTFA puis chauffé à 60 "C pendant 1 h. Le
tout a été filtré et 200 pL de chloroforme ont été ajoutés avant i'analyse.
L'appareil est un chromatographe 5890A Hewlett Packard (Palo Alko, CA, USA)
muni d'un détecteur à ionisation de flamme et équipée d'une colonne de 25 m (le
revêtement interne est constitué de 95% de méthyl et de 5% de phénylsilicone), de
diamètre inteme de 0,25 mm et d'une épaisseur de film de 0,1 pm. L'analyse au GC
a été faite à l'aide d'une chambre silylée par deux ou trois injections du témoin de
départ. La silylation consiste à injecter automatiquement un derivé silylé dans la
chambre du GC. Les conditions d'opération du GC ont été les suivantes: gaz
porteur : HZ,50KPa. Split Vent : 50ml. température initiale : 100 "C .Temps initial :2
min, 10°C Imin, Température finale 300 OC, Durée finale :14 min.
2.2.2. Étude sur l'importance de la fermentation dans un milieu à deux phases
(chapitre 2).
L'étude de la fermentation des acides gras par P. roqueforti a été conduite en
présence d'un solvant organique, I'hexane. L'importance de celui-ci a été apprécié
en examinant les rendements de transformation en absence et en présence
d'hexane. Durant les fermentations, le rôle de i'oxygène a été également étudié.
Figure 2. Schéma de l'installation du fermenteur.
L'efficacité de I'hexane a été apprécié en comparant les fermentations dans des
différentes conditions de température (20 O, 24 "et 28 OC), de durée ( 1 à 16 h). De
I'hydrolysat de caséine (0,1 ou 0,049 /ml) a été ajouté au milieu en présence de
chloramphénicol.
Le bioréacteur utilisé a été soit des vials de 10 ml ou un fermenteur de 1,25L. Outre
le matériel précédemment décrit nécessaire pour des expériences préliminaires afin
d'apprécier le suivi et le milieu de la fermentation, le système a nécessité en plus
un appareillage permettant de mesurer la quantité d'oxygène dissous, le pH ainsi
que le soutirage. Nous avons utilisé un fermenteur en Teflon de 1,25 L. II était
équipé d'un agitateur magnétique,
d'une sonde de température permettant
d'assurer la régulation thermique au moyen d'un boîtier électronique; d'une
électrode de pH (sonde Cole-Parmer AgIKcl, Chicago, II, USA) qui permet de suivre
l'évolution du pH; d'une sonde à oxygène (sonde galvanique. compagnie NSS
Brunswick ,NJ, USA) préalablement calibrée et qui permet de suivre en temps réel
l'évolution de l'oxygène dissous; et d'un tubulaire latéral en silicone permettant le
soutirage du milieu de fermentation.
Conduite des fermentations et acquisition des données
Le volume réactionnel de la fermentation en discontinu (Fermenteur de1,25 L en
Teflon) a été de 500 mL avec 20% d'inoculum et 12% de solvant (hexane). Le milieu
a été stérilisé par addition de 0,35 g/L de chloramphénicol . Le chloramphénicol qui
n'a pas un effet sur la transformation (Larroche,l988) est utilisé pour prévenir les
contaminations bactériennes en particulier pour des durées dépassant 24 heures.
La fermentation a été effectuée en discontinu pour une concentration initiale de 54
ppm (0,32 mM), 5mM et 20mM pendant O à 50 h. Des échantillons de 20 mL sont
prélevés tous les 4 h pour la détermination du poids sec, des méthylcétones et des
acides aminés.
Dès que le fermenteur a été ensemencé, une acquisition des données en temps
réel est effectué par micro-ordinateur, ce qui a permis un suivi automatique de
certains paramètres de la fermentation (pH, oxygène dissous).
Analyses.
Détermination du poids sec.
Après centrifugation, la phase organique a été extraite avec de I'hexane (3 x 2 ml).
Après lavage avec de i'eau, le culot a été filtré avec un filtre type DA de 0,65 Pm.
Le filtre a été séché à 80 OC sous vide pendant 24 h. II a été ensuite transféré dans
un dessiccateur une demi journée avant pesée. Le poids sec des spores est
déterminé par la différence avec le poids du filtre.
2.2.3- Etude de l'effet du CO2 sur la fermentation de l'acide octanoïque
en culture fed-batch dans un milieu octane-eau (chapitre3)
Le mélange de spores et d'hydrolysat de caséine a été incubé dans le fermenteur
tandis que le substrat (acide octanoïque) a été dissous dans un erlenmeyer
contenant de l'octane (5 g1100 mL d'octane). Le pH a été maintenu constant à 6,s
.
Le substrat a été alimenté régulièrement selon un débit contrôlé par le programme
de l'ordinateur (25 mL tous les 4h)
L'essentiel de l'équipement employé a été le même que celui utilisé dans le chapitre
2.
Le reste constituait d'un système d'alimentation du substrat par l'intermédiaire
d'une électrovanne qui maintient un début régulier grâce à un programme
d'ordinateur; d'un tubulaire latérale en silicone permettant le soutirage du milieu de
fermentation; d'une sonde à oxygène; et d'une bonbonne de gaz carbonique. Le
CO2 était mélangé avec de l'air pour donner des pourcentages de 5, 15, et 30% de
CO2. Le tout était assuré par un débitmètre. La régulation du pH a été assurée par
l'addition d'un volume de NaOH 2 N par l'intermédiaire d'une électrovanne et d'une
pompe à air. L'électrovanne s'ouvrait et injectait une quantité de NaOH pour amener
le pH à sa valeur de consigne (6,s).
3. Résultats et Discussion
Dans ce chapitre, I'hexane est utilisée durant la fermentation mais son rôle est
rapporté au 2m"chapitre.
3.l.lnfluence de la concentration en spores
Le rendement en heptanone a été déterminé après 16 h de fermentation
en
utilisant différentes concentrations d'acide octanoïque. La capacité d'oxydation est
reliée à la concentration de spores. Le tableau 1 montre les résultats obtenus dans
un milieu où la concentration en spores initiale de 2,4x10i ImL a été diluée pour
avoir des concentrations de I O 7 à
10' /mL. Ces résultats montrent que des
concentrations inférieures à I O 6 ImL ne sont pas susceptibles d'oxyder I'acide
octanoïque du moins durant le temps de l'expérience. Bien que le taux de synthèse
de I'heptanone n'est pas linéairement dépendant du contenu en spores du milieu,
Larroche et al. (1994) ont montré que les conditions optimales sont celles où le
contenu en spores est plus haut que 106/mL.Ce phénomène pourrait être relié au
potetitiel de germination (Barrios-Gonzalez et al., 1989). L'auteur a mesuré le
pourcentage de germination des spores de Aspergillus niger corrélé avec la
concentration des spores après 12 h. Ce pourcentage est maximal lorsque la
concentration en spores est égale ou moins que I O 6 ImL. Or lorsque les cellules
commencent à germer, la résistance au potentiel toxique des acides gras diminue.
3.2.Nature et composition du milieu de fermentation.
3.2.l.lnfluence de la nature du substrat
L'influence de la nature du substrat sur les rendements en méthylcétones a été
évaluée pour les acides caproique (C 6), caprylique (C8 ) et caprique (Cl0 ).Les
rendements en quantité de méthylcétones produites pour chaque série d'acide
montrent que la nature de l'acide gras influe sur le niveau de transformation et de
production des composés carbonylés. Les résultats sont exprimés sur la
figure 3.
Les trois substrats sélectionnés réagissent différemment vis à vis des réactifs (
spores) et de leurs enzymes qui convertissent les acides gras en méthylcétones.
Trente huit pour cent de l'acide C l 0 ont été utilisés contre 7% pour le C6 et 2% pour
le C8. Les méthylcétones isolées par rapport aux acides transformés sont de 38%
pour le C8, moins de 2% pour le C l 0 et nul pour le C 6.
L'acide octanoïque est le substrat préféré par les spores de
P. roqueforti pour
produire les méthylcetones. Ce résultat est conforme à celui de
Lawrence et
Hwake (1968), Dwivedi et Kinsella ( 1974) et Kinsella et Hwang ( 1976b)
.
Cette
préférence est cependant dépendante de la souche et de la présence ou non d'un
mélange d'autres acides gras.
Dans une étude récente, Kranz et al. (1992)
trouvent que Monascus purpureus métabolise mieux l'acide hexanoique que les
autres acides gras lorsque ceux-ci sont fournis individuellement aux spores. En
présence de l'acide decanoique, le micro-organisme utilise préférentiellement
l'acide octanoïque. II ressort de ces résultats que l'influence de l'acide gras
précurseur sur l'activité métabolique est différente suivant que ce dernier est seul
ou en mélange. L'inefficacité de l'utilisation de l'acide décanoïque s'explique par sa
toxicité en raison de son hydrophobicité beaucoup plus importante (Viegas et al.
1989 ). Cette hydrophobicicité peut s'exercer négativement au niveau des
membranes.
3.2.2. Influence de la concentration en substrat
L'influence de la concentration en substrat a été appréciée en utilisant des
concentrations allant de 10 à 64 ppm pour deux niveaux de concentrations en
spores. La figure 4 montre que le rendement optimal est de 40% pour le niveau bas
en spores et de 50% pour le niveau haut. La multiplication par 33 de la
concentration er. spores permet d'augmenter de 10% le rendement en heptanone.
3.2.3. Effet de l'utilisation de I'acide octanoïque et du sel de son sodium pour la
production d'heptanone.
Un autre aspect important de la fermentation de I'acide octanoïque conceme les
conditions physico-chimiques du substrat favorables au biocatalyseur.
Ces conditions sont celles qui contrôlent la pénétration de I'acide octanoïque vers
l'intérieur des spores. Le substrat est ajouté au milieu soit sous forme d'acide soit
sous forme de son sel de sodium. La figure 5 montre que le rendement demeure
presque le mëme dans la plage de concentration étudiée (32 à 81 ppm) lorsque
I'acide libre est utilisé comme substrat. Les résultats obtenus ( figure 6) sont
comparés à ceux des figure 4 et 5 en ce qui conceme les concentrations en substrat
et la nature du substrat (acide libre et sel de sodium) . Ces résultats montrent que le
sel d'acide présente un effet favorable à la synthèse des méthylcétones par les
spores. La capacité des spores de P.roqueforti à métaboliser I'octanoate de sodium
est augmentée comparativement aux acides gras libres (figure 6). Les données
montrent que des niveaux de concentration élevés de sel d'acide peuvent être
utilisés par les spores. L'incubation des spores avec des concentrations allant de
32 à 81 pprn d'acide libre ne peuvent pas produire des quantités significatives de
méthylcétones. Le rendement maximal obtenu dans ces conditions est de 30%
lorsque 43 pprn d'acide gras libre ont été incubés. La figure 6 mcntre que les
spores peuvent métaboliser des quantités élevées d'octanaoate allant jusqu'à 90
pprn avec des hauts rendements de 72%. Nous remarquons également que des
rendements de 90% sont atteints lorsque 49 pprn de sel sont utilisés contre 30%
lorsque 43 pprn d'acide libre ont été incubés. De plus, les 30% de rendement sont
atteints en 6h lorsque le sel est utilisé alors qu'il faut attendre 16h avec I'acide libre
pour obtenir ce même rendement. L'utilisation du sel d'acide octanoique au lieu de
l'acide neutre affecte positivement l'activité des spores et permet la production de
I'heptanone à des concentrations élevées par rapport à celles observées avec
l'acide lui même.
II ressort de ces résultats qu'une des
conditions essentielles qui favorise la
production des methylcetones est celle qui contrôle la vitesse de pénétration du
substrat. Les résultats obtenus avec des spores libres (Yagi et a1.,1990a) ou
avec des spores immobilisées (larroche et a1.,1989) ont suggéré que la vitesse de la
réaction ne dépend pas de la concentration résiduelle du milieu mais limitée par la
concentration inteme du substrat etlou par sa vitesse de pénétration dans les
spores. Or les acides gras entrent dans les cellules sous forme protonnée
(Larroche et al.,1996 ; Hatton et a1.,1991; Freese et aL.1973 ; Harold et a1.,1970).
Ils se dissocient dans la cellule , causent une acidification du contenu cellulaire en
raison de leur faible pKa (4.8) (Ameborg et a1.,1995) et une inhibition des enzymes
respiratoires (Harold et a1 .,1970). En outre, il est connu que les effets inhibiteurs
primaires des composés toxiques sur les cellules fongiques se produit après qu'ils
ont pénétré dans la cellule. La présence du groupe carboxylique est donc
mportante pour l'activité fongicide (Freese et al., 1973), donc responsable de la
toxicité.
La conclusion qui se dégage de ces résultats est que le contrôle ou la limitation de
la diffusion intrasporale est un moyen d'améliorer la productivité. Ce contrôle se fait
dans le milieu de fermentation en foumissant le substrat non sous la forme d'acide
libre mais sous forme de son sel de sodium.
3.2.4. Effet de l'utilisation des activateurs et des inhibiteurs
On définit un activateur comme une substance chimique qui stimule le transport
des acides gras à l'intérieur des spores. Elle est également supposée activer le
cycle de Krebs en particulier des cellules âgées (Larroche,l988 ) pour fournir
l'énergie nécessaire à leurs enzymes qui utilisent l'acide gras en méthylcétones. En
tant que source d'énergie, les activateurs influent sur l'activation des spores pour
dépasser le stade de la dormance (Lawrence, 1965). Ils induisent des
transformations physiologiques pour passer d'une
basse à une haute activité
métabolique avec une augmentation de la quantité d'oxygène consommée par les
spores.
L'influence des activateurs sur l'évolution de I'heptanone (tableau 2 et figure 7)
a été appréciée sous trois hautes concentrations d'octanoate de sodium pour les
spores. L'analyse de variance indique qu'au moins un des activateurs utilisés dans
l'expérience de fermentation fait varier le rendement en heptanone à 16 h avec un
effet hautement significatif (p>F=0.009). Et 86% des sources de variation durant
l'expérience est explicable par les différences entre les différents activateurs. Le
coefficient de variation indique que la dispersion des données autour de la moyenne
est inférieure à 25% . La figure 5 montre que le rendement pour le témoin passe de
42% à 34% lorsque la concentration en substrat augmente de 54 à 108 ppm. Ceci
en raison du fait que les spores ont atteint leur limite du taux de transformation.
Alanine
Bien que légèrement élevé au départ par rapport au témoin, le rendement avec
I'alanine décroit de 45 % à 25% (figure 7). Le niveau d'utilisation du substrat
diminue, passant de 64% à 47% lorsque la concentration d'acide augmente de 54 à
108 ppm (tableau 2). L'efficacité (quantité de produit formélquantité de substrat
utilisée) diminue également. Ces résultats montrent que i'alanine ne stimule pas la
production de i'heptanone soit en raison de sa faible concentration par rapport à
celle du substr~:(Lawrence et Bailey,1970), soit
en raison de l'âge des spores
(Larroche et a1.,1988). En présence de 5 pmolesImL d'acide octanoïque, i'effet
activateur de I'alanine se manifestait sur des spores lavés et stockés pour 67 jours à
-20 OC dmnant un reridement en méthylcétones de 70% (Larroche et aL.1988).
Dans une étude récente. Creuly et al. (1992) examinaient i'effet de I'alanine sur le
comportement des spores cultivés sur une variété de sarrasin pendant la
fermentation de trois acides gras. En étudiant la vitesse de consommation du
substrat, il trouve que I'alanine a une influence négative pour i'acide octanoïque et
positive pour les acide hexanoïque et decanoïque. Le résultat obtenu lors de notre
expérience le confirme même si la fermentation s'est déroulée dans un autre milieu,
c'est à dire en présence d'hexane. L'alanine est aussi connue être une initiatrice de
la germination des spores de P.roqueforti (Kinsella et al., 1976b) et contribue ainsi
à l'augmentation de la perméabilité membranaire et à l'activité métabolique des
spores (Fan et aL.1976). Durant cette période, l'entrée des acides gras est plus
importante et leur toxicité pour des spores est augmentée.
Glucose
Pour ce qui est du glucose, le rendement est un peu élevé au départ (44%) puis
diminue au fur et à mesure qu'on augmente la concentration en substrat. L'analyse
de variance indique que l'effet du glucose n'est pas significatif (p>F=0.475) (tableau
3). A des concentrations d'acide élevées (72 et 108 ppm), le glucose exerce une
influence sur l'utilisation de l'acide sans que toute fois que cela améliore le
rendement (tableau 2). Ainsi l'efficacité diminue. II est possible que cette quantité
d'acide soit utilisée pour faire de l'énergie ou simplement incorporée dans les
membranes (Larroche, 1996). Les spores jeunes ou inertes ne requièrent pas l'effet
des agents stimulants tels que le glucose et l'alanine (Larroche et a1.,1988). C'est
ainsi que la fermentation de 5 pmolesimL par des spores stockés pour 12 jours à 20 OC donnait un rendement de transformationde 87% à 30 h (Larroche et aL.1988). Alors
que le glucose est reporté être l'activateur commun pour les spores de P. roqueforti,
il est possible qu'il montre simplement un effet négatif pour la souche utilisée dans
l'expérience (Lawrence et Bailey, 1970).
~thanol
L'effet de l'éthanol
a été étudié à une concentration relevant de la littérature
(Larroche,l988 ). La figure 7 montre que la production de l'heptanone passe de
33% à un maximum de 48% lorsque la concentration en octanoate augmente de 54
à 72 ppm. Ensuite le rendement en heptanone diminue lorsque la concentration en
substrat est supérieure à 72 ppm, en particulier à 108 ppm. Et lorsque la
concentration d'octanoate augmente, la quantité d'acide utilisée par les spores
augmente également de 50 à 6O%.(tableau 2)
A 72 ppm, l'effet activateur de l'éthanol sur les spores jeunes pourrait être le résultat
d'une perméabilisation de la membrane (Lawrence et Bailey, 1970). L'augmentation
de la quantité d'acide utilisée serait le résultat d'une forte entée du substrat à
l'intérieur des spores en présence d'éthanol. Cependant. I'effet inhibiteur de l'acide
octanoique peut être accru lorsque celui-ci est en association avec I'ethanol
(Viegas et al.. 1989). Le faible rendement en méthylcétones observé à 54 ppm est
donc la révélation toxique de l'éthanol qui défavorise la production de I'heptanone.
A une forte concentration de 108 ppm, la productivité en heptanone est faible.
L'acide solubilisé par l'éthanol révèle une haute toxicité pour les spores à cette
concentration.
Hvdrolvsat de caséine
L'hydrolysat de caséine est un mélange d'acide aminés et de peptides dérivés du
lait. La quantité de méthylcétones produite en présence d'hydrolysat de caséine est
présentée à la figure 5. Le tableau 2 montre également le niveau d'utilisation de
I'acide octanoïque en présence de I'hydrolysat de caséine. Celui-ci est utilisé à une
concentration de 0,l glmL (King et a1.,1980). L'analyse de variance indique que
I'hydrolysat de caséine présente un effet hautement significatif sur le rendement en
heptanone (tableau 3).
Avec les trois concentrations d'acides présentées, le substrat est totalement
transformé même aux concentrations pour lesquelles la répression catabolique vis-
à -vis des spores a été manifestée (108 ppm). L'utilisation de l'hydrolysat de
caséine à cette concentration (O.lg /mL) développe une pression osmotique exteme
plus importante qui favorise la perméabilité des spores au substrat. Les rendements
sont nettement élevés de 83,5% à 54 ppm d'octanoate et 80,5% pour 108 ppm.
L'effet positif de l'hydrolysat de caséine sur le métabolisme de l'acide octanoïque
provient de son potentiel nutritif
pour les spores de P. roqueforti. En effet,
I'hydrolysat de caséine est un mélange de peptides et d'acides aminés. II est riche
en acide aminés tels que l'acide glutamique et l'acide aspartique. Ces deux acides
aminés, contrairement à l'alanine, que les spores des moisissures pourraient mal
utiliser, peuvent être rapidement métabolisés en s'incorporant dans le cycle de
Krebs (Lawrence et Bailey, 1970).
Une autre explication viendrait de l'effet tampon que les acides aminés pourraient
exercer sur le milieu et réguler ainsi la délivrance du substrat aux spores et en
maintenant un pH intracellulaire compatible avec les exigences métaboliques. Cet
effet tampon est renfmé par la présence de peptides qui forment avec les acides
gras des complexes l< sel
2.
. Dans ce cas, le complexe formé entre I'octanoate et
les groupements aminés des acides aminés et des peptides est plus soluble.
Acide maloniaue
L'utilisation de l'acide malonique ( 0,001 g/L) a montré une inhibition totale de la
consommation du substrat. Ce résultat semble montrer i'inhibition du cycle de
Krebs. Cependant, mime si les expériences ont été répétés trois fois pour chaque
traitement afin de confirmer l'hypothèse du blocage du cycle de Krebs, il faudra
mesurer le niveau des composés du cycle de Krebs, la consommation d'oxygène
ainsi qu'à
varier les différents paramètres (concentration inhibiteur, aération.
agitation, etc).
3.2.5.Utilisation des acides aminés
Les acides aminés de I'hydrolysat de caséine constituent une fraction importante du
lait et du fromage (Polychroniadou et al., 1979). Les moisissures utilisent une
variété de composés organiques incluant les acides aminés.lls constituent une
source importante nutritive pour leur métabolisme (Lawrence et Bailey, 1970) et
stimulent la germination des spores de Penicillium roqueforti (Lau-once, 1967).
L'influence d'un hydrolysat de caséine sur la fermentation des acides gras en
heptanone a été démontrée comme jouant un rôle nutritif pour P. roqueforti (King
et a1.,1980 ).
L'expérience présente est réalisée pendant une période limitée de non croissance
(16h) et I'influence de I'hydrolysat de caséine sur la croissance est jugée
négligeable. Pans une expérience précédente (figure 7), I'effet de I'hydrolysat de
caséine sur la production en méthylcetones a été démontrée. Cependant durant la
fermentation de i'ocatanoate de sodium, le pH reste constant. Ce qui nous amène à
se demander si les acides aminés libres sont consommés, auquel cas le pH d~?vrait
en principe augmenter.
Ce travail consiste à évaluer l'utilisation de certains acides aminés du mélange
pendant la fermentation. II cherche également à déterminer la nature des composés
qui jouent le rôle majeur durant la consommation de I'acide octanoïque.
L'assimilation des acides aminés du mélange durant la fermentation est illustrée sur
la figure 8. L'analyse cinétique de ces acides aminés a été faite par
chromatographie en phase gazeuse après dérivation et silylation des acides aminés
L'acide aminé majoritaire détecté dans ce mélange est I'acide glutamique avec 0,11
mglmL. Les autres acides aminés
tels que alanine, tyrosine, phenylalanine,
histidine et autres sont en quantités mineures. Les acides aminés ne sont pas tous
représentés .
Le profil (figure 8) montre trois catégories d'utilisation des acides aminés: les
acides aminés qui sont immédiatement consommés (acides glutamique et
aspartique ), les acides aminés qui sont utilisés après un temps de latence (
tyrosine, phénylalanine et les acides aminés qui sont peu consommées (alanine et
histidine ).
La diminution des acides aminés est due à la consommation par les spores. La
vitesse de consommation reliée aux différents acides aminés suggère un degré de
sélectivité pour les acide glutamique et aspartique. La diminution plus rapide de
0,11 à 0,01 mglmL pour I'acide glutamique et de 0,037 à 0,0058 mg/mL pour I'acide
aspartique indique une utilisation préférentielle du système perméase pour ces
acides aminés. Les acides aminés tels que tyrosine, phénylalanine et histidine ne
sont pas consommés dès les premières heures. Un temps de latence de 4 h est
nécessaire avant que les perméases soient mobilisés. La cinétique de ces acides
aminés aromatiques indique que leur diffusion peut contribuer à la production
d'énergie nécessaire pour la dégradation de I'acide octanoïque.
En général, le transport des acides aminés vers l'intérieur des cellules se fait par
diffusion facilitée. Ce mode de transport est imposé par la présence d'un gradient de
pH dû à la présence d'un milieu extérieur plus concentré en ions H' que le milieu
intérieur. Ce gradient de pH est généré lors de l'oxydation des molécules NADH au
niveau de la chaîne respiratoire à la suite de la dégradation de l'acide octanoïque en
acétylcoA. Les ions H' produits migrent de la chaîne respiratoire vers l'extérieur de
la cellule et créent le gradient de pH. Des études réalisées sur Streptococcus lactis
ont montré la relation entre la vitesse de transport de glutamate et du pH interne
(Driessen et al., 1987 ; Poolman et al., 1987).
Dans notre cas, ce gradient est annule par l'existance d'un pH extérieur plus élevé.
La vitesse de consommation des acides aminés demeure ainsi indépendante du
gradient du pH
.
Elle apparaît probablement
reliée au degré d'affinité des
différentes perméases par rapport à la nature et à la concentration de ces acides
aminés.
L'utilisation rapide de ces aciaes aminés suggère la possibilita que les transporteurs
spécifiques soient induits lors de la culture des spores. Ces derniers sont cultivés et
se multiplient sur du PDA (Potato-Dextrose-Agar), riche en acide glutamique et
aspartique par rapport aux autres acides aminés. Les proportions des acides
aminés dans la pomme de terre par mg d'acide aminé1 100 g de matière sèche de
tubercule sont de 162 à 212 mg pour I'acide aspartique, 345 mg pour l'acide
glutamique, 19 à 45 mg pour l'alanine, 174 à 316 mg pour la tyrosine, 91 à 204 mg
pour la phénylalanine et 71 à 239 mg pour l'histidine (Davies, 1977 ). Des
transporteurs peuvent donc être induits plus que d'autres. Cette hypothèse peut être
vérifiée en cultivant les :;ores
sur du PDA en présence d'hydrolysat de caséine et
en regardant de nouveau le profil d'utilisation des acides aminés.
L'autre possibilité vient de l'induction de ces transporteurs en raison de la richesse
en acides aminés. L'hydrolysat de caséine présente des concentrations différentes
en acides aminés, ce qui influe sur les constantes d'affinités des transporteurs vis-àvis d'acides aminés plus que d'autres.Pour vérifier cette hypothèse, la fermentation
devra être conduite en présence d'acides aminés individuels de même
concentration et vérifier le nouveau profil d'utilisation.
Enfin, les acides glutamiques et aspartiques sont métabolisés directement au
niveau du cycle de Krebs par la voie de I'oxaloacétate et de l'alphacétoglutaraie en
utilisant les molécules de NAD disponibles. Ce qui représente un intérêt pour les
spores de se fournir rapidement de l'énergie. L'alanine
et l'histidine sont au
contraire peu consommés. Cette consommation est inactivée par la présence d'un
haut pH interne qui inactive le transport de l'alanine dont le pK apparent est de 7
(Driessen et al., 1987) . Ce résultat confirme celui observé à la figure 7 et pour
lequel l'alanine ne présente pas un effet significatif sur la production en
rnéthylcétones lorsque les spores sont inertes.
Tableau 1. Effet de la concentration en spores sur le rendement en heptanonea
I Concentration I
Rendement en heptanone (9)
de spores/ mL
Concentration d'acide (pprn)
l
" 1mL hexane, 1 mL Tampon phosphate pH 6,8,16 h ,28 O C , volume total=8mL.
Tableau 2. Effet (%) des activateurs sur la transformation de l'acide gras
Octanoate de sodium (ppm)
Activateur(%)
54
72
1
1 08
1
Rendement (%)
Témoin
Glucose
Ethanol
Alanine
Hydrolysat de
Caséine
Acide malonique
Rendement (%)= Méthylcétone formé /Acide de départ.
IT(%)=indice de transport=Acide transformé1Acide de départ
IE (%)=indice d'efficacité= Méthylcétone formé1Acide transformé.
.
Tableau 3 Analyse de variance : Effet des différents activateurs a sur la production de
i'heptanone
Source de variation
DL
SCEb
MC'
Modele
6
5404.032
900.671
Errour
7
843.482
120.49
Total
13
6247.514
valeur F
P
7.47"
0.009
0.0044
Contrastes
Témoin VS Caséine 1
2057.006
2057.006
17.07"
Témoin Vs Ethanol
1
357.708
357.708
2.97
0.128
Témoin Vs Glucose
1
68.495
68.495
0.57
0.475
Caséine Vs Ethanol
1
917.606
917.606
7.62'
0.028
"(Glucose, Ethanol, Alanine, Hydrolysat de caséine) ; %CE= somme des carrés des
écarts. 'MCE= moyenne des carrés des écarts. DL= dégrée de liberté Coefficient de
détermination :R2=0.86.
Coefficient de variation : Ck20.73
"Affinité" Substrat- Spores
100%
80%
DAcide mleu
I
O Acide transforme
60%
Cetone mleuIAcide
transforme
40%
20°>0
~ C e l o n emleu/Acide depan
O".
Cl0
a
C6
Acides gras
Figure 3. Effet de la longueur des chaîne d'acides gras sur la conversion en
méthylcétones correspondantes : 1,5'106 spores. 1ml d'hexane, 1.5 ml de tampon
phosphate pH 6.8, 1,5 h ,28 O C . Milieu aqueux, volume totak8mL.
10.7
21
32
43
54
64.5 t 6 . 1 0 E 7
Acide octanoique(pprn)
Figura 4. Effet de la concentration en acide octanoique et en spores sur le rendement
en heptanone. Concentration de spores utilisées : 1.8x10bspores et 6x107spores; 1rnL
d'hexane ;l,5mL tampon phosphate pH 6,8 ,16 h, 28 OC. Milieu aqueux. volume total
=8 mL,
O
5
10
15
20
Temps (h)
I
I
Figure 5. Effet de la concentration initiale d'acide octanoïque
et du temps de fermentation sur le rendement en heptanonea
100
-
E
g
-
90
--
80
--
70
--
60
---
P
50
40
LE
30
.-
-20 --
t36ppm
10 .-
t49ppm
O
O
5
10
Temps (h)
15
20
Glppm
nppm
+9Oppm
Figure 6. Effet de la concentration initiale de sel d'acide octanoïque sur le rendement
en heptanonea. '5'10' spores, ImL d'hexane, 2 mL de Tampon phosphate pH 7, 16 h,
28 OC. Milieu aqueux, volume total du milieu=8 mL.
Figure 7. Activation de l'oxydation de I'octanoate de sodium par différents activateurs à
différentes concentration d'acide. 5'107spores, 2 mL tampon phosphate pH 68, 16 h,
28°C.; éthanol 2vUmL, glucose ImglmL. Alanine 0,5 mglmL, Hydrolysat de caséine 0,l
glmL. Milieu aqueux, volume total du milieu=8mL.
-- 0.1
O
4
8
12
16
Temps (h)
Figure 8. Utilisation des acides aminés provenant de I'hydrolysat de caséine durant la
fermentation de I'octanoate de sodium par P.roqueforti. 10' spores. 60 mL d'hexane, 16
h, 28 OC. 0,04 glmL d'hdrolysat de caséine. Milieu aqueux, volume total du milieu= 500
mL.
Dans cette étude, nous avons examiné certaines conditions du milieu permettant aux
spores de P. roqueforti de produire des méthylcétones à partir d'acides gras. Une de
ces conditions conceme la nature du substrat lui mëme. En raison de leur lony~eurde
chaînes différentes, certains acides gras sont mieux métabolisés que d'autres par les
spores de P. roqueforti. Bien que l'acide caprique est plus utilisée (38%) que l'acide
caproïque (7%) et I'acide caprylique (2%), la quantité de méthylcétone issue de cette
transformation est 19 fois plus importante chez I'acide caprylique qu' avec l'acide
caprique alors qu'elle est nulle en présence de l'acide caproïque.
L'acide caprylique, comme les autres acides gras, présente à des degrés variables une
certaine toxicité. C'est ainsi que les spores utilisées dans l'étude étaient incapables de
métaboliser des concentrations dépassant les 54 ppm durant les 16 h de la
fermentation. En revanche, lorsque l'acide octanoïque est présent sous la forme de sel
de sodium, la performance des biocatalyseurs est augmentée mëme à des
concentrations de 72 ou de 108 ppm. Ces résultats montrent que la toxicité des acides
gras est associée à leur forme non dissociée. L'entrée massive des molécules d'acide
gras sous la forme protonée acidifie le milieu htracellulaire et peut causer un blocage
de l'activité métabolique et enzymatique des spores.
Durant la synthèse de I'heptanone, l'oxygène est requis. Le cycle de Krebs est aussi
mis à contribution pour fournir l'énergie nécessaire à la dégradation de l'acide gras.
Cette énergie provient en partie de I'acide lui même. Elle peut provenir également de
.
certaines substances telles que l'alanine, le glucose, l'éthanol l'hydrolysat de caséine,
etc. Lorsque les spores sont jeunes et inertes. l'addition au milieu de ces composés
énergétiques en présence de concentrations importantes en substrat. n'améliore pas
leur performance. excepté pour I'hydrolysat de caséine.
Ces résultats suggèrent qu'il y a certains composés métabolisés qui influeraient plus
rapidement pour favoriser la transformation du substrat en énergie (glucose, éthanol)
ou pour favoriser la formation des produits (hydrolysat de caséine). La non stimulation
de l'oxydation de l'acide octanoïque en heptanone par le glucose (1 mglmL). l'alanine
(0,5 mg/mL) ou l'éthanol (2 pVmL ) serait due au fait que les spores utilisés étaient plus
jeunes que ceux utilisés par Lawrence (1966) et Larroche (1988). Ils n'ont pas subi de
traitement de lavage (Lawrence et Bailey, 1970 ) ou de congélation (Larroche et
a1.,1994 ). La capacité des spores à oxyder les acides gras diminue avec l'âge et
c'est l'addition de ces composés activateurs
qui vont stimuler la consommation
d'oxygène et la formation des méthylcétones.
Ces résultats semblent montrer également que hydrolysat de caséine est meilleur que
les autres activateurs dans les conditions où les spores sont jeunes et la durée de
fermentation courte. Ils suggèrent l'hypothèse selon laquelle les différents nutriments
peuvent ëtre métabolisés à differentes vitesses, contrôlant la vitesse à la quelle le cycle
de Krebs peut ëtre stimulé pour induire l'oxydation de l'acide gras. Pour apprécier le
rôle de ces composés dans le fonctionnement du cycle de Krebs et la formation des
méthylcétones, d'autres expériences auraient été nécessaires. Par exemple, on aurait
pu mesurer le taux de consommation de l'éthanol, de l'alanine et du glucose dans le
temps. On peut également vérifier l'efficacité de chaque activateur en utilisant
differentes concentrations. La classification des activateurs reste pour l'instant difficile
dans la mesure où les conditions utilisées n'étaient pas absolues. L'hydrolysat de
caséine (0,l g/mL) est 200 fois plus concentrée que l'alanine. De même, le contenu
énergétique pour ces différentes concentrations d'activateurs n'est peut ëtre pas
équivalent. Ce sont donc les niveaux énergétiques de ces composés pour stimuler soit
la perméabilité soit le cycle de Krebs qui devront ëtre comparés. Le manque de telles
données dans la littérature ne nous a pas permis de vérifier l'information. Ces données
sont nécessaires pour comprendre les conditions physiologiques du micro-organisme
qui ne sont pas les mëmes suivant les niveaux de glucose, d'éthanol et d'alanine.
Le rôle plus important joué par l'hydrolysat de caséine à la différence de l'alanine et des
autres composés énergétiques, tient à sa richesse en acides aspartique et glutamique.
Même pour des courtes périodes, ces acides aminés sont rapidement métabolisés,
foumissant de I'énérgie aux biocatalyseurs. La vitesse à laquelle ces acides aminés
sont assimilés est explicable par l'induction des transporteurs spécifiques.
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CHAPITRE 2
Importance d e la fermentation d e s acides gras
dans un milieu à deux phases
Resumé
L'heptanone est produite à partir de l'acide octanoïque ou de son sel de sodium par les
spores de P.roqueforîi dans un système eau-hexane. La réaction utilise des spores
inertes dans un milieu contenant l'acide octanoïque ou son sel de sodium et i'hydrolysat
de caséine (0,04glmL).
L'évaluation des paramètres tels que la température et le pH ont montré une
température optimale de 28 OC . L'hydrolysat de caséine joue le rôle de tampon autour
du pH 5,s à 6. La réaction a montré que I'hexane peut être utilisé pour augmenter la
quantité d'oxygène solubilisée sans diminuer l'activité des spores. En fait, la productivité
en heptanone s'en trouve doublée. L'hexane permet également aux spores de mieux
supporter et d'utiliser des concentrations jugées toxiques d'acide octanoïque (10 mM) .
Les acides gras sont des composés toxiques aux moisissures. Leur biotransformation
en méthylcétones dépend de la concentration d'acide non dissocié présente dans le
milieu .
Plusieurs procédés de fermentation ont été utilisés pour produire des méthylcétones.
Ces procédés utilisent des spores ou du mycélium dans une fermentation submergée
en utilisant de la crème lipolysée sous pression et avec aération (Nelson,1970). Cette
technique a été améliorée pour faire un système continu (Dwivedi et Kinsella,1974)
mais elle demande des durées longues. C'est ainsi que la fermentation a l'état solide a
été étudiée (Tomassini et a1.,1995). ce qui a permis de
rabaisser la durée de
fermentation de 19 a 6 jours. Cependant dans ces fermentations, la concentration
d'acide gras doit ëtre étroitement contrôlée, surtout si d'autres précurseurs d'acide gras
et lipases ont été ajoutés, car l'excès d'acides gras accumulé peut en effet inhiber la
croissance de P.roquefortiet la réaction de P-décarboxylation.
Pour limiter l'effet toxique des acides gras et favoriser la biosynthèse des
méthylcétones, une autre approche est décrite par Pannell et Olson (1991). Les spores
de P. roqueforfi ont été encapsulées avec une variété de lipases afin d'accélérer le
développement des flaveurs. Les spores encapsulées tolèrent mieux des hautes
concentrations d'acide gras car leur migration à l'intérieur des capsules diminue leur
concentration effective. Cependant cette méthode n'empêche pas la métabolisation des
.
méthylcétones. Pour résoudre le problème lié a la toxicité d'autres techniques ont été
utilisées . L'utilisation du silicate pour l'adsorption du n-butanol (Moreira et a1.,1981) et
la technique de fermentation sous dialyse. Mais ces techniques réduisent la toxicité liée
aux produits de fermentation et non celle du substrat.
L'immobilisation des spores de P. roqueforfi étudié par Creuly et al. (1992) a permis
d'augmenter la stabilité mécanique et l'activité des spores mais le transfert de l'oxygène
est limité.
Cette deuxième partie du mémoire traite l'importance de la fermentation des acides
gras dans un milieu organique et l'influence de la durée sur la productivité. Étant donné
que la synthèse des méthylcétones se fait par mécanisme aérobie. la disponibilité de
I'oxygène aux cellules demeure un des facteurs à considérer pour favoriser la réaction.
Celle-ci a eu lieu dans le milieu aqueux. Or trois problèmes sont rencontrés quand les
méthylcétones sont synthétisés dans le milieu aqueux. Le premier est lié à
la
disponibilité de l'oxygène. La fermentation des acides gras est connue comme un
processus aérobique et l'oxygène dissous est cnicial pour la bioconversion.
L'alimentation de l'oxygène dissous est généralement limitée dans une fermentation
aérobique à cause de sa faible solubilité dans les solutions aqueuses (8 à 10 ppm).
Pour enlever cet obstacle, des vecteurs d'oxygène tels que certains hydrocarbures ont
été ajoutés au milieu pour améliorer la fermentation (Rols et a1.,1989 ; Rols et Goma,
1989). 11 a été montré que les hydrocarbures jouent un rôle intermédiaire dans le
transport de I'uxygène des bulles gazeuses à la phase aqueuse. Rols et Goma (1991)
ont utilisé de l'huile de soja pour augmenter le transfert de l'oxygène durant la culture de
Aerobacter aerogenes. De même, l'influence du n-hexadecanesur la fermentation de la
pénicilline avec P. chrysogenum a été attribuée à la concentration de I'oxygène dissous
et au changement morphologique (Peng et Chen.1994). Les effets des hydrocarbures
ont été attribués à la haute solubilité de l'oxygène dans ces composés. Larroche et al.
(1992) ont utilisé une isoparafffine industrielle afin de produire des méthylcétones (C5Cg) en utilisant des spores inertes initialement cultivées sur du sarrasin. La fraction
d'acide octanoique convertie en 2-heptanone est évaluée à partir du rapport volume de
CO, dégagé pendant la réaction sur le substrat. Cependant, il existe très peu
d'information dans la littérature sur les effets des solvants organiques sur la production
des méthylcétones. Or certains rapports ont préconisé la nécessité de maintenir un haut
niveau d'oxygène pour favoriser la productivité en méthylcétones (Larroche et aLl994).
Du fait que la fermentation se produit dans un environnement aqueux. la récupération
des méthylcétones demeure une étape cruciale. Cette étape limite également la
compétitivité du procédé de fermentation. Ceci en raison du fait que les méthylcétones
ont un coefficient d'activité plus important dans l'eau (Larroche,l988).
Par ailleurs, dans une fermentation, comme les méthylcétones sont en concentration
faible. ils sont solubles dans I'eau. II est alors difficile de les séparer. C'est le deuxième
probleme. La solution serait alors d'effectuer une distillation. Seulement si on chauffe
trop, on risque de détruire les spores. Le dernier probleme est lié à la volatilité du
produit surtout si on effectue un balayage avec de I'air. En plus, comme les
méthylcétones sont en contact avec les spores. elles peuvent par conséquent ëtre
métabolisées en alcools secondaires (King et Clegg,1979). En plus, il est souvent
nécessaire de garder la concentration des méthylcétones au dessous d'une certaine
concentration car elles peuvent à leur tour inhiber les biocatalyseurs.
C'est pour réduire ces obstacles et limiter l'influence toxique des acides gras sur
I'activité métabolique des cellules qu'une technique de fermentation extractive a été
proposée (Minier et Goma, 1982). Elle est utilisée pour réduire l'inhibition par le produit
en enlevant les produits de la fermentation in situ tout en gardant le substrat, ce qui
réduit sa toxicité effective envers les spores. Malheureusement il existe très peu de
publications sur la production des méthylcétones par fermentation extractive (Creuly et
al .,1992).
L'objectif de cette étude est donc de tirer profit de ces travaux en utilisant de I'hexane
directement dans le milieu de bioconversion. Celui-ci offre I'avantage d'être accepté
dans les procédés alimentaires (exemple, extraction des huiles végétales) et peut ëtre
analysé directement par chromatographie en phase gazeuse. II reste à s'assurer que
l'environnement marqué par la présence de I'hexane soit susceptible de maintenir la
viabilité des cellules, car la piésence d'un solvact organique peut engendrer des effets
biochimiques et physiques pouvant affecter I'activité catalytique des cellules en raison
de sa toxicité (Pinheiro et Cabral, 1991). Osborne et al. ( 1990) ont utlisé un système
aqueux-organique pour étudier I'activité de lla-hydroxylase de la progéstérone en
présence des spores de Rhizopus nigricans. En raison de sa faible solubilité dans
I'eau (0,143 mM), I'hexane était très loin de saturer la phase aqueuse pour pouvoir
affecter les membranes de spores. Ainsi l'amélioration du procédé est possible car
I'hexane non seulement améliore la solubilité de I'oxygène mais extrait les
méthylcétones par affinité au fur et à mesure qu'elles sont produites dans la phase
aqueuse, échappant ainsi à une possible dégradation par les spores. Cette technique
offre l'avantage d'enlever les effets toxiques du produit et du substrat sur les spores.
Dans ce chapitre, le comportement des spores de P.roqueforti durant la fermentation
des acides gras dans ce système à deux phases sera rapporté. Les effets de I'hexane
dans la bio-conversion de I'heptanone ainsi que la consommation en oxygène seront
examinés.
1.1. Les méthodes de fermentation
A cause du besoin croissant d'arômes concentrés dans les plats, desserts, salades et
soupes, un certain nombre de techniques a été développé pour produire des
concentrés de methylcétones.
1.1.1 Fermentation submergée
Cette technique utilise des spores ou du mycélium frais. La fermentation submergée a
été étudiée par Nelson (1970) afin de produire des méthylcétones potentiellement
commercialisables. Le procédé utilise un inoculum riche en spores. En effet, la méthode
qui encourage le maximum de sporulation est basée sur le contrôle de la composition
du substrat avec une pression osmotique élevée. La moisissure est alors cultivée dans
un milieu contenant du lait stérilisé en présence de 3 à 4% de sel. Les méthylcétones
sont produites dans un milieu additionné de crème lipolysée, sous pression avec
aération pendant deux à trois jours.
Dwivedi et Kinsella (1974), tirant profit des travaux précédents, en particulier sur la
possibilité d'obtenir un milieu riche en spores, ont développé dans leur laboratoire un
système de fermentation continu utilisant du mycélium avec un flux de gras laitier
alimenté en continu. Dans leur cas, les spores sont cultivées dans un milieu stérile
comprenant 5% d'extrait de malt, 0,5% d'extrait de levure et en présence de 2% de
glucose. Les spores sont récoltées aseptiquement dans un flacon contenant de la
liqueur de mais. Un jeune mycélium se développe après 4 jours puis est transféré dans
un deuxième contenant de liqueur de mais et de sucrose, dont le pH est ajusté à 7 par
du NaOH. La culture préalablement diluée est enfin transférée dans un flacon n04 où
des acides gras produits par une lipase pancréatique ont été envoyés par une pompe et
ajustés de manière à obtenir 20 pmoles d'acide graslmg de moisissures. Bien que long
(18 à 19 jours), le procédé présente l'avantage de pouvoir changer et ajuster les
concentrations des méthylcétones en changeant celles des acides gras dans le milieu
de fermentation.
Nous avons vu que ces techniques demandent des durées longues. C'est ainsi qu'une
technique de fermentation à I'état solide a été étudiée (Tomassini et a1..1995). Elle
utilise du lait concentré contenant 50% de matière sèche et 26% de gras. Un coagulum
est développé sous l'action de souches lactiques (L. lactis et L. helveticus]. Des coupes
de 0.5 cm ont alors été effectués avant l'inoculation des spores de P. roqueforti. La
production des flaveurs est réalisée pendant six à sept jours et les concentrations en 2heptanone et 2-nonanone sont respectivement six et deux fois plus hautes que celles
obtenues par Dwivedi et Kinsella (1974).
Dans ces fermentations submergées, la concentration d'acide gras doit être étroitement
contrôlée surtout si d'autres précurseurs d'acide gras et lipases ont été ajoutés. Car
l'excès d'acides gras accumulé peut en effet inhiber la croissance de P.roqueforfi et la
réaction de j3-décarboxylation.
L'utilisation potentielle de P. roqueforti dans une fermentation à I'état solide afin de
diminuer la durée de l'opération a été aussi étudiée par Kirane et al. (1995). 11 s'agit d'un
mélange de lait de vache (48%), de lait écrémé (la%), de caseinate de calcium (4%) et
d'extrait de soja en poudre (30%). L'acidification du milieu est d'abord réalisée par
fermentation de l'extrait de soja en présence de Lactobacillus acidophilus qui conduit à
la réduction en sucres (stachyose. raffinose et saccharose). Le produit est alors
mélangé avec le lait de vache et utilisé comme substrat pour P. roqueforti. Après quatre
jours de maturation à 27 OC et 85% HR, 10% de crème lipolysée sont ajoutés. Une
concentration maximale (11 mg.g") de méthylcétones est obtenu après 6 jours avec une
faible teneur en sucres et la flaveur de fève de soja n'est plus détectée. II semble que le
produit final offre des applications potentielles dans l'industrie alimentaire. Cependant
l'élimination des hydrates de carbones indésirables est dépendante de la croissance du
mycélium qui souvent pose problème dans la récupérationdes produits.
Un problème inhérent à ces techniques souvent en
.t
batch 1~ est le décalage entre le
moment de la prise d'échantillon et son analyse pour mesurer la concentration en
méthylcétones. Ces essais nécessitent plusieurs extractions et des colonnes de
séparation. C'est ainsi que la technologie de fermentation submergée a été améliorée
en couplant au procédé de production une colonne chromatographique en phase
gazeuse (Taylor, 1995). Une souche sélectionnée de P. decumbens a été utilisée et les
conditions d'agitation et d'aération étudiées. La concentration en pentanone (100 ppm)
obtenue est dix fois supérieure à celle rencontrée dans le fromage bleu (sur la base de
la matière sèche).
1.1.2.Production par spores encapsulées
Pour limiter l'effet toxique des acides gras et favoriser la biosynthèse des
méthylcétones, une autre approche est décrite par Pannell et Olson (1991). Les spores
de P. roqueforti ont été encapsulées avec une variété de lipases afin d'accélérer le
développement des flaveurs. II est connu que la concentration en acides gras exerce un
contrôle sur la production des méthylcétones. voire un effet limitant dans le fromage
(Kinsella et Hwan,1976b). Même si des études pour déterminer le niveau de
concentration maximale tolérable par les capsules sont nécessaires, il semble que
celles-ci tolèrent mieux des hautes concentrations d'acide gras car leur migration à
l'intérieur des capsules diminue leur concentration effective. Cependant cette méthode
n'empêche pas le métabolisme et la disparition des méthylcétones. L'autre problème
est lié à la possibilité qu'une certaine quantité d'acide gras puisse migrer dans les
parois des capsules et échapper ainsi à la réaction. A cause de cette instabilité des
méthylcétones, les capsules ne sont pas utiles pour beaucoup d'application visant la
maturation accélérée du fromage.
1.1.3. Production par spores immobilisées.
L'immobilisation des spores de P.roqueforti par un gel d'alginate enfermé sur un
copolymère acrylate-méthacrylate permet d'augmenter la stabilité mécanique et
l'activité catalytique des spores (Larroche et al.,) et donc la vitesse de consommation
du substrat (Creuly et al1 ; 1990 ;1992) . Les spores immobilisés produisent jusqu'à 2
fois plus de méthylcétones que les spores libres (Creuly et al., 1990 ). Malgré cette
performance, le procédé de l'immobilisation des cellules aérobiques présente des
problèmes parmi lesquels la rétention des cellules dans la matrice, la résistance au
transfert de masse de nutriments et des produits à travers la matrice. La vitesse de
réaction peut être modifiée lorsque la concentration en biomasse dans la matrice
dépasse 1 g/L (Creuly et a1..1990). Cette matrice devient alors incapable de retenir
cette biomasse, ce qui peut provoquer une turbidité graduelle dans le surnageant.
L'effet de l'immobilisation sur la physiologie de Penicillium chrysogenum pendant la
production de la penicilline a été étudiée (Mussenden et al., 1993). Il a été conclu
que la restriction sur le transfert de masse de l'oxygène lequel limite la productivité
était le résultat de l'immobilisation.
2.Résultats et Discussion
Pour augmenter la productivité des méthylcetones a partir de la fermentation d'acides
gras. I'hexane a été utilisé. L'objectif est de fournir aux spores un environnement
favorable pour la production de rnéthylcétones. Pour cela. la présence d'un solvant non
miscible et très faiblement soluble à l'eau est une des stratégies. Cette condition est
indispensable pour la viabilité des cellules. L'hexane permet de dissoudre le substrat
hydrophobe, de limiter la toxicité de ce dernier vis à vis des spores et d'augmenter la
solubilité de l'oxygène, indispensable dans une fermentation aérobie.
2.1 .Efficacité de la transformation en absence et en présence d'hexane
Le taux d'utilisation d'acide utilisée par les spores en absence d'hexane est beaucoup
plus important qu'en présence d'hexane (figure 9b). En effet. la quantité d'acide utilisée
est 80% apres 2h et de 98% apres 24h dans le milieu aqueux contre 20% après 2 h et
45% en fin de réaction en présence d'hexane. L'acide est peu utilisé en présence
d'hexane a cause de
I'échange et de la libération lente entre les acides gras
solubilisés dans la phase organique et les spores qui sont dans le milieu ;queux.
Par
contre la productivité en méthylcétones est de 1,5 à 2 fois plus élevée en présence
qu'en absence d'hexane (figure 9c). Dans le milieu purement aqueux, les
méthylcétones. en contact avec les spores, peuvent à leur tour être métabolisées
(King et Clegg,1979). C'est ainsi que la courbe de I'heptanone en milieu aqueux reste
en dessous de celle observée en présence d'hexane. Dans le milieu biphasique, les
méthylcétones migrent par affinité au fur et mesure de leur synthèse. Elles échappent
ainsi au métabolisme par les spores.
A quatre heures, la courbe d'évolution de I'heptanone en présence d'hexane décroît
pour réjoindre celle du milieu aqueux (figure 9c). Ce résultat indique une production
instable, une perte quelconque par volatilité ou un problème d'analyse .
Ces résultats démontrent clairement que le système à
deux phases hexane-eau
comparé au système purement aqueux (figure 9a et 9b.) peut être un bon milieu de
bioconversion par les spores. Dans un systeme aqueux, les coefficients d'activité des
méthylcétones sont élevés (Larroche et a1.,1988). La bonne récupération des
méthylc4tones est favorisée par la baisse des coefficients d'activité de ces arômes et
de leur dissolution dans l'hexane, ce qui prévient leur utilisation par les spores. Le
rendement final en méthylcétones en présence d'un solvant organique est presque 2
fois celui récupéré dans un systeme purement aqueux (figure 9b). II est intéressant de
constater que la présence du solvant organique dans le milieu c'affecte pas l'activité
des spores soit par leur contact avec la portion immiscible,
soit par la partie soluble
de I'hexane dans l'eau (0,143 mM). L'amélioration du système demande toutefois
d'évaluer les effets toxiques du solvant en réalisant des expériences qui déterminent les
ratio solvant~volumedu milieu .
2.2.Effet de I'hexane
températures.
sur
le
rendement
en
heptanone
à
différentes
L'effet de la température sur la production des méthylcétones en absence et en
présence d'hexane est présenté au tableau 4. L'examen a été fait à des températures
de 20,24 et 28 OC.
En absence d'hexane, les concentrations en heptanone sont rapidement plus élevées
durant les 8 premières heures avec des rendements comparables à 28°C et 24°C et
un rendement inférieur à 20 OC. Cette productivité est trois à quatres fois moins élevée
en présence d'hexane durant la même période. Dans le système aqueux, l'échange
acide gras-spores est beaucoup plus rapide au départ à toutes les températures alors
que dans le mélange biphasique c'est un échange lent qui se fait entre les molécules
d'acides gras solubilisées dans la phase organique et les spores. Par contre après 12 h.
la productivité en présence d'hexane devient plus forte, surtout à 28 OC, en raisori de
l'augmentation de la vitesse de consommation du substrat. Celle-ci est facilitée par la
capacité du solvant à solubiliser le substrat, à l'apporter et le faire passer à travers la
capacité du solvant à solubiliser le substrat, à l'apporter et le faire passer à travers la
membrane des spores. A partir de 12 h, les rendements baissent sauf à la température
de 28 OC. A la fin de la réaction, le maximum de formation de i'heptanone s'est produit
en présence d'hexane et à 28 OC. Ce résultat est relativement conforme à celui obtenu
par Yagi et al. (1990a) avec Pénicillium o'ecumbens IF0 791. 11 montre que le
métabolisme des acides gras par les spores de Pénicillium est davantage favorisé à
une température de 28 OC laquelle correspond à la température optimale de la réaction
(Kinsella et Hwang,1976b). Ces résultats indiquent que les spores sont capables de
métaboliser les acides gras avec des niveaux d'éfficacité décroissant suivant les
températures 28 OC >24 OC> 20 OC.
2.3.Effet de I'hexane sur la solubilisation de l'oxygène et sur la vitesse de
réaction.
Un élément important de toute fermentation aérobie est la fourniture en oxygène. Celuici est indispensable pour les NADH et FADH oxydases de la moisissure et doit être
préalablement dissous dans le milieu aqueux. Or la solubilité de l'oxygene dans le
milieu aqueux est limitée. Comme des solutions pour i'amélioration ds la fermentation
des acides gras par les spores passe par le transport de i'oxygéne, une façon
d'augmenter le taux de transfert de I'oxygène est donc d'ajouter une seconde phase
dans le milieu de fermentation dans laquelle la solubilité de l'oxygène est augmentée.
La figure 10 montre le profil de I'oxygène dissous
pendant la fermentation de
i'octanoate de sodium avec P .roquefortidans un fermenteur agité. La fermentation est
conduite en utilisant 12% (vlv) d'hexane qui joue aussi le rôle d'antimousse en
s'adsorbant sur l'interface gaz-liquide. Dans ces essais expérimentaux. la concentration
de substrat utilisée est de 54 ppm dans 20 mL de milieu.
Pour les essais de référence, sans vecteur d'oxygène (c'est à dire I'hexane), la
concentration d'oxygène dissous dans le phase aqueuse passe de 8.2 à 9.5 ppm après
agitation. Puis elle diminue pour se stabiliser à 9 pprr! après 2 heures . Le rendement en
heptanone est égal à 23.5% et la biomasse accumulée à 16 heures est égale à 70
mg1L. Quand I'hexane est présent dans le milieu de fermentation , la diminution de
l'oxygène dissous se fait pendant une demi heure puis augmente progressivement
jusqu'à 9.8 ppm
. Ce résultat indique que
la solubilité de I'oxygène dans la phase
aqueuse est favorisée en présence de solvant organique . L'hexane est ainsi devenu
ainsi un réservoir d'oxygène et l'échange est plus facile entre deux phases liquides
(hexane-eau) qu'entre air-eau. Durant l'échange hexane-eau, la production en
heptanone est égale à 54,3% soit presque deux fois plus importante qu'en absence
d'hexane. La production en biomasse est égale à 57 rngll.
Le profil de l'oxygène dissous et le rendement obtenu montrent que la vitesse de
consommation du substrat et la biomasse accumulée sont fortement influencées par la
présence de I'hexane dans le milieu de fermentation .La diminution de I'oxygene
dissous dans le milieu de fermentation indique sa consommation par les spores (figure
10). Cette consommation a eu lieu lorsque le substrat commence à pénétrer à l'intérieur
des spores pour subir l'oxydation. La diminution de I'oxygène dissous se fait plus
rapidement lorsque le fermentation a eu lieu en présence d'hexane. Ce qui indique que
.
la vitesse d'oxydation du substrat est plus grande. Enfin dans un milieu biphasique la
vitesse de pénétration du substrat à l'intérieur des spores se fait plus rapidement que
dans un milieu aqueux.
Ces résultats montrent un des avantages qu'offre l'utilisation de I'hexane pour
augmenter la solubilité de l'oxygène. II est en effet connu que la solubilité de I'oxygène
dans les hydrocarbures est plus forte que dans Veau pure. D'une part, Rols et Goma
(1989) ont exploré les moyens d'ajouter au milieu de fermentation un liquide qui a une
haute solubilité en oxygène, et d'autre part, l'utilisation de l'hexadecane par Ho et
al. (1990 ) a permis d'augmenter de huit fois cette solubilité et favoriser la production de
la pénicilline.
A cause de la faible diminution de I'oxygène dissous pendant les 16 heures de la
fermentation (figure IO), l'addition dans le milieu de grandes concentrations (20mM)
devrait permettre de visualiser mieux le phénomène de consommation de I'oxygène.
Or comme le montrent les figures 11 et 12 , la concentration d'oxygène dissous ne varie
pas par rapport à l'expériences précédente : faible consommation d'oxygène par les
spores puis stagnation en absence d'hexane. La concentration de substrat utilisée étant
considérée m ' w e pour P. roqueforti (Creuly et al., 1990), le rendement en heptanone
obtenu en absence d'hexane est nul. La diminution de l'oxygene dissous peut être
attribuée à une petite activité cellulaire . la biomasse a augmenté légèrement de 4 à 8
heures pour rester constante par la suite. Lorsque le solvant organique est ajouté au
milieu, la quantité de l'oxygene dissous est augmentée (figure 12) et le rendement
obtenu à 16 heures est de 12%. Ces résultats montrent
que même pour des
concentrations inhibitrices, l'utilisation de la fermentation extractive permet d'enlever
cette inhibition.
2.4. Effet de la durée de fermentation sur la consommation en oxygène et
sur le rendement en heptanone
2.4.1. Effet de la durée sur la consommation en oxygène par les spores inertes
Les spores inertes cueillies sont incubées dans le milieu en absence de substrat et la
consommation en oxygène par les cellules est mesurée à 28 Oc (température optimale
de la scl~che)par une sonde pour une fermentation d'une durée de 50 h . L'évolution
de la consommation d'oxygene est indiquée sur la figure 12 laquelle montre une
biotransformation conduite en présence d'hexane, la concentration d'oxygène dissous
augmente jusqu'à 12 ppm après agitation .
En absence de substrat, la consommation d'oxygene endogène est très faible
(figure 13) ; mais lorsque le milieu est additionné d'acide octanoïque, en présence
d'hydrolysat de caséine comme sources ci,? carbone et d'énergie, la concentration
d'oxygene dissous est fortement augmentée (figure 14). La concentration de l'oxygène
dissous diminue de 11.8 à 7.9 mg/L durant les premières 18 heures et tombe presque à
zéro par la suite. Lorsqu'on tient compte de la concentration d'oxygene dissous en
absence de substrat (consommation endogène), on peut dédgire que la vitesse de
consommation d'oxygene est de 350 nmoledh et par mg de poids sec lorsque 5 mM
d'octanoate de sodium sont additionnés aux spores. Pour des cellules de même âge, la
quantité d'oxygène consommée est donc fortement dépendante de la présence de
substrat carboné. La pénétration de l'acide dans les spores résulte en une forte
diminution de l'oxygène dissous compares à l'activité en absence de substrat indiquant
sa consommation. Ces résultats suggèrent que les spores manifestent une activité
métabolique lorsque les conidies et le substrat sont en contact.
Cette expérience montre qu'on peut diviser la cinétique de fermentation en deux
périodes: La première période est caractérisée par une faible consommation en
oxygene qui est toute de mëme nécessaire pour assurer la régénération du NAD, et la
deuxième phase (après 18 h ), caractérisée par une forte consommation en oxygène.
Ceci signifie la très forte contribution du cycle de Krebs qui va assurer la production des
squelettes carbonés précurseurs des constituants organiques cellulaires nécessaires
pour la germination, par exemple. Aussi, l'observation directe des conidies au
microscope à 6, 10, 18. 32, 42, et 48h a montré des changements morphologiques à
partir de 18h
. L'examen au microscope a
eu lieu. Le gonflement des conidies par
augmentation de leur diamètre indique leur début de germination. Un début de
formation de mycélium a eu lieu à 48h. Cette germination résulterait de la
perméabilisation des parois sous l'influence de I'oxygène (Barrios-Gonzales,l989). La
consommation de celui-ci jusqu'à un certain seuil, déclenche la germination. L'oxydation
du substrat ou du produit en tant que source de carbone et la présence d'hydrolysat de
caséine comme source d'azote jouent également un rôle dans la germination. On note
également une augmentation de la température à 50 h, ce qui semble indiquer la
présence d'une culture exothermique.
2.4.2. Effet dc- la durée sur le rendement en heptanone
L'accumulation de I'heptanone est indiquée sur la figure 15. Elle représente deux
phases dont la première est caractérisée par une productivité élevée en méthylcétones
et une consommation totale du substrat. L'analyse de la matière sèche montre
également une biomasse globalement constante, ce qui explique que I'acide gras subit
une transformation chimique sans qu'il participe à la croissance du micro-organisme au
moins durant cette période.
La deuxieme phase (après 18 h ) se manifeste par une diminution de la productivité en
méthylcétones (figure 15) et une forte consommation en oxygène (figure 14).
La figure 12 montre ainsi que les conditions aérobies influencent fortement la vitesse de
synthèse de I'heptanone par les pores laquelle est de 7,14'10"'
mmolelhlspore
L'utilisation maximale de 1.18'10"\
6,7'10'"
d'acideIUspore foumit
.
g de
méthylcétonesIU spore lorsque la consommation d'oxygène est minimale (première
phase) pour un rendement de 57%. A noter que I'acide est complètement consommé
avant la fin de la première période.
Lorsque la concentration de l'oxygène dissous
diminue jusqu'à 7,9 mglL, la productivité en heptanone baisse également. Quand
l'expérience se poursuit jusqu'à la deuxième phase, les cellules sont capables d'une
fermentation butyrique. En effet de I'acide butyrique dont la présence a été confirmé par
spectrométrie de masse, est produit à 48 h. il est. La production de I'acide butyrique est
le résultat d'une forte consommation en oxygène et de l'utilisation de méthylcétone
comme source d'acétylcoA.
Le début de germination pendant la deuxième période se passe quand le substrat est
totalement consommé. En effet, les acides gras sont connus être inhibiteurs de la
germinations des spores des bactéries et sont antifongiques. Ce début de germination
coïncide aussi avec la baisse de la productivité en heptanone. Ce résultat montre que la
période de meilleure productivité correspond à celle où les spores sont inertes,
confirmant les résultats de Fan et al. ( 1976) qui ont montré que les spores incubées
dans un milieu contenant une source de carbone et d'azote manifestent, après un
cefiain temps, des changements morphologiques et physiologiques
qui sont
connectées à la germination. La perte de la capacité à synthétiser I'heptanone est reliée
à la perte de résistance des parois au potentiel toxique des acides ( Fan et al., 1976 )
suite à ces changements. Ces modifications physiologiques des parois rendent les
spores plus perméables à la pénétration de ces acides .
Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent que la germination des spores
apparaît après une totale consommation de I'acide octanoïque et défavorise la synthèse
de I'heptanone laquelle est favorisée lorsque les spores sont inertes. La pénétration de
l'acide dans les spores est suivie d'une importante consommation en oxygène. Cette
pénétration se passe par un mécanisme de transport actif qui nécessite de I'ATP
(Larroche et a1.,1994 ;1996) produite par i'activité biocatalytique des spores. Cette
étude montre que l'optimisation de la production de i'heptanone par les spores de
P.roqueforti passe par la suppression de la période de germination. Elle implique
pratiquement des fermentations de courte période et sans limitation d'oxygène.
2.4.3. Evolution du pH pendant la fermentation
Le milieu initial a été ajusté à pH neutre par addition de NaOH et son évolution a été
suivie (figure 16). Pour étudier i'évolution du pH durant la fermentation. nous avons
ajouté 20 g d'hydrolysat de caséine au milieu réactionnel. En présence d'hydrolysat de
caséine, le pH reste constant durant la fermentation que ce soit à faible ou à forte
concentration d'acide (figures 11,12 et 14). Ceci indiquerait
qu'il n'y a pas eu
production de NH, dans le milieu, ou que les acides aminés jouent alors le rôle de
tampon. En absence d'hydrolysat de caséine, le pH reste constant durant les quatre
premières heures puis monte progressivementjusqu' à 7.9 après 16h. L'augmentation
du pH en absence d'hydrolysat de caséine correspond à une diminution de la
concentration d'acide dans le milieu. Ces résultats montrent que les acides gras
entrent à i'intérieur des spores sous forme protonnée, ce qui diminue la concentration
des ions H' dans le milieu de fermentation. Certains autsurs ont noté i'influence du pH
sur la production des méthylcétones et il ressort que des conditions alcalines ou
proches de la neutralité sont celles favorables à la production des méthylcétones (Yagi
et a1..1990a), ce qui est le cas dans un milieu tamponné par hydrolysat de caséine
(expériences précédentes).
2.5.Effet de I'hexane sur le rendement en biomasse et sur la diminution de
la toxicité des acides gras
Les acides gras sont des composés hydrophobiques connus pour être ar~tifongiqueset
antibactériens. A cause de leur caractère hydrophobique, ils peuvent s'accumuler très
fortement dans les membranes (Osbome et al., 1990) des cellules de Rhizopus
nigricans. La toxicité des acides gras envers les micro-organismes eucaryotes peut
s'exercer en inhibant la consommation de l'oxygène et /ou au niveau des membranes
par accumulation. Ils peuvent alors inhiber des enzymes comme les déshydrogénases
membranaires. Notre étude consiste à examiner l'effet de l'hexane sur l'accumulation
de ces substances. En contrôlant le rendement en biomasse. L'effet de I'hexane a été
examiné sur le rendement en biomasse. Comme indique dans le tableau 5 ci dessous,
les rendements en matière sèche ont été calcules.
Les résultats montrent qu'en absence d'hexane, les rendements en matière sèche sont
de 16 à 24% supérieurs. Une autre expérience précédente réalisée en présence de 54
ppm (figure 9) donne une biomasse de 70 mg/L en absence d'hexane contre 57 mglL
en présence d'hexane après 16h. soit une différence de 18%. A la lumière de ces
résultats, 2 hypothèses peuvent être retenues :La première est que l'hexane extrait des
composés nydrophobiques sur les membranes des spores augmente la perméabilité et
diminue la quantité de matière sèche. La seconde est que les acides gras pourraient se
coller au niveau des parois des spores (Larroche et a1.,1996) en raison de la nature
lipohile de ces parois, ce qui augmente la biomasse en absence d'hexane. Ces
résultats expliqueraient le potentiel toxique beaucoup plus important des acides gras
sur les spores lorsque la fermentation est faite en absence de solvant organique.
L'acide octanoïque s'accumule dans les membranes cellulaires ( Osbome et al .1990 ;
Larroche et a1.,1996) et aux parois des spores. En se collant ainsi sur les parois, ils
désorganiseraient certaines interactions proteines-lipides et empêcheraient l'entrée de
nutriments essentiels comme les acides aminés. De plus l'oxydation enzymatique des
acides gras se produit dans les structures intemes de la cellule proche de la paroi
cellulaire.
Tableau 4.Effet
de I'hexane sur la biosynthèse de i'heptanone a différentes
Rendement (%)
SansHexane
Temps
TOC 28
24
" 54 ppm d'octanoate de sodium ,
AvecHexane
20
28
24
20
5'109 spores, hydrolysat de caseine (0,04 glmL),
hexane (12% v/v). 16 h ; 28OC. Milieu acqueux, volume total=253 mL.
Tableau 5. Effet de I'hexane sur le rendement en biomasse en présence et en absence
d'hexanea
Rendement de biomasse mg/L
Temps (h)
avec Hexane
Sans Hexane
Différence (%)
" 3'10' spores, 5 mM d'octanoate de sodium , hexane (12% vlv), hydrolysat de
caséine (0,05 glmL), 16 h, 28 "C ; Milieu aqueux, volume total=500mL.
. -Csans hexane '
10
15
20
25
+avec
hexane
!
1
Temps (h)
Figure 9a. Evolution de l'acide residuel durant la fermentation dans un milieu aqueux et
organiquea
"1
15
$'
&sans
5
O
5
10
15
20
25
hexane
hexane
Temps (h)
Figure 9b. Evolution de I'acide utilisé durant la fermentation dans un milieu aqueux et
organiquea. '54 ppm d'acide octanoique, 3'10'spores. ,lmL Tampon phosphate pH6,8,
1 mL d'hexane, 28 OC Volume total, 8mL. La barre représente l'écart type.
01
O
+sans
hex
+avec
hex
i
I
5
10
15
20
25
Temps (h)
Figure 9c. Evolution de i'heptanone formé durant la fermentation dans un milieu
aqueux et organiquea. ' 54 ppm d'acide octanoïque. 3'1 O'spores, , 1 mL Tampon
C . Milieu aqueux, volume totak8mL. La barre
phosphate pH6,8, 1 mL d'hexane, 28 '
représente l'écart type.
Temps (h)
Figure 10. Evolution de la consommation d'oxygène en présence et en absence
d'hexane. "54 ppm d'octanoate de sodium 1'10~spores, hexane (12% vlv) hydrolysat
de caséine (0.04 glmL). 28 OC. Milieu aqueux, volume total= 20 m l .Rendement
d'heptanone :sans hexane= 23,596 ; avec hexane=54,3%.
5.52
I+Oxygene dssous
=
5.48
5.44
Temps (min)
Figure 11. Evolution de la consommation d'oxygene durant la fermentation de
I'octanoate de sodium en absence d'hexanea 10 mM d'octanoate de sodium d'hexane
(12% vlv) , 3'10' spores, hydrolysat de caséine (0,049 ImL) , volume total, 500 mL.
Figure 12. Evolution de la consommation d'oxygene durant la fermentation de
i'octanoate de sodium en présence d'hexanea '20 mM d'octanoate de sodium ,
d'hexane (12% vlv) , 3'10' spores, hydrolysat de caséine (0,049 ImL), 28°C .Milieu
aqueux, volume total, 500 mL.
Figure 13. Evolution de la consommation d'oxygène par les spores en absence de
substrata . 7'10'
spores. d'hydrolysat de caséine (0.049 /ml), 0,175 g de
chloramphénicol et d'hexane (12% vlv). 28 %.Milieu aqueux, volume total= 500 rnL.
-cO*ygene
O
10
20
30
40
50
dissous
-+pH
-
Temps (h)
Figure 14. Evolution de la consommation d'oxygène et du pH au cours de la
fermentation de I'octanoate de sodiuma
-n-
Substrat residuel
-a- RoduR f o r d
O
10
20
30
40
50
Temps (h)
Figure 15. Evolution de la consommation de I'octanoate de sodium, du produit et de la
biomasse au cours de la fermentationa '5 mM d'octanoate de sodium ; 7.10~ spores,
d'hydrolysat de caséine (0,04 glmL), 0.175 g de chloramphénicol et d'hexane (12%
vIv), 28 OC. Milieu aqueux, volume total= 500 mL.
5.5 5
4.5
+pH
.
( avec hydroiysal;
caseine)
-a- pH (sans hydroiysal ;
~
:
caséine)
Figure 16. Evolution du pH pendant la fermentation de I'ocatanoate de sodium"
"5mM en présence d'hexane et 3'10' spores ; en absence et en présence d'hydrolysat
de caséine (0,04 glrnL) , 16 h et 28 O C . Milieu aqueux, volume total=500 mL.
A la lumière de ces résultats, on constate que la productivité en méthylcétones peut
être augmentée par l'ajout dans le milieu de fermentation de l'hexane. L'utilisation d'un
solvant organique non miscible à l'eau permet d'offrir aux cellules un environnement
favorable en permettant entre autres, une augmentation de la solubilité de l'oxygène et
une amélioration de l'activité fermentaire des cellules par l'augmentation du taux de
transfert de l'oxygène. Après un certain temps, l'échange entre deux phases liquides
(hexane-eau) est plus facile qu'entre deux phases air -eau. En outre, l'hexane permet
de garder le substrat qui est foumi aux spores par échange contrôlé. Les produits issus
de la réaction, les méthylcétones, migrent par affinité vers la phase organique.
Ils
échappent ainsi à leur transformation en alcools secondaires par les spores (King et
clegg. 1979). Enfin, la toxicité des acides gras envers les spores diminue lorsque la
fermentation se fait en présence d'hexane. La biomasse toujours élevée en absence
d'hexane signifie que l'acide octanoïque pourrait, à cause du contact physique direct,
peut s'accumuler dans les membranes cellulaires (Osbome et al.. 1990) ou s'incorporer
facilement dans les parois des spores (Larroche et al., 1996). A cause de leur caractère
fongicide, ces acides pourront empëcher les activités métaboliques et enzymatiques
des spores mais les résultats démontrent que
même à des concentrations dites
inhibitrices pour les spores, l'utilisation de solvant organique permet de foumir le
substrat à des niveaux acceptables pour les spores .
L'examen de quelques paramètres de la fermentation dans le milieu biphasique a
montré que la réaction est favorisée à 28
O C
durant des périodes courtes et que le
temps de la réaction ne doit pas pas dépasser 16 à 18 heures. En effet, lorsque la
durée est trop longue, la concentration d'oxygène diminue dans le milieu et la
germination, étape métabolique défavorable à l'activité fermentaire des spores. La
paroi de celles-ci devient beaucoup plus perméable à l'entrée des acides qui
s'accumulent à l'intérieur et manifestent leur toxicité. L'ensemble de ces résultats peut
être étendu à d'autres solvants moins volatils que l'hexane, par exemple, l'octane qui
fait l'objet du prochain chapitre.
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CHAPITRE 3
Effet du dioxyde de carbone sur la fermentation de
l'acide octanoique par Penicillium roqueforti en
culture Fed-batch dans un milieu octane-eau.
Resumé.
Une technique en Fed-batch pour la production de I'heptanone à partir de l'acide
octanoïque dissous dans de l'octane est présenté. II a nécessité l'utilisation d'un pH
constant par addition de NaOH 2 N pour neutraliser l'addition régulière de I'acide. Cette
réaction est réalisée en présence d'un mélange d'air et dioxyde de carbone pour
stimuler la production de I'heptanone. A 15% de CO, , le système montre une haute
stabilité avec un rendement de 64% à 8 h avec 1,39 rnmolelh de produit formé. La
réaction Fed-batch peut donc être utilisée pour étudier la production de I'heptanone
dans le temps.
II est connu depuis de nombreuses années que la croissance et le métabolisme des
micro-organismessont accompagnés par la consommation etlou l'évolution du dioxyde
de carbone. Leur besoin en dioxyde de carbone ou d'oxygène varie suivant la nature et
l'état du micro-organisme et certains, comme les autotrophes, dépendent de la fixation
du dioxyde de carbone. L'effet de ces gaz sur la croissance microbienne et sur la
formation de produit est différent et dépend généralement de la souche du microorganisme mais aussi des conditions et de I'état de la culture.
Le dioxyde de carbone est un important composant dans le métabolisme microbien non
seulement comme produit mais aussi comme réactif. II est aussi nécessaire pour la
production des intermédiaires métaboliques tels que I'oxaloacetate par la pyruvate
carboxylase . Quand le CO, se dissout dans l'eau, il réagit selon la réaction suivante.
CO,
+ H,O + H,CO,+HCO' ,+H'
Le dioxyde de carbone est capable de pénétrer dans le cytoplasme des cellules comme
dans la matrice mitochondriale. Dans ce cas, la structure de la paroi cellulaire influence
sa vitesse de transport (Mclntyre et McNei1,1997). Le résultat de ce transport est
I'accurnulation de I'acide carbonique et des ions bicarbonates dans la cellule ( HCO;
H,CO,
et
1. La dissociation de ces demiers peut neutraliser les charges sur la membrane,
induisant des pressions osmotiques et donc un gonflement, causant une grande
pénétration des petits ions dans la cellule. Ho et Smith(1986a) ont montré que ce
phénomène de dépolarisation causait une inhibition de Pénicillium chrysogenum. Le
CO, peut altérer également les membranes cellulaires en affectant le core des acides
gras des membranes cellulaires des levures, altérant ainsi la fluidité membranaire
(Castelli et a1.,1969 ). Les ions HCO;
peuvent eux aussi affecter les charges des
groupes phospholipides et des protéines de surface de la membrane. Mais le dioxyde
de carbone a aussi des rôles bénéfiques, par exemple pendant la maturation du
fromage. D'ailleurs, ce sont des hautes concentrations de CO, combinés avec des
basses concentrations d'oxygène qui jouent un rôle important lors de la maturation du
fromage bleu. des conditions défavorables pour les autres micro-organismes (Dixon et
Ke11,1989). Golding (1940) a montré que P. roqueforti est capable de croître dans une
atmosphère contenant 75% de CO, et 5% d'oxygène alors que P. glaucum manifeste
une germination en présence de 90% de CO,
.
Déjà longtemps. Thom et Currie(l913)
ont analysé ces gaz dans le fromage et ont mesuré des pourcentages respectifs de
21,14 à 40.95 pour le CO, et de 2.42 à 7,00 pour I'oxygène. La production de protéase
par A. oryzae est aussi stimulée à 0,02-0,05 atm de dioxyde de carbone (Narahara et
a1.,1982). En fermentation solide, 0,05 atm de dioxyde de carbone stimule la production
de cellulase par Aspergillus sp. (Mudgett and Bajracharya,l979). En culture submergée,
des hautes teneurs en CO, sont capables d'inhiber la production de pénicilline (Pirt et
Mancini,l975) ou causer des changements morphologiques dans les cultures de
Penicillium chrysogenum (Ho et Smith,1986a). Compte tenu de ces résultats, il a été
montré que le contrôle de l'environnement gazeux peut ëtre utilisé pour optimiser les
procédés de fermentation et considérer un outil pour examiner les effets du CO, et de
l'oxygène sur le métabolisme microbien.
Les méthylcétones sont les principaux composés aromatiques du fromages bleu. Ils
sont utilisés comme ingrédient pour donner le goüt aux soupes, salades et autres plats.
Creuly et a1.(1990) ont utilisé une procédure de Fed-batch pour la production de
I'heptanone. Dans ce système, le pH est maintenu constant à 6,s et 0,4 mM/h d'acide a
pu ëtre consommé. Dans une expérience précédente (chapitre 2), nous avons montré
l'importance d'utiliser un solvant organique comme I'hexane dans la fermentation des
acides gras par P. roquefofli. L'hexane permet de multiplier jusqu'à trois fois le
rendement en heptanone. Mais en raison de sa volatilité, I'hexane diffuse plus
facilement dans le matériel de fermentation souvent couvert de silicone. Celui-ci gonfle
après un contact prolongé avec I'hexane, ce qui peut détériorer le matériel et fausser
les lectures des mesures.
Dans cette présente étude, nous avons au contraire utilisé l'octane, moins volatil que
I'hexane et considéré la faisabilité d'utiliser les spores dans une réaction Fed-batch en
présence d'un mélange d'air et de dioxyde de carbone. Dans ce travail, les effets de
CO, sur la formation de I'heptanone dans un fermenteur aéré et clos ont été examinés.
2.Résultats et Discussion
2.1. Influence du CO2 sur la production en rnéthylcétones.
Quatre séries de fermentation sont réalisées en opérant dans un milieu octane-eau.
Une quantité de 59 d'acide sont préalablement dissout dans 100 mL d'octane puis
alimenté dans le fermenteur à raison de 25 mL toutes les 4 heures. Un mélange d'airCO, est utilisé pour donner des concentrations finales dans le mélange de 5, 15, et
30% de CO, Les différentes fermentations sont comparées au contrôle dans lequel le
CO, n'a pas été ajouté. Le pH tout le long du procédé reste constant à 6.5 grâce à
l'addition de NaOH 2 N de manière automatique et la température est de 28 OC. Quant
aux concentrations d'heptanone, elles sont mesurées à des intervalles réguliers. Ces
résultats sont montrés sur la figure 17 et le tableau 6. Les valeurs reportées
représentent les valeurs moyennes de deux fermentations. II se dégage de ces résultats
que la concentration du CO, de la phase liquide exerce une influence sur la synthèse
de l'heptanone. Le tableau 6 montre que le maximum de concentration d'heptanone est
produite à 8 heures lorsqu'un mélange d'air à 15% de CO,
a été utilisé pour un
rendement de 64%. En présence de 30% de CO,, une très faible concentration est
produite avec un maximum à 12 h. En présence de 5% de CO,. un maximum de
rendement de 23% est atteint à 8 h.Toutes les concentrations de CO, présentent un
effet positif par rapport au témoin. Ce phénomène peut être dü à I'effet stimulateur du
CO, au niveau du cycle de Krebs. Mclntyre et McNeil (1997) ont travaillé sur Aspergilluç
niger et la conclusion qui est ressortie de cette étude montrait que I'isocitrate
déhydrogénase d'Aspergillus était affectée suggérant les effets spécifiques du C0,sur
des enzymes clés du cycle de Krebs. L'absence presque de production chez le témoin
montre l'effet hautement toxique de la concentration d'acide octanoïque utilisée même
en mode fed-batch. Enfin, le faible niveau de concentration en heptanone produite en
présence de 30% de CO, indique une inhibition du métabolisme secondaire et peut
être primaire lorsque les spores sont exposées à des hautes concentrations en dioxyde
de carbone. Ce faible niveau de production peut être le résultat de plusieurs
phénomènes. Premièrement, le CO, exerce une inhibition non spécifique des enzymes
nécessaires à l'utilisation du substrat ou une inhibition de leur consommation. le CO, à
forte concentration peut exercer un effet inhibiteur sur l'activité des spores. C'est le cas
où la pression partielle du dioxyde carbone dans la phase liquide est supérieure à la
pression normale dans le cytoplasme. L'entrée d'une excessive concentration en CO,
va générer une augmentation des ions HCO;
dans le cytoplasme et provoquer un effet
narcotique sur le métabolisme ou sur certaines voies du métabolisme primaire. Des
hautes concentrations de CO, peuvent provoquer des changements au niveau de la
paroi de la membrane des spores. Ho et Smith (1986b) ont étudié les altérations
morphologiques causés par différentes concentrations de dioxyde de carbone allant de
8 à 15% sur Penicillium chrysogenum. Des effets tels qu'un retard de production
d'antibiotique, une diminution de la vitesse de croissance et des changements
morphologiques ont été constatés. Ce sont d'abord les propriétés de transport
membranaire qui sont affectés en raison du gonflement provoqué par la pression
osmotique. Une étude sur l'inhibition de Sclrotium rolfsii (Kritzman et Henis, 1977) a
révélé une augmentation significative de I'isocitrate déhydrogénase et de I'isocitrate
lyase à des niveaux de CO, de 1-10%. Deuxièment, le changement de pH induit par des
hautes pressions partielles de CO, peuvent ëtre suffisantes pour perturber l'équilibre
enzymatique inteme. Tel changement de pH inteme peut affecter les enzymes comme
celles impliquées dans les réactions de décarboxylation qui produisent du CO, dans le
milieu. II n'est pas impossible également que l'accumulation de CO, dans la cellule
ralentit la vitesse de décarboxylation de l'acide octanoïque, qui est l'étape finale
conduisant à I'heptanone. Le CO, peut aussi exercer une influence indirecte sur les
enzymes en affectant leurs propriétés physico-chimiques, ou en réagissant avec les
acides aminé Comme ceux des protéines membranaires, et causant des changements
importants au niveau de l'activité.
2.2. Comportement des spores en mode discontinu et en mode Fed-batch
.
Les résultats montrent que la consommation du substrat diminue sous l'influence du
CO, et que la concentration en heptanone augmente lorsque les concentrations en CO,
sont minimales. Ceci peut indiquer que la première cause des effets indiqués peut
provenir du CO,. Lorsque la concentration du dioxyde de carbone est augmentée,
l'efficacité du CO,
est diminuée. Celui-ci. grâce à sa capacité à pénétrer les
membranes, peut produire des changements de pH intracellulaires. Ces changements,
causés par une forte diffusion, peuvent être suffisantes pour perturber les équilibres
enzymatiques.
Dans une fermentation en discontinu (expériences du chapitre 2), la vitesse de
production de I'heptanone à partir de 5 mM de sel d'acide octanoïque est de 0,32 mM/h
soit 2,29'1UV mmole de produit formé par heure et par spore. Dans une réaction en fedbatch en présence de l'acide octanoïque dissous dans l'octane, la vitesse de réaction
est nettement améliorée et donne 2,78mM/h. Dans une autre expérience en fed-batch,
les spores ont été immobilisées afin d'améliorer la stabilité mécanique des spores
(Creuly et a1..1990). Un taux de transformation de substrat de 1,73mMlh de substrat a
été alors observé. Leur expérience a été réalisée sur du Bioflo C30, du verre où les
spores se collent et s'agglutinent. Les résultats de l'expérience en Fed-batch en
présence de 15% de CO, sont comparés à ceux de Creuly et a1.(1990). Ils montrent
que l'expérience réalisée dans un fermenteur en Teflon évite le problème de
l'agglutination et donne un taux de transformation supérieur à près de 65%, soit
2,78mM/h (tableau 7).
2.3. Vitesse de production de I'heptanone
La vitesse de production de I'heptanone par Penicillum roqueforti est un important
paramétre pour apprécier la performance du micro-organisme. L'effet du dioxyde de
carbone sur la vitesse de
production de I'heptanone est examiné pour chaque
fermentation et comparé par rapport au témoin. La figure 18 montre que des fortes
concentrations de dioxyde de carbone sont capables de réduire sérieusement la
capacité des spores de P. roquefort! à produire de I'heptanone. Lorsqu'un mélange de
CO, à 15% est utilisé. la vitesse de production atteint un maximum de 2.78 mMlh à 8 h.
Quand un mélange d'air et de CO, à 30% est injecté dans le fermenteur, la vitesse de
production est considérablement réduite par rapport à un mélange de CO, à 15% ou
5%. Cependant, l'utilisation du CO, à 30% est toujours bénéfique si on compare au
témoin. Ce dernier est presque incapable de transformation en raison de la
concentration de l'acide octanoïque hautement toxique utilisée (34 mmoles).
Les
spores non stimulées par le CO, ne sont plus capables de transformation. Lorsque les
spores sont soumises
à des concentrations de 30% de CO,, la production de
I'heptanone est faible et la raison peut être attribuée à une accumulation toxique du
dioxyde de carbone et ou des changement morphologiques des spores à de telles
concentrations ( Ho et Smith, 1986a ;1986b). Ces auteurs ont étudié l'effet du CO, de 3
à 20% sur la production de la pénicilline. Ils ont montré que ses effets qui réduisent la
vitesse de production, sont associés à des changements morphologiques de Pénicillium
chrysogenum.
Tableau 6. Effet du CO2 s u r la production de I'heptanonea
Temps
%CO?
4h
8h
12 h
16 h
"5% d'acide octanoïque dans octane (ph), hydrolysat de caséine (0.04 g/mL),
10gspores; 28OC. Milieu aqueux, volume total=SOOmL.
Tableau 7. Effet du type de fermentation et du CO2 sur la productivité en heptanonea
[Subsuat initiale]
Vitesse maximale*
mm
1
I+Octane
l
Discontinu
+hexane
1
Témoin
30% CO?
Vitesse production
mmolrm/ spore
0,003
0.3
produit total formé
5 l6h (mmoles)
0,014
1,97*1O"~
5miM
0.32
2,29* IO'"
2Omh4
0.15
2,j*10.11
3,23
fed-batch
immobilisé
4mM
Vempérature=28 O C , pHS.5 ; Volume total, 500 mL. "reuly et a1.1990 ' Substrat dont
production estimée à 100% de transformation en heptanone. ' La vitesse n'est pas
linéaire tout au long de la réaction de fermentation. La vitesse maximale est enregistrée
au cours de la première phase de la réaction (durant les premières 8h pour la réaction
fed-batch et durant les 18 premières heures pour la réaction discortinue en présence
d'hexane).
4
8
12
16
temps (h)
Figure 17. Effet de la concentration du dioxyde de carbone sur la production
d'heptanone en mode fed-batcha .5% d'acide octanoïque dans octane (p/v). hydrolysat
de caséine (0,04 glmL). 10gspores,28°C.Milieu aqueux, volume totak500mL. La barre
représente l'écart type. Le témoin était incapable de produire de I'heptanone à cette
concentration d'acide.
4
8
12
16
Temps (h)
Figure 18. Effet de la concentartion du dioxyde de carbone aqueux sur la vitesse de
production de l'heptanoneaau cours de la fermentation 5% d'acide octanoïque dans
octane (ph), hydrolysat de caséine (0,04 g/mL), 109 spores, 28°C. Milieu aqueux,
volume total=500 mL.
Cette étude a montré que le dioxyde de carbone est capable d'influencer la production
de I'heptanone par les spores de
P. roqueforfi. Pour les trois concentrations de dioxyde
de carbone utilisées pour l'expérience, le mélange à 30% réduit la productivité. La
fermentation soumise à 15% de CO, résulte
en une
nene augmentation de la
productivité. La fermentation exposée à 5% de CO, est peu affectée. Quant à la
fermentation conduite en absence de CO, elle montre que ce gaz est, d'une part
nécessaire pour stimuler la production et d'autre part que les spores sont incapables de
fermenter I'acide octanoïque en présence d'une aussi forte concentration en raison de
sa toxicité.
Castelli,A.Littani, J.P. et Barbesie,G. 1969. Effect of pH and CO2 ccncentration
chançc
-7
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ANNEXES
Valeurs numériques pour les tableaux et les figures
Tableau 2. Effet(%) des activateurs sur la transfonation de i'acide gras
Figure3. Effet de la longueur des chaînes d'acides gras sur la conversion en
rnéthylcétones correspondantes
Cétone isolél acide de départ
Cl0
xl
1 .2
C6
O
x2
0.8
Moyenne
1= 0.28
O
Cétone isolél acide transformé
CIO
CS
C6
2.08
65.6
O
CIO
30.1
C6
6.8
3.92
75.8
O
311.3
70.72721
Acide transformé
37.3
33.74.09
10.8
8.8e.82
70.3
98
96
66.3d.5 1
94.3fi.23
91.2t6.78
Acide isole
C 10
C8
C6
62.1
90.6
86.1
e
Figure 4. Effet de la concentration d'acide octanique sur le rendement en heptanone
Concentration
(en ppm)
xl
l.8x10bspores
x2
x3
M0ye~e22
10.7
22.8
30.:
..-.
a.> 7
36.8
35
8.2
26.6
28.7
34.6
37
38
6.9
31.3
41.7
42.8
48
48.5
6.2
26.9~4.25
33.5536
36.76.36
40.6k6.4
40.5+7.08
7.111.01
21
32
43
54
65
Figure 5. Effet de la concentration initiale d'acide octanoique et du temps de
fermentaticn sur le rendement en heptanone
Concentration d'acide(ppm)
32 ppm
Temps(h) x l
2
2.3
4
6,7
8
15,2
16
24.8
Temps(h) x l
2
2,s
4
85
18,4
8
16
25.6
Temps(h)
2
4
8
16
x2
03
8.3
21,4
29
54ppm
Moyenne
1,620.58
7,521.13
18,314.38
26.9Q.96
x2
03
3,6
15.8
29.2
81P P ~
xl
2.6
52
18,6
27.9
x2
09
7,4
23
28.5
Moyenne
1.4+1.55
6.12353
17,121.83
27.4Q.54
Moyenne
1,521.53
6,321.55
20,823.1 1
28.220.42
43ppm
xl
2,5
7,1
18,2
25.7
65ppm
xl
2,2
4,7
20,8
26.5
x2
0,3
5.7
21,2
33.1
Moyenne
1,421.55
6,410.98
19.7Q.12
29.425.23
Moyenne
1
1.620.84
7,7 6,2Q.12
18
19,421.97
25.325.9+0.84
x2
Figure 6. Effet de la concentration en sel d'acide octananoique sur le rendement en
heptanone
Temps (h) xl
16
12,5
42,8
72.3
Moyenne
11,l
47,4
75.9
11,8+0.98
45,113.25
74.122.54
Figure 7. Activation de i'oxydation de i'octanoate de sodium par différents activateurs
B différentes concentrations d'acide
Figure 8. Utilisation des acides aminés provenant de I'hydrolysat de caséine durant la
fermentation de I'octanoate de sodium par P.roqueforti
Moyenne
0,04510.019
0,013
0.01 1
Moyenne
12
16
0,051 1
0,0158
0.00457
0,003
0,004
Moyenne
12
16
0,045
0.036
0,023
0,021
Chapitre 2
Tlibleilu 4. Effet de I'hexane sur la biosynthke de I'heptanone h différentes rempér~tures.
4
8
12
16
4
8
12
16
11,6
16,2
70,s
68.1
14,2
80
76.5
20°C
15,2'1,41
75,4+6,50
72.315.93
xl
x2
11,2
16.2
65,4
51.1
56
8,4c3,95
56,4
36.7
60,9r6,36
43.9210.18
Tableau 5. Effet de I'hexane sur le rendement en biomasse en présence et en
absence d'hexane
12
16
Matière sèche avec hexane (mglL)
moyenne
80+5,65
95+7,07
70
75+7,07
7521 1,31
83
12
16
Matière sèche sans hexane (mg/L)
moyenne
100+4,24
11012,82
112
108
112
108
110+2,82
106
114
110+5.65
Figure 13. Evolurion de la consommxion d'oxyghne par les spores en absence de substnr
Quantité d'oxygène dissous (ppm)
Temps (h)
O
2
4
6
8
1O
12
14
16
18
20
22
xl
11.86
9,68
8,78
8,68
8,79
9,Ol
936
9,41
9,74
10.35
10,s
10,6
x2
11.9
9,76
92
8.88
8,95
9,17
9,46
9.53
9,88
10,19
10,68
10.46
moyenne
11,8810.028
9,7210,056
8,9910,296
8,7810,141
8,8710,113
9,09t0,118
9,41=0,070
9,4710,084
9,8110,098
10,27r0,113
10,5910,127
10,5310,098
Figure 14. Evolution de la consommation d'oxjgene durant la fomentation de
I'octanoate de sodium
Temps (h)
O
2
8
12
16
18
24
32
42
48
Quantité d'oxygène dissous (ppm)
x2
moyennele
xl
4,936
11,38
10,249
8,41
8,23
0.375
0,387
0,382
0,391
0.45
4.982
11,56
10,433
9,15
644
0.355
10,401
0,402
0,413
1.638
4,95920,032
11,47+0,127
10,341 20,130
8,78t0,523
7,33521,265
0,365=0,014
0.394=0,009
0,39220,014
0,402=0,015
1.044+0.840
Fiaure 14. Evolution du DH durant la fermentation de I'octanoate de sodium
Mesures de pH durant la fermentation
moyenne
Temps (h) pH1
pH2
O
2
8
12
16
18
24
32
42
6,l
6,047
63
6,378
634
6,342
636
6,39
6.38
6,02
6,037
6,154
6,384
6.56
6.42
6,41
4,338
4.574
6,0630,056
6,042=0,007
6,22710.1 03
6,38120,004
6,4520.1 55
6,38150,055
6,385*0,035
5,36451,450
5,47721,277
Figure 15.Evolution du produit formé au cours de la fermentation
Heptanone (produit) formé
Temps(h) xl
x2
Moyenne
O
6
18
24
32
42
48
O
O
0.169+0,028
0,475+0,236
0,434+0.107
0,391+0,084
0,35420,083
0.389+0,008
O
0,149
0.642
051
0,451
0,413
0,395
0,189
0,308
0.358
0,331
0,295
0,383
Figure 15. Evolution du substrat résiduel au cours de la fermentation
Acide(substrat résiduel) isolé
Temps
xl
O
0.83
0.37
0,Ol
O
O
O
6
18
24
32
42
48
50
O
x2
083
0,47
0,054
O
O
O
O
O
Moyenne
083
0,42+0,070
0,032=0.031
O
O
O
O
O
Figure 15.Evolution de la biomasse au cc-irs de la fermentation
Biomasse(matière sèche) en g/L
Temps
xl
O
0,1E4
0,163
0,162
0,135
0,135
0,135
0.134
0.136
6
18
24
32
42
48
50
x2
0,166
0,147
0,088
0,115
0,115
0.115
0,136
0.164
Moyenne
0,165+0.001
0,155+0,011
0.125+0,052
0,125+0,014
0,125+0,014
0,125+0,014
0,135+0,001
0.15+0.019
Fioure 16. Evolution du pH en absence d'hydrolysat de caséine pendant la
fe;mentation de I'octanoate de sodium.
Temps(h)
1
.
2
4
6
8
1O
12
14
16
pH en absence d'hydrolysat de Caseine
moyenne
x2
xl
6,65+0,56
6,69
6,61
6,53i0,141
6,63
6.43
6,5i0,226
6,66
6,34
6,553~0,113
6,47
6,63
6,750,438
6.39
7.01
7,Ol *C.551
6.62
7.4
7,37i0,070
7,32
7,42
7,67+0,155
7,78
7,56
7.82i0.056
7.86
7.78
Chapitre 3
Tableau 6. Effet du C0,sur la production de I'heptanone
Melange d'air et de 5% de CO2
moyenne
initiale rnrnoles
12
16
Temps(h)
12
16
17,36
26,04
5,Ol
34.72
3.2
Melange d'air et de 15% de CO2
Concentration
1x1
26.04
6,04
34.72
0.9
Meiange d'air et de 30% de CO2
3,49
1.54
1,18t1,159
4,05t1,060
4,2521,074
2,3721,173
x2
moyenne
2.96
1.68
1
moyenne
initiale rnrnoles
16
17,36
26,04
34.72
0,38
0.9
0.5
1
0.92