Evaluation de la réponse immunitaire spécifique chez la souris
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Université d’Oran Faculté des Sciences Département de Biologie Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire ﺟﺎﻣﻌﺔ وهﺮان آﻠﻴﺔ اﻟﻌﻠﻮم ﻗﺴﻢ اﻟﺒﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺎ ﻣﺨﺒﺮ ﻓﺴﻴﻮﻟﻮﺟﻴﺎ اﻟﺘﻐﺬﻳﺔ واﻷﻣﻦ اﻟﻐﺬاﺋي MEMOIRE DE MAGISTER Option : Physiologie de la Nutrition et la Sécurité Alimentaire Thème : Evaluation de la réponse immunitaire spécifique chez la souris Swiss après ingestion subchronique de la tartrazine Présenté par Melle GUENDOUZ MALIKA Soutenu en : 2010 Devant les membres du jury : Devant le Jury composé de : Président : Mr BOUTIBA Z. Examinateur : Mr KHEROUA O. Professeur, Université d’Oran Professeur, Université d’Oran Mr SAHRAOUI T. Maître de Conférence A, Université d’Oran. Rapporteur : Mr SAIDI D. Professeur, Université d’Oran. Co-rapporteur : Mme HOUDJEDJ-MEHEDI N. Chargée de Cours, Université d’Oran. 15 À Dieu, En qui j’ai toujours cru, En qui je croirai toujours. À mes parents, sans qui je n’aurai jamais réalisé tout ce parcours. Ce mémoire leur est dédié. À mes soeurs et mes frères pour leur soutien et leurs encouragements continus. Je le dédie à toute ma famille et mes amies. 16 Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire sous la direction de Monsieur Djamel SAIDI Professeur de Physiologie au Département de Biologie (Université d’Oran). Que Monsieur SAIDI et Monsieur KHEROUA veuillent accepter mes remerciements les plus sincères pour la confiance qu’ils m’ont accordée durant la réalisation de ce travail et surtout pour m'avoir accueillie au sein de leur équipe de recherche J’exprime mes plus vifs remerciements à Monsieur Djamel SAIDI pour son encadrement scientifique, sa disponibilité, ses conseils pertinents. Merci de m’avoir guidée avec patience et d’avoir consacré autant d’heures pour les corrections de ce manuscrit. Merci à Monsieur Zitouni BOUTIBA Professeur à l’Université d’Oran qui me fait l’honneur de présider ce jury. Je lui suis reconnaissante d’avoir accepté ce rôle, et de me faire l’honneur de juger mon travail. J’exprime toute ma gratitude à Monsieur Omar KHEROUA Professeur à l’Université d’Oran qui a bien voulu agir en tant qu’examinateur et qui m’a fourni de précieux conseils tout au long de la réalisation de ce travail. J’adresse mes vifs remerciements à Monsieur Toufik SAHRAOUI Maître de Conférence à l’Université d’Oran, pour sa participation dans l’évaluation de ce travail. Qu’il trouve ici l’expression de ma très profonde reconnaissance. Ma profonde reconnaissance va aussi à Mme Nabila HOUDJEDJ-MEHEDI, Chargée de Cours à l’Université d’Oran, pour sa grande rigueur scientifique et ses conseils avisés. Je la remercie profondément de m’avoir procuré un coencadrement rigoureux et si précieux. Ce travail n’aurait pas été aussi efficace sans la contribution de nombreuses personnes dont le savoir être et le savoir faire méritent d’être soulignés. Merci à : Mme Tabak bessaih, zaoui chahinaz, Dr Fellah H, Dr Fellah Setti L. Mes remerciements vont tout particulièrement à Mr Abdellah CHEKROUN pour son aide scientifique, Mme Hanane NEGAOUI pour toutes ses connaissances qu’elle a su partager avec joie. Je la remercie pour son aide et ses conseils qui m’ont été précieux pour la réalisation de ce travail. Un grand merci et tous mes encouragements à toute ma promotion de magister : Melle Amina BRAHIM, Melle Fatima TBAHRITI, Melle Nasira LAHOUEL, Melle Abir HADDI, et Melle Soade BOUDALI et Mr Omar ALAMI. . Que toutes les personnes du laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire, trouvent ici, l'expression de ma vive reconnaissance : Melle Hanane KADDOURI, Mr Kamel Edine EL MECHERFI, Mr Khaled NAAMAN, Mme Samia ADDOU, Mr Fateh MEZMAZ. Merci infiniment à tous. 17 RESUME La tartrazine est un colorant alimentaire synthétique, très incriminé dans les réactions d’intolérances chez les personnes sensibles. Les mécanismes physiopathologiques impliqués et l’immunotoxicité de ce colorant sont peu connus. Le but de notre travail est d’évaluer la réponse immunitaire spécifique après ingestion subchronique de la tartrazine chez la souris Swiss, utilisée comme modèle expérimental. 2 groupes de souris comprenant chacun 12 mâles et 12 femelles âgées de 4 semaines et pesant en moyenne 19g sont utilisés. Les animaux sont nourris à l’aide d’un régime standard et reçoivent pendant 90 jours consécutifs de l’eau de breuvage supplémentée de tartrazine aux concentrations respectives de 0,45% et 1%. Chaque essai est comparé à un traitement contrôle (eau de boisson sans tartrazine) comprenant également 12 mâles et 12 femelles. Quotidiennement, est déterminé le volume de tartrazine diluée dans l’eau de boisson consommé par les souris et hebdomadairement le poids corporel. Après 90 jours d’expérience, 6 souris de chaque groupe sont immunisées par voie sous cutanée avec une émulsion de SAB et d’adjuvant complet de Freund. Les teneurs des IgG antiSAB sont déterminés par méthode ELISA. La rate, le thymus et l’intestin sont prélevés pour l’étude cytologique et histologique puis la rate et le thymus sont pesés pour déterminer le poids relatif. Les résultats obtenus montrent que: La consommation subchronique de la tartrazine ralentit significativement l’évolution du poids corporel des groupes traités à 0,45% et 1% de tartrazine comparés aux témoins (p<0,05). une diminution du poids relatif de la rate chez les animaux mâles traités à 1% de tartrazine et du thymus chez les mâles du groupe traités à 0.45% de tartrazine (p<0,05). La cinétique comparative des titres en IgG anti-SAB montre une diminution très significative de la teneur en IgG anti-SAB chez les animaux mâles traités à 0,45% et 1% de tartrazine comparé aux témoins immunisés au J28 ( p<0,01). L’observation des coupes histologiques révèlent une modification de l’architecture tissulaire au niveau de la rate et du thymus avec une augmentation des infiltrats lymphocytaires ainsi qu’une atrophie villositaire primaire chez les animaux mâles et femelles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%. Sur le plan cytologique, on distingue une hyperplasie cellulaire chez les souris traitées à la tartrazine à la dose de 0,45% et une atrophie lymphocytaire avec une malformation des cellules lymphocytaires marquée chez les animaux traités à 1% de tartrazine. Conclusion: L’ingestion subchronique de la tartrazine entraîne une diminution de la teneur en IgG-anti SAB sériques chez les mâles et modifie le nombre et la taille des cellules immunitaires intestinales et l’architecture tissulaire de la rate et du thymus et affecte donc la fonction du système immunitaire. Mots clés : Tartrazine – Consommation subchronique – Souris Swiss – IgG – Rate –Thymus – Intestin. 18 SUMMARY Tartrazine is a synthetic food colorant, very implicated in intolerance reactions in sensitive individuals. The pathophysiological mechanisms involved and immunotoxicity of this dye is poorly understood. The aim of this work is to evaluate the specific immune response after subchronic ingestion of tartrazine in the Swiss mice, used as experimental model. 2 groups of mice, understanding/including each one 12 males and 12 females 4 weeks old and weighing on average 19g are used. The animals are feed using a standard diet and receive during 90 days consecutive water breuvage supplemented with tartrazine with the respective concentrations of 0,45% and 1%. Each test is compared with to a control treatment (drinking water without tartrazine) also including 12 males and 12 females. Daily, is determined the volume of tartrazine diluted in the water of drink consumed by mice and the body weight of each mouse was also recorded on a weekly basis. After 90 days of experiment, 6 mice in each group were immunized subcutaneously with an emulsion of SAB and Freund's complete adjuvant. The contents of the IgG anti-SAB are determined by ELISA method. The spleen, thymus and intestine were taken for the cytological and histological study then the spleen and thymus are weighed to determine the relative weight. The results obtained show that: The subchronic consumption of tartrazine to slow down meaningfully the evolution of the body weight of the groups treated to 0,45% and 1% of tartrazine compared to the witnesses (p<0,05). Reduction in the relative weight of spleen in the male animals treated with 1% of tartrazine and the thymus in the males of the group treated with 0,45% of tartrazine (p<0,05). The comparative kinetic of the titles in IgG anti-SAB shows a decrease in amount of IgG anti-SAB in male animals treated with 0,45% and 1% tartrazine compared with controls immunized at D28 (p <0,01). Observation of histological sections revealed a change in tissue architecture in the spleen and thymus with increased lymphocyte infiltration and villous atrophy primary among males and females treated at doses of tartrazine 0,45 % and 1%. On cytological level, there is cell hyperplasia in mice treated with tartrazine in doses of 0,45% and lymphocytic atrophy with lymphocytic cells malformation marked in animals treated with 1% tartrazine. Conclusion: the subchronic ingestion of tartrazine causes a decrease in the amount of IgG antiserum SAB of males mice and modifies the number and size of intestinal immune cells and the tissular architecture of the spleen and the thymus and thus affects the immune system function. Keywords: Tartrazine - Consumption Subchronic - Swiss mice - IgG- Spleen- Thymus- Intestine. 19 ﻣﻠﺨﺺ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻣﻠﻮن ﻏﺪاﺋي اﺻﻄﻨﺎﻋﻲ ،ﻳﻈﻬﺮ ﻓﻲ اﻟﻌﺪﻳﺪ ﻣﻦ ردود اﻟﻔﻌﻞ اﻟﻤﺘﻌﺼﺒﺔ ﻋﻨﺪ اﻷﻓﺮاد اﻟﺤﺴﺎ ﺳﺔ ،اﻵﻟﻴﺎت اﻟﻤﺸﺎرآﺔ ﻓﻲ اﻟﻔﻴﺰﻳﻮﻟﻮﺟﻴﺎ اﻟﻤﺮﺿﻴﺔ وﺗﺴﻤﻢ اﻟﺠﻬﺎز اﻟﻤﻨﺎﻋﻲ ﻟﻬﺬا اﻟﻤﻠﻮن ﻏﻴﺮ ﻣﻔﻬﻮﻣﺔ. اﻟﻬﺪف ﻣﻦ هﺬا اﻟﺒﺤﺚ هﻮ ﺗﻘﻴﻴﻢ اﻻﺳﺘﺠﺎﺑﺔ اﻟﻤﻨﺎﻋﻴﺔ اﻟﻤﺤﺪدة ﺑﻌﺪ اﺳﺘﻬﻼك اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ E102ﻟﻤﺪة ﺛﻼﺛﺔ أﺷﻬﺮ ﻋﻨﺪ اﻟﻔﺌﺮان اﻟﺴﻮﻳﺴﺮﻳﺔ ،ﺗﺴﺘﺨﺪم آﻨﻤﻮذج ﺗﺠﺮﻳﺒﻲ. ﻓﻮﺟﺎن ﻣﻦ اﻟﻔﺌﺮان ﻳﺤﺘﻮي آﻞ ﻣﻨﻬﻤﺎ ﻋﻠﻰ 12ذآﺮا و 12أﻧﺜﻰ ﻳﺒﻠﻐﻮن ﻣﻦ اﻟﻌﻤﺮ 4أﺳﺎﺑﻴﻊ و ﻳﺰﻧﻮن 19غ .ﻳﺘﻢ ﺗﻐﺬﻳﺔ اﻟﺤﻴﻮاﻧﺎت ﻣﻊ إﺗﺒﺎع ﻧﻈﺎم ﻏﺬاﺋﻲ ﻣﻌﻴﻦ إﺿﺎﻓﺔ إﻟﻰ ﻣﻴﺎﻩ ﺷﺮب ﻣﻤﺰوﺟﺔ ﻣﻊ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻟﻤﺪة 90ﻳﻮﻣﺎ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ٪1 , ٪0,45 :ﻋﻠﻲ اﻟﺘﻮاﻟﻲ .آﻞ اﺧﺘﺒﺎر ﻳﻘﺎرن ﻣﻊ ﻋﻼج ﺷﺎهﺪ )ﻣﻴﺎﻩ ﺑﺪون ﺗﺮﺗﺮازﻳﻦ( .ﻳﺤﺘﻮي أﻳﻀﺎ ﻋﻠﻰ 12ذآﺮ و 12أﻧﺜﻰ. ﻳﻮﻣﻴﺎ ﻳﺘﻢ ﺗﺤﺪﻳﺪ ﺣﺠﻢ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ اﻟﺘﻲ ﻳﺴﺘﻬﻠﻜﻬﺎ اﻟﻔﺌﺮان ﻓﻲ ﻣﻴﺎﻩ اﻟﺸﺮب ووزن اﻟﺠﺴﻢ آﻞ أﺳﺒﻮع. ﺑﻌﺪ 90ﻳﻮﻣﺎ ﻣﻦ اﻟﺘﺠﺮﺑﺔ 6 ،ﻓﺌﺮان ﻓﻲ آﻞ ﻓﻮج ﺗﻢ ﺗﻠﻘﻴﺤﻬﺎ ﺗﺤﺖ اﻟﺠﻠﺪ ﺑﻤﺴﺘﺤﻠﺐ ﻣﻦ ﺑﺮوﺗﻴﻦ ﺑﻘﺮي SABﻣﻊ ﻣﺎدة ﻣﺴﺎﻋﺪة آﺎﻣﻠﺔ ﻓﺮوﻧﺪ .ﺗﻘﺪر ﻧﺴﺒﺔ اﻟﻐﻠﻮ ﺑﻠﻴﻨﺎت اﻟﻤﻨﺎﻋﻴﺔ IgGاﻟﻤﻀﺎدة ل SABﺑﺘﻘﻨﻴﺔ ، ELISAﻧﻨﺰع اﻷﻋﻀﺎء:اﻟﻄﺤﺎل و اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ و اﻷﻣﻌﺎء ﻣﻦ اﺟﻞ اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﺨﻠﻮﻳﺔ واﻟﻨﺴﻴﺠﻴﺔ .أﻣﺎ اﻟﻄﺤﺎل و اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ ﻳﺘﻢ وزﻧﻬﻢ ﻟﺘﺤﺪﻳﺪ اﻟﻮزن اﻟﻨﺴﺒﻲ . اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ اﻟﺘﻲ ﺣﺼﻞ ﻋﻠﻴﻬﺎ ﺗﺒﻴﻦ أن اﺳﺘﻬﻼك اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻟﻤﺪة ﺛﻼﺛﺔ أﺷﻬﺮ ﻳﺒﻄﺊ ﻣﻦ ﺗﻐﻴﺮ ﻓﻲ وزن اﻟﺠﺴﻢ ﻓﻲ اﻷﻓﻮاج اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ب ٪0,45و ٪ 1ﻣﻘﺎرﻧﺔ ﻣﻊاﻟﻔﻮج اﻟﺸﺎهﺪ ).(P<0,05 اﻧﺨﻔﺎض اﻟﻮزن اﻟﻨﺴﺒﻲ ﻟﻄﺤﺎل ﻟﺪي اﻟﺬآﻮر اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ب ٪ 1ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ و اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ ﻟﺪي اﻷﻓﻮاج اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ب 0,45 ٪ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ).(p<0,05 اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﻨﺴﺒﻴﺔ اﻟﻤﻘﺎرﻧﺔ ﻟﻤﺴﺘﻮﻳﺎت اﻟﻐﻠﻮﺑﻠﻴﻦ اﻟﻤﻨﺎﻋﻲ IgGاﻟﻤﻀﺎدة ل SABأﻇﻬﺮت اﻧﺨﻔﺎﺿﺎ ﻣﻠﺤﻮظ ﻓﻲ ﻣﺴﺘﻮﻳﺎتاﻟﻐﻠﻮﺑﻠﻴﻦ اﻟﻤﻨﺎﻋﻲ GIgاﻟﻤﻀﺎدة ل SABﻟﺪي اﻟﺬآﻮر اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ب ٪ 0,45و ٪ 1ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻣﻘﺎرﻧﺔ ﻣﻊ اﻟﻔﻮج اﻟﺸﺎهﺪ اﻟﻤﻠﻘﺢ ﻓﻲ اﻟﻴﻮم .(p<0,01) 28 اﻟﺪراﺳﺔ اﻟﻨﺴﻴﺠﻴﺔ آﺸﻔﺖ ﻋﻦ وﺟﻮد ﺗﻐﻴﺮ ﻓﻲ اﻟﺒﻨﻴﺔ اﻷﻧﺴﺠﺔ ﻓﻲ اﻟﻄﺤﺎل و اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ ﻣﻊ ﺗﺰاﻳﺪ ﻋﺪد اﻟﻠﻤﻔﺎوﻳﺎت اﻟﻤﺘﺴﻠﻠﺔ وﺿﻤﻮر اﺑﺘﺪاﺋﻲ ﻋﻠﻲ ﻣﺴﺘﻮي اﻟﺰﻏﺒﺎت اﻟﻤﻌﻮﻳﺔ ﻋﻨﺪ اﻟﺬآﻮر واﻹﻧﺎث اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ﺑﺘﺮاآﻴﺰ ٪0,45و ٪1ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ. ﻋﻠﻰ اﻟﻤﺴﺘﻮى اﻟﺨﻠﻮي ،هﻨﺎك ﺗﻀﺨﻢ ﻓﻲ ﺧﻼﻳﺎ اﻟﻔﺌﺮان اﻟﺘﻲ ﻋﻮﻟﺠﺖ ٪ 0,45ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻣﻊ ﻣﻼﺣﻈﺔ ﺿﻤﻮر و ﺗﺸﻮﻩﻟﻠﺨﻼﻳﺎ اﻟﻠﻤﻔﺎوﻳﺔ ﻋﻨﺪ اﻟﺤﻴﻮاﻧﺎت اﻟﻤﻌﺎﻟﺠﺔ ب ٪1ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ. اﻟﺨﻼﺻﺔ :اﺳﺘﻬﻼك اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ ﻟﻤﺪة ﺛﻼﺛﺔ أﺷﻬﺮ ﻳﺴﺒﺐ اﻧﺨﻔﺎض ﻣﺴﺘﻮﻳﺎت اﻟﻐﻠﻮﺑﻠﻴﻦ IgGاﻟﻤﻀﺎدة ل SABﻓﻲ اﻟﻤﺼﻞ ﻋﻨﺪ اﻟﺬآﻮر و ﺗﻐﻴﺮ ﻓﻲ ﻋﺪد و ﺣﺠﻢ اﻟﺨﻼﻳﺎ اﻟﻤﻨﺎﻋﻴﺔ ﻓﻲ اﻷﻣﻌﺎء واﻟﺒﻨﻴﺔ اﻟﻨﺴﻴﺠﻴﺔ ﻟﻄﺤﺎل و اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ و ﺑﺎﻟﺘﺎﻟﻲ ﻳﺆﺛﺮ ﻋﻠﻲ وﻇﻴﻔﺔ ﻧﻈﺎم اﻟﻤﻨﺎﻋﺔ. اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ :اﻟﺘﺮﺗﺮازﻳﻦ -اﺳﺘﻬﻼك ﺷﺒﻪ ﻣﺰﻣﻦ -اﻟﻔﺄر اﻟﺴﻮﻳﺴﺮﻳﺔ - IgG -اﻟﻄﺤﺎل -اﻟﻐﺪة اﻟﺼﻌﺘﺮﻳﺔ – اﻷﻣﻌﺎء. 20 ABREVIATIONS ADN : Acide d’désoxyribonucléique AFC : Adjuvant Complet de Freund AICF : Adjuvant Incomplet de Freund AINS : Anti Inflammatoires Non Stéroïdiennes ANVISA : Agence de la Surveillance Sanitaire brésilienne CSAH : Comité Scientifique de L’alimentation Humaine DC : Cellules dendritiques. DJA : Dose Journalière Admissible DSE : Dose Sans Effet ELISA : Enzym Linked Immuno Sorbent Assay FAO : Food And Agriculture Organisation Ig : Immunoglobuline IgE :Immunoglobuline E IgG : Immunoglobuline G JECFA : Joint Expert Comite Food Additive OPD : Orthophényléne diamine SAB : Sérum albumine bovine TPODACP: Tests De Provocation En Double Insu Contre Placebo TDAH : Trouble Déficit D’attention /Hyperactivité TH : T helper WHO : World Health Organisation 21 LISTE DES FIGURES ET DES TABLEAUX Liste des figures Figure 1 : Structure moléculaire de la tartrazine ........................................................................... 4 Figure 2 : Structure chimique de la tartrazine ............................................................................... 4 Figure 3 : Représentation schématique de la structure du thymus .............................................. 19 Figure 4 : Structures anatomiques de la rate et coupe à travers une artériole et un follicule ; circulation des lymphocytes. .......................................................................................................... 21 Figure 5 : Schéma de répartition des souris par différents groupes expérimentaux .................... 26 Figure 6 : Etapes du dépôt des sérums et solutions tampons pour le dosage ELISA des anticorps ......................................................................................................................................... 31 Figure 7: Croissance pondérale des souris femelles reçevant pendant 90 jours de tartrazine aux doses de 0,45% et 1% .................................................................................................................... 40 Figure 8 : Croissance pondérale des souris mâles reçevant pendant 90 jours de tartrazine aux doses de 0,45% et 1% ................................................................................................................... 41 Figure 9 : Consommation de tartrazine (ml/j/souris) diluée dans l’eau de boisson aux doses de 0,45% et 1% pendant 90 jours d’expérimentation. ........................................................................ 43 Figure 10 : Effet de la tartrazine sur le poids relatif de la rate chez les animaux mâles et femelles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine pendant 90 jours de consommation de tartrazine ................................................... 44 Figure 11 : Effet de la tartrazine sur le poids relatif du thymus chez les animaux mâles et femelles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine pendant 90 jours de consommation de tartrazine. .................................................. 45 Figure 12 : Effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate chez les mâles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% .............................................................................................. 47 Figure 13: Effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate chez les femelles traitées à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% ............................................................................................ 48 Figure 14 : Effet de l’immunisation sur le poids relatif du thymus chez les mâles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% .............................................................................................. 49 Figure 15: Effet de l’immunisation sur le poids relatif du thymus chez les femelles traitées à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% .............................................................................................. 50 22 Figure 16: Cinétique comparée des titres en IgG spécifiques mesurés par ELISA. Entre les femelles après l’immunisation à la SAB des groupes traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% ............................................................................................................................................... 52 Figure 17: Cinétique comparée des titres en IgG spécifiques mesurés par ELISA. Entre les femelles après l’immunisation à la SAB des groupes traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% ............................................................................................................................................... 53 Figure 18: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).................... 55 Figure 19: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 55 Figure 20 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon)... ...................................................................................................................................... 55 Figure 21 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ........................ 56 Figure 22 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traités à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 56 Figure 23 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traités à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 56 Figure 24 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ... 57 Figure 25 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 57 Figure 26 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 57 Figure 27 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) 58 23 Figure 28 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) .................................................................................................................. 58 Figure 29 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 58 Figure 30 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). ....................... 59 Figure 31 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon)…. .................................................................................................................................... 59 Figure 32: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 59 Figure 33 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).................... 60 Figure 34: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 60 Figure 35: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). ........................................................................................................................................ 60 Figure 36 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) .... 61 Figure 37: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus de souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 61 Figure 38 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 61 Figure 39 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) 62 24 Figure 40: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ............................................................................................................. 62 Figure 41 : Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 62 Figure 42: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ........................ 63 Figure 43: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... 63 Figure 44: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum de souris mâle traitées à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ......................................................................................................................................... ... 63 Figure 45: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).................... 64 Figure 46: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). ........................................................................................................................................ 64 Figure 47: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ....................................................................................................................................... 64 Figure 48: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ... 65 Figure 49: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 65 Figure 50: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 65 Figure 51: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) 66 25 Figure 52: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) .................................................................................................................. 66 Figure 53: Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) ...................................................................................................................... 66 Figure 54: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ............................................................68 Figure 55: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100 coloration à l’hémalun –éosine) ... 68 Figure 56: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100 coloration à l’hémalun –éosine) ....... 68 Figure 57: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine)................................ 69 Figure 58: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 69 Figure 59: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .. 69 Figure 60: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ................ 70 Figure 61: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine immunisés (C: G x 40, D: G x 100 coloration à l’hémalun –éosine) .......................................................................................................................................... 70 Figure 62: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 1% de tartrazine immunisées (E: G x 40, F: G x 100 coloration à l’hémalun – éosine) ...................................................................................... ..................................................... 70 Figure 63: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ........... 71 Figure 64: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine immunisées (C: G x 40, D: G x 100 coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 71 26 Figure 65: Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100 coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 71 Figure 66: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .................................... 72 Figure 67: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .. 72 Figure 68 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ...... 72 Figure 69 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ..................... 73 Figure 70 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .......................................................................................................................................... 73 Figure 71 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 73 Figure 72: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ................ 74 Figure 73: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 74 Figure 74 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .......................................................................................................................................... 74 Figure 75: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ........... 75 Figure 76: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 75 Figure 77: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E : G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 75 27 Figure 78 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................... 77 Figure 79: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C: G x 40. D: G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 77 Figure 80 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E: G x 40. F : G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 77 Figure 81 : Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) .................... 78 Figure 82: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C: G x 40. D: G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 78 Figure 83: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E: G x 40. F: G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 78 Figure 84: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ..... 79 Figure 85: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 79 Figure 86: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun – éosine) ............................................................................................................................................ 79 Figure 87: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles témoins immunisées (A: G x 40. B: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ... 80 Figure 88: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 80 Figure 89: Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine) ......................................................................................................................... 80 28 Liste des tableaux Tableau 1 : Spécifications de la tartrazine E102, selon le codex alimentaire ............................. . 16 Tableau 2: Répartition des souris et protocole d’immunisation ................................................. . 20 Tableau 3: Composition du tampon phosphate salin PBS, 1M, 10x concentré pH7 .................. . 24 Tableau 4 : Composition des solutions tampon d’ELISA. ......................................................... . 24 Tableau 5 : Composition du colorant polychrome de la Compagnie Paragon ......................... . 27 Tableau 6: Composition du Colorants à l’hématoxyline de Harris .......................................... . 30 29 30 Sommaire I- Introduction ...................................................................................................................................... 01 Rappels bibliographiques 1. Les colorants alimentaires ................................................................................................................ 03 2. La dose journalière admissible (DJA) .............................................................................................. 03 3. Propriétés physiques et chimiques ................................................................................................... 03 4. Toxicocinétique et métabolisme du colorant alimentaire E102 ...................................................... 05 4.1. Métabolisme au niveau du tube digestif ................................................................................... 05 4.2. Action due à la flore intestinale................................................................................................ 05 4.3. Absorption intestinale .............................................................................................................. 06 4.4. Catabolisme hépatique ........................................................................................................... 06 5. Propriétés toxicologiques et principales formes de toxicité de la tartrazine ................................... 06 5.1. Effet génotoxique de la tartrazine ....................................................................................... 06 5.2. Effet cancérigène de la tartrazine ......................................................................................... 07 5.3. Effet de la tartrazine sur le système immunitaire ................................................................. 07 5.3.1. Intolérance aux colorants et additifs........................................................................... 07 5.3.2. Réactions adverses de la tartrazine........................................................................... 08 5.3.3. Effet de tartrazine sur les cellules immunitaire ......................................................... 09 5.4. Effet de la tartrazine sur la neurophysiologie et l’hyperactivité ........................................... 09 6. Organes du système lymphoïde........................................................................................................ 10 6.1. Anatomie du thymus ............................................................................................................ 10. 6.1.2. Rôle du thymus........................................................................................................ 12 6.2. Structure de la rate................................................................................................................ 12 6.2.1. Rôle de la rate ........................................................................................................... 13 Matériels et méthodes 1. Animaux et condition d’élevage ...................................................................................................... 15 2. Produits et réactifs ............................................................................................................................ 15 2.1. Colorant alimentaire ............................................................................................................. 15 2.2. Antigène et adjuvant............................................................................................................. 15 2.3.1. Rôle de l’adjuvant .................................................................................................. 15 3. Protocoles expérimentaux ................................................................................................................ 17 31 3.1. Toxicité subchronique de la tartrazine ......................................................................... 17 3.1.1. Suivi des animaux du protocole de toxicité subchronique ............................... 17 3.1.1.1. Évaluation de la consommation journalière de la tartrazine ........................ 17 3.1.1.2. Mesure de la croissance pondérale ................................................................ 17 3.2. Immunisation ................................................................................................................ 17 3.2.1. Répartition des animaux ................................................................................... 17 3.2.2. Protocole d’immunisation ................................................................................ 19 3.2.3. Prélèvements sanguins et d’organes des souris .............................................. 19 4. Dosage des anticorps IgG sériques par ELISA ....................................................................... 21 4.1. Principe général de la méthode ELISA ........................................................................ 21 4.2. Mode opératoire ........................................................................................................... 21 5. Etude de la cytopathologie ...................................................................................................... 25 5.1. Principe........................................................................................................................ 25 5.2. Traitement des échantillons ................................................................................ 25 5.2.1. Empreinte ......................................................................................................... 25 5.2.2. Fixation des cellules ......................................................................................... 25 5.2.3. Coloration des lames ........................................................................................ 26 6. Etude histologique .................................................................................................................... 26 6.1. Traitement des échantillons .......................................................................................... 26 6.1.1. Fixation...................................................................................................................... 26 6.1.2. Déshydratation ................................................................................................. 26 6.1.3. Clarification ..................................................................................................... 26 6.1.4. Inclusion ........................................................................................................... 28 6.2. Traitement des lames ........................................................................................... 28 6.2.1. Etalement sur lames ........................................................................................ 28 6.2.2. Déparaffinage ................................................................................................... 28 6.2.3. Réhydratations .................................................................................................. 28 6.2.4. Coloration ......................................................................................................... 28 7. Analyse statistique ................................................................................................................... 29 32 Résultats 1. Effet de la tartrazine sur la croissance pondérale .................................................................... 31 2. Consommation de tartrazine chez les souris ............................................................................ 31 3. Effet de la tartrazine sur le poids relatif des organes lymphoïdes (la rate et thymus) ............. 34 4. Effet de l’immunisation sur le poids relatif des organes des souris traitées à la tartrazine. .... 38 3.1. Poids relatif de la rate .................................................................................................. 38 3.2. Poids relatif du thymus ................................................................................................. 38 4. Effet de consommation subchronique de la tartrazine sur la réponse immunitaire ................ 43 4.1. Titre en IgG sérique anti-SAB des souris swiss immunisées à la SAB ..................... 43 5. Etude cytopathologie ................................................................................................................ 43 5.1. Au niveau de la rate ...................................................................................................... 43 5.2. Au niveau du thymus.................................................................................................... 46 5.3. Au niveau du jéjunum .................................................................................................. 46 6. Etude histologique .................................................................................................................... 46 6.1. Au niveau de la rate ...................................................................................................... 59 6.2. Au niveau du thymus.................................................................................................... 59 6.3. Au niveau de l’architecture villositaire jéjunale .......................................................... 68 Discussion. ................................................................................................................................... 74 Conclusion. .................................................................................................................................. 80 Références bibliographiques. 33 34 Introduction Ces 50 dernières années, les développements scientifiques dans l'alimentation et les avancées technologiques ont abouti à la découverte de nouvelles substances qui peuvent remplir de nombreuses fonctions dans des produits alimentaires divers. Parmi ces substances, les colorants alimentaires qui ajoutent artificiellement la couleur aux aliments pour les rendre théoriquement plus appétissants. La biosécurité alimentaire est un sujet très sensible et concerne directement la production de la santé humaine. Pour cela L'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (AESA) examine la sécurité de tous les additifs alimentaires, en accordant une grande importance aux colorants alimentaires. Aujourd’hui le Comité Scientifique de l’Alimentation Humaine (CSAH), encourage l’utilisation des doses les plus basses possible pour chaque additif, pour s’assurer que les consommateurs n'excèdent pas la dose journalière admissible (DJA) en consommant de trop grandes quantités d’un additif particulier. De nombreuses études de toxicologie ont été menées sur les animaux de laboratoire ainsi que des essais cliniques sur les êtres humains. Beaucoup d'entre eux ont incriminé la tartrazine comme étant responsable de problèmes allergiques respiratoires, en déclenchant certaines réactions indésirables comme l’urticaire, l’eczéma et l’asthme (Inomata et al., 2006). Cette substance est à l’origine de l’exacerbation de dermatite atopique et angio-œdème, ainsi que des troubles gastro-intestinaux décrits chez les individus, principalement sensibles à l’aspirine (Devlin et David, 1992). Il semble également que la tartrazine exerce une activité cytotoxique et immunosuppressive sur les lymphocytes du sang périphérique humain (Koutsogeorgopoulou et al., 1998). D’autres effets ont été attribués à la tartrazine, comme la génotoxicite (Sasaki et al., 2002), l’hyperactivité infantile (McCann et al, 2007) et la diminution de la fertilité chez les souris Swiss mâle (Mehedi et al., 2009). 35 A la lumière de ces données, le but de notre travail est : ¾ D’évaluer les conséquences de la consommation subchronique de la tartrazine sur la réponse immunitaire spécifique chez la souris Swiss. ¾ D’observer les effets toxiques de ce colorant sur l’aspect histologique et cytologique des organes lymphoïdes et l’intestin. 36 37 1. Les colorants alimentaires Les colorants alimentaires font partie d’une famille de substances appelées additifs alimentaires. Ces derniers sont utilisés pour la conservation et l’obtention d’une meilleure sapidité mais également pour la rentabilité du produit (Mittal et al., 2007). Il existe des colorants alimentaires synthétiques ou naturels (organiques ou minéraux). Les colorants synthétiques résultent de la reproduction industrielle de substances naturelles ou d'une création artificielle. Et en fonction de leur structure chimique, on les sépare en colorants azoïques (par exemple la tartrazine E 102) ou non azoïques (par exemple l'érythrosine E 127) (Taylor et Dormedy, 1998). Pour l'instant, de nombreuses études ont également incriminé certains colorants alimentaires dans les réactions allergiques comme la tartrazine E102, la carmine 120 (Quirce, 2003; TabarPurroy, 2003; Inomata, 2006), le jaune orangé E110 et le jaune de quinoléine E104 dans les effets cancérogènes (Gaunt, 1974; Björkner, 1983). 2. La dose journalière admissible (DJA) La DJA est la dose d’un produit qui peut être ingéré quotidiennement par l’individu pendant sa vie entière sans risques perceptibles prévisibles (Directive du 21/11/2005 EU). Le comite mixte FAO/WHO (Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture/ World Health Organisation), notamment le Joint Expert Comite on Food Additives (JECFA), recommandent une dose journalière admissible (DJA), qui basée sur la dose sans effets observés (DSE), est exprimée en mg.kg-1 de poids corporel. La DJA pour la tartrazine est de 7,5 mg/kg/jour (Toledo, 1996; Hirschbruch et Torres, 1998; Walton et al., 1999). 3. Propriétés physiques et chimiques La tartrazine est un sel trisodique d’acide (5-hydroxy-1-(4-sulfonatophenyl)-4-(4sulfonatophenylazo)-H-pyrazol-3-carboxylate), sa formule moléculaire chimique est (C16, H12, N4, O9, S2.3Na ou C16-H9-N4-O9-S2.3Na) (figure 1), également connue sous le nom de FD & C Yellow N° 5 (JECFA, 1964) ou E 102 d’après les codes des colorants alimentaires du marché européen. La tartrazine fait partie des colorants alimentaires monozoїques dérivé du goudron, de couleur jaune orangé. 38 Figure 1: Structure moléculaire de la tartrazine (D’ après Mittal et al., 2007) Figure 2: Structure moléculaire de la tartrazine en trois dimensions (D’après kapor et al., 2001) 39 La tartrazine est largement utilisée dans les produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques (Moll et Moll, 1995) (figure 2). 4. Toxicocinétique et métabolisme du colorant alimentaire E102 Les colorants azoïques pénètrent dans l'organisme par l’ingestion. Ils sont métabolisés en amines aromatiques par des micro-organismes intestinaux. Les enzymes réductrices dans le foie peuvent également catalyser la coupure de la liaison réductive azoïque pour produire des amines aromatiques. Toutefois, la preuve indique que l’azo-réduction microbienne intestinale peut être plus importante que l’azo-réduction par les enzymes hépatiques. Une grande variété de bactéries anaérobies isolées à partir de matières fécales ou caecales d'animaux de laboratoire et d’humains a la capacité de cliver les colorants azoïques pour produire des amines aromatiques (Chung et al., 1992). 4.1. Métabolisme au niveau du tube digestif La tartrazine se retrouve dans le tractus gastro-intestinal où elle va subir l’action des sucs digestifs et de la flore intestinale (Christie et al., 2003). 4.2. Action due à la flore intestinale La tartrazine est facilement métabolisée dans le côlon par la flore intestinale (JECFA, 1964; Khera et Munro, 1979) et le principal métabolite urinaire issu de cette réduction est l’acide sulfonique (Roxon et al., 1967). La présence des transporteurs d'électrons libérés par les bactéries (par exemple la flavine) et les conditions d’anaérobie dans le côlon permettent la réduction de la tartrazine en acide sulfonique et aminopyrazolone (Chung et al., 1978; Watabe et al., 1980). Chung et al (1978) suggèrent que les accepteurs d’électrons extracellulaires peuvent stimuler la réduction du colorant azoïque. En fonction de la souche de bactéries, cette réduction peut être catalysée par une réaction enzymatique. L’aminopyrazolone est ensuite dégradé en acide 4-hydrazinobenzenesulfonique dans l'intestin, puis réduit en acide sulfonique (Ryan, 1972), bien que principalement excrété dans les fèces. 40 4.3. Absorption intestinale Il semblerait que chez l’être humain et les animaux de laboratoire, l'absorption orale de la tartrazine est extrêmement faible. Des études publiées dans la littérature montrent que moins de 2% de la tartrazine ingérée sont absorbés (Murdoch et al., 1987) parce que la tartrazine est hautement chargée par des groupements du sulfonate qui empêchent l'absorption considérable quand celle-ci est administrée oralement (Phillips et al., 1987; Levine, 1991; Chung et al., 1992; Ould Elhkim et al., 2007; EFSA, 2008). 4.4. Catabolisme hépatique La tartrazine est absorbée par la muqueuse intestinale, puis transportée par voie sanguine vers le foie, qu’elle atteint rapidement. C’est au niveau des microsomes hépatiques qu’elle va subir des dégradations ; ces réactions seront surtout des réductions, des Ndésalkylations, des hydroxylations et des conjugaisons (Dahal et al., 1995). Les enzymes hépatiques ne joueraient qu'un rôle mineur dans le métabolisme du colorant azoïque, donc la réduction par les bactéries intestinales serait la voie la plus probable (JECFA, 1964; Bertagni et al., 1972; Ryan, 1972; Chung et al, 1978; Khera et Munro, 1979). 5. Propriétés toxicologiques et principales formes de toxicité de la tartrazine 5.1. Effet génotoxique de la tartrazine De nombreuses études de génotoxicite montrent que la tartrazine est potentiellement mutagène. Elle peut induire des aberrations chromosomiques chez le hamster chinois (Ishidate et al., 1981; Ishidate et al., 1984), et augmente significativement les échanges des chromatides soeur et les aberrations chromosomiques des cellules de la moelle osseuse chez la souris et les rats (Giri et al., 1990) à la suite d’une exposition aiguë et chronique à des doses élevées de la tartrazine introduite dans le régime alimentaire. Elle peut induire également des dommages d’ADN dans le côlon des souris à des doses proches de la dose journalière admissible (DJA) (Sasaki et al., 2002). Une étude récente, utilisant un test de micronoyau sur l’intestin de souris à des doses pouvant atteindre jusqu'à 2000 mg/kg⁄ poids corporel, suggère que la tartrazine n'est pas potentiellement mutagène (Poul et al., 2009). 41 5.2. Effet cancérigène de la tartrazine Plusieurs études montrent que la tartrazine n’est pas potentiellement cancérigène dans les deux espèces à des doses allant jusqu'à 5% (8103 et 9735 mg / kg de poids corporel / jour chez les mâles et les femelles des souris, respectivement). Et 5% (2641 et 3348 mg / kg de poids corporel / jour pour les rats mâles et femelles, respectivement (Borzelleca et Hallagan, 1988a ; Borzelleca et Hallagan, 1988b). Une révision récente d’Ould Elhkim et al., (2007) indique que la tartrazine a une biodisponibilité orale basse chez les rongeurs. Cette révision qui fait référence à plus de 20 publications conclut qu'un grand nombre d'études de la toxicologie génétique a montré que la tartrazine n’a aucune possibilité cancérigène chez les rats et les souris. 5.3. Effet de la tartrazine sur le système immunitaire 5.3.1. Intolérance aux colorants et additifs Reste une réalité, bien étayée chez l'adulte, mais plus difficile à prouver chez l'enfant en raison de la lourdeur des explorations qu'il faudrait mettre en œuvre. L'incidence des effets adverses est certainement faible dans la population générale, entre 0,03 et 0,20 % pour de nombreux auteurs, mais pouvant aller jusqu'à 1 % pour d'autres. Elle est plus importante dans les populations sélectionnées, mais ne dépasse pas 2 % chez l'enfant atopique. Les mécanismes physiopathologiques sont nombreux, dépendant de la nature des substances en cause. Un mécanisme IgE-dépendant est incriminé pour le carmine de cochenille (E 120), les carraghénanes (E 407), la gomme adragante (E 413), le lysozyme (E 1105) (Bourrier, 2005). Mais chez la plupart des autres additifs, le mécanisme est surtout celui d'une intolérance ; les tests cutanés et biologiques n'ont alors pas d'intérêt. Dans cette situation, de loin la plus fréquente, les termes utilisés sont nombreux : « idiosyncrasie », « intolérance », « hypersensibilité non allergique ». L'additif peut se comporter comme une haptène se liant à des protéines. Il peut aussi s'agir d'une augmentation de la perméabilité intestinale, d'une histaminolibération non spécifique, d'une inhibition de la cyclo-oxygénase par la voie de la lipooxygénase avec augmentation de la production de leucotriènes. Deux études récentes se sont intéressées à ce dernier mécanisme. La première étude, portant sur la dermatite atopique de l'adulte avec intolérance aux additifs, fait appel à un régime oligoantigénique et des tests de provocation en double insu contre le placebo (TPODAC), avec mesure de la production de leucotriènes par les basophiles circulants. En présence d'additif isolé, à doses croissantes de 0,2 à 200 µg/ml, il n'y a pas 42 d'augmentation des leucotriènes chez dix témoins non atopiques, mais on constate une augmentation des leucotriènes dans le groupe mis au contact de la tartrazine, trois cas sur neuf (Worm et al., 2001). L’autre étude évalue indirectement l’efficacité des antileucotriènes chez les adultes présentant une urticaire chronique avec intolérance aux additifs et/ou à l’aspirine. Chez les patients traités par montelukast (10 mg), cétirizine (10 mg) ou placebo, il s’est avéré que le montelukast et de la cétirizine sont plus efficaces que le placebo (Wüthrich, 1993). 5.3.2. Réactions adverses de la tartrazine Les poussés d’urticaire chronique peuvent être déclenchées par des additifs alimentaires, à savoir des colorants azoïques et des agents conservateurs ou par des dérivés des médicaments, dont l’aspirine ou d’autres anti inflammatoires non stéroïdiennes (AINS) qui se lient aux récepteurs des IgE à la surface des mastocytes et des basophiles et provoquent la libération des médiateurs chimiques (Chapel et al., 2004). Les additifs alimentaires sont considérés comme un facteur de risque de morbidité de l'asthme (Bird et Burks, 2009). La tartrazine a été décrite comme étant responsable du déclenchement des réactions allergiques, tel que l'urticaire, l’asthme et l’eczéma, en particulier chez les patients intolérants à l'aspirine (Loblay et Swarin, 1985 et Morales et al., 1985; Geller, 1987; Marisol et Modesto, 1989; Devlin et David, 1992; Corder et Buckley, 1995). De même, des réactions indésirables à la tartrazine s’ajoutent aux précédentes en particulier, l’exacerbation de la dermatite atopique et l’angio-œdème, et des troubles gastrointestinaux qui ont été décrits chez les individus principalement sensibles à l’aspirine (Devlin et David, 1992). L’intolérance à la tartrazine a été signalée dans 6-50% des personnes intolérantes à l'aspirine (Weber et al., 1979). Quelques pays, tels que la Suède, la Suisse et la Norvège ont retiré la tartrazine de certains produits à cause des réactions anaphylactiques qu’elle peut produire (Wüthrich, 1993). L'Agence de la Surveillance Sanitaire Brésilienne, a demandé de mentionner dans les étiquettes des médicaments la présence de la tartrazine car celle-ci peut causer des réactions allergiques tels que l’asthme bronchique et l’urticaire chez des gens susceptibles (ANVISA, 2002). En revanche, aucun cas de réaction allergique grave à la tartrazine n’a été déclaré au réseau de surveillance de l'allergie en France au cours des années 2002 et 2003 (Morisset, 2003). 43 5.3.3. Effet de tartrazine sur les cellules immunitaires Aboel-Zahab et al., (1997) ont montré une augmentation des éosinophiles sanguins chez des rats albinos recevant une association de colorants contenant la tartrazine sur une durée de 30 et 60 jours. Une autre étude expérimentale, avec une méthode différente, décrit la cytotoxicité et l'immunosuppression de la tartrazine sur des lymphocytes du sang périphérique humain, indiquant une prolifération mitotique des lymphocytes ainsi qu’une inhibition de leur activité lytique (Koutsogeorgopoulou et al., 1998). Dans une étude encore plus récente, il a été montré que l’administration de la tartrazine à la dose journalière admissible (DJA) provoque une augmentation considérable du nombre des éosinophiles dans l'antrum gastrique ainsi qu’une augmentation importante des lymphocytes mais sans atrophie de la muqueuse gastrique de la souris. Cette étude fait ressortir l'effet allergénique connu de la tartrazine, dû à la production d'acide sulfonique ce qui s’ajoute à l'incertitude quant à son action (Moutinho et al., 2007). 5.4. Effet de la tartrazine sur la neurophysiologie et l’hyperactivité Des études ont montré l’existence d’un rapport logique entre la prise des colorants artificiels et/ou agents de conservation et les symptômes de trouble de déficit d’attention /hyperactivité (TDAH) (Bateman et al., en 2004). Pour confirmer le lien entre les colorants alimentaires et l’hyperactivité, des chercheurs ont décrit, en 2007 une augmentation de l’hyperactivité chez les enfants de trois à quatre ans et de huit à neuf ans, après une consommation de colorants et d’additifs alimentaires (McCann et al., 2007). De plus, une étude très récente faite sur trois générations de souris montre qu’à la dose de la DJA, les souris présentent peu de troubles neurophysiologiques (Tanaka, 2008). 44 6. Organes du système lymphoïde Le thymus est un organe essentiel de la différenciation et de la maturation fonctionnelle des lymphocytes T. Outre la moelle osseuse et la Bourse de Fabricius (chez les oiseaux), il est désigné comme organe lymphoïde primaire, par distinction des organes lymphoïdes secondaires tels que la rate, les ganglions et les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (Andrade, 2008). 6.1. Anatomie du thymus Sa taille varie selon 1’âge, elle atteint le maximum, quand le système immunitaire arrive à maturité. Ensuite, le parenchyme diminue continuellement suite à cette évolution le thymus d’un individu âgé est majoritairement composé de graisse et de tissu conjonctif, un petit nombre d'îlots de parenchyme lymphoïde subsiste. L’organe évolué est souvent difficile à distinguer du tissu adipeux médiastinal. Chaque lobe thymique est divisé par des cloisons fibreuses en lobules plus petits qui sont composés d'un cortex externe et d'une medulla interne (Male, 1999; Wheater et al., 2001). - Le cortex : contient des amas denses de lymphocytes, une prolifération intense reflétée par un grand nombre de mitoses. - La medulla : en revanche, dans la medulla la densité des cellules lymphoïdes est nettement plus faible. Elle contient des structures appelées corpuscules de Hassall qui sont composés de couches cellulaires denses, potentiellement des résidus de cellules épithéliales dégénérées, une barrière intra thymique similaire à la barrière hémato-encephalique sépare la corticale du sang circulant, alors qu'aucune barrière n'existe pour la médullaire (figure 3). Pour des raisons fonctionnelles ainsi qu'anatomiques, les cellules T venant à maturité dans le thymus sont souvent désignées thymocytes. Le profil des marqueurs de surface permet la différenciation immuno-phénotypique des thymocytes et des cellules T matures selon leur stade de développement, les thymocytes sont d'abord très sensibles à la cortisone avant de devenir de plus en plus résistants au cours de leur différenciation. Alors que les thymocytes immatures sensibles à la cortisone, se trouvent majoritairement dans la corticale. Les thymocytes résistants résidents dans la medulla outre les lymphocytes et les corpuscules de Hassall, des cellules épithéliales au cytoplasme large des cellules dendritiques et des macrophages sont trouvés dans le thymus (les deux derniers n’étant pas représentés). 45 Figure 3. Représentation schématique de la structure du thymus (D’après Dhem, 2004) 46 Le thymus est fortement vasculaire et possède des tissus lymphatiques afférents qui drainent vers les ganglions mediastinaux (Burmester et Pezzutto, 2000; Male, 2005). 6.2. Rôle du thymus Le thymus est un organe lymphoépithélial, siège de la maturation et de la sélection des lymphocytes T. C’est un organe lymphoïde central, où la prolifération lymphocytaire est indépendante des stimulations antigéniques exogènes et qui est dépourvu de follicules lymphoïdes chez l’individu sain. Il est colonisé par les précurseurs des lymphocytes T, mais aussi par d’autres cellules d’origine hématopoïétique telles que les macrophages et les cellules dendritiques. Les cellules épithéliales forment, avec le tissu conjonctif, le stroma thymique, qui joue un rôle fondamental dans le développement des lymphocytes T (Weinreich et Hogquist, 2008). Le thymus est également un organe endocrine dont les cellules épithéliales sécrètent des hormones telles que la thymosine, la thymuline et la thymopoïétine, qui participent à la maturation fonctionnelle des lymphocytes T. Le thymus évolue dès les premières années de la vie. Ses fonctions dans la maturation des lymphocytes T déclinent lentement mais elles persistent jusqu’à un âge avancé (Bertho et al., 1997). Aussi, Il joue un rôle fondamental dans l’induction de la tolérance au soi, en permettant la destruction intra thymique des lymphocytes T auto réactifs (sélection négative) et la maturation des lymphocytes T régulateurs. Des anomalies de la sélection thymique de ces deux types de lymphocytes T sont responsables de la survenue de maladies auto-immunes (Puissant, 2003; Clark, 2007). 6.3. Structure de la rate La rate est le plus grand organe lymphoïde dans l’organisme, située à la partie supérieure gauche de l’abdomen. Elle est de couleur rouge foncée, de consistance ferme, mais très fragile et recouverte d’une capsule (Pabst, 1988; Dadoune et al., 2000). Elle est composée de deux types de tissus, la pulpe blanche et la pulpe rouge. La pulpe blanche est composée de lymphocytes, alors que la pulpe rouge ressemble à une éponge pleine d'érythrocytes et est le lieu de l'élimination des érythrocytes âgés ou abîmés. La rate est enveloppée par une capsule de fibres de collagène partant de cette capsule. Les cloisons de collagène, accompagnées d'artérioles, rayonnent dans le parenchyme splénique. La pulpe blanche est localisée dans cette région; les lymphocytes T se trouvent autour des artérioles dans la gaine lymphocytaire péri artérielle (PALS) et sont entourés de lymphocytes B qui 47 forment la zone marginale aux limites de la PALS. De nombreuses accumulations de lymphocytes B sont observées (follicules primaires) au cours d'une réaction immunitaire, ces derniers se développent en vrais follicules dotés d'un centre germinatif et d'une enveloppe folliculaire (follicules secondaires). Les cellules arrivent de la circulation dans la région péri- artériolaire riche en lymphocytes T avant de gagner les follicules en passant par la zone marginale et les vaisseaux veineux sinusoïdaux dans la pulpe blanche, elles rejoignent ensuite la circulation (Chevrel, 1994; Burmester et Pezzutto, 2000; Abbott et al., 2004) (figure 4). 6.4. Rôle de la rate Chez le fœtus, le rôle principal de la rate est la formation des globules rouges (érythropoïèse). Elle cesse normalement d’assurer cette fonction après la naissance, mais peut la reprendre, si la production d’hématies par la moelle osseuse est insuffisante. Chez l’adulte, la rate est partie intégrante du système lymphatique et du système vasculaire. Ses fonctions principales sont la défense immunitaire par la fabrication d’anticorps à partir des plasmocytes. Elle élimine aussi des micro-organismes provenant de la circulation sanguine et participe à la destruction des cellules sanguines âgées ou anormales. La rate extrait le fer de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges qu’elle détruit et le garde en réserve. Elle élimine également les pigments biliaires. Chez certains mammifères, la rate stocke les cellules sanguines et les réintroduit dans le système circulatoire selon les besoins, afin de réguler le volume sanguin, particulièrement en cas d’hémorragie (Hirazono et al., 1995; Burmester et Pezzutto, 2000). La rate subit alors des changements anatomiques soit par rétrécissement du parenchyme tissulaire soit par augmentation de son volume (splénomégalie). Une altération fonctionnelle de la défense immunitaire par extension ou rétrécissement des follicules lymphoïdes de la pulpe blanche (Khalaf, 1993). 48 Figure 4. Structures anatomiques de la rate et coupe à travers une artériole et un follicule ; circulation des lymphocytes (D’après Burmester et Pezzutto, 2000) 49 50 1. Animaux et condition d’élevage Les animaux utilisés dans nos protocoles sont des souris de souche swiss, une souche largement utilisée en toxicologie expérimentale. Ils ont été obtenus auprès de l’Institut Pasteur d’Alger (IPS). Ils sont constitués des deux sexes, élevés et acclimatés avant toute manipulation dans l’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire (LPNSA) dans des conditions d’hébergement conformes à la réglementation. Les souris vivent dans des cages conventionnelles, munies d’une mangeoire et d’un biberon. Elles ont libre accès à une nourriture standard, correspondant à un aliment pour rongeurs commercialisé par l’ONAB. 2. Produits et réactifs 2.1. Colorant alimentaire Le colorant alimentaire choisi est la tartrazine (E102). Il provient de chez Courtex International (France). Le fournisseur indique un degré de pureté à 86,6% du produit. La substance se présente sous un aspect de poudre très fine de couleur orange, inodore et de saveur âcre (tableau1). 2.2. Antigène et adjuvants La fraction pure de la SAB (Sérum albumine bovine) provient de chez Merck Germany (Allemagne). L'adjuvant complet de Freund (FCA) et l'adjuvant incomplet de Freund (FIC) sont des produits Sigma (USA). 2.2.1. Rôle de l’adjuvant Ce sont des substances inertes, non immunogènes qui augmentent la réponse immunitaire non spécifique, tant humorale que cellulaire, lors de leur administration simultanée avec l'antigène, en favorisant une réaction inflammatoire. Ils agissent essentiellement en transformant les antigènes solubles en matériel particulaire, ce qui favorise leur «captation» par les cellules présentatrices et leur « libération plus lente» par ces dernières : tout ceci aboutit à augmenter le temps de contact entre l'antigène et les cellules immunocompétentes (Jeannin, 2004). Nous avons utilisé l'adjuvant complet de Freund (FCA), ce dernier est une suspension de «Mycobactérium tuberculosis» tués dans une solution eau- huile (Stewart-Tull, 1994), qui permet d’indure les deux réponses AMIR (Antibody-mediated immune response) et CMIR (Cellmediated immune response) (Hernàndez et al., 2005). 51 Tableau 1: Spécifications de la tartrazine E102, selon le codex alimentaire Et de la directive 96/77/CE DE La Commission Européenne. Spécifications Non de produit Non scientifique Code de référence UE Code international Concentration Perte matière sèche Stabilité à la chaleur Stabilité à la lumière Solubilité dans l’eau Insolubilité dans l’eau (standard 0,2% max) Substances Iso-propyl Ether (standard 0.3% max) Humidité max Chlorure (CL) + sulfate (SO4) (Standard 5% max) Cadmium Métaux lourds (pd) Mercure (Mr) Arsenic (As) Spécifications COURTEX Tartrazine Colorant synthétique alimentaire sel tri sodique d’acide (5-hydroxy-1-(4-sulfonatophenyl)4-(4-sulfonatophenylazo)-Hpyrazol-3-carboxylate) E102 19140 86,6% 3,5% 100° 4 99,96% 0,04% 0,2% 5% 1% 0,0001% 0,001% 0,0001% 0,0001% 52 3. Protocoles expérimentaux 3.1. Toxicité subchronique de la tartrazine Dans cette étude, 72 souris des deux sexes, âgées de 4 semaines et pesant en moyenne 19,50±0,25 g sont réparties en 2 groupes expérimentaux et un groupe témoin comprenant chacun 12 souris mâles et 12 souris femelles (figure 7). Les animaux des 2 groupes expérimentaux sont abreuvés au moyen de biberons pendant 90 jours avec de l’eau supplémentée de tartrazine aux concentrations respectives de 0,45% et 1% (Maekawa et al., 1987). Dans les mêmes conditions expérimentales, les souris du groupe témoin reçoivent de l’eau de robinet, sans colorant. 3.1.1. Suivi des animaux du protocole de toxicité subchronique 3.1.1.1. Évaluation de la consommation journalière de la tartrazine Tout au long des 90 jours de l’expérimentation, la consommation journalière de la solution de tartrazine est mesurée pour chaque groupe. Le volume moyen consommé par chaque souris est calculé et exprimé en ml / jour ⁄ souris. 3.1.1.2. Mesure de la croissance pondérale Le poids corporel individuel de tous les animaux est mesuré chaque semaine pendant toute la durée de l’expérimentation. 3.2. Immunisation 3.2.1. Répartition des animaux Au terme des 90 jours de consommation subchronique de tartrazine, les animaux sont répartis en 12 lots : - lot 1 : 6 souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées à la SAB. - lot 2 : 6 souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées à la SAB. - lot 3 : 6 souris mâles témoins immunisées à la SAB. - lot 4 :6 souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées à la SAB - lot 5 : 6 souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées à la SAB. - lot 6 : 6 souris femelles témoins immunisées à la SAB. - lot 7 : 6 souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine non immunisées. - lot 8 : 6 souris mâles traitées à 1% de tartrazine non immunisées. - lot 9 : 6 souris mâles témoins non immunisées. - lot 10: 6 souris femelles à 0,45% de tartrazine non immunisées. 53 72 SOURIS 24 souris 24 souris 0,45% Tartrazine 1% Tartrazine 12♂ 12♀ 24 souris Témoins 12♂ 12♀ 12♂ 12♀ 6 souris ♀ immunisées à la SAB 6 souris ♂ immunisés à la 6 souris ♀ immunisées à la 6 souris ♂ immunisés à la 6 souris ♀ immunisées à la 6 souris ♂ immunisés à la SAB SAB SAB SAB SAB 6 souris ♀ Non immunisées 6 souris ♂ Non immunisés 6 souris ♀ Non immunisées 6 souris ♂ Non immunisés 6 souris ♀ Non immunisées 6 souris ♂ Non immunisées Figure 7. Schéma de répartition des souris par différents groupes expérimentaux recevant la tartrazine à 0.45%et 1% dans l’eau de boisson immunisées à la SAB et non immunisées en plus des groupes témoins. 18 - lot 11 : 6 souris femelles traitées à 1% de tartrazine non immunisées. - lot 12 : 6 souris femelles témoins non immunisées. Les lots constitués des souris mâles et femelles ne recevant aucune immunisation sont considérés comme témoins négatifs (figure7). 3.2.2. Protocole d’immunisation Les souris de chaque lot reçoivent une primo-injection d’un volume de 0,3 ml d’un mélange par voie sous-cutanée. Les solutions à injecter sont préparées à partir d’un volume de 0,2 ml d’une suspension d’adjuvant complet de Freund émulsionné, avec un volume de solution de sérum physiologique (NaCl 0.9%) contenant 15 ug de la SAB. La dose injectée est répartit sur 3 points séparés le long de la colonne vertébrale (Directive de Protection des animaux, 1999). Dans les mêmes conditions, un rappel est effectué au 14éme jour du protocole en remplaçant l’adjuvant complet de Freund par l’adjuvant incomplet de Freund (tableau 2). 3.2.3. Prélèvements sanguins et d’organes des souris Un prélèvement sanguin est effectué à l’aide d’une pipette Pasteur à J0, avant toute immunisation, à partir du sinus rétro orbitaire. Cette opération est répétée aux 7éme ,14éme, 21eme et 28eme jours qui suivent la primo-injection. Un volume de 200µl de sang par souris est prélevé et centrifugé à 3500 tr/min pendant 15 minutes à 4°C ensuite le sérum est congelé à 20° C jusqu’à utilisation. A la fin du protocole à J30, les animaux sont sacrifiés par une dislocation cervicale, puis rapidement la rate, le thymus et le jéjunum sont prélevés chez tous les animaux immunisés et non immunisés. Tout de suite après, la rate et le thymus sont pesés pour la détermination du poids relatif des organes. Les organes sont fixés dans une solution de formol tamponnée à 10%, pour réaliser une étude histologique. 19 Tableau 2: Répartition des souris et protocole d’immunisation. Lots Immunisation Rappel de l’immunisation Prélèvement sanguin sacrifice sous cutanée dans 3 dépots J14 J0.J7,J14, J21,J28 J30 sous cutanée dans 3 dépots J14 J0,J7,J14, J21,J28 J30 15 µg SAB+85µL NaCl 0,9% +200µL ACF sous cutanée dans 3 dépots J14 J0,J7,J14, J21,J28 J30 Aucun anitgéne — — J0.J7,J14, J21,J28 J30 — — — J0,J7,J14, J21,J28 J30 — — — J0,J7,J14, J21,J28 J30 Antigène 300µL/Souris souris traités à 15 µg SAB+85µL 0,45% de tartrazine NaCl 0,9% immunisées à la +200µL ACF SAB souris traités à 1% 15 µg SAB+85µL de tartrazine NaCl 0,9% immunisées à la +200µL ACF SAB souris témoin et immunisées à la SAB souris traités à 0,45% de tartrazine et non immunisées souris traités à 1% de tartrazine et non immunisées souris témoin non immunisées 20 4. Dosage des anticorps IgG sériques par ELISA 4.1. Principe général de la méthode ELISA Le principe de cette technique est basé sur un procédé dans lequel les anticorps à doser réagissent dans un premier temps avec l’antigène immobilisé par adsorption sur une phase solide. Dans un deuxième temps, la quantité d’anticorps fixés par l’antigène est mesurée à l’aide d’un deuxième anticorps (anti-immunoglobuline).Dans le cadre de notre travail, nous utilisons des plaques de microtitration en Polystyrène (NUNC Maxisorb, puits à fond plat), qui permettent d’adsorber la plupart des antigènes. Apres dépôt de l’immun-sérum contenant les anticorps spécifiques, la phase solide est lavée et on révèle la présence de ces anticorps par l’addition d’un conjugué qui correspond à des anti anticorps couplés ou non à une enzyme (peroxydase). La dernière étape correspond au dosage de l’enzyme marqueur. Cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de molécules d’enzyme que l’on pourra détecter, dépendra le seuil de sensibilité. Le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Au cours de la réaction enzymatique, un radical O se forme. Pour le détecter, on ajoute à la solution un chromogène, l’orthophenyléne diamine (OPD). 4.2. Mode opératoire Le dosage ELISA des IgG spécifiques anti-SAB est réalisé par la technique ELISA à l’aide de plaques de 96 puits à fond plat (NUNC Maxisorb), selon les étapes suivantes : • Tous les puits de la microplaque reçoivent 100 µl d’antigène à la à la concentration de 10 µg/ml de SAB, dilués dans du PBS pH 7,4. Les plaques sont alors incubées pendant au moins une nuit à + 4°C. • L’excès d’antigène non fixé est éliminé par 3 lavages successifs de la plaque avec PBSTween 20 0,05% à l’aide d’un laveur automatique (El x 50). • Les sites non spécifiques sont saturés par le dépôt, dans tous les puits, de 200 µl par de la gélatine de poisson à 2% dans du PBS pH 7,4. • La plaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C puis rincée 3 fois de suite sous agitation par le tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%. 21 • L’opération suivante consiste à diluer les échantillons de sérum à tester au 1/10ème dans un tampon de dilution (PBS 0,01M/ gélatine de poisson 0.66% Tween 20 0,1% pH 7). Pour cela, une série de dilution est alors effectuée allant de 10-1 à 10-7. Puis, un volume de 100 µl est déposé dans des puits appropriés (figure 8). • La plaque est alors incubée à 37°C pendant 2 heures, puis lavée 3 fois de suite sous, puis lavée 3 fois de suite sous agitation, au tampon de lavage PBS/Tween 20 0,05%. • Ensuite, chaque puits de la plaque reçoit, selon les anticorps recherchés, 100 µl d’antianticorps de souris dilué au 1/20000ème dans du tampon de dilution. L’anti anticorps déposé est un anti IgG biotinylés (Pharmingen). • La plaque est alors incubée pendant 1 heure 30 mn à 37°C, suivie d’un lavage 3 fois de suite au tampon de lavage PBS/ Tween 20 0,05%. • les plaques ayant reçu 100 µl d’extravidin peroxydase (Sigma) diluée à 1/5000ème dans le tampon de dilution pH 7 sont déposés dans tous les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 30 mn à 37°C. • Après lavage avec le PBS/Tween 20 0,05%, 200 µl d'une solution contenant un chromogène (l’orthophenyléne diamine (OPD) : 75 mg dilués dans 25 ml de tampon citrate de sodium 0,05M à pH 5,1 ainsi que 37.5 µl de H2O2) sont déposés dans chaque puits de la plaque. Une réaction colorée se développe en 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière. L'ajout de H2SO42N permet de stopper la réaction (tableau 3 et 4). • L'intensité de la réaction colorimétrique est mesurée à 492 nm à l'aide d'un lecteur (ELx 800). • Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans chaque plaque à fin de contrôler la spécificité et la sensibilité de chaque mesure. Les titres en IgG des sérums testés sont exprimés par l’inverse de la plus haute dilution de sérum supérieure au bruit de fond. 22 Blanc (témoin négatif) Témoin positif Témoin 1 Témoin 2 S1 Sérums de souris immunisées S2 S3 S4 Figure 8. Etapes du dépôt des sérums et solutions tampons pour le dosage ELISA des anticorps. S : sérum B : blanc 23 Tableau 3. Composition du tampon phosphate salin PBS, 1M, 10x concentrés pH7. Solution Quantité Na2HPO, 12 H2O 29g KH2PO4 2g NaCl 80g KCl 2g Thymérosal 1g Eau 1000ml Tableau 4. Composition des solutions tampon d’ELISA. Tampon à diluer 1/10éme Tampon de lavage : PBS 0,01 pH 7,0 Tween 20 0,05% Tampon de saturation : PBS 0,01 M pH 7 gélatine de poisson 2% Tampon de dilution : PBS 0,01 M pH 7 gélatine de poisson 0.66 % Tween 20 0,1% Solution de révélation : H2O2 à 0,025% final, substrat de la peroxydase (sigma) et l’OPD (orthophenyléne diamine, Sigma) à 0,5 mg/ml, révélateur de la réaction enzymatique, dilués dans un tampon citrate trisodique 0,05M, pH 5,1. 24 5. Etude de la cytopathologie 5.1. Principe C’est la méthode diagnostique qui étudie les cellules sur des frottis (Hould, 1984). Cette étude a pour but de vérifier s’il existe des modifications au niveau cellulaire des organes lymphoïdes (la rate, thymus) et l’intestin des souris traitées à la tartrazine aux teneurs de 0,45% et 1% comparées aux témoins. Nous avons évalué aussi les modifications cellulaires de ces organes après immunisation à la SAB chez les souris traitées et non traitées à la tartrazine. 5.2. Traitement des échantillons 5.2.1. Empreinte Tout de suite après le sacrifice et le prélèvement des organes, l’organe est coupé en deux parties, une partie est destinée à l’histologie et l’autre à la cytologie. Les côtés intérieurs de la rate et du thymus sont mis au contact de la lame pour prendre leur empreinte. Ensuite une autre lame est glissée sur la lame précédente pour éliminer l’excès des cellules. Pour l’intestin, 2 méthodes sont possibles soit : - L’empreinte jéjunale Après le sacrifice, l’abdomen est ouvert et le segment jéjunal entier est prélevé délicatement de la cavité abdominale, vidé de son contenu par lavage à l’eau physiologique, ensuite il est découpé en fragments. Prendre l’empreinte de la surface de la muqueuse intestinale à l’aide d’une lame de verre. - Raclage de la muqueuse Racler avec une lame de bistouri le côté muqueux de l’intestin et étaler sur la lame. Faire glisser délicatement une autre lame sur la surface de lame précédente pour éliminer l’excès des cellules. Dans notre protocole expérimental, nous avons utilisé la méthode du raclage au niveau du jéjunum. 5.2.2. Fixation des cellules Les cellules des différents organes étalés sur les lames, sont fixées pendant quelques secondes dans de l’acétone pur. 25 5.2.3. Coloration des lames Les lames ont été colorées par le colorant polychrome de la Compagnie Paragon, qui représente la plus simple des colorations combinées. La coloration de noyau est bleue à violet et le cytoplasme rose à mauve. La préparation du colorant est indiquée dans le (tableau 5) (Hould, 1984). La coloration des lames s’effectué comme suit : Mettre les lames dans la solution de coloration durant 2 min. Laver bien les lames à l’eau ordinaire. Observer tout suit au microscope optique. 6. Etude histologique Cette étude a pour but de vérifier s’il existe des modifications au niveau de la structure histologique de la rate et du thymus et sur la structure de l’épithélium intestinal, particulièrement au niveau de l’architecture villositaire jéjunale ainsi que sur la composition en lymphocytes intraépitheliaux des souris traitées à la tartrazine pendant 90 jours aux teneurs de 0,45% et 1% comparées aux témoins. Nous avons évalué aussi l’effet de l’immunisation sur ces organes chez les souris traitées à la tartrazine par rapport aux témoins. 6.1. Traitement des échantillons Les échantillons utilisés sont soumis préalablement à différentes étapes qui sont : 6.1.1. Fixation Les tissus sont fixés dans du formol à 10% tamponné. Les solutions de formaldéhyde sont les fixateurs les plus répandus. 6.1.2. Déshydratation Après fixation, les tissus ont été déshydratés dans 3 bains successifs d’acétone, chaque bain dure 45 minutes. 6.1.3. Clarification Cette opération s’effectue après la déshydratation, les pièces sont placées dans 2 bains de xylène. Chaque bain dure 45 minutes. 26 Tableau 5 : Composition du colorant polychrome de la Compagnie Paragon (Hould, 1984). Composants Quantités Bleu de toluidine 0,73 g Fuchsine basique 0,27 g Ethanol absolu 30 ml Eau distillée 70 ml 27 6.1.4. Inclusion L’inclusion est effectuée avec de la paraffine, qui est un mélange d’hydrocarbure solide à poids moléculaire élevé et de faible affinité. Ces substances sont caractérisées par leur indifférence aux agents chimiques. Les échantillons sont placés dans deux bains successifs de paraffine pendant une heure chacun à une température de 56˚C puis coulés dans des moules métalliques. Ensuite, des cassettes en plastique seront fixés dessus et le volume sera complété avec de la paraffine, puis mis au congélateur pendant 15 minutes pour une bonne solidification. 6.2. Traitement des lames Après l’inclusion à la paraffine, les blocs contenant le fragment sont coupés à l’aide d’un microtome à une épaisseur de 7 µm. 6.2.1. Etalement sur lames Une fois les coupes réalisés, elles sont mises sur une lame de verre recouverte de colle (2 g d’albumine +50 ml de glycérine dans 1000 ml d’eau distillé) puis placées sur une plaque chauffante réglée à une température convenable, inférieure à celle du point de fusion de la paraffine. A l’aide d’une pince, les plis de la paraffine sont tirés légèrement de chaque côté, ensuite l’ensemble coupe- lame est retiré de la plaque, égoutté puis essoré au papier joseph. Avant de procéder à la coloration des lames, il faut les déparaffiner et les réhydrater. 6.2.2. Déparaffinage Pour déparaffiner les lames, il suffit de les placer dans deux bains successifs de toluène. Chaque bain dure 10 minutes. 6.2.3. Réhydratation Elle se fait dans 3 bains successifs d’alcool éthylique de degrés décroissants (100°, 95°, 90°, 70°). Chaque bain dure 2 minutes ; le dernier est suivi d’un rinçage à l’eau courante. 6.2.4 Coloration Nos lames ont été colorées à l’hémalun–éosine qui représente la plus simple des colorations combinées. On a fait agir successivement un colorant nucléaire « basique » l’hématéine, et un colorant cytoplasmique «acide», l’éosine. La coloration du noyau est bleu-noir et le cytoplasme rose à rouge. La préparation du colorant hématoxyline de Harris est indiquée dans le (tableau 6) (Hould, 1984). 28 La coloration des lames a été effectuée comme suit : * Mettre les lames dans l’ hématoxyline de Harris durant 2 à 3 minutes. * Laver les lames à l’eau ordinaire pendant 5 minutes. * En cas de surcoloration, les lames sont trempées légerment dans de l’alcool chlorhydrique pendant quelques secondes (100 ml d’alcool à 95° +5 gouttes de Hcl à 1%). * Bleuir dans une solution aqueuse saturée de carbonate de lithium (rinçage). * Laver les lames à l’eau ordinaire. * Mettre les lames dans un bain d’alcool éthylique 1 à 2 minutes. * Colorer les lames à l’éosine alcoolisée (2g d’éosine dans 100ml d’alcool éthylique) pendant 5 minutes. * Rinçage des lames dans deux bains successifs d’alcool éthylique à 70 ° puis à 95°. * Mettre les lames dans du toluène pendant 1 minute. * Mettre entre les lames et lamelle une goutte de baume de Canada ou d’eukitt. * Laisser sécher puis observer au microscope optique. 7. Analyse statistique Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard (X ± ES). L’analyse de la variance est effectuée avec le test ANOVA. Mais les résultats de poids relatif des organes sont réalisés à l’aide d’un test T de Student pour les données appariées et non appariées. Le seuil de signification retenu est celui qui est habituellement considéré, soit 5 %. 29 Tableau 6: Composition du colorant à l’hématoxyline de Harris (Hould, 1984). Composants Hématoxyline Quantités 5g Alum de potassium 100g Ethanol absolu 50 ml Eau distillée 1000ml Faire bouillir le mélange Oxyde mercurique 2.5 g Chauffer la solution et filtrer avant usage 30 35 1. Effet de la tartrazine sur la croissance pondérale Dans cette première partie de travail, nous avons évalué les conséquences de la consommation subchronique de la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% sur l’évolution du poids corporel chez les souris swiss (figure 7 et 8). Nos résultats montrent que, aussi bien chez les mâles que chez les femelles, le poids corporel augmente progressivement en fonction du temps. Cependant, on note une diminution très significative du degré d’évolution du poids corporel des femelles traitées à 0,45% de tartrazine (p<0,01) au cours des semaines 1, 2,4 et 5 par rapport aux témoins. Les valeurs sont (22,78 ± 0,42) vs (24,98 ± 0,41), (25,90 ± 0,42) vs (27,88 ± 0,38), (29,02 ± 0,52) vs (31,23 ± 0,42), (29,73 ± 0,57) vs (31,82 ± 0,41g). De même, cette diminution d’évolution du poids corporel est significative chez les femelles traitées à 1% de tartrazine (p< 0,05) au cours des semaines 1et 4, par rapport aux groupes témoins. Les valeurs sont respectivement (23,32 ± 0,66) vs (24,98 ± 0,41), (29,45 ± 0,53) vs (31,23 ± 0,42g). A partir de la 6 éme semaine, l’évolution du poids corporel de souris femelles traitées à 0,45% et 1% de tartrazine est comparable à celle des souris témoins. En revanche, dès la 2ème semaine et jusqu'à la 13ème semaine, on note une diminution très significative de degré d’évolution du poids corporel des mâles traités à 1% de tartrazine (p< 0,01) par rapport aux témoins. En outre, cette diminution significative est signalée chez les mâles traités à 0,45% de tartrazine (p<0,05) comparée aux témoins au cours des semaines 7, 8 et 10. Les valeurs sont respectivement (37 ± 1,09) vs (39,72 ± 0,61), (37,42 ± 0,68) vs (40,91± 1,03), (39,34± 1,01) vs (42,44 ± 0,73g). Au cours des semaines 9,12 et 13, on a noté également une diminution très significative des valeurs du poids corporel (37,93 ± 1,12) vs (42,03 ± 0,57), (38,25 ± 0,73) vs (44,01 ± 0,54), (39, 39 ± 0,90) vs (43,10 ± 0,57g) (p<0,01). 2. Consommation de la tartrazine chez les souris La tartrazine est administrée aux différents groupes expérimentaux diluée dans l’eau de boisson. La figure 9 représente le score cumulé, exprimé en volume d’eau consommé par souris pour chaque groupe expérimental durant toute la période d’expérimentation (90 jours). 36 F témoin Poids corporel (g) F 0,45% 45 F 1% 40 35 30 * ** ** ** ** * 25 * ** ** 20 15 10 5 Semaines 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Figure 7. Croissance pondérale des souris femelles recevant pendant 90 jours de la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%, le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) établies sur 12 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * : les groupes expérimentaux vs témoin. * p<0,05 ; ** p< 0,01 On note une évolution très importante du poids corporel des souris du groupe témoin par rapport les groupes traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%. 37 M témoin M 0,45% M 1% Poids corporel (g) 50 45 ** 40 * 35 ** * 30 * ** * ** ** ** ** ** ** ** ** ** 25 20 15 10 5 Semaines 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Figure 8. Croissance pondérale des souris mâles reçevant pendant 90 jours de la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%, le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) établies sur 12 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 ; ** p< 0,01 On note, une diminution très significative du degré d’évolution du poids corporel des mâles du groupe traités à 1% de tartrazine (p<0,01) par rapport au groupe témoin, dès la 2ème semaine jusqu'à la 13ème semaine. 38 Nos résultats indiquent que la consommation du colorant alimentaire (tartrazine) aux doses de 0,45% et 1% chez les souris mâles et femelles se fait de manière comparable à la consommation de l’eau sans tartrazine chez le témoin. 3. Effet de la tartrazine sur le poids relatif des organes lymphoïdes (la rate et thymus) Le poids relatif des organes [(poids de l’organe/poids corporel) ×100] renseigne sur l’évolution de l’organe par rapport à celle de l’organisme entier. A la fin de la période expérimentale, aucune différence significative n’est signalée pour le poids relatif de la rate chez les animaux mâles du groupe traité à 0,45% de tartrazine par rapport aux témoins. De même, on note une diminution significative du poids relatif de la rate chez les animaux mâles traités à 1% de tartrazine comparés aux témoins (p< 0,05).Les valeurs exprimées en (%) sont (0,25 ± 0,02) vs (0,40 ± 0,04) (figure 10). Par contre, on note une diminution significative du poids relatif du thymus chez les animaux mâles traités à 0,45% de tartrazine comparés aux témoins (p< 0,05). Les valeurs exprimées en (%) sont (0,13 ± 0,21) vs (0,20 ± 0,01) (figure 11). Par ailleurs, chez les femelles, aucune différence significatives du poids relatif de la rate et du thymus n’est observé entres les différentes groupes comparé au groupe témoins. 39 Volume (ml) Mâle 10 Femelle 8 6 4 2 0 Témoins 0,45% 1% Figure 9. Consommation de tartrazine (ml/j/souris) diluée dans l’eau de boisson aux doses de 0,45% et 1% pendant 90 jours d’expérimentation. Les témoins sont abreuvés avec de l’eau sans tartrazine (n=12 pour chaque groupe). Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES), établies sur 12 souris mâles et sur 12 souris femelles pour chaque groupe. 40 0,7 Mâles Femelles 0,6 Poids relatif % 0,5 0,4 * 0,3 0,2 0,1 0 Témoins 0,45% 1% Figure 10. Effet de la tartrazine sur le poids relatif de la rate chez les animaux mâles et femelles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%, et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine pendant 90 jours de consommation de tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 On note une diminution significative du poids relatif de la rate chez les animaux mâles traités à 1% de tartrazine comparés aux témoins (p< 0,05). 36 0,4 Mâles Femelles 0,35 Poids relatif % 0,3 0,25 0,2 * 0,15 0,1 0,05 0 Témoins 0,45% 1% Figure 11. Effet de la tartrazine sur le poids relatif du thymus chez les animaux mâles et femelles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine pendant 90 jours de consommation de tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 On note une diminution significative du poids relatif du thymus chez les animaux mâles traités à 0,45% de tartrazine comparés aux témoins (p< 0,05). 37 4. Effet de l’immunisation sur le poids relatif des organes lymphoïdes chez les souris traitées à la tartrazine. 4.1. Poids relatif de la rate Le poids relatif de la rate des animaux mâles traités à 1% et immunisés à la SAB est significativement plus élevé comparé à leurs propres témoins (p < 0,01). En effet les valeurs exprimées en (%) sont (0,56 ± 0,06) vs (0,25 ± 0,02) (figure 12). De même, aucune différence significative n’est notée dans le poids relatif de la rate après immunisation des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine comparées aussi à leurs propres témoins. En outre, le poids relatif de la rate des mâles et témoins immunisés à la SAB est significativement augmenté comparé aux témoins non immunisés (p<0,05). Les valeurs exprimées en (%) sont (0,57 ± 0,06) vs (0,40 ± 0,04) (figure 12). Nos résultats montrent quel n’existe pas une différence significative du poids relatif de la rate entre les trois groupes mâles immunisés (traités à 0,45% et 1% de tartrazine et témoins). On observe une augmentation significative du poids relatif de la rate chez les femelles traitées à 0,45% et 1% de tartrazine et les femelles témoins par rapport aux groupes témoins non immunisés (p<0,05). Les valeurs exprimées en (%) sont respectivement (0,70 ± 0,09) vs (0,34 ± 0,01), (0,47± 0,02) vs (0,36 ± 0,01) et (0,52 ± 0,03) vs (0,36 ± 0,03) (figure 13). 4.2. Poids relatif du thymus Nos résultats montrent une augmentation significative du poids relatif du thymus chez les animaux mâles traités à 0,45% et immunisés à la SAB comparés aux témoins non immunisés (p< 0,05). En effet les valeurs exprimées en (%) sont (0,18 ± 0,008) vs (0,13±0,02) (figure 14). Par contre, aucune différence significative du poids relatif du thymus n’est notée chez les autres groupes mâles traités à 1% et chez les témoins immunisés par rapport à leurs propres témoins. De même, on note une différence significative du poids relatif du thymus chez les femelles du groupe traités à 1% de tartrazine et immunisés à la SAB par rapport aux témoins non immunisés (p< 0,05). Les valeurs exprimées en (%) sont (0,30 ± 0,01) vs (0,26 ± 0,008) (figure 13). Par ailleurs, chez les autres groupes des femelles (0,45% et témoins) immunisés à la SAB, aucune différence significative du poids relatif du thymus n’est observée. 38 M NON I 0,8 MI 0,7 * ** Poids relatif % 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Témoins 0,45% 1% Figure 12. Effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate chez les mâles traités à la tartrazine aux doses de 0,45%, 1% et témoin reçoit de l’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 ; ** p< 0,01 On note une augmentation significative du poids relatif de la rate chez les mâles témoins (p<0,05) comparés aux témoins non immunisés. De même, une augmentation très significative est notée chez les mâles traités à 1% de tartrazine (p<0,01) par rapport aux témoins non immunisés. 47 F NON I 0,9 F I * 0,8 0,7 Poids relatif % 0,6 * * 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Témoins 0.45% 1% Figure 13. Effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate chez les femelles traitées à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de L’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES). établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 On observe une augmentation significative du poids relatif de la rate chez les femelles traitées à 0,45% et 1% de tartrazine et les femelles témoins par rapport aux groupes témoins non immunisés (p<0,05). 48 M NON I 0,3 % MI Poids relatif % 0,25 0,2 * 0,15 0,1 0,05 0 Témoins 0.45% 1% Figure 14. Effet de l’immunisation sur le poids relatif du thymus chez les mâles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) Établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 On note une augmentation significative du poids relatif du thymus chez les animaux mâles traités à 0,45% et immunisés comparés aux témoins non immunisés (p< 0,05). 49 F NON I FI 0,4 0,35 ** Poids relatif % 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Témions Témoins 0.45% 1% 1% Figure 15. Effet de l’immunisation sur le poids relatif du thymus chez les femelles traitées à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin reçoit de l’eau sans tartrazine. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES). établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 On note une différence significative du poids relatif du thymus chez les femelles du groupe traités à 1% de tartrazine et immunisés par rapport aux témoins non immunisés (p<0,05). 50 4. Effet de la consommation subchronique de la tartrazine sur la réponse immunitaire 4.1. Titres en IgG sériques anti-SAB des souris swiss immunisées à la SAB Dans notre travail, nous avons utilisé une méthode de dosage ELISA hautement spécifique des IgG dirigées contre la SAB. Les figures 16 et 17 indiquent l’évolution en fonction du temps du niveau de production sérique des IgG anti-SAB. A j0, c'est à dire avant toute innoculation de l’antigène, aucun anticorps n’est détectable. A partir de la primo injection, on observe une évolution de la teneur sérique en IgG chez tous les animaux des groupes expérimentaux. On observe une augmentation très rapide de la teneur en IgG à partir du rappel qui est effectué au 14éme jour. Chez les femelles, cette évolution est comparable entre le groupe témoin et le groupe traité à 0,45% de tartrazine. Alors qu’elle est plus importante pour le groupe traité à 1% de tartrazine à J14. Par contre, aucune différence significative n’est constatée entre les trois groupes immunisés à J28. Cependant, on note une diminution de la teneur en IgG anti-SAB chez les animaux mâles traités à 0,45% et 1% de tartrazine par rapport aux témoins immunisés à partir de J21. 5. Etude cytopathologique L’objectif de ce travail est de vérifier les conséquences de la consommation subchronique de la tartrazine sur les organes lymphoïdes (la rate et thymus) ainsi que l’intestin par l’étude d’aspect cellulaire de ces organes par l’utilisation de frottis cellulaires. Nous avons évalué aussi les modifications cellulaires de ces organes après immunisation à la SAB chez les souris traitées et non traitées à la tartrazine. 5.1. Au niveau de la rate Sur plan cytologique, on distingue une augmentation du nombre des macrophages (hyperplasie des macrophages) chez les mâles et chez les femelles traitées à 0,45% de tartrazine, comparée aux témoins (fig 19 et 22). 51 IgG (Log1/ Titre) Série1 F témoin Série2 F 0,45% FSérie3 1% 8 Rappel Rappel 7 6 * 5 4 3 2 1 0 0 J0 Jours J7 J14 J21 J28 Figure 16. Cinétique comparée des titres en IgG spécifiques mesurés par ELISA. Entre les femelles, après l’immunisation à la SAB des groupes traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES). Établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. * p<0,05 F témoin : souris femelles immunisées à la SAB F 0,45% : souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées à la SAB F 1% : souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées à la SAB On note une évolution en fonction de temps des titres en IgG. On observe une augmentation significative d’IgG anti-SAB au 14 éme jour chez Le groupe des femelles traitées à 1% de tartrazine. Aucune différence significative n’est notée pour les différents groupes immunisés par rapport aux témoins à J28. 52 IgG (Log1/ Titre) 9 M témoin Série1 M 0,45% Série2 M 1% Série3 8 Rappel 7 ** 6 ** 5 4 3 2 1 Jours 00 J0 J7 J14 J21 J28 Figure 17. Cinétique comparée des titres en IgG spécifiques mesurés par ELISA. Entre les mâles, après immunisation à la SAB des groupes traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et le groupe témoin. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES), établies sur 6 souris dans chaque groupe expérimental et pour le groupe témoin. ** p< 0.01 M témoin : souris mâles immunisés à la SAB M 0,45% : souris mâles traités à 0,45% de tartrazine et immunisés à la SAB M 1% : souris mâles traités à 1% de tartrazine et immunisés à la SAB On note une évolution en fonction de temps des titres en IgG. On observe une diminution très significative d’IgG anti-SAB au 28éme jour chez le groupe des mâles traités à 0,45% et 1% de tartrazine comparé aux témoins. 53 Par contre, on observe une atrophie lymphocytaire avec une malformation des cellules lymphocytaires marquée chez les mâles et les femelles traités à 1% de tartrazine (fig 20 et 23). Chez les animaux immunisés, on remarque une hyperplasie des macrophages chez les mâles traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% et immunisés à la SAB, par rapport aux témoins immunisés (fig 25 et 26). 5.2. Au niveau du thymus On observe une hyperplasie cellulaire avec une dystrophie lymphocytaire chez les mâles traités à 0,45% de tartrazine (fig 31). Par contre, on remarque chez les animaux traités à 1% de tartrazine une atrophie avec une malformation cellulaire chez les mâles et une dystrophie lymphocytaire chez les femelles (fig 32 et 35). Chez les animaux immunisés, on observe une hyperplasie lymphocytaire avec un changement de taille des cellules de la même population chez les deux sexes traités à 1% de tartrazine par rapport aux témoins immunisés (fig 38 et 41). 5.3. Au niveau du jéjunum Nos résultats indiquent une atrophie cellulaire chez les femelles traitées à 0,45% de tartrazine (fig 46). Par contre, chez les femelles traitées à 1% de tartrazine, une hyperplasie lymphocytaire apparaît (fig 47). Chez les animaux immunisés, nous avons remarqué une atrophie cellulaire au niveau du jéjunum chez les mâles traités aux doses de 0,45% et 1% de tartrazine et immunisés à la SAB, avec un changement morphologique des cellules jéjunales chez les femelles traitées à 0,45% de tartrazine, comparé aux témoins immunisés (fig 49, 50, 52 et 53). 6. Etude histologique Des coupes histologiques au niveau des organes lymphoïdes (la rate et thymus) et sur la structure de l’épithélium intestinal, particulièrement au niveau de l’architecture villositaire jéjunal de souris témoins et celle des autres groupes expérimentaux traités aux doses de 0,45% et 1% de tartrazine ont été réalisées afin de détecter toute transformation morphologique ou altération tissulaire de ces organes chez les différentes groupes expérimentaux. Nous évaluons aussi l’effet de l’immunisation sur la morphologie de ces organes chez les groupes traités à la tartrazine par rapport aux témoins. 54 Noyau sphérique de lymphocyte Macrophage Figure 18. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles témoins (G x40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Macrophage Figure 19. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une augmentation des macrophages (hyperplasie). Malformation Figure 20. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).On note une atrophie lymphocytaire. 55 Macrophage Lymphocyte Figure 21. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Augmentation du nombre de macrophage Figure 22. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (G x40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une hyperplasie des macrophages. Atrophie lymphocytaire Figure 23. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).On note une dystrophie lymphocytaire. 56 Macrophage Lymphocyte Figure 24. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon) Macrophages Figure 25.Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une hyperplasie des macrophages Augmentation des macrophages Figure 26. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris mâles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une hyperplasie des macrophages. 57 Macrophage Lymphocyte Figure 27. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 28. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 29. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). 31 Lymphocyte Figure 30. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 31.Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une hyperplasie cellulaire. Malformation cellulaire Atrophie cellulaire Figure 32. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une atrophie cellulaire au niveau du thymus avec une malformation. 32 Lymphocyte Figure 33. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 34. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 35. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).On note une dystrophie lymphocytaire. 33 Lymphocyte Figure 36.Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 37. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus de souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Différence de taille Figure 38. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). 34 Lymphocyte Figure 39. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 40. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 41. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). 35 Figure 42. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 43. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Lymphocyte Figure 44. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum de souris mâle traitées à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). 36 Lymphocyte Figure 45. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles témoins (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 46. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une atrophie lymphocytaire. Lymphocyte Figure 47. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1 % de tartrazine (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon).On observe une hyperplasie lymphocytaire. 37 Macrophages Lymphocyte Figure 48. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Lymphocyte Figure 49. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une atrophie cellulaire. Figure 50. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris mâles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une atrophie cellulaire. 38 Figure 51. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles témoins immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Cellules Malformé Figure 52. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). Figure 53. Observation au microscope optique de l’aspect cytologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1 % de tartrazine et immunisées (G x 40, coloration par le polychrome de la Compagnie Paragon). On note une atrophie cellulaire. 39 6.1. Au niveau de la rate L’observation microscopique réalisée sur des rates montre un élargissement des sinus médullaires chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec une augmentation de la densité cellulaire plus marquée chez les souris traitées à 0,45% de tartrazine. La présence de la population plasmocytaire est très marquée au niveau du cordon médullaire (fig 55, 56, 58 et 59). A l’échelle nucléaire, les noyaux des lymphocytes des lots traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% paraissent plus volumineux, plus condensés, un entassement de ces derniers est observé avec épaississement de l’enveloppe nucléaire. La localisation chromatinienne est très hétérogène dans la même population cellulaire. Par rapport au sexe, les différences morphologiques sont non significatives. Ces anomalies sont plus marquées chez les animaux traités à la tartrazine et immunisés à la SAB par rapport aux témoins immunisés (fig 61, 62, 64 et 65). 6.2. Au niveau du thymus Chez les mâles et les femelles, la comparaison entre les coupes histologiques montre une vacuolisation du cytoplasme avec une diminution de la densité cellulaire, cette diminution et plus marquée chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec apparition de structure fibreuse intense (fig 68 et 71), les corpuscules de Hassall sont présents dans les trois lots. A l’échelle nucléaire, des différences marquées sont observées : Les noyaux changent de configuration, il apparaît un épaississement de l’enveloppe nucléaire avec marginalisation de la chromatine, avec des endroits où la chromatine est en mottes. Par rapport au sexe, les différences morphologiques sont non significatives. Ces anomalies sont plus marquées chez les animaux traités à la tartrazine et immunisés à la SAB que chez les animaux témoins immunisés (fig 73, 74, 76 et 77). 40 A B Figure 54. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Noyau volumineux Centre germinatif D C Figure 55. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Pulpe rouge Noyau marginal E G Figure 56. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 41 A B Figure 57. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Noyau à chromatine annulaire C D Figure 58. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). E F Figure 59. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 42 A B Figure 60. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). D C Figure 61. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C: G x 40, D: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). E F Figure 62. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 43 A B Figure 63. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). C D Figure 64. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C: G x 40, D: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). E F Figure 65. Observation au microscope optique d’une coupe histologique de la rate des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 44 A B Figure 66. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). C D Figure 67. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Hyperplasie E F Figure 68. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 45 Tissus conjonctif inter- lobulaire B A Figure 69. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). C D Figure 70. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). E F Figure 71. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E : G x 40, F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 46 A B Figure 72. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles témoins immunisés (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). C D Figure 73. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisés (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun – éosine). Chromatine en motte Noyau marginal E Hyperplasie F Figure 74. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisés (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 47 B A Figure 75. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles témoins immunisés (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). D C Figure 76. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisés (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Noyau volumineux Hyperplasie E Regroupement des noyaux F Figure 77. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du thymus des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisés (E : G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 48 6.3. Au niveau de l’architecture villositaire jéjunale En microscope les coupes histologiques réalisées au niveau de jéjunum, montrent en premier lieu une importante infiltration inflammatoire avec une atrophie villositaire primaire au niveau de la muqueuse jéjunale des animaux traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%. Ainsi, une importante hyperplasie localisée est observée. L’épithélium apparaît dans des endroits pluristratifiés réguliers et dans d’autres des amas cellulaires irréguliers. Avec la raréfaction des cellules à mucus, des mitoses normales qui doivent être observées dans les cryptes apparaissent au niveau des régions en contact avec la lumière intestinale (fig 79, 80, 82 et 83). A l’échelle nucléaire, les contours des noyaux sont légerment irréguliers avec un léger épaississement de l’enveloppe, la répartition et la densité chromatinienne sont différentes d’un entérocyte à l’autre et par région, les noyaux sont rapprochés dans les zones des hyperplasies. Ces anomalies sont plus marquées chez les animaux traités à 0,45% de tartrazine. Par ailleurs, les différences morphologiques sont non significatives par rapport au sexe. Ces anomalies sont aussi plus marquées chez les animaux traités à la tartrazine et immunisés à la SAB par rapport aux animaux témoins immunisés (fig 85, 86 et 89). De même, on observe une diminution du nombre des cellules du chorion chez les femelles du groupe traitées à 0,45% de tartrazine et immunisés à la SAB (fig 88). 49 A B Figure 78. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Infiltration lymphocytaire D C Figure 79. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine (C: G x 40. D: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Hyperplasie E F Figure 80. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 1% de tartrazine (E: G x 40. F : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 50 A B Figure 81. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles témoins (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Atrophie Villositaire D C Figure 82. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine (C: G x 40. D: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Atrophie villositaire Augmentation de nombre des lymphocytes de chorion E F Figure 83. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1% de tartrazine (E: G x 40. F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 51 A B Figure 84. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles témoins immunisées (A : G x 40. B : G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). Infiltration lymphocytaire Hyperplasie C D Figure 85. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration à l’hémalun – éosine). Infiltration inflammatoire des lymphocytes F E Figure 86. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris mâles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). 52 B A Figure 87. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles témoins immunisées (A: G x 40. B: G x 100, coloration à l’hémalun –éosine). C D Figure 88. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 0,45% de tartrazine et immunisées (C : G x 40, D : G x 100, coloration àl’hémalun –éosine). F E Figure 89. Observation au microscope optique d’une coupe histologique du jéjunum des souris femelles traitées à 1% de tartrazine et immunisées (E: G x 40, F: G x 100, coloration à l’hémalun – éosine). 53 54 Discussion Dans ce travail, nous avons étudié les effets de la consommation subchronique de la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% sur la réponse immunitaire spécifique chez la souris swiss. Il existe peu de travaux effectués sur l’immunotoxicité des colorants alimentaires synthétiques, et encore moins sur la tartrazine. Du point de vue toxicologique, le système immunitaire peut être une cible pour les toxiques issus de produits chimiques, des médicaments, ou toutes autres substances étrangères appelées xénobiotiques (Dean et Murray, 1990; Burrell, 1993). Selon les recommandations du Séminaire International sur le Système Immunitaire, une substance immunotoxique est une substance chimique qui a une action directe et/ou indirecte (et/ou son produit de biotransformation) sur le système immunitaire; sur la réponse immunitaire de l’hôte au composé et/ou à ses métabolites (Bennett et Mercier, 1987). Dans la première partie de notre travail nous avons déterminé l’effet toxique de la tartrazine sur le poids corporel des souris traitées à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1% pendant 90 jours d’expérience. La perte ou le gain pondéral est un signe de toxicité qui peut compléter l'interprétation des d’effets directs possibles sur le système immunitaire (Kociba, 1982 ; Anderson, 1990). Nos résultats montrent une augmentation progressive du poids corporel chez les deux groupes d’animaux expérimentaux. Cependant, une diminution de l’évolution du poids corporel par rapport aux souris témoins a été notée ce qui est probablement dû à l’effet anorexigène de la tartrazine. Les travaux d’Osman et al., (1995) ont montré que le colorant synthétique (sunset yellow FCF) administré par voie orale à une dose de 5 mg/kg/jour pendant un mois chez des rats conduisait à une augmentation significative du gain corporel jusqu’à la 4éme semaine de toxicité. Des études de multigénérations (génération F0 âgées de 5 semaines et la génération F1 âgées de 9 semaines) menées par Tanaka, en 1993, sur des souris consommant le colorant alimentaire synthétique l’amarante (E123) à des doses de : 0,025%, 0,075%, et 0,225% montrent une augmentation du poids corporel chez les souris de la génération F1 traitées à 0,025% de l’amarante. 55 Par contre, les travaux entrepris par Imazawa et al., (1996) ont montré que le colorant alimentaire synthétique (gardenia bleu) administré chez les rats par voie orale à des doses de : 0,6%, 1,25%, 2,5%, 5% et 6% pendant 13 semaines n’induisait aucune différence du gain pondéral. Une autre étude faite par Aboel-Zahab et al., (1997) a montré une réduction du poids corporel chez les rats après l’administration par voie orale du colorant alimentaire synthétique (indigocarmine E132). La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l’étude de l’immunotoxicité de la tartrazine. Nous avons mesuré le poids relatif de la rate et du thymus chez les animaux traités à 0,45% et 1% de tartrazine et les animaux qui reçoivent de l’eau sans tartrazine. Nos résultats montrent une diminution du poids relatif de la rate chez les mâles traités à 1% de tartrazine et celui du thymus chez les mâles traités à 0.45% de tartrazine. Ces résultats seraient la conséquence de l’effet toxique de la tartrazine. En effet, il a été montré que la diminution du poids relatif des organes lymphoïdes est un signe d’immunotoxicité (Anderson, 1990 ; Thomas et al., 1990), Cependant aucune modification du poids relatif de ces deux organes n’est observée chez les femelles. Par ailleurs, nos résultats concernant l’effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate et du thymus chez les animaux traités et non traités à la tartrazine montrent une augmentation du poids relatif de la rate chez les mâles traités à 1% de tartrazine, ainsi qu’une augmentation du poids relatif du thymus chez les mâles et les femelles traités respectivement à 0,45% et 1% de tartrazine. Cette augmentation du poids des organes lymphoïdes est probablement due à l’hyperplasie des cellules immunitaires, induite par l’adjuvant complet de Freund utilisé lors de l’immunisation qui permet d’amplifier la réponse immunitaire humorale et cellulaire (Hernàndez et al., 2005). Dans la 3 éme partie de notre travail, nous avons évalué la réponse immunitaire humorale spécifique à la sérum albumine bovine (SAB) après une exposition subchronique des souris swiss à la tartrazine. Il a été montré que l'immunotoxicité causée par les xénobiotiques entraîne des modifications structurelles et fonctionnelles du système immunitaire qui peut mener à une immunodépression/immunosuppression. Celle-ci peut être modifiée par les mécanismes de la défense de l’hôte contre les infections et les processus cancéreux ainsi que sur les 56 réponses immunitaires anormales qui provoquent généralement des allergies et des maladies auto-immunes (Gleichmann et al., 986; Exon et al., 1987; Luster et al., 1988; Luster et al., 1994; Descotes, 2008). Nos résultats montrent une augmentation progressive des titres en IgG anti-SAB obtenus directement après administration de l’antigène chez toutes les femelles immunisées traitées et non traitées à la tartrazine. Cependant, nous avons remarqué que le taux des IgG anti-SAB diminue très significativement à partir du J21 chez les mâles immunisés et traités à 0,45% et 1% de tartrazine. Deux hypothèses peuvent expliquer la diminution de la réponse immunitaire spécifique. La première serait une diminution du taux des immunoglobulines sériques, la deuxième hypothèse serait une diminution des nombres des globules blancs, due à l’effet toxique de la tartrazine. Il a été montré que la diminution du taux des immunoglobulines sériques totaux est un signe de la diminution du taux des globulines (Vos et Roij, 1990). Le travail de Mokrane, (2007) montre une réduction du taux des protéines sériques chez les mâles et les femelles ayant reçu une consommation subchronique de la tartrazine à des doses de 0,1%, 1% et 2,5%. Cette diminution du taux des protéines sériques serait la conséquence d’une augmentation de l'albumine, résultat d’un déséquilibre du rapport l'albumine/globuline. Il est admis que les substances toxiques qui affectent la moelle osseuse induisent une modification du nombre des globules blancs produisant ainsi une leucopénie (Merrill et al., 1997). Les travaux entrepris par Aboel-zahab et al., (1997) ont montré une neutropénie et une lymphocytose sélective mais sans modifications importantes de globules blancs totaux suite à l’administration des colorants synthétique (Sunset yellow E110, la tartrazine E102, carmoisine E 122 et brillant bleu). De même, une étude d’immunotoxicité menée sur un colorant alimentaire naturel a démontré que l’administration du colorant du Caramel III peut causer une réduction dans le nombre des globules blancs totaux chez les rats, due à une réduction des lymphocytes CD4+ et CD8+. Plusieurs autres effets du colorant Caramel III ont été rapportés sur le système immunitaire des rongeurs lorsqu’il est associée avec un déficit de vitamine B6, y compris la fonction immunitaire et le changement de résistance de l’hôte vis-à-vis des l'infections (Houben et al., 1994). Cependant aucun changement n'a été observé dans 57 l’activité des cellules NK ou dans la réponse humorale à un antigène viral (Thuvander et Oskarsson, 2002). La dernière partie de notre travail nous a permis d’évaluer l’impact de la tartrazine et de l’immunisation sur l’aspect cytopathologique et histopathologique des organes lymphoïdes (la rate et thymus) ainsi que l’intestin. L’examen microscopique, cytologique et histologique est réalisé au niveau de la rate, du thymus et sur l’intestin, particulièrement au niveau de l’architecture villositaire jéjunale des souris traitées à la tartrazine pendant 90 jours à raison de 0,45% et 1% par jour. Nos résultats montrent un élargissement des sinus médullaires au niveau de la rate chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec une augmentation de la densité cellulaire plus marquée chez les souris traitées à 0,45% de tartrazine. La présence de la population plasmocytaire est très marquée au niveau du cordon médullaire, avec une modification dans le noyau des lymphocytes chez les deux groupes traités à la tartrazine. Au niveau du thymus une vacuolisation du cytoplasme avec une diminution de la densité cellulaire a été observée, cette diminution est plus marquée chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec apparition de structure fibreuse intense, ainsi qu’un changement de configuration des noyaux. Par contre au niveau du jéjunum, on a observé une infiltration lymphocytaire importante avec une atrophie villositaire primaire au niveau de la muqueuse jéjunale des animaux traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%. Ces anomalies sont plus marquées chez les animaux traités à 0,45% de tartrazine. Sur le plan cytologique, on distingue une hyperplasie cellulaire chez les souris traitées à la tartrazine à dose de 0,45% et une atrophie lymphocytaire avec une malformation des cellules lymphocytaires marquée chez les animaux traités à 1% de tartrazine, comparée aux témoins. Par ailleurs, les différences morphologiques sont plus marquées chez les animaux traités à la tartrazine et immunisés par rapport aux témoins immunisés. Cette analyse cytologique et histologique de l’architecture tissulaire révèle une action toxique due à la tartrazine sur ces organes aux doses de 0,45% et 1% chez la souris Swiss. Il y a une évidence que l’exposition aux xénobiotiques par le thymus, la moelle osseuse, et les ganglions lymphatiques entraîne des dommages de ces organes en affectant leurs aspects cytopathologiques et l'histopathologiques par une prolifération anormale des cellules souches dans la moelle osseuse, une altération de la maturation des cellules 58 immunocompétentes, un changement dans les subpopulations des cellules B et T, ainsi que des modifications fonctionnelles des cellules immunocompétentes. Ces modifications sont classées généralement comme une altération de l’immunité humorale (HMI), de l’immunité cellulaire, ou des réponses non spécifiques (NSR) (Penn, 1988; Descotes et Vial, 2004). Une étude menée par Maekawa et al., (1987) chez les rats recevant 5% de la tartrazine montrent une dégénération et/ou une atrophie des organes hématopoïétiques (thymus, moelle osseuse, ganglions lymphatiques et la rate). Les travaux de Ali et Bashier, (2006) montrent l’effet immunotoxique d’un colorant alimentaire (fast green) sur les propriétés des thymocytes et splénocytes chez les souris albinos. En revanche, les travaux de Moutinho et al., (2007) montre que l’administration de la tartrazine à la dose journalière admissible (DJA) 7,5 mg/kg/jour chez les souris pendant 46 semaines, provoque une augmentation considérable du nombre des éosinophiles et des lymphocytes dans l'antre gastrique avec l’absence d’une atrophie dans la muqueuse gastrique. L’administration du colorant alimentaire (Metanyl Yellow) par voie orale à des doses de 0,1%, 0,25%, 0,5% chez les rongeurs pendant 30 jours, n’induit aucun changement significatif dans les paramètres hématologiques et de l’architecture histologique du foie, du rein, des ganglions lymphatiques mésentérique, du thymus et de la vessie à l’exception de desquamation légère des villosités intestinales et des changements modérés dans les plaques de Peyer de l’intestin grêle chez les groupes traités à des doses élevées. Une amélioration significative de la réponse immunitaire humorale primaire est observée avec la dose la plus faible du Metanyl Yellow alors que des doses supérieures produisent des effets opposés. Le traitement a également entraîné des changements dans les capacités fonctionnelles des macrophages bien que ces altérations immunitaires ne peuvent guère influer l'immunité locale de l’intestin (Shanker et al., 1992). Par ailleurs, les travaux de Koutsogeorgopoulou et al., (1998) ont décrit l’effet cytotoxique et immunosuppressif des colorants alimentaires synthétiques (Amarante, Tartrazine) in vitro en culture avec les lymphocytes du sang périphérique humain, montrant une prolifération mitotique des lymphocytes ainsi qu’une inhibition de leur activité lytique. 59 60 Conclusion La tartrazine est un colorant alimentaire synthétique, employée dans une multitude de produits de l’agroalimentaire. Ce colorant ne présente aucun intérêt nutritionnel avéré, par contre il est très utilisé pour améliorer l’aspect des produits alimentaires pour des raisons de marketing. Cependant, un excès de ce produit peut provoquer des réactions adverses sur le système immunitaire. Ce travail a permis d’évaluer de façon expérimentale quelques effets toxiques consécutifs à une consommation subchronique de la tartrazine à des doses de 0,45% et 1% par voie orale chez les souris Swiss. L’étude a porté sur la croissance pondérale, sur la réponse immunitaire spécifique, sur le poids relatif et l’aspect cytologique et histologique des organes lymphoïdes (la rate et thymus), ainsi que l’architecture villositaire jéjunale. Nos résultats montrent que la croissance pondérale chez l’ensemble des groupes expérimentaux augmente jusqu’à la fin de l’expérience, mais la consommation subchronique de la tartrazine provoque une diminution du degré d’évolution du poids corporel chez les souris traités à 0,45% et 1% de tartrazine par rapport aux souris témoins. D’autre part, la consommation journalière du colorant alimentaire (tartrazine) administrée aux doses de 0,45% et 1% chez les souris mâles et femelles se fait de manière comparable à celle de la consommation de l’eau sans tartrazine chez le témoin. Par ailleurs, nous avons observé une diminution du poids relatif de la rate chez les animaux mâles traités à 1% de tartrazine et du thymus chez les mâles du groupe traités à 0,45% de tartrazine qui du à l’effet toxique de la tartrazine. En revanche, l’effet de l’immunisation sur le poids relatif de la rate et du thymus chez les femelles traitées à 1% de tartrazine et les mâles traités à 1% de tartrazine à été constaté. Nous avons remarqué que la cinétique comparative des titres en IgG anti-SAB mesurée par ELISA montre une diminution de la teneur en IgG anti-SAB chez les animaux mâles traités à 0,45% et 1% de tartrazine comparé aux témoins immunisés à partir de J21. L’examen microscopique, cytologique et histologiques réalisées au niveau de la rate et de thymus et jéjunum, montre un élargissement des sinus médullaires au niveau de la rate chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec une augmentation de la densité cellulaire plus marquée chez les souris traités à 0,45% de tartrazine. La présence de la population plasmocytaire est très 61 marquée au niveau du cordon médullaire, avec une modification dans le noyau des lymphocytes chez les deux groupes traités à la tartrazine. Au niveau du thymus une vacuolisation du cytoplasme avec une diminution de la densité cellulaire, cette diminution et plus marqué chez les souris traitées à 1% de tartrazine avec apparition de structure fibreuse intense, ainsi qu’un changement de configuration des noyaux. Par contre au niveau de jéjunum, on observé une infiltration lymphocytaire importante, avec une atrophie villositaire primaire au niveau de la muqueuse jéjunale des animaux traités à la tartrazine aux doses de 0,45% et 1%. Ces anomalies sont plus marquées chez les animaux traités à 0,45% de tartrazine. Sur le plan cytologique, on distingue une hyperplasie cellulaire chez les souris traitées à la tartrazine à dose de 0,45% et une atrophie lymphocytaire avec une malformation des cellules lymphocytaires marquée chez les animaux traités à 1% de tartrazine, comparée aux témoins. Par ailleurs, les différences morphologiques sont plus marquées chez les animaux traités à la tartrazine et immunisés par rapport aux témoins immunisés. Cette analyse cytologique et histologique de l’architecture tissulaire révèle une action toxique due à la tartrazine sur ces organes aux doses de 0,45% et 1% chez la souris Swiss. Ce travail ouvre d’autre perspectives de recherche sur les effets toxiques de la tartrazine, particulièrement son impact sur : La génotoxicite et l’effet cancérigène L’effet de tartrazine sur l’activité enzymatique La fertilité féminine 62 63 • Abou-El Zahab HSH, El-Khyat ZA, Awadallah R, Mahdy KA.- Physiological effects of some synthetic food coloring additives on rats .Boll Chim Farm, 1997; 136: 615-627. • Abbott RM, Levy AD, Aguiléra NS, Gorospe L, Thomson WM.- Archives of the AFIP primary vascular néoplasms of the spleen: Radiologic- pathologic correlations. Radiographics, 2004; 24:1137-63. • Ali MA, Bashier SA.- Effect of fast green dye on some biophysical properties of thymocytes and splenocytes of albino mice. Food Addit Contam, 2006; 23(5):452-61. • Anderson DP.- Immunological indicators: effects of environmental stress on immune protection and disease outbreaks. 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