Partie 1

Lectines et Ciblage Cellulaire
Lectines et Ciblage Cellulaire
Christian Girard, M.Cf. ENSCP
Christian Girard, M.Cf. ENSCP
Cours de Vectorologie
Cours de Vectorologie
Th
Thé érapie g rapie gé énique: l nique: l"’ "’emballage, le transport et emballage, le transport et
la livraison de l
la livraison de l"’ "’ADN m ADN mé édicament dicament
ADN
ADN “ “Liposomes Liposomes” ”P Pé én né étration tration
–
– Transfecte Transfecte peu seul peu seul
+ Enrobage pour le
+ Enrobage pour le
compacter/transporter
compacter/transporter
+ Vecteurs non-viraux
+ Vecteurs non-viraux
+ Lipides cationiques
+ Lipides cationiques
+ Bon pouvoir pour
+ Bon pouvoir pour
compacter/transporter
compacter/transporter
–
– Certaine toxicit Certaine toxicité é
+ Bonne p
+ Bonne pé én né étration (+) tration (+)
±
± Efficaces pour la Efficaces pour la
Transfection
Transfection (ADN) (ADN)
–
– Pas tr Pas trè ès s s sé électifs lectifs
V
V
I
I
T
T
R
R
O
O
VS
VS
V
V
I
I
V
V
O
O
Diff
Diffé érence en vitro et vivo: le destin des particules rence en vitro et vivo: le destin des particules
Liposomes:
Liposomes: apr aprè ès injection intra-veineuse (i.v.) s injection intra-veineuse (i.v.)
Opsonisation rapide
Opsonisation rapide Macrophages Macrophages
Les particules recouvertes de prot
Les particules recouvertes de prot é éines et glycoprot ines et glycoproté éines sont ines sont é élimin liminé ées es
de la circulation par pi
de la circulation par piè ègeage (taille) dans les organes ou intervention des geage (taille) dans les organes ou intervention des
macrophages (surtout les cellules de Kupffer du foie). Transfection dans
macrophages (surtout les cellules de Kupffer du foie). Transfection dans
divers organes (poumons, foie, rate, etc.)
divers organes (poumons, foie, rate, etc.)
Liposomes
Liposomes “ “furtifs furtifs” ”: : couche de protection hydrophile (PEG) couche de protection hydrophile (PEG)
Circulation
Circulation
Les liposomes sont pr
Les liposomes sont pr é épar paré és avec des polym s avec des polymè ères. Ins res. Insé ér ré és dans la bicouche s dans la bicouche
par une partie grasse, leur partie hydrophile pointe vers l'ext
par une partie grasse, leur partie hydrophile pointe vers l'ext é érieur recou- rieur recou-
vrant ainsi la particule: stabilisation st
vrant ainsi la particule: stabilisation st é érique et masque de charge. Restent rique et masque de charge. Restent
en circulation longtemps mais ne transfectent que peu.
en circulation longtemps mais ne transfectent que peu.
Grosses particules pi
Grosses particules piè èg gé ées es
En augmentant la stabilit
En augmentant la stabilité é
in vivo
in vivo
du liposome on diminue la transfection non-sp
du liposome on diminue la transfection non-spé écifique mais cifique mais
on perd
on perd é également l'efficacit galement l'efficacité é du vecteur. Pour sp du vecteur. Pour spé écificit cificité é et efficacit et efficacité é = t = tê êtes de ciblage. tes de ciblage.
R
Ré égler le probl gler le problè ème de la s me de la sé électivit lectivité é: :
Ciblage des cellules
Ciblage des cellules à à traiter traiter
Cellules:
Cellules: Activ
Activé ées par l es par l’ ’inflammation ou alors inflammation ou alors
en angiogen
en angiogenè èse ou en simple (sur)prolif se ou en simple (sur)prolifé ération. ration.
Maladies:
Maladies: Cancer, d
Cancer, dé ég gé én né érescence r rescence ré étinienne, tinienne,
inflammation chronique (arthrite), etc.
inflammation chronique (arthrite), etc.
Caract
Caracté éristiques: ristiques: Cellules diff
Cellules diffé érentes de rentes de
celles normales par leur activation ou leur type.
celles normales par leur activation ou leur type.
R
Ré écepteur: cepteur: Expression de divers r
Expression de divers ré écepteurs cepteurs
sp
spé écifiques aux cellules cifiques aux cellules à à traiter traiter à à leur surface. leur surface.

La membrane cellulaire et son enrobage sucr
La membrane cellulaire et son enrobage sucré… é…
–
– On retrouve On retrouve à à la surface de la membrane cellulaire le glycoalyx. la surface de la membrane cellulaire le glycoalyx.
–
– Constitu Constitué é de prot de proté éines, glycoprot ines, glycoproté éines et glycolipides. ines et glycolipides.
–
– Ces biomol Ces biomolé écules sont impliqu cules sont impliqué ées dans divers processus cellulaires es dans divers processus cellulaires
(bior
(bioré égulation, interactions et reconnaissance mol gulation, interactions et reconnaissance molé éculaires & cellulaires). culaires & cellulaires).
Principe du ciblage cellulaire: incorporation du ligand
Principe du ciblage cellulaire: incorporation du ligand
T
Tê ête de Ciblage: te de Ciblage: On greffe sur la couche de protec- On greffe sur la couche de protec-
tion du liposome une t
tion du liposome une tê ête de ciblage qui est le ligand te de ciblage qui est le ligand
du r
du ré écepteur s cepteur sé électionn lectionné é ( (
). De cette fa
). De cette faç çon le liposo- on le liposo-
me deviendra
me deviendra “ “ciblant ciblant” ” pour les cellules vis pour les cellules visé ées. es.
Effet thérapeutique
nu
Vecteur+
ciblant
protéine
En th
En thé éorie: orie: Le liposome furtif poss Le liposome furtif possé édant dant
des t
des tê êtes de ciblage tes de ciblage à à sa surface devrait sa surface devrait
gagner en sp
gagner en spé écificit cificité é et sa liaison aux r et sa liaison aux ré é- -
cepteurs cellulaires permettre son inter-
cepteurs cellulaires permettre son inter-
nalisation
nalisation… … en esp en espé érant atteindre des ni- rant atteindre des ni-
veaux de transfection acceptables.
veaux de transfection acceptables.
Maladie, cellule, r
Maladie, cellule, ré écepteur cepteur… … quelle combinaison choisir? quelle combinaison choisir?
–
– R Ré écepteur de l'acide folique (folate) cepteur de l'acide folique (folate)
–
– R Ré écepteurs des facteurs de croissance (GF) cepteurs des facteurs de croissance (GF)
–
– R Ré écepteurs de la s cepteurs de la sé équence RGD quence RGD
–
– R Ré écepteurs des oligosaccharides (sucres) cepteurs des oligosaccharides (sucres)
Cancer:
Cancer:
Folate
Folate
GFs
GFs
(RGD)
(RGD)
Angiogen
Angiogenè èse: se:
(et tumeurs)
(et tumeurs)
GFs
GFs
RGD
RGD
Sucres
Sucres
Type cellulaire:
Type cellulaire:
(normale/activ
(normale/activé ée) e)
GFs
GFs
RGD
RGD
Sucres
Sucres
Ciblage par le r
Ciblage par le ré écepteur de l'acide folique (folate) cepteur de l'acide folique (folate)
–
– Ligand: Ligand: Acide folique (vitamine B Acide folique (vitamine B9
9)
)
–
– R Ré écepteur: cepteur: R Ré écepteur du folate (FR) ou FBP (folate binding protein). cepteur du folate (FR) ou FBP (folate binding protein).
Prot Proté éine sous 3 isoformes ine sous 3 isoformes α α, , β β et et γ γ (rare). (rare).
Affinit
Affinité é: FR : FRα α = 10 = 10-10
-10 M (0,1 nM) / FR
M (0,1 nM) / FRβ β = 10 = 10-9
-9 M (1 nM).
M (1 nM).
–
– Expression: Expression: Surexprim Surexprimé é chez les cellules de la plupart des cancers chez les cellules de la plupart des cancers
humains (ex.: ovaires, reins, ut humains (ex.: ovaires, reins, uté érus, testicules, cerveau, rus, testicules, cerveau,
colon, poumon, etc.).
colon, poumon, etc.).
–
– Avantages: Avantages: Le folate et ses conjugu Le folate et ses conjugué és p s pé én nè ètrent facilement et rapi- trent facilement et rapi-
dement les cellules par endocytose modul
dement les cellules par endocytose modulé ée par la fixation e par la fixation
au r
au ré écepteur. cepteur.
N
NN
N
O
N
N
H
2
N
OCO
2
H
H
HH
CO
2
H

–
– ADN: ADN: Deux oligonul Deux oligonulé éotides anti-EGFR (r otides anti-EGFR (ré écepteur de facteur de cepteur de facteur de
croissance
croissance é épidermique). pidermique).
–
– T Tê ête de ciblage: te de ciblage: DSPE-PEG-folate (0,5% mol) dans EPC/chol (3/2). DSPE-PEG-folate (0,5% mol) dans EPC/chol (3/2).
n = 45, PEG 2000
n = 45, PEG 2000
Liposomes au folate pour un antisense contre l'EGFR
Liposomes au folate pour un antisense contre l'EGFR
–
– Cellules: Cellules: Lign Ligné ée KB (FR positive) de carcinome humain du nasopharynx. e KB (FR positive) de carcinome humain du nasopharynx.
Acide folique
Acide folique PEG PEG– –DSPE DSPE
N
NN
N
O
N
N
H
2
N
OCO
2
H
H
HH
NOOH N
O
n
OPO
ONa
O
O
OC
17
H
35
O
C
17
H
35
OH
O
Fluorescence (oligo marqu
Fluorescence (oligo marqué é) )Inhibition de croissance Inhibition de croissance
aEGFR
libres
liposome
simple
liposome
ciblant
+folic
R
Ré ésultats de l'effet antisense (anti-EGFR) sultats de l'effet antisense (anti-EGFR)
liposomes
ciblants
l
i
b
r
e
l
i
b
r
e
simple
ciblant vide
R
Ré ésultats de fluorescence en cultures mixtes sultats de fluorescence en cultures mixtes
Cancer de l'ovaire
Cancer de l'ovaire
HeLa (cancer de l'ut
HeLa (cancer de l'uté érus) rus)
et dendritiques (WI38)
et dendritiques (WI38)
macrophages
érythrocytes
HeLa
WI38
Ciblage par les r
Ciblage par les ré écepteurs des facteurs de croissance cepteurs des facteurs de croissance
–
– Ligand: Ligand: Facteurs de croissance Facteurs de croissance é épidermique (EGF) ou de l'endoth pidermique (EGF) ou de l'endothé élium lium
vasculaire (VEGF); qui sont des prot
vasculaire (VEGF); qui sont des proté éines. ines.
–
– R Ré écepteur: cepteur: R Ré écepteur de l'EGF (EGFR) ou r cepteur de l'EGF (EGFR) ou ré écepteurs du VEGF (VEGFR). cepteurs du VEGF (VEGFR).
Glycoprot
Glycoproté éines ines à à activit activité é tyrosine kinase. Les VEGFRs ressem- tyrosine kinase. Les VEGFRs ressem-
blent
blent à à des immunoglobulines (partie extracellulaire). des immunoglobulines (partie extracellulaire).
–
– Expression: Expression: Surexprim Surexprimé é chez les cellules canc chez les cellules cancé éreuses (EGF) et les cellules reuses (EGF) et les cellules
vasculaires en angiogen
vasculaires en angiogenè èse (VEGF). se (VEGF).
–
– Avantages: Avantages: Les cellules en angiogen Les cellules en angiogenè èse (tumeur en progression, maladies se (tumeur en progression, maladies
des yeux, etc.) expriment beaucoup de VEGFR.
des yeux, etc.) expriment beaucoup de VEGFR.

EGF humain
EGF humain
les VEGFR
les VEGFR
–
– ADN: ADN: Aucun dans ce cas ! Un test pr Aucun dans ce cas ! Un test pré éliminaire avec un radio-marqueur liminaire avec un radio-marqueur
–
– T Tê ête de ciblage: te de ciblage: DSPE-PEG-AntaG (0,6% mol) dans HSPC*/chol (2/1) DSPE-PEG-AntaG (0,6% mol) dans HSPC*/chol (2/1)
avec du mPEG-DSPE (2,6%) pour le liposome furtif.
avec du mPEG-DSPE (2,6%) pour le liposome furtif.
n = 45, PEG 2000
n = 45, PEG 2000
Liposomes
Liposomes à à l'antagoniste G pour le ciblage de l'EGFR l'antagoniste G pour le ciblage de l'EGFR
–
– Cellules: Cellules: Lign Ligné ée H69 du cancer du poumon e H69 du cancer du poumon à à petites cellules. petites cellules.
Antagoniste G
Antagoniste G PEG PEG– –DSPE DSPE
* HSPC: phosphatidylcholine de soja hydrog
* HSPC: phosphatidylcholine de soja hydrogé én né ée e
SN
OOH
N
O
n
OPO
ONa
O
O
OC
17
H
35
O
C
17
H
35
OH
O
Antagoniste G
R
Ré ésultats de la sp sultats de la spé écificit cificité é de l de l’ ’association association
Cellules H69 (EGFR+)
Cellules H69 (EGFR+)
Cellules Namalwa (EGFR
Cellules Namalwa (EGFR–
–)
)
liposome ciblant
liposome ciblant
liposome furtif
liposome furtif
liposome ciblant
liposome ciblant
liposome furtif
liposome furtif
Ciblage par les int
Ciblage par les inté égrines (reconnaissance RGD) grines (reconnaissance RGD)
–
– Ligand: Ligand: S Sé équence Arg-Gly-Asp (RGD) quence Arg-Gly-Asp (RGD)
dans des prot
dans des proté éines (ex: fibronectine). ines (ex: fibronectine).
Versions cycliques (bloqu
Versions cycliques (bloqué ées) es)
ont une meilleure affinit
ont une meilleure affinité é
(ex: RGD-4C, 100 nM).
(ex: RGD-4C, 100 nM).
R
G
D
–
– R Ré écepteur: cepteur: Glycoprot Glycoproté éine constitu ine constitué ée e
de deux sous-unit
de deux sous-unité és ( s (α α & & β β) dim ) dimé éris risé ées. es.
Les int
Les inté égrines, sont impliqu grines, sont impliqué ées dans la es dans la
reconnaissance et l
reconnaissance et l’ ’adh adhé ésion cellulaire. sion cellulaire.
- Int
- Inté égrine grine α αIIb
IIbβ
β3
3: plaquettes
: plaquettes
- Int
- Inté égrine grine α αV
Vβ
β3
3: cellules endoth
: cellules endothé éliales liales
–
– Expression: Expression: α αV
Vβ
β3
3 surexprim
surexprimé ée lors de e lors de
l
l’ ’angiogen angiogenè èse sur l se sur l’ ’endoth endothé élium vasculai- lium vasculai-
re mais aussi dans les m
re mais aussi dans les mé étastases. tastases.

–
– ADN: ADN: Aucun dans ce cas ! Un test pr Aucun dans ce cas ! Un test pré éliminaire par microscopie. liminaire par microscopie.
–
– T Tê ête de ciblage: te de ciblage: DMTG-espaceur-cRGC (2% mol) dans DMPC*/chol (1/1) DMTG-espaceur-cRGC (2% mol) dans DMPC*/chol (1/1)
avec du PEG
avec du PEG2000
2000-DMPE (1%) pour le liposome furtif.
-DMPE (1%) pour le liposome furtif.
*DMPC= dimyristoylphosphatidylcholine
*DMPC= dimyristoylphosphatidylcholine
DMTG= dimyristoylthioglyc
DMTG= dimyristoylthioglycé érol rol
Liposomes contenant un cRGD pour le ciblage des int
Liposomes contenant un cRGD pour le ciblage des inté égrines grines
–
– Cellules: Cellules: Aucunes! Un ersatz; des liposomes contenant l Aucunes! Un ersatz; des liposomes contenant l’ ’int inté égrine grine α αIIb
IIbβ
β3
3.
.
cRGD
cRGD
Phe
Lys
espaceur
espaceur– –DMTG DMTG
Gly
Asp (D)
Gly (G) Arg (R)
SO
OC
13
H
27
O
C
13
H
27
O
N
O
O
N
N
N
N
O
HO
HO
HO
H
N
N
O
N
H
H
O
H
C
O
N
H
N
N
O
H
O
H
C
O
HO
2
C
N
NH
2
N
H
R
Ré ésultats de l sultats de l’é ’étude d tude d’ ’association par fluorescence association par fluorescence
Les gros liposomes (200 nm) contenant le lipide-espaceur-cRGD sont recou-
Les gros liposomes (200 nm) contenant le lipide-espaceur-cRGD sont recou-
verts des microv
verts des micrové ésicules (points) contenant de l sicules (points) contenant de l’ ’int inté égrine marqu grine marqué ée (rhodamine). e (rhodamine).
Ciblage par les lectines (r
Ciblage par les lectines (ré écepteurs d cepteurs d’ ’oligosaccharides) oligosaccharides)
Lectine:
Lectine: Prot Proté éine ou glycoprot ine ou glycoproté éine de taille variable constitu ine de taille variable constitué ée d'une suite d'aci- e d'une suite d'aci-
des amin
des aminé és comportant un (ou plusieurs) site de reconnaissance d'un carbohydrate s comportant un (ou plusieurs) site de reconnaissance d'un carbohydrate
(Carbohydrate Recognition Domain ou CRD). D
(Carbohydrate Recognition Domain ou CRD). Dé épourvue d'activit pourvue d'activité é catalytique, elle catalytique, elle
participe aux processus de reconnaissance mol
participe aux processus de reconnaissance molé éculaire et cellulaire. culaire et cellulaire.
Les lectines:
Les lectines:
•
• se lient de fa se lient de faç çon sp on spé écifique et r cifique et ré éversible aux oligosaccharides, versible aux oligosaccharides,
•
• n'ont pas d'activit n'ont pas d'activité é catalytique ( catalytique (
vs
vs
enzyme),
enzyme),
•
• ne sont pas issues d'une r ne sont pas issues d'une r é éponse immunitaire ( ponse immunitaire (
vs
vs
anticorps),
anticorps),
•
• circulantes ou membranaires, circulantes ou membranaires,
•
• pr pré ésentes ou exprim sentes ou exprimé ées dans des conditions particuli es dans des conditions particuli è ères, res,
•
• se retrouvent dans tous les organismes vivants, se retrouvent dans tous les organismes vivants,
•
• jouent un r jouent un rô ôle vital dans les processus de reconnaissance cellulaire. le vital dans les processus de reconnaissance cellulaire.
Le site de reconnaissance des carbohydrates (CRD)
Le site de reconnaissance des carbohydrates (CRD)
•
• Le site de reconnaissance a la forme d'une d Le site de reconnaissance a la forme d'une dé épression (concave) pression (concave) à à la surface de la prot la surface de la proté éi- i-
ne. Ceci diff
ne. Ceci diffè ère des autres r re des autres ré écepteurs ou des enzymes o cepteurs ou des enzymes où ù le sucre doit s'enfoncer dans la le sucre doit s'enfoncer dans la
structure pour atteindre le site actif.
structure pour atteindre le site actif.
•"
•"Les sites de reconnaissance semblent pr Les sites de reconnaissance semblent pré éform formé és car peu de modifications conformation- s car peu de modifications conformation-
nelles se produisent lors de la complexation du sucre par la lectine.
nelles se produisent lors de la complexation du sucre par la lectine.
–
–Les lectines se lient aux sucres par ponts hydrog Les lectines se lient aux sucres par ponts hydrog è ène et ne et
interactions hydrophobes.
interactions hydrophobes.
–
–La coordination avec des ions m La coordination avec des ions m é étalliques contenus dans talliques contenus dans
certaines lectines participe quelques fois
certaines lectines participe quelques fois à à la liaison. la liaison.
–
– Les ponts hydrog Les ponts hydrogè ène se forment entre les hydroxyles ne se forment entre les hydroxyles
des carbohydrates et les fonctions NH
des carbohydrates et les fonctions NH 2
2, OH et carbo-
, OH et carbo-
nyles des acides amin
nyles des acides aminé és de la prot s de la proté éine. ine.
–
– Des ponts hydrog Des ponts hydrogè ène bidentates peuvent exister entre ne bidentates peuvent exister entre
deux hydroxyles et le carboxylate des acides aspartique
deux hydroxyles et le carboxylate des acides aspartique
ou glutamique.
ou glutamique.
–
– Des liens coop Des liens coopé ératifs existent ratifs existent é également o galement où ù l'hydroxy- l'hydroxy-
le agit
le agit à à la fois comme donneur et accepteur. la fois comme donneur et accepteur.