Partie 1

Thé
emballage, le transport et
Thérapie gé
génique: l"’
l"’emballage,
la livraison de l"’
ADN mé
l"’ADN
médicament
Lectines et Ciblage Cellulaire
ADN
Christian Girard, M.Cf. ENSCP
Cours de Vectorologie
– Transfecte peu seul
+ Enrobage pour le
compacter/transporter
+ Vecteurs non-viraux
Diffé
Différence en vitro et vivo: le destin des particules
Liposomes: aprè
après injection intra-veineuse (i.v.)
Opsonisation rapide
V
I
T
R
O
VS
V
I
V
O
Macrophages
Les particules recouvertes
recouvertes de
de prot
protéines et glycoprot éines sont éliminé
liminées
de la circulation par pi
piègeage (taille) dans les organes
organes ou
ou intervention
intervention des
des
macrophages (surtout les
les cellules
cellules de
de Kupffer
Kupffer du
du foie).
foie). Transfection
Transfectiondans
dans
divers organes (poumons,
(poumons, foie,
foie, rate,
rate, etc.)
etc.)
Liposomes “furtifs”
furtifs”: couche de protection hydrophile (PEG)
(PEG)
Grosses particules pi
piè
ègées
Circulation
Les liposomes sont
sont pr
préparé
parés avec des polymè
polymères. Insé
Insérés dans la bicouche
par une partie grasse, leur
leur partie
partie hydrophile
hydrophile pointe
pointe vers
vers l'ext
l'extérieur recouvrant ainsi la particule:
particule: stabilisation
stabilisation st
stérique et masque de charge. Restent
Restent
en circulation longtemps
longtemps mais
mais ne
ne transfectent
transfectent que
que peu.
peu.
En augmentant la stabilit
stabilité
é in vivo du liposome on diminue la transfection non-sp
non-spé
écifique mais
on perd également l'efficacité
spé
écificité
l'efficacité du vecteur. Pour sp
cificité et efficacité
efficacité = tê
têtes de ciblage.
“Liposomes”
Liposomes”
+ Lipides cationiques
+ Bon pouvoir pour
compacter/transporter
– Certaine toxicité
toxicité
Pénétration
+ Bonne pé
pénétration (+)
± Efficaces pour la
Transfection (ADN)
– Pas trè
très sé
sélectifs
Régler le problè
problème de la sé
sélectivité
lectivité:
Ciblage des cellules à traiter
Maladies: Cancer, dé
dégénérescence ré
rétinienne,
inflammation chronique (arthrite),
(arthrite), etc.
etc.
Cellules: Activé
Activées par l’l’inflammation ou alors
en angiogenè
angiogenèse ou en simple (sur)prolifé
(sur)prolifération.
Caracté
différentes de
Caractéristiques: Cellules diffé
celles normales par leur activation ou leur type.
Récepteur: Expression de divers ré
récepteurs
spé
spécifiques aux cellules à traiter à leur surface.
La membrane cellulaire et son enrobage sucr
sucré…
é…
Principe du ciblage cellulaire: incorporation du ligand
Tête de Ciblage: On greffe sur la couche de protection du liposome une tê
tête de ciblage qui est le ligand
du ré
é
cepteur
sé
é
lectionné
r
s lectionné (
(). De cette faç
façon le liposome deviendra “ciblant”
ciblant” pour les cellules visé
visées.
ciblant
Vecteur+
– On retrouve à la surface de la membrane cellulaire le glycoalyx.
– Constitué
Constitué de proté
protéines, glycoproté
glycoprotéines et glycolipides.
– Ces biomolé
biomolécules sont impliqué
impliquées dans divers processus cellulaires
(bioré
(biorégulation, interactions et reconnaissance molé
moléculaires & cellulaires).
Maladie, cellule, ré
récepteur…
cepteur… quelle combinaison choisir?
protéine
nu
Effet thérapeutique
En thé
théorie: Le liposome furtif possé
possédant
des tê
têtes de ciblage à sa surface devrait
gagner en spé
spécificité
cificité et sa liaison aux ré
récepteurs cellulaires permettre son internalisation…
nalisation… en espé
espérant atteindre des niveaux de transfection acceptables.
Ciblage par le ré
récepteur de l'acide folique (folate)
O
– Ré
Récepteur de l'acide folique (folate)
– Ré
Récepteurs des facteurs de croissance (GF)
– Ré
Récepteurs de la sé
séquence RGD
– Ré
Récepteurs des oligosaccharides (sucres)
Cancer:
Angiogenè
Angiogenèse:
Type cellulaire:
Folate
GFs
(RGD)
(et tumeurs)
GFs
RGD
Sucres
(normale/activé
(normale/activée)
GFs
RGD
Sucres
O
– Ligand: Acide folique (vitamine B 9)
H
H 2N
N
N
N
N
N
H
CO2H
N
H
CO2H
– Ré
Récepteur: Ré
Récepteur du folate (FR) ou FBP (folate
(folate binding
binding protein).
protein).
Proté
Protéine sous 3 isoformes α, β et γ (rare).
Affinité
Affinité: FRα
FRα = 10-10 M (0,1 nM) / FRβ
FRβ = 10-9 M (1 nM).
– Expression: Surexprimé
Surexprimé chez les cellules de la plupart des cancers
humains (ex.: ovaires, reins, ut érus, testicules, cerveau,
colon, poumon, etc.).
– Avantages: Le folate et ses conjugué
conjugués pé
pénètrent facilement et rapidement les cellules par endocytose modulé
modulée par la fixation
au ré
récepteur.
Liposomes au folate pour un antisense contre l'EGFR
– ADN: Deux oligonulé
oligonuléotides anti-EGFR (ré
(récepteur de facteur de
croissance épidermique).
– Cellules: Ligné
Lignée KB (FR positive) de carcinome
carcinome humain
humain du
du nasopharynx.
nasopharynx.
Résultats de l'effet antisense (anti-EGFR)
Fluorescence (oligo marqué
marqué)
aEGFR
libres
– Tê
Tête de ciblage: DSPE-PEG-folate (0,5% mol) dans EPC/chol (3/2).
(3/2).
CO2H
O
O
H
H 2N
N
N
N
N
N
H
N
H
H
N
O
H
N
O
n
O
O
O
O P O
ONa
+folic
l
i
b
r
e
l
i
b
r
e
O
C17H35
O
C17H35
O
O
n = 45, PEG 2000
Acide folique
Inhibition de croissance
PEG–
PEG–DSPE
Résultats de fluorescence en cultures mixtes
érythrocytes
WI38
liposome
simple
liposome
ciblant
ciblant vide
simple
liposomes
ciblants
Ciblage par les ré
récepteurs des facteurs de croissance
– Ligand: Facteurs de croissance épidermique (EGF) ou de l'endoth élium
vasculaire (VEGF); qui sont des proté
protéines.
macrophages
– Ré
Récepteur: Ré
Récepteur de l'EGF (EGFR) ou ré
récepteurs du VEGF (VEGFR).
Glycoproté
Glycoprotéines à activité
activité tyrosine kinase. Les VEGFRs ressemblent à des immunoglobulines (partie extracellulaire).
– Expression: Surexprimé
Surexprimé chez les cellules cancé
cancéreuses (EGF) et les cellules
vasculaires en angiogenè
angiogenèse (VEGF).
HeLa
Cancer de l'ovaire
HeLa (cancer de l'uté
l'utérus)
et dendritiques (WI38)
– Avantages: Les cellules en angiogenè
angiogenèse (tumeur en progression, maladies
des yeux, etc.) expriment beaucoup
beaucoup de
de VEGFR.
VEGFR.
Liposomes à l'antagoniste G pour le ciblage de l'EGFR
EGF humain
– ADN: Aucun dans ce cas ! Un test pré
préliminaire avec un radio-marqueur
– Cellules: Ligné
Lignée H69 du cancer du poumon à petites cellules.
– Tê
Tête de ciblage: DSPE-PEG-AntaG (0,6% mol) dans HSPC*/chol (2/1)
avec du mPEG-DSPE (2,6%) pour le liposome furtif.
furtif.
H
N
Antagoniste G S
O
O
les VEGFR
H
N
O
n
O
O
O P O
ONa
O
C17H35
O
C17H35
O
O
n = 45, PEG 2000
Antagoniste G
PEG–
PEG–DSPE
* HSPC: phosphatidylcholine de soja hydrogé
hydrogénée
Cellules Namalwa (EGFR
(EGFR––)
Cellules H69 (EGFR+)
Résultats de la spé
spécificité
cificité de l’l’association
Ciblage par les inté
intégrines (reconnaissance RGD)
liposome ciblant
G
R
D
liposome furtif
– Ligand: Sé
Séquence Arg-Gly-Asp (RGD)
dans des proté
protéines (ex: fibronectine).
liposome ciblant
liposome furtif
Versions cycliques (bloqué
(bloquées)
ont une meilleure affinité
affinité
(ex: RGD-4C, 100 nM).
– Ré
Récepteur: Glycoproté
Glycoprotéine constitué
constituée
de deux sous-unité
é
s
(α
α
&
β
)
dimé
sous-unit (
dimérisé
risées.
Les inté
é
grines,
sont
impliqué
é
es
dans
la
int
impliqu
reconnaissance et l’l’adhé
é
sion
cellulaire.
adh
- Inté
Intégrine αIIbβ3: plaquettes
- Inté
Intégrine αVβ3: cellules endothé
endothéliales
– Expression: αVβ3 surexprimé
surexprimée lors de
l’angiogenè
angiogenèse sur l’l’endothé
endothélium vasculaire mais aussi dans les mé
métastases.
Liposomes contenant un cRGD pour le ciblage des inté
intégrines
Résultats de l’é
tude d’
l’étude
d’association par fluorescence
– ADN: Aucun dans ce cas ! Un test pré
préliminaire par microscopie.
– Cellules: Aucunes! Un ersatz; des liposomes contenant l ’inté
intégrine αIIbβ3.
– Tê
Tête de ciblage: DMTG-espaceur-cRGC (2% mol) dans DMPC*/chol (1/1)
avec du PEG2000-DMPE (1%) pour le liposome furtif.
Lys
Phe
H N
C N
O H
O
O H N
Asp (D) HO2C
H
N
O
O
N
H
H
N
O
O
N
H
N
O
Gly
O
O
C13H27
O
C13H27
S
O
O
N H O
O
N H
N C
H O
Gly (G)
espaceur–
espaceur–DMTG
Arg (R)
N
N
H
NH2
*DMPC= dimyristoylphosphatidylcholine
DMTG= dimyristoylthioglycé
dimyristoylthioglycérol
cRGD
Ciblage par les lectines (ré
(récepteurs d’
d’oligosaccharides)
Lectine: Proté
Protéine ou glycoproté
glycoprotéine de taille variable constitué
constituée d'une suite d'acides aminé
reconnaissance d'un
d'un carbohydrate
carbohydrate
aminés comportant un (ou plusieurs) site de reconnaissance
(Carbohydrate Recognition Domain ou CRD). D
Dé
épourvue d'activité
d'activité catalytique, elle
participe aux processus de reconnaissance mol
molé
éculaire et cellulaire.
Les lectines:
• se lient de faç
façon spé
spécifique et ré
réversible aux oligosaccharides,
oligosaccharides,
• n'ont pas d'activit é catalytique ( vs enzyme),
• ne sont pas issues
issues d'une
d'une rréponse immunitaire ((vs anticorps),
• circulantes ou membranaires,
membranaires,
• pré
présentes ou exprim ées dans des conditions
conditions particuli
particulières,
• se retrouvent dans
dans tous
tous les
les organismes
organismes vivants,
vivants,
• jouent un r ôle vital dans les processus
processus de
de reconnaissance
reconnaissance cellulaire.
cellulaire.
Les gros liposomes (200 nm) contenant le lipide-espaceur-cRGD sont recouverts des micrové
microvésicules (points) contenant de l’l’inté
intégrine marqué
marquée (rhodamine).
Le site de reconnaissance des carbohydrates (CRD)
• Le site de reconnaissance a la forme d'une d
dé
épression (concave) à la surface de la proté
protéine. Ceci diffè
écepteurs ou des enzymes ooù
ù le sucre doit s'enfoncer dans la
diffère des autres rré
structure pour atteindre le site actif.
•"Les
semblent pr
pré
éformé
•"Les sites de reconnaissance semblent
formés car peu de modifications conformationnelles se produisent lors de la complexation du sucre par
par la
la lectine.
lectine.
–Les lectines se lient
lient aux
aux sucres
sucres par
par ponts
ponts hydrog
hydrogène et
interactions hydrophobes.
hydrophobes.
–La coordination avec des ions
ions m
métalliques contenus dans
dans
certaines lectines participe
participe quelques
quelques fois
fois à la liaison.
– Les ponts hydrog ène se forment entre
entre les
les hydroxyles
hydroxyles
des carbohydrates et les
les fonctions
fonctions NH
NH2, OH et carbonyles des acides amin
aminés de la proté
protéine.
– Des ponts hydrog ène bidentates peuvent
peuvent exister
exister entre
entre
deux hydroxyles et le carboxylate
carboxylate des
des acides
acides aspartique
aspartique
ou glutamique.
– Des liens coopé
coopératifs existent
existent également où
où l'hydroxyle agit à la fois comme donneur et
et accepteur.
accepteur.