Nouveaux outils de cytogénétique moléculaire \(MLPA et CGH

Nouveaux outils de cytogénétique
moléculaire (MLPA et CGH)
utilisés en constitutionnel
COUTTON Charles
EC Génétique
Jeudi 12 Janvier 2012
Remaniements génomiques
• Regroupent les duplications, les délétions,
les insertions, les inversions et les
translocations.
• Impliquent des régions d’une centaine de
paires de bases jusqu’à plusieurs millions
• A l’origine de:
– polymorphismes bénins
– maladies génétiques regroupées sous le nom
de maladies ou désordres génomiques
Mécanismes
• Trois principaux mécanismes:
– NAHR (Non Allelic Homologous Recombination)
ou recombinaison homologue non allélique
– NHEJ (Non Homologous End Joining) ou
raccordement d’extrémités non homologues
– FoSTeS (Fork Stalling and Template Switching)
• Surviennent aussi bien dans les cellules germinales
(méiose) que dans les cellules somatiques (mitose /
mosaïque)
=> maladies génétiques / cancers
NAHR
• Dérive d’un mécanisme de réparation d’une CDB de l’ADN
• Recherche d’une matrice contenant une séquence homologue =>
erreurs possibles si une mauvaise matrice de réparation est
utilisée => NAHR
• Du à des séquences répétées appelées LCR (Low copy repeat) (5 %
de notre génome , forte homologie (>90%)
• A proximité de structures génomiques capables de générer des
CDB
NAHR
Pathogène ou bénin ?
Bénin +++
Risque pour la descendance
NHEJ
• Mécanisme biochimique
de réparation de l’ADN
• Perte d'information :
les extrémités de la
cassure double brin
sont souvent digérées
avant d'être recollées
• Impliqués dans les
• recombinaisons
«physiologiques» V(D)J
•
• En pathologie: cancers
+++, DMD…
FoSTeS
• Lié à la réplication (pas
de CDB)
• Entraine la formation de
réarrangements non
récurrents complexes
• En pathologie: PelizaeusMerzbacher, PotockiLupski (PTLS)
• Nécessite « que » des
micro-homologies de
séquences
Copy Number Variation
• Si le réarrangement génomique entraine
une variation du nombre de copies (gain
/ perte) d’un segment d’ADN de 1 kb et
plus, on parle de CNV (Copy Number Variation)
• Soit polymorphes, soit pathogènes:
⇒ Intérêt médical
⇒ Intérêt d’étude et de détection
CNV et polymorphismes
Cohorte d’individus « apparemment » sains
CNVs et polymorphismes
Répertoriés dans des bases de données (DGV)
57 000 CNVs décrits
Représenterait 13 à 20% du génome
Situés dans des régions pauvres en gènes ou liés à
l’environnement (R olfactifs)
Si F > 1% : CNP (copy number polymorphism)
CNVs et pathologies
Phénotype anormal:
RM + dysmorphie
Répertoriées dans des
bases de données
(DECIPHER)
Méthodes de detection
1956
Premier caryotype
.
.
.
1970
« banding »
.
.
.
1990
.
.
.
« banding » haute-résolution
FISH
CGH
CGH-array
2000
.
.
.
MLPA, QMPSF
Choix des techniques
Approche globale
Approche ciblée
FISH
Caryotype
CGH-array
MLPA
Choix des techniques
MLPA
Exon: 50 à 1000 pb
CGH-array
Gène moyen: 2.104 pb
FISH
Sous-bande: 2.105 pb
Caryotype
Résolution
Séquençage
Paire de bases
Bande chromosomique: 3.106 pb
ATGCACTGATGAATGCATGCAAT
Caryotype / FISH
Carotype
Résolution entre 3 et 5 Mb
Inconvénients: long ; faible résolution; cout
Avantages: mécanismes remaniements
FISH
Résolution: 150Kb
Inconvénients: petite duplication, cout,
culture, banque de clones
Avantages: mécanismes remaniements
FISH
CGH-array
• Technique d’hybridation comparative génomique sur microréseau
(puce à ADN).
• Technique de quantification relative: mise en évidence de
pertes ou de gains de matériel chromosomique (par rapport à
une référence).
CGH-array
• Digestion de l'ADN génomique par les
enzymes AluI et RsaI
– Obtention de produits de digestion dont la
taille varie entre 100 et 500 pb
• Marquage fluorescent de l'ADN digéré
– Alexa Fluor 5 et Alexa Fluor 3
• Purification sur colonne de l'ADN digéré et
marqué
• Vérification du marquage au Nanodrop
– Rejet des échantillons si marquage
insuffisant
CGH-array
Dans chaque spot:
Fragment spécifique d’ADN simple brin de petite taille (60 pb)
Dépôt multiple du même oligonucléotide
CGH-array
• Hybridation sur lame CGH
– 4x180K
– Caisson ozone free
– Durée 24 h à 65°C
ADN
Témoin
ADN
Patient
CGH-array
• Lavages
CGH-array
• Scan des lames et extraction des données
– Mesure des intensités de fluorescence
– Logiciels d'extraction des données et
d'analyse
CGH-array
• Interprétation
Patient
Témoin
Patient
=
Quantité d’ADN identique chez le
patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Log2(R/V)
Témoin
Patient
Témoin
CGH-array
• Interprétation
Patient
Témoin
Patient
Témoin
Patient
=
Quantité d’ADN identique chez le
patient et le témoin
- fluorescence jaune
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
Quantité d’ADN moindre chez le
patient par rapport au témoin
- délétion
Log2(R/V)
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
Témoin
CGH-array
• Interprétation
Patient
Témoin
Patient
Témoin
Patient
Témoin
=
Quantité d’ADN identique chez le
patient et le témoin
Quantité d’ADN supérieure chez le
patient par rapport au témoin
- fluorescence jaune
- duplication
- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0
- fluorescence rouge
- ratio de fluorescence log2(3/2) = 0,58
Log2(R/V)
Quantité d’ADN moindre chez le
patient par rapport au témoin
- délétion
- fluorescence verte
- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1
CGH-array
Expérience en quatuor:
CGH-array
Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin)
Délétion ?
Duplication ?
CGH-array
• Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin) :
courbe rouge
• Courbe rouge : log2(1/2) = -1
• 1 copie patient / 2 copies témoins
• Patient A en Al3 et D en Al5 : courbe
verte
• Courbe verte : log2(2/1) = 1
• 2 copies témoins / 1 copie patient
=> Image en miroir
⇒ Délétion chez A confirmée
• Pas de miroir pour la duplication
⇒ CNV n'appartiennent pas à A
CGH-array
Expérience en quatuor:
• Avantages du quatuor et dye swap
– Moindre coût : 4 patients par lame
– Confirmation de l’anomalie qui apparaît en miroir
– Bonne attribution des CNV
– Lecture plus facile quand la courbe est bruitée
– Attention : ne pas associer patients avec clinique strictement
identique
CGH-array
Détection d’anomalies au niveau de régions pauvres en bandes
Délétion 4q21.22q22.3 ~ 15.2 Mb
CGH-array
Détection facilité des anomalies complexes
Délétion
Inv dup
del (8p)
Duplication
CGH-array
Détection de petits remaniements
Duplication de 30 Kb
CGH-array
Détection de faibles mosaïques
Duplication 1qcenq24.2 de 35 Mb en mosaïque à 23 %
CGH-array
• Différents type de puces CGH-array (en f° des
cibles)
– BAC/PAC: robuste, sensible, contrôle aisé, faible
résolution (80-200 Kb), limite de la banque
– Oligonucléotides: résolution: < 30kb moy.
• Longs: CNV seulement; excellente spécificité
• Courts: détection des CNV + SNPS (LOH)
– cDNA: étude du niveau d’expression
• Puces ciblées
– Hyperdense sur un région d’intérêt (< 1 kb)
– Limitées à des régions précises (résolution std)
• Choix de la plate-forme dépend aussi du cout
et des outils d’analyse bio-informatique.
Choix des techniques
Approche globale
Approche ciblée
FISH
Caryotype
CGH-array
MLPA
MLPA
Denaturation
Hybridation
MLPA
Ligation
MLPA
Ligation
MLPA
Amplification
1
2
3
45
MLPA
Séparation électrophorétique
Patient
Témoin
Une différence relative de la hauteur ou surface d’un pic
indique une variation du nombre de copie de la séquence cible.
Triple X
MLPA
Normalisation
• Permets une quantification relative des signaux de chaque sonde:
• par rapport aux sondes contrôles (c)
• par rapport à un témoin négatif (sain)
⇒ obtenir un ratio
⇒ apprécier le nombre de copie de la région cible
1
Exemple
Témoin
1.5
c
c
0.5
1
1
0
MLPA et 22q11
Région
22q11
Témoin
Comparaison
Délétion
22q11
Patient
MLPA / CGH-array
CGH-array
MLPA
Hybridation
sondes / cibles
Analyse
des
signaux
Quantification
MLPA / CGH-array
• Avantages
MLPA
• Pas de culture (ADN)
• Multiplexage
• Spécificité 100%
• Sensibilité 100%
• Coût
• Rapide (48h)
• Tous types de tissus
CGH-array
• Pas de culture (ADN)
• Analyse pangénomique
• Haute résolution
• Haut débit
• Automatisable
• Tous types de tissus
CGH-array et RM
• Patients avec RM + dysmorphie:
– Le caryotype seul: 3 à 5% de diagnostic
– Caryotype + FISH: 8 à 10% de diagnostic
– CGH-array: 9 à 13% d’anomalies supplémentaires
par rapport au caryotype => 12 à 18% de diagnostic
CGH-array en première intention en post-natal ?
MLPA et 22q11
La MLPA détecte 100% des anomalies impliquées
LA FISH ne détecte « que » 95% des anomalies
Stachon et al. 2007. AJMG
MLPA / CGH-array
• Limites
MLPA
• Ne détecte pas les
remaniements équilibrés
• Anomalie de la ploïdie
• Analyse ciblée
• Mécanisme de l’anomalie
• Faux positifs
• Pas automatisable
CGH-array
• Ne détecte pas les
remaniements équilibrés
• Anomalie de la ploïdie
• Prix
• Mécanisme de l’anomalie
• Éthique
• Interprétation complexe
Ethique
Perte d’un gène suppresseur de tumeur (TP53)
Impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni => attitude ?
Interprétation
• Que faire quand on trouve des délétions ou des duplications ?
– Est-ce un CNV (Copy Number Variation) bénin ?
– Est-ce un CNV responsable de la maladie ?
– Bases de données
– Vérification de la variation chez le cas index
– Analyse des parents
Interprétation
Interprétation
• Anomalies héritées = polymorphismes ??
- L’expressivité variable : une même maladie s’exprime de
manière différente chez plusieurs personnes porteuses de
la même anomalie génomique.
- La pénétrance incomplète : elle consiste en l’absence
d’expression de la maladie chez une personne porteuse
d’une même anomalie génétique.
- La récessivité ou hétérozygote composite : un gène inclus
dans la région délétée peut avoir son deuxième allèle
porteur d’une mutation révélant ainsi une maladie récessive
autosomique.
- L’empreinte parentale : elle consiste en l’expression
différentielle de régions génomiques selon qu’elles sont
héritées du père ou de la mère du patient.
- La régulation épigénétique : la méthylation ou l’acétylation
différentielles de certaines régions génomiques entraînent
une modification du niveau d’expression des gènes.
Interprétation
Array CGH
Van Ommen GJ
Nat Genet 37:333-4, 2005
Normal
CNV
Connu
Inconnu
Analyser
les parents
Hérité
de novo
Anomalie causale
Anomalie
causale
Polymorphisme
(CNP)
Critères de Lee
Guidelines :Vermeesch et al, Shaffer et al
Interprétation
Interprétation
Anomalie de novo dans une région dépourvue de gènes et
non répertoriée dans les bases de données
=> interprétation ?
Interprétation
Interprétation
• L’association de plusieurs CNVs apparemment
bénins et/ou l’association avec d’autres
facteurs comme des facteurs
environnementaux peut favoriser l’apparition
d’une maladie.
• Depuis quelques années, certains CNVs ont
été clairement identifiés comme facteurs de
prédisposition ou de susceptibilité à des
maladies complexes multifactorielles (cancers,
neuro-dégénératives etc…).
Interprétation
• CNVs et prénatal
Signes d'appel écho ne
justifiant pas à eux seuls l'IMG
CNV inconnus
Hérités ?
CNV dans les gènes de
prédisposition aux
cancers
Technique longue
et coûteuse
Séquençage haut-débit
• Séquenceurs nouvelles génération
– Séquençage d’un grand nombre de
fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)
– Séquences générées alignées sur séquence
de référence
– Application en cancéro / constitutionnel
• Efficacité validée mais recherche fondamentale
• Niveau de résolution meilleure que puces