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///͘ϮD>/^>>Z'/Yh^͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ϳϬ
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&+$3,75(,9B'(7(50,1,60(*(1(7,48('(60$/$',(608/7,)$&725,(//(6
/s͘ϭ/EdZd^DK>^E/Dhy͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘͘ϳϵ
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Atps-induced immunological disorders
Auto-immune regulator
Activating Protein 1
Activating transcription factor
Auro ThioPropanol Sulfonate
"Back-Cross" ou croisement en retour
Récepteur à l'antigène des cellules B
Barrière hémato-encéphalique
Brown Norway
Chromosome 9
Cellule Dendritique
CD45RC Expression in CD4/CD8 T cells locus
Adjuvant Complet de Freund
Calponin Homology
CentiMorgan
Complexe Majeur d'Histocompatibilité
Cellule Présentatrice d'Antigène
Calcium Release Activated calcium Chanel
cortical Thymic Epithelial Cells
Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
Dermatite atopique
Diacylglycérol
Dbl Homology
Double négatif
Double positif
Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale
Extracellular signal-regulated protein kinases
Hybride de première génération
Hybride de deuxième génération
Foxp3 regulatory t cells locus
Forhead box protein 3
Guanine nucleotide Exchange Factor
Glucocorticoid- Induced Tumor necrosis factor Receptor
Growth factor receptor-bound protein 2
Indoléamine 2,3-dioxygénase
Interféron
Interleukine
Inositol-1,4,5-triphosphate
Immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy-X-linked Syndrom
Immune Response
Interval-Specific Congenic Strain
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JNK
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KI
KO
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LB
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LT
MAPK
MBP
MOG
mTEC
NFAT
NF-kB
NLS
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PiP2
PKB
PKC
PLC
PLP
PP-MS
PR
PS-MS
PTEN
QTL
RAG
RR-MS
SCID
SEP
SH
SLP76
SNC
SNP
SOS
STAT5
Tconv
TCR
Treg
IL-2 inducible T cell kinase
c-Jun NH2-terminal kinases
kilobase
Knock-In
Knock-Out
Linker for Activation of T cells
Lymphocyte B
Lewis
Lymphocyte T
Mitogen Activator Protein Kinase
Protéine basique de la myéline
Glycoprotéine de la myéline et de l'oligodendrocyte
Cellules épithéliales médullaires
Nuclear Factor of Activated T cells
Nuclear Factor-țB
Signal de localisation nucléaire
Paire de bases
Pleckstrin homology
Phosphatidyl-inositol-3 Kinase
Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate
Proteine Kinase B
Proteine Kinase C
Phospholipase C
Protéine protéolipidique
Forme progressive primaire de la SEP
Domaine riche en proline
Forme progressive secondaire de la SEP
Phosphatase and tensin homolog
Quantitative Trait Locus
Recombinase Activating Gene
Forme rémittente-récurrente de la SEP
Severe Combined Immunodeficiency
Sclérose En Plaques
Src Homology
SH2 domain containing Leucocytes Phosphoprotein of 76Kd
Système Nerveux Central
Single Nucleotide Polymorphism
Son Of Sevenless
Signal Transducer and Activator of Transcription 5
LT conventionnel
Récepteur à l'antigène des cellules T
Lymphocyte T régulateur CD4+ Foxp3+
2
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Les maladies auto-immunes et allergiques sont des maladies multifactorielles. Elles résultent
d’interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux. L’identification des
gènes impliqués dans la sensibilité à ces maladies est rendue difficile par l’hétérogénéité génétique des
populations et la variabilité de l’environnement. Notre laboratoire a développé un modèle de choix
sans équivalent chez la souris pour étudier le contrôle génétique de ces maladies immunes
multifactorielles en pathologie expérimentale. Ce modèle est représenté par deux souches de rats,
Lewis (LEW) et Brown-Norway (BN), qui sont génétiquement prédisposés à développer des types de
réponses immunes différentes. Ces différences sont associées à des sensibilités opposées vis-à-vis des
maladies auto-immunes et des manifestations allergiques. Le rat LEW est sensible, et le rat BN
résistant, aux maladies auto-immunes de type 1, comme l’encéphalomyélite auto-immune
expérimentale (EAE), modèle de sclérose en plaques (SEP). En revanche, le rat BN développe des
désordres allergiques de type 2 après injections chroniques de sels de métaux lourds, alors que le rat
LEW est résistant à l'induction de ces désordres. Les études génétiques dans ce modèle ont identifié à
l’extrémité acrocentrique du chromosome 9, une région contrôlant la sensibilité à l’inflammation du
système nerveux central (locus Eae4) et aux manifestations allergiques induites par les sels de métaux
lourds (locus Iresp3). La co-localisation de ces loci suggère que cette région contient un gène ou
cluster de gènes jouant un rôle majeur dans l’homéostasie du système immunitaire.
Au cours de ma thèse, la dissection génétique de ces loci à l’aide de lignées et sous-lignées
congéniques de rats m'a permis d’affiner la localisation du locus Iresp3 à 117 kb et du locus Eae4 à
1cM. J’ai montré que la région de 117 Kb contrôle la proportion et le nombre absolu des lymphocytes
T régulateurs Foxp3+ (Treg) (locus Fort1). Par cartographie haplotypique de six souches de rats, le
polymorphisme codant pour la mutation p.Arg63Trp dans l’exon 1 de Vav,1 a été associé au niveau d'
expression des cytokines de type 1, et à la proportion des Treg au sein des LT CD4. Les études
cellulaires réalisées in vitro ont montré que le polymorphisme R63W a un impact fonctionnel et
quantitatif majeur sur la protéine Vav1. Le variant Vav1-63W est associé à une faible quantité
protéique, à une hyperphosphorylation des tyrosines et a une augmentation de l’activité "facteur
d’échange guanidique" de Vav1. Nous avons aussi montré que ce variant est associé à une réduction
du flux calcique dans les LT activés, phénomène probablement lié à une réduction de l’activité
adaptatrice du Vav1. Enfin, l’étude du gène orthologue chez l’homme a montré une association entre
un haplotype de l’intron 1 de VAV1 et la sensibilité à la sclérose en plaques (SEP).
Ce travail souligne l'intérêt des recherches translationnelles allant des modèles expérimentaux
à la pathologie humaine. Les résultats obtenus ouvrent de nouvelles possibilités d'études sur le rôle des
voies cellulaires mettant en jeu Vav1 dans les cellules du système immunitaire avec à terme de
possibles retombées pour le traitement des maladies immunes, notamment de la SEP.
3
4
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Autoimmune and allergic diseases are multifactorial diseases resulting from complex
interactions between genetic and environmental factors. Human genetic studies are hampered by the
genetic heterogeneity of human population and the variability of environment. Our team has
developed a rat model to investigate the genetic control of immune diseases. This model is based on
two rat strains, BN and LEW, which are different for their immune responses. These differences are
associated with opposite susceptibility to autoimmune and allergic diseases. LEW rats are susceptible,
and BN rats resistant, to type-1-mediated autoimmune diseases, like experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE), an animal model of multiple sclerosis (MS). Conversely, BN rats are
susceptible, and LEW rats resistant, to type-2-mediated allergic disorders induced by heavy metal
injections. Genetic studies in this model have identified at the acrocentric tip of chromosome 9 (c9), a
region that controls the susceptibility to central nervous system inflammation (locus Eae4) and the
susceptibility to heavy metal-triggered immune disorders (locus Iresp3). This region also controls the
level of CD45RC expression on T cells. This level defines subsets of T lymphocytes (CD45RChigh and
CD45RClow) that are characterized by different cytokinic profiles and functions. The colocalization of
these three loci suggests that this region contains a gene or set of genes that plays a major role in the
control of immune system homeostasis.
During my thesis, genetic dissection of these loci using rat congenic and sub-congenic lines
led to narrow down Iresp3 and Cdexp1 to a 117 kb region and Eae4 to a 1cM region that includes
Iresp3 and Cdexp1. We further demonstrated that, in basal conditions, the 117 kb region controls the
absolute number and proportion of regulatory Foxp3+ T cell population (Treg) (locus Fort1). The
haplotypic maps of six rat strains allowed us to associate R63W polymorphism in exon 1 of Vav1 with
a decreased expression of type 1 cytokines and an increased proportion and number of Treg.. In vitro
studies showed that the R63W polymorphism impacts the cellular amount of Vav1 protein and its
function. In fact, the Vav1-63W variant was responsible for a 4 fold reduction of Vav1 protein and for
Vav1 constitutive activation, revealed by its tyrosine hyperphosphorylation and increased guanine
nucleotide exchange factor activity. Moreover, Vav1-63W is increased by 4 fold as compared to
Vav1-63R. Vav1-63W is also associated with a decrease of calcium flux after TCR engagement,
which may be related to the decrease in the total amount of Vav1 and thus to the decrease of cellular
Vav1 adaptor capacity. Finally, human studies of the orthologous gene showed the association of an
haplotype in intron 1 of VAV1 with MS.
This work demonstrates the power of translational researches going from animal models to
human pathology and suggests that alterations in Vav1 signaling could be a new target for the
management and treatment of immune diseases such as MS.
5
6
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8
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
Chapitre I _ Lymphocytes T effecteurs, principaux acteurs du
système immunitaire.
Le système immunitaire assure le maintien de l’homéostasie de l’organisme. Sa
fonction est de lutter contre les processus infectieux et cancéreux. Caractérisé par une
collaboration intensive entre de nombreux types cellulaires, son fonctionnement s’articule
autour de trois processus critiques : 1) La reconnaissance du danger, 2) la mise en place d’une
réponse adaptée, 3) la modulation de la réponse immune.
Un des aspects majeurs de l’immunologie est de comprendre comment l’organisme est
capable de détecter la présence d’agents infectieux et de les éliminer sans détruire ses propres
tissus. L’immense diversité moléculaire des pathogènes, leurs forts niveaux de réplication
ainsi que leurs fortes capacités à muter expliquent la complexité de ces processus. La réponse
du système immunitaire à ces agents infectieux peut être subdivisée, chez les vertébrés, en
deux sous-ensembles, la réponse innée et la réponse adaptative.
Le système immunitaire inné agit en premier pour détecter la présence et la nature des
infections et assurer une première ligne de défense de l’organisme. Il contrôle l’initiation et la
nature de la réponse adaptative. Celle-ci est permise par la génération aléatoire d’un immense
répertoire de récepteurs à l’antigène, les TCR (Récepteur à l’antigène des cellules T) et les
BCR (Récepteur à l’antigène des cellules B). Elle nécessite une expansion clonale des cellules
spécifiques et est responsable de la mémoire immunologique. Bien que critique dans la
protection de l’organisme, le système adaptatif ne peut fonctionner de façon autonome. En
effet, les lymphocytes T (LT) sont incapables de détecter les pathogènes dans leurs contextes
biologiques, mais reconnaissent des motifs antigéniques présentés par les molécules du CMH
(Complexe Majeur d’Histocompatibilité). La distribution clonale des réc1epteurs implique un
délai d’expansion des clones spécifiques et de différenciation en cellules effectrices
généralement compris entre 4 et 7 jours. C'est au système immunitaire adaptatif, et plus
précisément aux LT, sujets de nos études, que nous nous intéresserons dans les chapitres
suivants.
I.1 Le thymus, une usine à lymphocytes T.
La population lymphocytaire T est une population cellulaire hétérogène constituée de
différentes sous-populations de phénotypes et de fonctions différentes. Les LT dérivent de
9
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
précurseurs lymphoïdes présents dans la moelle osseuse qui migrent précocement dans le
thymus, l'organe central de leur différenciation où va se réaliser la génération aléatoire de
récepteurs à l'antigène, la différenciation en sous-populations CD4+ et CD8+ et l'élimination
d'une grande partie des cellules auto-réactives par le mécanisme de tolérance centrale. Il
existe plusieurs types de LT caractérisés par la nature de leur TCR. Nous nous intéresserons
ici à la population LT majoritaire dite conventionnelle exprimant un TCR composé des
chaînes Į et ȕ.
I.1.a) Le développement thymique
L’objectif du système immunitaire est de générer des LT exprimant à leur surface des
récepteurs dont la spécificité, en théorie, couvre l’ensemble des pathogènes. Pour cela, le
développement thymique des LT nécessite de nombreuses étapes ordonnées, caractérisées par
l’acquisition ou la perte de molécules clefs. Ainsi, au long de sa maturation, le thymocyte peut
être identifié selon l’expression de différentes molécules de surface, dont les co-récepteurs
CD4 et CD8 (Figure 1). Le thymocyte le plus immature, caractérisé par l’absence
d’expression des molécules CD4 et CD8, est appelé « double négatif» (DN) (Scollay, Wilson
et al. 1988). La survie et le développement des thymocytes DN dépendent de signaux émis par
les cellules corticales épithéliales thymiques (cTEC) , mettant en jeu notamment les ligands
de Notch et des cytokines telle que l’interleukine (IL)-7 (Schmitt and Zuniga-Pflucker 2005).
Au stade DN, on observe plusieurs étapes en fonction de l’expression de CD44 et de CD25
(Godfrey, Kennedy et al. 1993) (Figure 1).
10
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
Figure 1. Développement thymique des lymphocytes T
Un progéniteur issu de la moelle osseuse ou du foie fœtal migre dans le thymus. La liaison du
récepteur Notch1 à son ligand exprimé par le stroma thymique favorise l’engagement dans le
développement en LT. Les thymocytes immatures traversent différents stades correspondant à
l’expression et la répression de certaines molécules (DN1, DN2, DN3 et DN4). Les thymocytes
doubles négatifs et doubles positifs subissent un remodelage génique pour exprimer un TCRĮȕ
fonctionnel. Le stade simple positif est permis après passage d’une sélection positive puis négative
permettant l’élimination de thymocytes potentiellement dangereux. Les thymocytes matures SP
migrent dans les organes lymphoïdes secondaires où ils exerceront leur fonction. Adapté de Sebzda
et al. Annual Review of Immunology 1999.
C’est durant le stade DN2 que la machinerie moléculaire nécessaire au réarrangement
somatique des segments V, D, J codant pour la chaîne ȕ du TCR se met en place, notamment
grâce aux enzymes RAG (Recombinase Activating Gene) (Mombaerts, Iacomini et al. 1992).
Par la suite, la chaîne ȕ s’apparie avec la chaîne invariante pTCRĮ pour former un complexe
exprimé à la surface : le pré-TCR. Ce complexe, associé à d’autres molécules telles que CD3,
permet la délivrance d’un signal qui favorise la survie, la prolifération et la progression du
thymocyte dans le processus de différenciation. De plus, la réception de signaux par ce préTCR induit la répression de l’expression des enzymes RAG afin d’empêcher l’expression
d’un second TCR : c’est l’exclusion allélique (Khor and Sleckman 2002). A ce niveau, les
thymocytes acquièrent les co-récepteurs CD4 et CD8, ce sont des cellules «doubles positives»
(DP). La recombinaison somatique des segments V, D et J codant pour la chaîne Į va alors
débuter. Si celui-ci est fonctionnel, les chaînes Į et ȕ s’apparient pour former le récepteur à
l’antigène, exprimé à la surface du thymocyte, le TCR. Au cours de leur développement, les
thymocytes subissent des sélections drastiques permettant de sélectionner, théoriquement,
11
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
ceux qui seront capables en périphérie d’engager une réponse immune spécifique et
protectrice. Seul 2% de thymocytes survivront à ces sélections et migreront en périphérie pour
constituer la population de LT matures.
I.1.b) Sélections positive et négative
Deux types de sélection existent au cours de la maturation thymique des LT, elles sont
regroupées sous le nom de tolérance centrale (Figure 2).
La première a lieu lorsque le pré-TCR, généré de manière aléatoire, est exprimé à la
surface des thymocytes : seuls les thymocytes exprimant un récepteur à l’antigène capable de
reconnaître les molécules de CMH du soi sont sélectionnés, c’est la sélection positive. Du fait
de la faible expression du récepteur à l'IL-7 et du facteur de survie Bcl-2, ces thymocytes DP
sont naturellement prédestinés à la mort dite par «négligence» qui se produit pour 90% d'entre
eux. Chez la souris, l’expression de molécules du CMH restreinte aux cTEC ou bien aux
cellules épithéliales médullaires (mTEC), a confirmé le rôle indispensable des cellules
corticales dans cette sélection positive (Laufer, DeKoning et al. 1996). Cette première
sélection conduit à constituer une population enrichie en cellules auto-réactives vis-à-vis des
molécules du CMH, donc potentiellement dangereuses pour l’organisme. Il est nécessaire de
"contrôler" la spécificité de ces thymocytes. C’est le rôle de la sélection négative. A ce stade,
les LT qui reconnaissent le complexe CMH-peptide avec une affinité supérieure à un certain
seuil sont éliminées. Ce mécanisme de tolérance centrale est indispensable pour éviter l'autoimmunité. Dans cette étape, deux types cellulaires interviennent : les mTEC et des cellules
présentatrices d’antigène (CPA) de la medulla (majoritairement des cellules dendritiques,
CD). Les thymocytes reconnaissant les antigènes à la surface des CPA sont éliminés par
délétion clonale. En revanche, la reconnaissance d’un peptide du soi à la surface d’une mTEC
(cellule médullaire épithéliale thymique) aboutira à l’inactivation fonctionnelle du thymocyte
: l’anergie (Roberts, Sharrow et al. 1990). En effet, les mTEC ont la particularité d’exprimer
dans le thymus des antigènes caractéristiques d’organes périphériques. Cette expression
ectopique est sous la dépendance de la protéine AIRE (auto-immune regulator) (Villasenor,
Benoist et al. 2005). La déficience de AIRE chez les patients atteints d’APECED (Autoimmune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy) ou chez la souris, conduit à
des symptômes auto-immuns similaires (Aaltonen, Bjorses et al. 1994), démontrant
l’importance de cette protéine. Il est intéressant de noter que l’expression ectopique de
12
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
certains antigènes est indépendante d’AIRE (Derbinski, Gabler et al. 2005), suggérant ainsi
l’existence de mécanismes complémentaires.
Figure 2. Tolérance centrale et choix du lignage CD4 vs CD8
Au stade DP, le thymocyte subit deux types de sélections ayant pour objectif de supprimer les cellules
inutiles ou potentiellement dangereuses. La sélection positive a lieu dans le cortex, au contact des
cTEC, et élimine par apoptose les cellules ne reconnaissant pas le CMH du soi. Les 10% de cellules
survivantes migrent vers la médulla, et subissent la sélection négative au contact des mTEC et des
CD : les cellules ayant une trop forte affinité pour le soi sont éliminées. La liaison TCR/CD4 au CMH-II
engendre une signalisation via Lck et conduit à l’engagement vers le lignage CD4. En revanche, les
thymocytes DP recevant un signal, plus faible, via le TCR/CD8 lié à CMH-I, favorisant la
surexpression de ZAP70, se dirigeront dans le lignage CD8. Les facteurs de transcription nécessaires
à la spécification du lignage sont indiqués. D’après I-Cheng Ho et al. 2009 Nat Rev Immunol.
I.1.c) Choix du lignage CD4/CD8
Comment un thymocyte DP va-t-il faire le choix du lignage dans lequel il va
s’engager? Cette question n’est pas encore complètement élucidée. Plusieurs études ont
identifié des molécules de signalisation et des facteurs de transcription clefs impliqués dans le
programme génétique favorisant le développement des LT CD4+ ou LT CD8+. Runx 3
13
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
(Taniuchi, Osato et al. 2002) et Th-POK (He, He et al. 2005; Sun, Liu et al. 2005) sont les
facteurs de transcription clefs pour le développement en LT CD8+ ou LT CD4+
respectivement. De nombreuses autres molécules sont impliquées dans ces processus de
différenciation, et l’engagement dans l’un des lignages inhibe le second : par exemple, Runx3
inhibe l’expression du facteur de transcription Th-POK, nécessaire au développement des LT
CD4+, et inversement (Setoguchi, Tachibana et al. 2008).
La manière dont ces programmes génétiques distincts se mettent en place dans les
thymocytes DP n’est pas bien comprise. L’idée principale repose sur l’intensité et la durée du
signal du TCR, où un signal soutenu et intense favorise la génération de LT CD4+, alors
qu’un signal moins soutenu est requis pour la génération de LT CD8+ (Brugnera, Bhandoola
et al. 2000) (Schmedt, Saijo et al. 1998). Il reste encore à comprendre comment un thymocyte
DP intègre ce signal TCR pour favoriser l’engagement dans l’un des lignages CD4 ou CD8.
Plusieurs modèles ont été proposés ces 30 dernières années. Aujourd’hui, un modèle
reposant sur le signal du TCR et l’induction de facteurs de transcription spécifiques permet de
rassembler la plupart de travaux, sans pour autant répondre à toutes les questions. Les
thymocytes DP reçoivent un signal provenant du TCR lié aux molécules du CMH-I ou CMHII, avec l’aide d’un des co-récepteurs CD8 ou CD4. Ces signaux sont transmis par l’activation
des tyrosines kinases Lck et ZAP70, et aboutissent en une sélection positive des thymocytes
DP exprimant le TCR approprié. Selon Saini et al, la sélection positive favorise une
augmentation d’expression de la molécule CD5 et du TCR sur les thymocytes DP les plus
immatures (Saini, Sinclair et al. 2010). A ce niveau, si le TCR reconnaît un CMH-II, les
cellules reçoivent un signal fort, dépendant de Lck et transmis après engagement du CMH-II
par le co-récepteur CD4. Ce signal favorise la différenciation des thymocytes DP en
thymocytes CD4+ matures. Cependant, si le TCR sur ces thymocytes DP reconnaît un CMH-I
via le co-récepteur CD8, le signal transmis est faible, empêchant la différenciation en
thymocytes CD4+ matures. En revanche, dans ce cas, il est observé une augmentation
d’expression de ZAP70, et une diminution de CD5, un régulateur négatif de la signalisation
TCR. Lorsque la quantité de ZAP70 est suffisamment élevée, un signal émanant du TCR et
dépendant de ZAP70 permet la différenciation de ces thymocytes DP en thymocytes matures
CD8+ (Alarcon and van Santen 2010) (Figure 2).
Contrairement aux cellules de l'immunité innée, les LT matures qui atteignent la
périphérie ne sont pas encore capables de participer efficacement aux réponses immunes. Pour
cela, elles devront être au préalable activées par des CPA professionnelles que sont les CD et
dans une moindre mesure, les macrophages.
14
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
I.2 Mise en place des voies de signalisation
Nous allons nous intéresser dans ce paragraphe à l’activation T, ainsi qu’à la signalisation
moléculaire engendrée dans la cellule. Une fois en périphérie, les LT sont capables
d’identifier des antigènes du non-soi présentés par le CMH à la surface d’une CPA. Cette
interaction moléculaire va permettre l’induction de réponses immunitaires adaptatives
hautement spécifiques. L’engagement du TCR et de différentes molécules membranaires
conduit à une importante série de modifications moléculaires à la membrane plasmique, dans
le cytoplasme mais aussi dans le noyau (Figure 3). Ces changements moléculaires
conditionnent la mise en place et la spécificité des fonctions effectrices des LT. Ces
mécanismes finement régulés permettent une réponse immunitaire adaptée aux stimuli
antigéniques ainsi que la mise en place d’une protection à long terme appelée mémoire
immunologique.
I.2.a) Les voies de signalisation mises en jeu lors de l’engagement du TCR
Suite à l’interaction d’un LT et d’une CPA, une synapse immunologique se crée et des
évènements proximaux se mettent en place. Il y a activation et recrutement rapides de
protéines tyrosines kinases comme Lck et Fyn (famille des Src kinases) qui vont phosphoryler
les tyrosines des motifs ITAM présents au niveau des domaines intra-cytoplasmiques des
chaînes du complexe CD3 (Smith-Garvin, Koretzky et al. 2009). Ceci provoque le
recrutement de la protéine tyrosine kinase ZAP-70 via ses deux domaines SH2 (Src homology
2). Cette dernière, à son tour phosphorylée par Lck, peut alors phosphoryler ses substrats,
parmi lesquels les protéines adaptatrices LAT (Linker for Activation of T cells) et SLP76 (SH2
domain containing Leucocytes Phosphoprotein of 76Kd), molécules pivots dans la mise en
place et la connexion des différentes voies de transduction du signal (Koretzky and Boerth
1999). Suite à ces évènements, différentes voies de signalisation sont mises en place : la voie
de la PLC-Ȗ1 (Phospholipase C-Ȗ1), la voie de la PKC-ș (Protein Kinase C-ș), la voie des
MAPKinases (Mitogen Activator Protein Kinase) et la voie de la Pi3K (Phosphatidyl-inositol3 Kinase). Finalement, cette mécanistique moléculaire va permettre l’activation de facteurs de
transcription comme : NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells), NF-țB (Nuclear FactorțB) et AP-1 (Activating Protein 1 : c-Fos complexé à c-Jun) initiant ainsi l’expression
sélective de nombreux gènes codant en particulier des cytokines et des récepteurs.
15
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
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cytoplasme
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noyau
Figure 3. Activation lymphocytaire T, rôle central de Vav1.
Après activation par engagement du TCR et de CD28, une signalisation complexe se met en place
dans le LT, aboutissant à la transcription de gènes nécessaires à leur prolifération, leur activation et
leurs fonctions. Pour plus de détails, se référer au texte. D’après Berg et al. 2004, Annu Rev Immunol
I.2.a.i) La voie PLC-Ȗ1
A la suite de l’engagement du TCR, la PLC-Ȗ1 est retrouvée dans le complexe de
signalisation proximal composé de SLP76, Vav1 et LAT, où elle est phosphorylée et activée
par ITK (IL-2 inducible t cell kinase). Une fois activée, la PLC-Ȗ1 hydrolyse le
phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PiP2). Cette hydrolyse conduit à la formation de deux
messagers secondaires : l’inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG),
responsables de l’activation de différentes voies de transduction du signal aboutissant à la
transcription de gènes, la survie et la prolifération.
I.2.a.ii) La voie calcique
L’IP3, généré par l’activation de PLC-Ȗ1, est capté par les récepteurs exprimés à la
membrane du réticulum endoplasmique (IP3R). Cette fixation provoque la libération dans le
16
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
cytoplasme de stocks de calcium contenus dans le réticulum. L’augmentation du calcium
intracellulaire va entraîner l'ouverture des canaux calciques CRAC (Calcium Release
Activated calcium Chanel) au niveau de la membrane du LT. Ces canaux permettent une
entrée importante de calcium dans le cytoplasme, qui va alors se fixer sur la calmoduline.
Celle-ci permet l’activation de la calcineurine, une phosphatase qui assure la
déphosphorylation du facteur de transcription NFAT. Sous forme phosphorylée, NFAT a une
localisation cytoplasmique. Sa déphosphorylation permet sa translocation nucléaire. Dans le
noyau, les différentes isoformes de NFAT sont capables de former des complexes avec
plusieurs autres facteurs de transcription, provoquant l’expression de multiples gènes selon le
contexte dans lequel le TCR a été engagé.
L’interaction la mieux étudiée est celle entre NFAT et AP-1 qui résulte en l’expression
de gènes importants pour l’activation T, comme l’IL-2 (Feske, Giltnane et al. 2001). A
l’inverse, lorsque l’activation est trop faible ou partielle, du fait de l'absence d’AP-1, NFAT
se dimérise. Les dimères de NFAT se fixent à l’ADN pour induire l’expression d’une série de
gènes conduisant à l’anergie de la cellule T (Macian, Garcia-Cozar et al. 2002) (Soto-Nieves,
Puga et al. 2009). La voie calcique, en agissant sur les protéines du cytosquelette, contribue
aussi à l’immobilisation du LT lors de sa rencontre avec une CPA, favorisant ainsi la
formation de la synapse immunologique mature.
I.2.a.iii) La voie de la PKC-ș
Il existe de nombreux isoformes de la PKC, mais seul l’isoforme PKC-ș est recruté à
la synapse immunologique, suite à l’engagement productif du TCR (Monks, Kupfer et al.
1997). Le DAG (mais aussi Lck) favorise son activation et son recrutement au niveau des «
rafts » membranaires. Une fois activée, la PKC-ș active Ikk qui à son tour assure la
phosphorylation d’IțB. A l’état non phosphorylé, IțB forme un complexe stable avec le
facteur de transcription NF-țB qui se retrouve séquestré dans le cytoplasme. La
phosphorylation d’IțB induit son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. NF-țB
se retrouve alors sous forme libre, révélant un site de localisation nucléaire et entraînant sa
translocation dans le noyau du LT, où il va jouer son rôle de facteur de transcription.
La PKC-ș induit aussi l’activation du facteur de transcription AP-1, mais les
mécanismes impliqués dans cette voie sont mal connus. L’activation de NF-țB et du
complexe AP-1 conduit alors à l’activation de gènes impliqués dans la survie, la
différenciation et les fonctions effectrices des LT (Schulze-Luehrmann and Ghosh 2006).
17
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
I.2.a.iv) La voie des MAP-kinases
La voie des MAP-kinases (MAPK), utilisée par toutes les cellules de l’organisme, fait
partie des voies de signalisation les plus anciennes et les plus conservées dans l’évolution.
Chez les mammifères, les MAPK sont impliquées dans tous les aspects de la réponse
immunitaire, allant de l’initiation de la réponse innée à l’activation de la réponse adaptative
jusqu’à la mort cellulaire (Whitmarsh and Davis 2004).
Il existe 3 groupes majeurs de MAPK chez les mammifères : ERK 1 et 2 (extracellular
signal-regulated protein kinases), les p38 MAPK et les JNK (c-Jun NH2-terminal kinases).
L’activation des MAPK résulte de l’enchaînement d’une cascade de phosphorylation sur des
résidus sérines (Ser) ou thréonines (Thr). Les MAPK sont phosphorylées par des MAP kinase
kinases (MAPKK) qui sont elles-mêmes phosphorylées par des MAP kinase kinase kinases
(MAPKKK).
Suite à l’engagement du TCR, la protéine LAT va recruter et fixer la protéine
adaptatrice Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) (Smith-Garvin, Koretzky et al.
2009), constitutivement associée à SOS (Son of sevenless), GEF (Guanine nucleotide
Exchange Factor) responsable de l’activation de la GTPase Ras. La protéine Ras active alors
les MAPKKK induisant la cascade des MAP kinases qui conduit à la translocation nucléaire
d’ERK 1 et 2. Les kinases ERK vont activer le facteur de transcription Elk qui active c-fos
(Rincon 2001). En parallèle, la protéine Vav1 est phosphorylée puis recrutée au niveau de
SLP-76. L’activité GEF de Vav1 permet l’activation de la Rho GTPase Rac. De là, part une
cascade de phosphorylation qui induit l’activation de JNK, qui peut alors phosphoryler c-jun.
Ce dernier s’associe à c-fos pour former le complexe AP-1, responsable de l’activation de
certains gènes importants dans l’activation T.
I.2.a.v) La voie Pi3K
La famille Pi3K est composée de 4 différentes classes : les classes I, II et III sont des
lipides kinases alors que les membres de la classe IV sont des protéines Ser/Thr kinases. Elles
sont généralement constituées d’une sous-unité catalytique et d’une sous-unité régulatrice.
Les Pi3K impliquées dans l’activation lymphocytaire sont les Pi3K de classe I. Elles utilisent
comme substrats le PdtIns(4)P (phosphatidyl-inositol-4-phosphate), le PtdIns(4,5)P2
(phosphatidyl-inositol-4,5-diphosphate) ou le PtdIns(5)P (phosphatidyl-inositol-5-phosphate)
et sont subdivisées en deux sous-groupes : IA et IB. Les premières, IA sont activées en aval de
18
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
récepteurs couplés à des tyrosines kinases tels que le TCR, le BCR, les récepteurs aux
cytokines et certaines molécules de costimulation. Le deuxième sous-groupe, IB, est activé en
aval de récepteurs couplés aux protéines G tels que les récepteurs aux chimiokines (Koyasu
2003).
La Pi3K la plus abondante dans les lymphocytes est une enzyme hétérodimérique
constituée d’une sous-unité régulatrice p85 et d’une sous-unité catalytique p110. Après
activation du TCR, la Pi3K est recrutée à la membrane plasmique via le domaine SH2 de sa
sous-unité p85. La p110, ainsi adressée à la membrane, phosphoryle le PIP2 membranaire
pour générer du PIP3 (Smith-Garvin, Koretzky et al. 2009). Le lipide membranaire PIP3
recrute sélectivement des protéines à domaine PH (Pleckstrin homology) telles que la
sérine/thréonine kinase AKT, des kinases de la famille Tec ou encore des GEF de la famille
Rho, comme Vav1. Ces protéines activent à leur tour un grand nombre d’effecteurs impliqués
dans le contrôle de la survie, de la prolifération et de la mobilité cellulaire.
Comme dit précédemment, une des conséquences de l’activation de la Pi3K est
d’induire le recrutement à la membrane plasmique d’AKT, connue également sous le nom de
PKB (protéine kinase B). Ce recrutement induit un changement de conformation d’AKT et
son activation qui va avoir plusieurs fonctions au sein du LT : contrôle du cycle cellulaire (via
le facteur de transcription E2F), phosphorylation et inactivation de GSK3 (Glycogen Synthase
Kinase-3), contrôle de la production cytokinique des LT (via GSK3 qui contrôle l’expulsion
de NFAT nucléaire) (Kane and Weiss 2003).
Cette voie de signalisation Pi3K/AKT a clairement été impliquée dans le
développement précoce des LT, plus précisément au niveau du point de sélection ȕ (Juntilla
and Koretzky 2008). En effet, l’absence de signalisation Pi3K provoque un défaut de survie
sur les thymocytes DP (Shiroki, Matsuda et al. 2007), alors que l’activation constitutive
d’AKT augmente la survie des thymocytes (Jones, Parsons et al. 2000). La perte de PTEN
(phosphatase and tensin homolog) restaure le développement au stade DP dans les souris
déficientes en composants du pré-TCR (Hagenbeek, Naspetti et al. 2004). Ces données
suggèrent que l’activation de la voie Pi3K est suffisante pour induire la différenciation en DP
en absence du pré-TCR. Le passage au stade DP implique un signal de prolifération et de
survie particulièrement important, pouvant être transmis par de nombreuses protéines. Des
études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre la manière dont cette voie influe sur
le développement des LT.
Les Tec kinases, parmi lesquelles ITK, sont des protéines qui possèdent aussi des
domaines PH. Elles peuvent donc être recrutées à la membrane pour y être activées. ITK est
19
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
alors capable d’activer la PLC-Ȗ1 créant ainsi une connexion entre la voie de la Pi3K et la
voie calcique.
I.2.b) Vav1 au centre du signalosome T
Nous venons de voir que la protéine Vav1 est présente dans le complexe de
signalisation proximal du TCR, ce qui suggère son rôle primordial dans la signalisation T. Les
protéines de la famille VAV sont des GEF : elles catalysent l’échange nucléotidique sur les
petites GTPases de la famille Rho, permettant ainsi l’activation de ces régulateurs essentiels
du remodelage du cytosquelette d’actine et d’autres fonctions cellulaires.
I.2.b.i) Les membres de la famille VAV
Beaucoup de protéines ont été initialement identifiées sous leur forme oncogénique.
C’est le cas de la protéine Vav1, qui fut découverte en 1989 alors que l’ADN isolé de cellules
cancéreuses de l’œsophage était testé pour son activité transformante (Katzav, Martin-Zanca
et al. 1989). Comme c’était le 6ème oncogène découvert dans le laboratoire du Dr Barbacid, il
fut désigné par la 6eme lettre de l’alphabet hébraïque VAV. La forme oncogénique de Vav1
correspond à la forme sauvage de la protéine tronquée d’une partie de son domaine Nterminal. Par la suite, deux autres protéines fortement homologues ont été isolées chez
l’homme et les rongeurs, VAV2 (Schuebel, Bustelo et al. 1996) et VAV3 (Movilla and
Bustelo 1999). De plus, une forme tronquée de VAV (VAV-T), dont le rôle reste à éclaircir, a
été isolée dans les spermatocytes de souris (Okumura, Kaneko et al. 1997). Enfin, il existe un
variant du gène VAV3, appelé VAV3.1, qui code la région C-Terminale, correspondant aux
domaines SH3-SH2-SH3 (Trenkle, McClelland et al. 2000).
Bien que les trois principaux membres de la famille VAV présentent une forte
homologie de séquence en acides aminés, les gènes codant ces protéines diffèrent quant à leur
localisation chromosomique et leur profil d’expression (Trenkle, McClelland et al. 2000;
Tybulewicz, Ardouin et al. 2003). Alors que l’expression de Vav2 et de Vav3 est ubiquitaire,
l’expression de Vav1 est restreinte aux cellules hématopoïétiques.
I.2.b.ii) Structure de la protéine Vav1.
La protéine Vav1 faisant partie de la famille des GEF, elle a une structure
caractéristique de ce groupe avec la présence des domaines DH (Dbl Homology) et PH,
nécessaires à la fonction d’échange nucléotidique. Cependant, la protéine Vav1 possède
20
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
d’autres domaines lui conférant a priori des possibilités d'interactions pouvant traduire des
fonctions de protéine adaptatrice (Figure 4).
Figure 4. Structure et mécanismes d’activation de la protéine Vav1
La protéine Vav1 est composée de 8 domaines : le domaine d’homologie à la calponine (CH), le
domaine acidique (Ac), le domaine d’homologie à Dbl (DH), le domaine d’homologie à la pleckstrine
(PH), le domaine riche en cystéine (C1), 2 séquences NLS et 2 domaines SH3 encadrant 1 domaine
SH2. Sous sa forme inactive, Vav1 est dans une conformation dite fermée, où l’activité GEF est
inhibée. En effet, dans cette conformation, les tyrosines de la région Ac lient le domaine DH, et le
domaine CH interagit avec le domaine C1. Ces liaisons intramoléculaires empêchent toute fixation
d’une GTPase à la protéine. Lors d’une activation, au moins 3 types d’évènements vont déstabiliser
cette conformation auto-inhibitrice. La phosphorylation des tyrosines empêche leur association au
domaine DH, la liaison du domaine CH avec un ligand encore non identifié cause sa dissociation du
domaine C1, et la liaison de PtdIns(3,4,5)P3 au domaine PH altère sa conformation. Ces différents
évènements aboutissent à une conformation ouverte, favorisant l’interaction avec les GTPases.
L’activation des GTPases est alors possible via l’échange d’un GDP contre un GTP grâce à l’activité
fateur d’échange de Vav1. D’après Tybulewicz, Curr. Opin Immunol 2005.
Le domaine DH possède l’activité GEF pour la famille des Rho-GTPases (Cerione and Zheng
1996). Il est organisé en tandem en C-Terminal avec un domaine PH qui permet la
localisation membranaire de la protéine en liant les phosphoinositols (Rossman and Campbell
2000). En outre, ce domaine joue un rôle important dans l’activité GEF (Bishop and Hall
2000). En effet, il a été montré que le tandem DH/PH possède, in vitro, une activité GEF
supérieure à celle du domaine DH seul (Liu, Hassler et al. 1998). le domaine CH (Calponin
Homology) semble exercer un effet régulateur négatif sur l’activité du domaine DH en
interagissant avec le domaine C1, masquant ainsi l’accès du domaine DH aux Rho-GTPases
(Zugaza, Lopez-Lago et al. 2002). Le domaine Ac (Acide) contient plusieurs résidus tyrosine
phosphorylables impliqués dans l’auto-inhibition de l’activité GEF. Le domaine C1 est riche
en cystéines et contient deux possibles structures en doigt de zinc. Ce domaine peut favoriser
la liaison de Vav1 à l’ARN et/ou à d’autres protéines. Il est également nécessaire à
21
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
l’activation de la fonction GEF (Romero and Fischer 1996). La région PR (riche en proline)
est impliquée dans la liaison avec d’autres protéines via leur domaine SH3. Le domaine SH2
est impliqué dans la liaison de Vav1 avec les résidus tyrosines phosphorylés de certaines
protéines. Les domaines SH3 permettent l’interaction avec les domaines riches en proline
d’autres protéines. Ces domaines SH confèrent à Vav1 son rôle de protéine adaptatrice et sont
nécessaires à son activation en permettant, entre autres, son recrutement à la membrane
plasmique (Zugaza, Lopez-Lago et al. 2002). Enfin, deux séquences NLS (Nuclear
Localization Signal) suggérant une capacité de la protéine à se localiser au niveau du noyau,
ont été mises en évidence (Houlard, Arudchandran et al. 2002).
La structure des protéines VAV est complexe et unique : ce sont les seules GEF qui
combinent dans la même structure, les motifs DH/PH et les domaines SH2-SH3,
caractéristiques de protéines adaptatrices de signalisation (Bustelo 2000; Tybulewicz,
Ardouin et al. 2003; Katzav 2004).
I.2.b.iii) Régulation de l’activité de Vav1
Cette structure complexe confère à la protéine Vav1 un nombre varié de fonctions
cellulaires. Nous avons vu que certains domaines jouent un rôle régulateur de l’activité
protéique en permettant une conformation particulière de la protéine. Nous allons apprécier
plus précisément les différents types de régulation opérés sur la protéine Vav1. Il existe de
nombreuses auto-régulations au sein de la protéine Vav1, et chaque domaine joue un rôle
particulier (Figure 4) :
(1) Des travaux montrent que la phosphorylation de la tyrosine 174 (Tyr174), qui se
trouve dans le domaine acide, provoque une augmentation de l’activité GEF (Lopez-Lago,
Lee et al. 2000). Une des hypothèses proposées, est qu’il existe une liaison entre la tyrosine
174 et le domaine DH, favorisant une forme fermée de la protéine. Dans cette forme inactive,
l’accès au site de liaison de la GTPase est inaccessible. La phosphorylation de la tyrosine 174
causerait la dissociation de cette liaison et lèverait l’auto-inhibition (Aghazadeh, Lowry et al.
2000). Selon Li et son équipe, il existerait une dynamique interne nécessaire pour l’activité du
domaine DH, mais également pour son contrôle (Li, Martins et al. 2008). Bien que la tyrosine
174 ait un rôle incontestable, plusieurs études suggèrent que ce processus d’auto-inhibition est
plus complexe qu’une modification sur ce simple site. Après stimulation de récepteurs, Vav1
est également phosphorylée sur deux résidus tyrosines existants sur la partie N-terminale,
Tyr142 et Tyr160 (Miletic, Sakata-Sogawa et al. 2006). La mutation de ces sites augmente
22
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
l’activité de Vav1 suggérant qu’ils jouent également un rôle dans l’auto-inhibition de la
protéine sauvage. Rosen et son équipe proposent que la phosphorylation de Tyr142 et Tyr160
diminuerait certaines interactions, favorisant l’accès des kinases à la Tyr174 : il y aurait une
activation séquentielle de Vav1 (Yu, Martins et al. 2010). Enfin, une étude récente montre
l’importance des résidus tyrosines dans la partie C-terminale : grâce au remplacement des
tyrosines par des phénylalanines, les auteurs montrent élégamment que la Tyr826 régule
l’activité de NFAT, alors que les Tyr841 et Tyr626 ont un rôle dans l’activité GEF de la
protéine. La manière dont ces tyrosines régulent l’activité de Vav1 n’est pas encore bien
comprise (Lazer, Pe'er et al. 2010).
(2) Des travaux de cristallographie montrent le complexe DH-PH-C1 en interaction
avec RAC1 et révèlent un nouveau mécanisme de régulation : les domaines PH et C1
n’interagiraient pas directement avec RAC1, mais stabiliseraient le domaine DH, favorisant
les interactions avec son ligand (Rapley, Tybulewicz et al. 2008).
(3) En plus de son rôle dans la localisation subcellulaire des GEF, le domaine PH est
également impliqué dans la régulation allostérique de leur activité enzymatique (Russo, Gao
et al. 2001). En effet, l’activité des GEF est aussi modulée par des interactions
intramoléculaires qui s’établissent entre les domaines DH et PH et qui dépendent de la liaison
de certains phospholipides au domaine PH (Rossman, Cheng et al. 2003). Ainsi, il a été
montré que l’activité de Vav1 sous forme phosphorylée était inhibée en présence de
PtdIns(4,5)P2, qui favorise l’établissement d’interactions intramoléculaires entre les domaines
PH et DH, rendus alors inaccessibles à la GTPase (Bustelo 2002; Zugaza, Lopez-Lago et al.
2002). Au contraire, l’activité GEF est augmentée en présence de PtdIns(3,4,5)P3 ou de
PtdIns(3,4)P2 ; ces derniers lèvent cette conformation auto-inhibitrice et favorisent ainsi la
phosphorylation et l’activation de Vav1. En accord avec ces observations in vitro, Das et son
équipe ont montré que l’inhibition de la Pi3K empêchait la phosphorylation de Vav1 et
bloquait l’activation consécutive de RAC1 in vivo (Das, Shu et al. 2000).
(4) La liaison du domaine CH avec des protéines adaptatrices pourrait permettre de
lever ces interactions intramoléculaires inhibitrices (Yabana and Shibuya 2002). Dans les
cellules immunitaires, le domaine CH est aussi important pour la fonction de protéines
adaptatrices n’impliquant pas leur fonction GEF, en particulier pour l’activation du facteur de
transcription NFAT, ainsi que pour la génération d’un flux calcique en réponse à l’activation
du BCR ou du TCR (Kuhne, Ku et al. 2000; Lopez-Lago, Lee et al. 2000; Bustelo 2001;
Bustelo 2002).
23
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
(5) Un régulateur négatif potentiel de l’activité des protéines VAV est la protéine Cblb. Elle appartient à la famille des ubiquitines ligases E3 et régule négativement différentes
cascades de signalisation, en favorisant l'ubiquitination de certaines protéines phosphorylées
sur tyrosine (Thien and Langdon 2005). Ainsi, un crible double hybride a permis d’isoler la
protéine Cbl-b comme interagissant avec les domaines SH3-SH2-SH3 de Vav1. La
surexpression de Cbl-b inhibe l’activation de JNK induite par Vav1 (Bustelo, Crespo et al.
1997). De nombreuses protéines interagissant avec les différents membres de la famille VAV
ont été isolées par des expériences de crible double hybride ou de co-immunoprécipitations.
Ces différents partenaires sont des candidats, en tant que régulateurs négatifs des protéines
VAV. Cependant, leur rôle fonctionnel reste encore à déterminer (Bustelo 2000).
I.2.b.iv) Rôle de Vav1 dans le développement des LT
Vav1 est critique pour le développement des LT. En effet, l’absence de Vav1 bloque
partiellement la maturation des thymocytes, que ce soit du stade DN à DP ou du stade DP à
SP (Turner, Mee et al. 1997; Kong, Fischer et al. 1998; Tybulewicz, Ardouin et al. 2003).
Pour le blocage du stade DN à DP, le défaut a lieu entre le stade DN3 et DN4. De
manière intéressante, le même point de blocage est retrouvé chez les souris déficientes en
RAG-1 ou RAG-2, où le réarrangement du gène ȕ est impossible. Ces résultats suggèrent que
l’absence de Vav1 confère un défaut dans la signalisation du pré-TCR, résultant en un blocage
partiel du développement des thymocytes. L’expression forcée d’un RAC1 constitutivement
actif restaure la sélection thymique au niveau de la sélection ȕ chez des souris déficientes en
Vav1. Ceci implique que Vav1 agit sur la signalisation du pré-TCR via son activité GEF, et
permet la maturation des thymocytes immatures en thymocytes DP (Gomez, Tybulewicz et al.
2000).
En revanche, pour le blocage du stade DP à SP, le défaut est plus en aval, et mettrait
en cause un problème dans la sélection positive. Pour mieux caractériser ce blocage Turner et
al. ont généré des souris à la fois déficientes en Vav1 et exprimant un TCR transgénique
restreint au CMH-I ou CMH-II. Quelque soit le TCR, les souris présentent une absence totale
de sélection positive en LT CD4+ et LT CD8+ (Turner, Mee et al. 1997; Kong, Fischer et al.
1998). Le fait que le blocage ne soit que partiel chez les souris simplement déficientes en
Vav1, exprimant un TCR polyclonal, peut s’expliquer par la sélection positive de TCR ayant
une très forte affinité pour les complexes CMH/peptide du soi.
24
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
Le fait que Vav1 n’affecte que partiellement le développement thymique soulève la
possibilité que d’autres membres de la famille Vav contribuent à cette fonction. En effet, des
études ont été réalisées chez des animaux déficients en Vav1 et Vav3, et celles-ci ont montré
que leur développement thymique était bloqué plus fortement que chez les animaux déficients
uniquement en Vav1. De plus, il a été observé que le développement thymique des animaux
déficients en Vav2 ou Vav3 n’est pas affecté. Enfin, les animaux déficients en Vav1, Vav2 et
Vav3 ont une forte lymphopénie : les thymocytes DP et SP, ainsi que les LT périphériques,
sont fortement réduits, alors que les thymocytes DN ne sont pas touchés. Ainsi, les protéines
de la famille VAV ont à la fois des rôles redondants, mais également uniques dans le système
hématopoïétique (Doody, Bell et al. 2001; Tedford, Nitschke et al. 2001; Fujikawa, Miletic et
al. 2003).
I.2.b.v) Rôle de Vav1 dans l’activation des LT et la signalisation du TCR
Les défauts en sélection positive et négative des thymocytes chez les animaux
déficients en Vav1 suggèrent un rôle important de ce dernier dans la transduction du signal en
aval du TCR. De plus, les voies de signalisation induites par la stimulation du TCR (ERK,
AKT, NFAT…), et la prolifération sont fortement affectées dans des LT déficients en Vav1
(Costello, Walters et al. 1999; Reynolds, de Bettignies et al. 2004)
La phosphorylation des résidus tyrosines de Vav1 après stimulation du TCR apporte
une preuve supplémentaire quant au rôle de Vav1 dans la signalisation du TCR dans le
système immunitaire (Margolis, Hu et al. 1992).
Une des fonctions de Vav1 dans la voie de signalisation du TCR, est l’activation de
NFAT. En effet, la surexpression de Vav1 permet d’induire la stimulation de NFAT dans les
LT, et celle-ci est augmentée après activation (Wu, Katzav et al. 1995). Après stimulation du
TCR, ZAP70 phosphoryle les résidus tyrosines de Vav1 (Margolis, Hu et al. 1992). Ainsi
activée, la protéine est recrutée à la membrane où elle exerce son rôle de GEF sur des petites
GTPases telles que RAC1, favorisant une modification du cytosquelette nécessaire à
l’activation de NFAT (Hornstein, Alcover et al. 2004). En accord avec ces résultats, les
cellules déficientes en Vav1 sont incapables de réorganiser leur cytosquelette d’actine après
activation du TCR, et présentent une diminution d’activité NFAT (Rao, Luo et al. 1997). Le
rôle de Vav1 dans l’activation de NFAT n’est pas restreint à son activité GEF : un mécanisme
indépendant de RAC1 semble également impliqué (Tybulewicz 2005; Lazer, Pe'er et al.
2010). En effet, la transfection d’un Vav1 mutant dépourvu d’activité GEF n’affecte pas sa
25
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
capacité à induire la voie NFAT (Lazer, Pe'er et al. 2010). De plus, des cellules déficientes en
Vav1 n’ont qu’un signal calcique partiel après engagement du TCR (Manetz, GonzalezEspinosa et al. 2001). Une hypothèse est qu’un flux calcique robuste est nécessaire à
l’activation de NFAT. Or, la protéine Vav1 joue un rôle important dans la génération de ce
flux calcique, et cette fonction est indépendante de l’activité GEF (Manetz, GonzalezEspinosa et al. 2001; Reynolds, Smyth et al. 2002; Saveliev, Vanes et al. 2009). La région CH
contrôlerait le flux calcique en facilitant l’activation de la PLC-Ȗ1, grâce à son activité
adaptatrice : de nombreuses protéines sont capables de s’associer avec la région CH (Socs1
(régulateur négatif de la voie des récepteurs tyrosine kinase Kit), ENX-1 (un régulateur
transcriptionnel potentiel des gènes de l’homéobox), LyGDI (régulateur des Rho-GTPases), la
calmoduline (Tybulewicz 2005; Zhou, Yin et al. 2007). Ce rôle de Vav1 dans la génération du
flux calcique doit être lié à la capacité de Vav1 d’activer des kinases de la famille Tec (ITK et
TEC). Ces dernières sont critiques pour l’activation de la PLC-Ȗ, et participent à la formation
du complexe LAT-SLP76-PLC-Ȗ1 nécessaire pour générer un flux calcique.
En dehors de cette voie impliquant NFAT, Vav1 est également associée à d’autres
voies de signalisation régulées par le TCR, comme ERK, JNK (Reynolds, de Bettignies et al.
2004). Dans cette étude, les auteurs montrent que Vav1 est requise pour la phosphorylation et
l’activation de LAT, nécessaire pour le recrutement de la PLC-Ȗ1, et des petites GTPases SOS
impliquées dans l’activation des MAPK.
Plus récemment, il a été montré que Vav1 est également capable d’activer, après
stimulation du TCR, le facteur de transcription CREB (cAMP Response Element Biding).
Cette régulation passe par la voie PKC (Haubert and Weckbecker 2010). Les gènes qui
contiennent un élément CRE, régulé par CREB, sont impliqués dans diverses fonctions
cellulaires, telles que le métabolisme, la neurotransmission, le cycle cellulaire, l’apoptose ou
la régulation immunitaire.
Il faut souligner le rôle de la région C-terminale de la protéine. En effet, celle-ci
contient le domaine SH2 qui interagit avec des tyrosines kinases autophosphorylées et des
protéines adaptatrices telles que ZAP-70, SLP-76 ou Syk. Le domaine N-terminal de SH3 se
lie à la protéine adaptatrice Grb2. Dans les lymphocytes, cette interaction est nécessaire pour
la translocation de Vav1 à la membrane plasmique et pour son interaction avec d’autres
tyrosines kinases (Tybulewicz 2005). En revanche, le domaine C-terminal de SH3 forme un
complexe avec une large variété de protéines, incluant des régulateurs du cytosquelette, des
protéines liant l’ARN (hnRNP-K, hnRNP-C et Sam68), des modulateurs transcriptionnels,
26
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
des facteurs d’ubiquitination, des protéines virales ou encore la Dynamine 2 (Bustelo 2000;
Turner and Billadeau 2002; Tybulewicz 2005).
Vav1 est également activée après stimulation de CD28 par ses ligands CD80-86
(Michel, Mangino et al. 2000). La costimulation du TCR avec CD28 est requise pour de
nombreuses réponses physiologiques des LT, incluant la production optimale de cytokines, la
prolifération, et les fonctions effectrices (Bluestone 1995). La stimulation de CD28 induit sa
phosphorylation via Lck notamment, ainsi que la phosphorylation de Vav1 et d’autres
protéines adaptatrices telles que SLP76. Il a été montré que l’association entre Vav1 et SLP76 est nécessaire pour la signalisation en aval du CD28, tel qu’un flux calcique ou la
production d’IL-2 (Dennehy, Elias et al. 2007). En plus des signaux similaires à ceux obtenus
suite à la stimulation du TCR seul, il a été montré que CD28 engendre une cascade unique. La
stimulation de CD28 provoque la méthylation d’arginine de plusieurs substrats, dont Vav1.
En revanche, la protéine Vav1 n’est pas méthylée après stimulation du TCR seul (Blanchet,
Cardona et al. 2005). Cette différence peut être due au fait que Vav1 est plus fortement
phosphorylée et donc activée après l’engagement de CD28 (Nunes, Collette et al. 1994), alors
que la liaison du TCR seul induit une activation transitoire (Coppola, Bryant et al. 1991).
I.2.b.vi) Vav1, une vie dans le noyau ?
Nous avons vu que Vav1 est une protéine cytoplasmique, capable de se relocaliser à la
membrane après activation des cellules hématopoïétiques (Arudchandran, Brown et al. 2000).
Plusieurs études rapportent que Vav1 peut aussi être retrouvée dans le noyau sous diverses
stimulations (Clevenger, Ngo et al. 1995; Micouin, Wietzerbin et al. 2000; Houlard,
Arudchandran et al. 2002). Il a ainsi été démontré que Vav1 était retrouvée dans le noyau
après stimulation de lignées T par de la prolactine, ou de l’IFN. Enfin, une équipe a montré
que la stimulation via le CD28 permettait la translocation nucléaire de Vav1. Selon les
auteurs, CD28 favoriserait la migration de Vav1 dans la noyau où la protéine serait méthylée
(Blanchet, Cardona et al. 2005). Environ 1 à 3% du Vav1 cellulaire est retrouvée méthylée
dans le noyau 20 à 30 min après stimulation de CD28 (Blanchet, Cardona et al. 2005). Le rôle
de Vav1 dans l’activation des voies ERK, calcique ou dans la modulation du cytosquelette est
observé quelques secondes/minutes après stimulation par les TCR/CD28. Or, l’accumulation
de Vav1 dans le noyau est notée après plus de 30 min de stimulation, ce qui soulève la
question d’un rôle distinct de Vav1 méthylée. Des travaux suggèrent que Vav1 participe à un
complexe de transcription contenant notamment NFAT (Houlard, Arudchandran et al. 2002).
Cette étude ne s’est pas intéressée à la méthylation de Vav1 et nous ne savons donc pas si la
27
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
méthylation de Vav1 favorise l’association préférentielle de Vav1 à ce complexe de
transcription. Cependant, une étude confirme l’importance de la méthylation de Vav1
(Lawson, Manenkova et al. 2007) : l’utilisation d’un inhibiteur de transméthylation provoque
une diminution de la signalisation T. Selon les auteurs, ces effets semblent dus à une
interférence avec la méthylation de Vav1. Notons que dans cette étude, l’inhibiteur induit un
défaut de signalisation uniquement dans les LT CD4+, et ceci de manière non expliquée.
Cette observation concorde avec les travaux de Prisco sur des souris mutées dans le domaine
PH de Vav1, où une glycine remplace une arginine (Prisco, Vanes et al. 2005). Ces animaux
présentent des perturbations dans la sélection thymique des LT CD4+, mais pas dans celle des
LT CD8+, malgré le recrutement de Vav1 dans les deux lignages. Il n’y a pas d’explication
claire pour cette spécificité de lignage, mais les travaux de Lawson et al. suggèrent qu’il
existe une différence de méthylation du domaine PH de Vav1 entre les LT CD4+ et LT
CD8+, qui pourrait être un facteur déterminant dans la sélection thymique (Lawson,
Manenkova et al. 2007).
I.3 Différenciation et fonction des LT CD4+
En réponse à une infection, une grande variété de cellules de l’immunité innée et
adaptative sont activées et collaborent pour contrôler et éliminer le pathogène. Les LT CD4+
jouent un rôle critique dans les réponses immunitaires adaptatives (Zhu and Paul 2008). Ces
cellules induisent la maturation des lymphocytes B en plasmocytes, et assurent leur
commutation isotypique. Les LT CD4+ peuvent également agir directement sur diverses
cellules de tissus, telles que les cellules épithéliales ou mucosales, durant le processus de
clairance du pathogène.
En 1986, Coffman et Mosmann décrivent l’existence de sous-populations parmi les LT
CD4+, les Th1 et Th2, qui s’opposent quant à leur production de cytokines (Mosmann,
Cherwinski et al. 1986). L’environnement en cytokines et l’activation spécifique de certains
facteurs de transcription, sont deux éléments clefs contrôlant la différenciation des LT CD4+
naïfs (Th0) en Th1 ou Th2. Chaque sous-population est capable de promouvoir son propre
développement et d’inhiber le développement de l’autre sous-population via les cytokines
qu’elle sécrète (Figure 5). Si l’équilibre entre ces sous-populations est rompu, le
développement de la réponse immune protectrice sera affecté.
Ces dernières années, de nouvelles sous-populations de LT CD4+ se sont ajoutées au
paradigme Th1/Th2 et diversifient le type de réponse immune : les Th17, Th9 et Tfh.
28
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
I.3.a) La sous-population Th1
La différenciation en Th1 va se produire après l'activation d'un Th0 par une CPA
productrice d'IL-12. L'IL-12 est une cytokine hétérodimérique composée des chaînes IL12p40
et IL12p35. Son récepteur est composé de deux chaînes : IL12Rȕ1 dont l'expression est
constitutive dans les Th0 et augmente au cours de l'activation, et IL12Rȕ2 qui est induit par
l'activation du TCR (Szabo, Dighe et al. 1997; Afkarian, Sedy et al. 2002). Le récepteur à
l'IL-12 utilise la voie de transduction dépendante des protéines kinases de la famille Janus, en
particulier JAK2 et TYK2 et permet l'activation du facteur de transcription STAT4 et la
production d'IFN-Ȗ (Afkarian, Sedy et al. 2002). Cette production initiale va avoir un rôle
majeur dans l'amplification du phénomène de différenciation. En effet l'IFN-Ȗ agit de façon
autocrine pour induire, via son récepteur, l'activation des kinases JAK1 et JAK2 et du facteur
de transcription STAT1 responsable de l'expression de T-bet (Szabo, Dighe et al. 1997;
Lighvani, Frucht et al. 2001). Le gène codant pour T-bet, Tbx21, est considéré comme un
gène régulateur primordial dans la différenciation et le maintien du phénotype Th1, il contrôle
le niveau d'expression de l'IFN-Ȗ. Son expression dans des Th2 ou dans des Th0 induit leur
production d'IFN-Ȗ (Szabo, Dighe et al. 1997; Mullen, High et al. 2001). En parallèle, T-bet
va réprimer GATA-3, un facteur clé de la différenciation Th2 (Hwang, Szabo et al. 2005)
ainsi que le gène de l’IL-4 (Djuretic, Levanon et al. 2007) et inhiber ainsi la différenciation en
Th2. Des données suggèrent que la fonction majeure de T-bet serait de réguler négativement
GATA-3 plutôt que de favoriser la transcription du gène de l’IFN-Ȗ (Usui, Preiss et al. 2006).
Physiologiquement, les Th1 sont responsables de la réponse contre les pathogènes
intracellulaires (Mosmann, Cherwinski et al. 1986) et chez l'homme, ils jouent un rôle crucial
dans la résistance aux infections mycobactériennes et parasitaires. Les cytokines produites par
les Th1 sont principalement l'IL-2, la Lymphotoxine Į (LTĮ) et l'IFN-Ȗ. Ce dernier joue un
rôle majeur dans l'activation des macrophages en augmentant de façon considérable leurs
activités antimicrobiennes (Bogdan 2000). L'IFN-Ȗ intervient également comme un signal
permettant aux LB de produire des Ig de classe G possédant la capacité à se lier aux protéines
du complément et aux récepteurs FcȖ de haute affinité. Ces anticorps permettent
l'opsonisation et la phagocytose des particules microbiennes. Les Th1, via leur production
d'IFN-Ȗ et d'IL-2, participent à la différenciation des LT CD8+ cytotoxiques et à la génération
de cellules mémoires (Peschon, Morrissey et al. 1994). Cette orientation de la réponse
immune par les Th1 explique le rôle de ces lymphocytes dans l'élimination des pathogènes
intracellulaires (Szabo, Sullivan et al. 2003). Chez l’homme, il existe une panoplie de
maladies dues à une absence de fonction des cellules Th1. Ces pathologies sont la résultante
29
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
de déficiences en IFN-ȖR1/2, STAT1, IL-12Rȕ1… Dans chaque cas, le phénotype dominant
correspond à une susceptibilité accrue aux infections par des mycobactéries, dont des agents
faiblement infectieux tel que BCG (Holland 2007).
I.3.b) La sous-population Th2
L’IL-4 est aux Th2 ce que l’IL-12 est aux Th1. La (les) source(s) initiale(s) d'IL-4 in
vivo reste(nt) controversée(s). Il est possible que les LT mémoires ou des cellules de
l'immunité innée comme les basophiles jouent un rôle dans cette production précoce (Xin,
Ohmori et al. 2007). La fixation de l'IL-4 sur son récepteur, exprimé par les Th0, conduit à
l'activation du facteur de transcription STAT-6 (Takeda, Tanaka et al. 1996), qui avec NFAT,
AP-1 et NF-țB induit l'expression de l’IL-4 et du facteur de transcription GATA-3, un facteur
de régulation majeur de la différenciation Th2 (Zheng and Flavell 1997). Cependant, la
présence seule de GATA-3 ne suffit pas à la production d’IL-4. GATA3 et STAT5 (Signal
transducer and activator of transcription 5) sont requis pour cette production, et une
surexpression de STAT5 activé permet un besoin moindre de l’expression de GATA3 pour
l’expression d’IL-4 (Cote-Sierra, Foucras et al. 2004). Il a également été montré que STAT5
était requis dans les Th2 différenciés pour permettre le maintien de GATA-3 (Guo, Wei et al.
2009). La boucle d’auto-amplification positive est donc amorcée grâce à l’autoproduction
d’IL-4. De plus, GATA-3 favorise la réponse Th2 en induisant la transcription de l’IL-5 et de
l’IL-13, situés sur le locus Il4. Mais GATA-3 prévient aussi le développement de la réponse
Th1 en inhibant l’expression de la chaîne ß du récepteur à l’IL-12 via STAT-4. L’expression
de GATA-3 empêche la différenciation en Th1 et Th17, notamment grâce à l’augmentation de
production du facteur de croissance indépendant 1 (GFI-1) qui est un inhibiteur de la
production d’IFN-Ȗ et d’IL-17 (Zhu, Davidson et al. 2009).
A l’inverse des Th1, les Th2 produisent de l’IL-4, de l’IL-5, et de l’IL-13, connues
pour être critiques dans la production d’IgE, le recrutement des éosinophiles et la clairance
des pathogènes extracellulaires (Ansel, Djuretic et al. 2006). L'IL-4 est le médiateur principal
de la commutation isotypique des LB vers la production d'IgE (Swain, Weinberg et al. 1990),
contrôlant les fonctions effectrices des basophiles et des mastocytes. Les Th2 contrôlent aussi
directement l’activation et le recrutement des éosinophiles.
I.3.c) La sous-population Th17
En 2000, la découverte de l’IL-23 permet d’éclaircir certaines observations jusqu’alors
considérées comme paradoxales (Oppmann, Lesley et al. 2000). L’IL-23 et l’IL-12 partagent
30
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
la chaîne cytokinique p40, et oblige à réévaluer le rôle de ces deux cytokines. En générant des
souris déficientes pour la sous-unité p40 (absence d'IL-12 et d'IL-23), pour la sous-unité p35
(absence d'IL-12) et la sous-unité p19 (absence d'IL-23), Cua et ses collaborateurs ont montré
de façon élégante que l’IL-23 était une cytokine majeure dans la physiopathologie de
l’encephalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) (Cua, Sherlock et al. 2003). Un
nouveau lignage, les Th17 a ainsi été identifié. Plusieurs études indépendantes ont montré en
2006 que la différenciation Th17 était sous la dépendance d'une combinaison de deux
cytokines à priori antagonistes : le TGF-ȕ bien connu pour ses propriétés immunorégulatrices et l'IL-6 qui possède de fortes capacités pro-inflammatoires (Bettelli, Carrier et al.
2006; Mangan, Harrington et al. 2006; Veldhoen, Hocking et al. 2006). Ces observations
obtenues in vitro ont été confirmées dans des modèles expérimentaux in vivo. En effet, une
invalidation de la signalisation du TGF-ȕ, empêche le développement de Th17 et de l'EAE
(Veldhoen, Hocking et al. 2006). De même, les souris déficientes pour l'IL-6 résistent au
développement de la maladie et ne génèrent pas la population pathogène Th17 (Samoilova,
Horton et al. 1998). En présence d'IL-6 et de TGF-ȕ, les facteurs de transcription RORȖt et
RORĮ sont induits. Cette induction s'accompagne de l'expression de la cytokine IL-21 qui
joue un rôle important dans l'amplification de la différenciation et de l'expression du récepteur
à l'IL-23.
L’IL-23 joue un rôle critique dans la différenciation terminale des Th17 (McGeachy,
Chen et al. 2009) ainsi que dans la survie et le maintien de la fonctionnalité de ces cellules. Le
processus de différenciation peut donc se résumer en trois étapes : 1) initiation de la
différenciation via l'IL-6 et le TGF-ȕ, 2) amplification via l'IL-21, 3) stabilisation via l'IL-23.
Il a été récemment montré que l’IL-17 peut directement inhiber la différenciation des Th1 in
vitro en inhibant l’expression de T-bet (O'Connor, Kamanaka et al. 2009). De plus, les souris
invalidées pour l’IL-17 développent une réponse Th1 exacerbée (Yi, Zhao et al. 2008;
O'Connor, Kamanaka et al. 2009).
Les Th17, produisent de fortes quantités d’IL-17A, d’IL-17F, d’IL-22 et d’IL-21
(Harrington, Hatton et al. 2005; Park, Li et al. 2005) et jouent un rôle dans les réponses
immunes contre des bactéries extracellulaires et fongiques (Weaver, Hatton et al. 2007; Korn,
Bettelli et al. 2009). Il a récemment été montré que les Th17 avaient également un rôle d’aide
aux LB (Mitsdoerffer, Lee et al. 2010). En effet, l’IL-21 et l’IL-17 sont des cytokines
capables d’engendrer la commutation de classe isotypique chez les LB et la formation de
centres germinaux. Les patients atteints du syndrome d’hyper IgE, causé par une mutation sur
STAT3 (Buckley 2001) ont une déficience en Th17. Ces patients sont sensibles aux infections
31
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
par Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae mais aussi par Candida albicans et
d’autres champignons. Les LT CD4+ isolés du sang de ces patients ne produisent pas d’IL-17
et sont incapables de se différencier en Th17 in vitro (Milner, Brenchley et al. 2008).
Figure 5. Hétérogénéité des lymphocytes T CD4+ effecteurs
Après une stimulation du TCR, les LT CD4+ naïfs peuvent se différencier en différentes souspopulation Th selon les cytokines présentes dans le milieu. Le processus de différenciation implique
l’activation de protéines STAT spécifiques, et la régulation positive de facteurs de transcription propre
à chaque lignage. Une fois différenciés, les Th sécrètent des cytokines spécifiques, permettant une
boucle d’auto-stimulation et la mise en place d’une réponse immune adaptée au danger.
L’engagement dans un des lignages permet d’inhiber la différenciation en en autre lignage (flèche tête
plate). Enfin les fonctions de chaque sous-population sont indiquées, que ce soit en conditions
normales ou pathologiques. D’après Zhu et al. Ann Rev 2010.
I.3.d) Les autres cellules Th
D’autres lignages potentiels de Th effecteurs ont été proposés, comme les Th9
producteurs d’IL-9 et les LTfh localisés dans les régions folliculaires des nœuds lymphatiques
et de la rate.
Les Th9 sont encore mal connus. L’IL-9 a longtemps été considérée comme une
cytokine propre aux Th2, mais aujourd’hui, cela semble moins clair. Il semble possible
d’obtenir des LT producteurs d’IL-9, lors de l’activation d’un Th0 via le TCR en présence de
TGF-ȕ et d’IL-4 et de "différencier" un Th2 en Th9 à l'aide d'un traitement par TGF-ȕ
(Dardalhon, Awasthi et al. 2008; Veldhoen, Uyttenhove et al. 2008). Mis à part le rôle des
Th9 dans les maladies allergiques et dans la résistance contre les nématodes intestinaux, le
rôle de ces cellules reste mal connu (Soroosh and Doherty 2009).
32
Introduction, Chapitre I : Les lymphocytes T effecteurs
Les principales caractéristiques des LTfh sont leur localisation unique dans les centres
germinaux, et leur capacité à différencier les LB en plasmocytes, producteurs d’anticorps
(King, Tangye et al. 2008; Nurieva, Chung et al. 2008). Grâce à l’expression constitutive de
CXCR5 et l’absence d’expression de CCR7, les LTfh sont capables de migrer vers les
follicules B des organes lymphoïdes secondaires, riches en CXCL13. Aujourd’hui, on ne sait
pas bien si ces cellules sont une sous-population distincte ou si elles sont produites suite à une
différenciation des Th1, Th2 ou Th17 en réponse à CXCL13 (Hardtke, Ohl et al. 2005;
Arnold, Campbell et al. 2007). Parmi ces propriétés, il y a la sécrétion de l’IL-21, importante
pour la différenciation des LB, et l’expression du régulateur de transcription Bcl-6. De
récentes études montrent que Bcl-6 représente un facteur de transcription spécifiquement
exprimé par les LTfh à l’inverse des cellules Th qui ne l'expriment pas (Chtanova, Tangye et
al. 2004). Ces LTfh sont nécessaires lors d’une réponse immune humorale normale.
Cependant, lors d’une réponse immune anormale ou chronique leur capacité d’aide peut
favoriser le développement de cancers ou de maladies auto-immunes (Fazilleau, Mark et al.
2009).
!
En conclusion, notre système immunitaire est caractérisé par une grande diversité
phénotypique et fonctionnelle de LT. Cette diversité est la clef d’une surveillance permanente
et d’une défense de l’organisme contre une grande variété d’agents pathogènes. Elle a pour
corollaire la présence en périphérie des lymphocytes potentiellement dangereux car possédant
la capacité de développer des réactions auto-immunes. Des mécanismes de régulation sont
nécessaires pour assurer le contrôle de ces lymphocytes autoréactifs, grâce notamment à la
présence de LT CD4+ régulateurs. Outre le rôle de ces cellules dans le contrôle des réponses
auto-immunes, elles sont primordiales pour divers autres contrôles, tels que l’amplitude de la
réponse immune, la protection vis-à-vis des réponses de type allergique et la tolérance fœtomaternelle.
33
34
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Chapitre II _ En périphérie, l’ordre est maintenu par les
lymphocytes T régulateurs : biologie des CD4+Foxp3+
La tolérance centrale a longtemps été considérée comme le principal mécanisme de
tolérance au soi. Aujourd’hui, il est clairement établi que ce processus n’est pas suffisant et
que des lymphocytes autoréactifs sont produits de façon physiologique (Fowell and Mason
1993). Pour contrôler ces populations potentiellement dangereuses, plusieurs mécanismes de
tolérance périphérique sont mis en place : ils peuvent être passifs (anergie, ignorance,
délétion) ou actifs (cellules NKT, LT CD8+, LT régulateurs). A l’heure actuelle, la population
régulatrice la mieux décrite est celle des LT régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (Sakaguchi
2006). Il existe des T régulateurs dérivant naturellement du thymus (Treg), et des T
régulateurs induits (iTreg) en périphérie. L’objet de ce chapitre portera sur les Treg naturels.
II.1 Mise en évidence et marqueurs phénotypiques des Treg
Malgré un début très difficile, il est maintenant bien établi que les Treg sont générés
dans le thymus et jouent un rôle primordial dans le maintien de la tolérance périphérique et
l’homéostasie du système immunitaire. De nombreuses équipes se sont intéressées à mieux
caractériser ces Treg, et ceci dans différents modèles. Malgré les nombreux efforts, les études
rencontrent des difficultés pour identifier un marqueur de surface stable et spécifique. De
même, les mécanismes moléculaires responsables du développement des Treg et de leurs
fonctions ne sont pas encore bien définis.
II.1.a) Les différents marqueurs membranaires des Treg
II.1.a.i) CD5high, Sakaguchi, 1982
Les travaux de Sakaguchi ont donc provoqué un regain d’intérêt pour ces cellules
suppressives, négligées pendant quelques années. En 1982, ils montrent que le transfert de LT
CD4+CD5high (ou Lyt-1 high) est capable de prévenir le développement de l'ovarite autoimmune chez les souris thymectomisées (Sakaguchi, Takahashi et al. 1982). La glycoprotéine
transmembranaire CD5 représente donc le premier marqueur phénotypique permettant de
caractériser et d’isoler ces cellules suppressives. Plus tard, la même équipe prouve la fonction
suppressive des LT CD4+CD5high : après avoir supprimé ex vivo les LT CD8 et les LT
CD5high grâce à une combinaison d’anticorps anti-CD8 et anti-CD5 et du complément, ils
injectent les LT CD4+CD5- provenant de souris sauvages à des souris «nudes». Ce protocole
induit l’apparition de pathologies auto-immunes multi-organes (ovaires, thyroïde, intestins).
35
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
La co-injection des LT CD4+CD5high prévient le développement de ces manifestations autoimmunes (Sakaguchi, Takahashi et al. 1982), démontrant l'activité suppressive de cette
population sur la population de LT CD4+CD5- autoréactifs.
Suite à ces résultats, plusieurs marqueurs ont été proposés pour caractériser cette
population suppressive de manière spécifique (Figure 6).
II.1.b.ii) CD45RBlow, Powrie, 1990
La protéine tyrosine phosphatase CD45 est exprimée par la quasi-totalité des cellules
d’origine hématopoïétique. En 1990, Powrie et son équipe montrent que l’injection de la souspopulation LT CD4+CD45RChigh à des rats congéniques athymiques provoque une pathologie
sévère s’accompagnant d’une perte de poids et d’une infiltration massive de cellules dans de
nombreux organes. En revanche, le transfert adoptif de la fraction cellulaire LT
CD4+CD45RClow n’induit aucune maladie. De façon surprenante, le transfert de LT CD4+
totaux n’est associé qu’à une morbidité mineure (Powrie and Mason 1990). Ces résultats
indiquent que la population LT CD4+CD45RClow est responsable du contrôle de la population
effectrice LT CD4+CD45RChigh. Ces données ont été confirmées chez la souris où l’isoforme
RC chez le rat correspond à l’isoforme RB chez la souris. En effet, en 1993, deux équipes
montrent que le transfert de LT CD4+CD45RBhigh à des souris SCID (Severe Combined
Immunodeficiency) induit le développement d’une pathologie intestinale auto-immune sévère
(l’IBD, Inflammatory Bowel Disease). L’injection de la fraction autologue LT
CD4+CD45RBlow ou bien la co-injection des fractions LT CD4+CD45RBhigh et LT
CD4+CD45RBlow n’induit pas l’IBD (Morrissey, Charrier et al. 1993; Powrie, Leach et al.
1993)
II.1.b.iii) CD25+, Sakaguchi, 1995
1995 est une année clef dans l’histoire des Treg. Les premiers marqueurs identifiés
regroupaient des populations cellulaires trop importantes pour faire la distinction entre
régulateurs et effecteurs. En effet, les LT CD4+CD45RBlow constituent 25 à 30% des LT
CD4+ chez une souris naïve (Sakaguchi 2004). L’équipe de Sakaguchi met en lumière un
nouveau marqueur membranaire : l’expression constitutive de la chaîne Į du récepteur à l’IL2, CD25. Ce marqueur de surface permet de discriminer de manière plus précise les Treg des
lymphocytes T conventionnels (Tconv), puisque les LT CD4+CD25+ représentent entre 5 et
10% des LT CD4+ chez une souris naïve et chez l’homme. Leur travaux montrent que les LT
36
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
CD4+CD25+ sont capables de contrôler le développement de pathologies auto-immunes,
provoquées dans des modèles de transfert adoptif de population autopathogènes (Sakaguchi,
Sakaguchi et al. 1995).
Les premiers résultats des études de thymectomies néonatales combinés à la
découverte de ce marqueur membranaire ont permis d’établir que la population LT
CD4+CD25+ n’apparaît dans les organes lymphoïdes périphériques que 4 à 5 jours après la
naissance (Asano, Toda et al. 1996). Les auteurs prouvent également l’effet suppresseur des
LT CD4+CD25+ dans ce modèle de thymectomie néonatale, en effectuant des transferts
adoptifs de cette population régulatrice. Ils ont ainsi associé la thymectomie à J+3 à l’absence
de génération des LT CD4+CD25+, ce qui explique l’apparition des manifestations autoimmunes.
Bien que CD25 soit un marqueur caractéristique des Treg, il n’est pas spécifique de
cette population. En effet, CD25 est aussi exprimé par les LT activés. La quête d'un marqueur
spécifique a donc été poursuivie, permettant l'identification de CTLA-4 (Cytotoxic TLymphocyte Antigen 4) (Read, Malmstrom et al. 2000; Takahashi, Tagami et al. 2000) et de
GITR (Glucocorticoid- Induced Tumor necrosis factor Receptor) (McHugh, Whitters et al.
2002). Malheureusement, ces deux marqueurs étant aussi exprimés par les LT activés, ils ne
représentent pas le marqueur spécifique recherché.
II.1.c) Foxp3, facteur de transcription spécifique des Treg
Le
syndrome
auto-immun
lymphoprolifératif,
IPEX
(Immune
dysregulation
polyendocrinopathy enteropathy-X-linked syndrom), a été décrit dans les années 1980 dans
une famille comprenant 17 garçons morts durant leur première année. L’évaluation
fonctionnelle du système immunitaire chez ces patients a révélé des anomalies dans le
fonctionnement du compartiment T (Powell, Buist et al. 1982). De plus, chez ces patients, le
niveau des IgE circulantes peut-être très élevé et associé à une augmentation des éosinophiles,
évidences indiquant une déviation du répertoire LT CD4+ vers un lignage Th2 (Chatila,
Blaeser et al. 2000). C’est seulement en 2001 que la cause de l’IPEX est identifiée : une
mutation dans le facteur de transcription Foxp3 (Forhead box protein 3) porté par le
chromosome X (Bennett, Christie et al. 2001; Wildin, Ramsdell et al. 2001). Rapidement, ce
phénotype a été confirmé par l’utilisation de souches de souris Scurfy, caractérisées par une
mutation invalidant le gène Foxp3 : les souris mâles meurent dans les premiers mois de vie,
après avoir développé un syndrome auto-immun (Brunkow, Jeffery et al. 2001; Lin, Truong et
al. 2005). En revanche, les souris femelles hétérozygotes pour la mutation, de même que les
37
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
femmes hétérozygotes pour cette mutation ne développent aucun symptôme auto-immun.
Ceci suggère que les LT exprimant Foxp3 contrôlent le développement des réponses
immunitaires auto-spécifiques. Ces observations ont permis d’associer ces mutations de
Foxp3 à une absence de Treg fonctionnels aussi bien chez les patients IPEX que chez les
souris scurfy (Zheng and Rudensky 2007).
Suite à ces résultats majeurs, les études sur Foxp3 se sont multipliées et ont permis
d’établir que le facteur de transcription Foxp3 est un facteur essentiel au développement et
aux fonctions des Treg (Fontenot, Gavin et al. 2003; Hori, Nomura et al. 2003). En effet, les
LT
CD4+CD25+
périphériques
et
les
thymocytes
CD4+CD8–CD25+
expriment
spécifiquement l’ARN messager de Foxp3 (Khattri, Cox et al. 2003). De plus, la transduction
rétrovirale de Foxp3 dans des Tconv (CD4+CD25-) leur confère un phénotype et des
fonctions régulatrices (contrôle in vitro et in vivo de la prolifération des Tconv, état anergique,
absence de production d’IL2, et expression de marqueurs membranaires caractéristiques des
Treg) (Fontenot, Gavin et al. 2003; Hori, Nomura et al. 2003).
Le facteur de transcription Foxp3 est donc le marqueur qui a permis d’identifier de
manière précise les Treg et reste aujourd’hui, un des marqueurs les plus fiables, même si chez
l’homme, son expression peut être induite dans les LT activés (Moller 1988; Walker, Carson
et al. 2005; Gavin, Torgerson et al. 2006). L’inconvénient principal de ce marqueur reste sa
localisation nucléaire qui empêche, à l’heure actuelle, toute possibilité de travail sur cellules
vivantes triées chez l’homme. Au vu du très large potentiel que ces cellules pourraient avoir
en clinique humaine, il reste important de continuer les recherches pour trouver un marqueur
de surface ou tout autre moyen qui permettrait d’isoler spécifiquement les Treg.
II.1.d) Les derniers marqueurs étudiés
La quête d’un marqueur hautement spécifique des Treg a conduit ces dernières années
à mettre en avant plusieurs molécules, telles que CD62L, CD27 (Ruprecht, Gattorno et al.
2005; Sakaguchi 2005). Cependant, les scientifiques se heurtent toujours au même problème :
après activation, l’expression de ces molécules est augmentée, rendant alors impossible la
distinction entre les Tconv et les Treg.
En 2006, une nouvelle avancée est faite : les Treg CD4+CD25+Foxp3+ n’expriment
que faiblement CD127 (CD127low), la chaîne Į du récepteur à l’IL-7, alors que les Tconv
(CD25+ ou non CD25-) l’expriment fortement (CD127high) (Choi, Pae et al. 2005). La
surexpression de Foxp3 dans une souris transgénique conduit à une population de cellules
exprimant de manière homogène et faible la molécule CD127 et possédant des propriétés
38
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
suppressives (Liu, Putnam et al. 2006). Malheureusement, de récentes études montrent que
l’expression de CD127 est diminuée après activation chez les Tconv (Allan, Crome et al.
2007; Aerts, Dombrecht et al. 2008).
Enfin, en 2007, le groupe de Sakaguchi a identifié chez la souris un nouveau marqueur
de surface FR4 (Folate Receptor 4), un sous-type de récepteur à l’acide folique, exprimé
fortement et constitutivement sur les Treg CD4+CD25+CD127lowFoxp3+. Ce marqueur
permet aussi de faire la distinction entre les Treg (CD4+CD25+FR4high) et les Tconv activés
(CD4+CD25+FR4low). L’élimination in vivo chez la souris des LT CD4+FR4high avec des
anticorps déplétants conduit au développement de pathologies auto-immunes. De plus, la
surexpression rétrovirale de Foxp3 dans des LT CD4+ conduit à un phénotype FR4high,
indiquant que Foxp3 contrôle le niveau d’expression de FR4 (Yamaguchi, Hirota et al. 2007).
Figure 6. Historique des marqueurs des Treg
Le marqueur le plus spécifique des Treg est le facteur de transcription Foxp3. Celui-ci est exprimé par
low
la majorité des LT CD4+CD25+ et une petite fraction de LT CD4+CD25-. Les LT CD4+CD45RB , LT
high
et LT CD4+CTLA-4+ contiennent les LTFoxp3+ chez une souris normale naïve. Le
CD4+ GITR
niveau d’expression du marqueur FR4 permet de distinguer chez la souris les cellules CD25+
régulatrices des cellules CD25+ effectrices activées. Les années de découverte de chacun de ces
marqueurs sont indiquées sur la droite. Adapté de Sakaguchi et al. 2004, Annu Rev Immunol.
II.2 Développement et homéostasie des Treg
L’origine thymique des Treg est soupçonnée depuis les premières expériences de
thymectomie chez des souris nouveau-nées, qui provoquaient des pathologies auto-immunes.
Depuis, il a été montré que ces cellules régulatrices prennent leur origine dans le thymus et
39
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
que l’ablation du thymus entraîne un déficit permanent en Treg (Apostolou, Sarukhan et al.
2002).
De récentes études révèlent que les LT exprimant Foxp3 apparaissent rapidement après la
naissance et que leur déplétion conduit au développement de maladies auto-immunes (Kim,
Rasmussen et al. 2007; Lahl, Loddenkemper et al. 2007). Bien que l’origine thymique des
Treg soit aujourd’hui largement acceptée, il n’est pas encore bien compris quel est le signal
initial qui engage les thymocytes dans la lignée régulatrice. Les données à ce sujet sont
controversées.
II.2.a) L’engagement du TCR, une nécessité
Plusieurs équipes ont pu montrer que les précurseurs des Treg subissent, tout comme
les thymocytes conventionnels, la sélection thymique (Bensinger, Bandeira et al. 2001;
Romagnoli, Hudrisier et al. 2002; Ribot, Enault et al. 2007). Ainsi, le développement des Treg
implique l’engagement du TCR, indispensable lors des sélections thymiques, comme nous
l’avons vu précédemment. Suite à cet engagement, deux mécanismes peuvent expliquer le
développement des LT en Treg.
Le premier mécanisme implique la nature du TCR. Selon Jordan (Jordan, Boesteanu et
al. 2001), la sélection des Treg dépendrait de l’affinité du TCR pour un peptide du soi. En
effet, un TCR transgénique avec une forte affinité pour un peptide du soi favoriserait
l’engagement dans le lignage Treg. Concordants avec ces résultats, des travaux chez des
souris déficientes en CD5, une molécule qui atténue le signal du TCR grâce au recrutement de
tyrosines phosphatases SHP-1, montrent une augmentation de la fréquence des Treg (Carter,
Calabrese et al. 2005; Ordonez-Rueda, Lozano et al. 2009). Ceci appuie l’hypothèse selon
laquelle les Treg sont exposés à de forts signaux provenant du TCR.
Dans le second mécanisme, c’est la résistance des thymocytes Foxp3+ à la sélection
négative par apoptose qui serait en cause. Selon Van Santen (van Santen, Benoist et al. 2004),
la sélection des Treg serait dûe à l’élimination préférentielle des Tconv autoréactifs, sensibles
à la sélection négative.
La question de la nature du répertoire des Treg est très souvent abordée. Dans un
premier temps, il a été largement accepté que le répertoire des Treg était autoréactif
(Takahashi, Kuniyasu et al. 1998). Cependant, cette hypothèse a été remise en cause lorsque
des études ont mis en évidence l’existence de Treg spécifiques de bactéries (Kullberg,
Jankovic et al. 2002), de champignons (Montagnoli, Bacci et al. 2002), d’allergènes (Zuany-
40
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Amorim, Sawicka et al. 2002), d’alloantigènes (van Maurik, Herber et al. 2002; Ochando,
Yopp et al. 2005), ou du parasite Leishmania major (Belkaid, Piccirillo et al. 2002).
Des études récentes (Pacholczyk, Kern et al. 2007), permettant l’analyse d’une
centaine de TCR exprimés à la surface des Tconv et des Treg, ne montrent pas que les Treg
reconnaissent préférentiellement des antigènes du soi. Au contraire, ces cellules reconnaissent
des antigènes étrangers au soi, aussi souvent que les Tconv. Ainsi, l’ensemble de ces données
suggère que, de la même manière que pour les Tconv, la spécificité pour le soi serait plus une
exception qu’une règle en ce qui concerne le répertoire des Treg.
Enfin, il est établi que la persistance de l’antigène en périphérie est nécessaire au
maintien de Treg fonctionnels. L’équipe de Mason provoque chez le rat une thyroïdite autoimmune en effectuant une thymectomie suivie d’irradiations. Le rat est protégé lors d’un
transfert de Treg provenant de rat syngénique. Cependant, si les Treg proviennent d’un rat
syngénique athyroïdien, la protection est perdue (Seddon and Mason 1999).
II.2.b) Rôle des molécules de co-stimulation, et des cytokines
Le signal délivré par le TCR n’est pas le seul signal impliqué dans la génération des
Treg. Des travaux montrent un rôle important des molécules de co-stimulation et de certaines
cytokines (Malek, Yu et al. 2002; Nakamura, Kitani et al. 2004; Keir and Sharpe 2005; Paust
and Cantor 2005). Ainsi, la molécule de co-stimulation CD28 a un rôle essentiel dans la
différenciation des Treg, comme le montre la réduction drastique de fréquence des Treg
observée chez des animaux déficients pour CD28 ou pour ses ligands CD80 et CD86
(Salomon, Lenschow et al. 2000; Tai, Cowan et al. 2005). Cette molécule de co-stimulation
favorise la survie des Treg en augmentant la production d’IL-2 par les Tconv, et en
maintenant l’expression de CD25 à leur surface (Tang, Henriksen et al. 2003; Fontenot,
Rasmussen et al. 2005). CD28 joue donc un rôle essentiel pour le développement, et
l’homéostasie des Treg.
Dans un modèle de souris déficientes en RAG, seule une partie des thymocytes
exprimant un TCR transgénique est capable de se différencier en Treg. Ainsi, sous l’influence
du ligand spécifique, une partie des thymocytes se différencie en Treg, l’autre en « non-Treg »
anergique (Jordan, Boesteanu et al. 2001; Apostolou, Sarukhan et al. 2002). Ceci prouve
l’existence d’un autre signal, venant s’ajouter à celui du TCR. Le second signal apporté aux
thymocytes précurseurs des Treg est principalement délivré par l’IL-2, mais aussi, en moindre
importance par deux autres membres de la famille des cytokines signalant par la chaîne Ȗ, qui
41
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
sont l’IL-7 et l’IL-15. En effet, des souris déficientes en IL-2 ou en chaîne Į du récepteur à
l’IL-2 ont un pourcentage et un nombre absolu de Treg diminués de moitié, alors que les
souris déficientes en IL-7 ou IL-15 ont un nombre normal de Treg. En revanche, des souris
n’exprimant pas la chaîne Ȗ (donc déficientes en IL-2, IL-7 et IL-15, mais aussi IL-4, IL-9 et
IL-21) sont totalement dépourvues de Treg (Fontenot, Rasmussen et al. 2005; Burchill, Yang
et al. 2007; Vang, Yang et al. 2008).
Enfin, un dernier signal connu s’ajoute aux précédents, il est délivré par le récepteur
au TGF-ȕ comme le montre l’équipe de Chen. L’ablation de la sous-unité ȕ du récepteur 1 au
TGF-ȕ dans des thymocytes DP provoque une profonde, mais transitoire, défaillance dans la
génération de Treg durant la première semaine de vie (Liu, Zhang et al. 2008). Ainsi, sur le
même modèle que les iTreg, Foxp3 serait activé dans les thymocytes par Smad, préalablement
induit par le TGF-ȕ. Smad est capable d’interagir avec le locus Foxp3 grâce à l’élément de
réponse Smad-NFAT (Tone, Furuuchi et al. 2008). Par la suite, le nombre de thymocytes
exprimant Foxp3 serait restauré grâce à une compensation du signal TGF-ȕ par une
augmentation de quantité d’IL-2 (Liu, Zhang et al. 2008). Cette cytokine joue également une
fonction importante dans le maintien de l’expression de Foxp3, l’homéostasie et le maintien
des Treg en périphérie (Marie, Letterio et al. 2005).
II.2.c) Rôle de Foxp3
Les études réalisées grâce aux souris Foxp3-GFP (la séquence codante pour la GFP est
insérée dans le locus de Foxp3) ont permis de révéler l’existence de thymocytes DP Foxp3+
et a, de plus, confirmé l’importance de ce facteur de transcription dans la spécification du
lignage régulateur (Fontenot, Rasmussen et al. 2005). Une étude du génome à grande échelle
a montré que Foxp3 est capable de se lier aux régions promotrices de 700 à 1100 gènes, la
plupart étant associés à la voie de signalisation du TCR (Marson, Kretschmer et al. 2007;
Zheng, Josefowicz et al. 2007). Une grande partie de ces gènes est régulée positivement ou
négativement dans les LT Foxp3+, ce qui permet d’attribuer à Foxp3 un rôle à la fois
activateur et répresseur de la transcription. Ces travaux renforcent le statut de Foxp3 comme
responsable de l’établissement intra-thymique du lignage régulateur et des propriétés
prolifératives et fonctionnelles des Treg en périphérie.
Cependant, une étude remet en cause le rôle de Foxp3 dans l'engagement intrathymique des lymphocytes vers le lignage régulateur (Hori 2008). Il se fonde sur un modèle
de souris qui exprime une protéine de fusion entre un Foxp3 non fonctionnel et la GFP. Les
42
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
résultats suggèrent que Foxp3 est requis pour les fonctions régulatrices des Treg, mais ne
serait pas impliqué dans l’engagement du lignage « régulateur » (Lin, Haribhai et al. 2007).
Deux groupes ont démontré par ailleurs que des thymocytes, n’exprimant pas la protéine
Foxp3, étaient capables de développer des caractéristiques phénotypiques des Treg
(expression de CD25, GITR, CTLA-4), sans pour autant avoir les caractéristiques
suppressives (Gavin, Rasmussen et al. 2007; Lahl, Mayer et al. 2009). Ces observations
renforcent la possibilité que les thymocytes soient engagés dans le lignage des Treg sans que
Foxp3 soit exprimé. Une fois engagés dans ce lignage, grâce à un signal inconnu, les
précurseurs exprimeraient Foxp3, ce qui aurait pour conséquence de stabiliser le phénotype
régulateur et de conférer les fonctions régulatrices. De plus, certains gènes sont spécifiques
des Treg, mais indépendant de l’expression de Foxp3 : insulin-like-7, galectine-1, granzyme B
et hélios. En effet, l’expression ectopique de Foxp3 dans des LT naïfs conventionnels ne
permet pas la régulation de ces gènes, contrairement à ceux dépendant de Foxp3 comme
GITR, CD25 et CTLA-4 (Gavin, Rasmussen et al. 2007; Hill, Feuerer et al. 2007). Ces
données indiquent qu’une régulation importante, indépendante de Foxp3, existe dans
l’engagement du lignage Treg. Il reste à comprendre les mécanismes impliqués dans le
programme de différenciation des Treg, permettant d’allumer l’expression de Foxp3 dans les
thymocytes en développement.
Au final, il est possible que Foxp3, sans réellement être le régulateur maître du lignage
Treg, puisse amplifier les caractéristiques moléculaires pré-établies des Treg. Le maintien de
l’expression de Foxp3 est ensuite important pour maintenir les Treg matures fonctionnels en
périphérie (Williams and Rudensky 2007). Il a été suggéré que pour cela l’expression de
Foxp3 est stabilisée par des modifications épigénétiques (comme la déméthylation) (Lal and
Bromberg 2009).
II.2.d) Bases moléculaires du contrôle de l’expression de Foxp3
Plusieurs voies de signalisation, impliquant le TCR, l’IL-2, des protéines STAT et
Smad, le TGF-b et la voie PI3K/Akt/mTOR sont impliquées dans l’induction de Foxp3 dans
les Treg (Shen, Chen et al. 2009). Une grande partie des travaux a été réalisée sur les iTreg,
plus simples d’utilisation in vivo. Cependant, ces études apportent tout de même des
informations sur la signalisation pouvant être mise en place dans les Treg naturels. Les
évènements moléculaires clefs impliqués dans l’expression de Foxp3 sont résumés dans la
figure 7.
43
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Figure7. Régulation de l’expression de Foxp3
Ce schéma représente les différentes voies décrites dans la régulation de l’expression de Foxp3 : en
vert, la signalisation du TCR et CD28, en rouge celle du récepteur à l’IL-2, en orange celle du
récepteur au TGF-ȕ, et en noir la voie de signalisation négative générée par l’activation de la Pi3K.
Les traits pointillés représentent une voie inhibée chez les Treg grâce à la présence de PTEN
fortement phosphorylé dans ces cellules. Les lettres P dans les ronds jaunes représentent des résidus
phosphorylés; les lettres M dans les ronds bleus représentent des méthylations. Se référer au texte
pour plus de détails. Adapté de Merkenschlager et al. JEM, 2010.
II.2.d.i) NFAT/AP-1 et Smad3
Après l’engagement du TCR avec le complexe CMH/peptide du soi, l’expression de
Foxp3 est contrôlée par des facteurs de transcription capables de se lier aux régions
promotrices du gène Foxp3. Dans la région 5’ du gène Foxp3, existent plusieurs sites de
liaison pour des facteurs de transcription importants, incluant AP-1 et NFAT (Mantel, Ouaked
et al. 2006). De récentes études ont montré que ces sites de liaison à AP-1 et NFAT régulaient
positivement l’activation transcriptionnelle du gène Foxp3 en réponse à la stimulation du
TCR. Une autre étude a localisé des sites de liaison de NFAT et Smad3 sur une région
régulatrice du gène Foxp3 (Tone, Furuuchi et al. 2008). L’acétylation d’histones dans cette
région régulatrice est observée dans des Treg matures, et elle est également retrouvée dans des
LT CD4+ primaires stimulés par un anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF-ȕ. NFAT et
44
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Smad3 coopèrent pour induire l’expression du gène Foxp3, et NFAT maintient l’activité de la
région activatrice et donc l’expression de Foxp3. En accord avec ces observations, il a été
montré que l’expression de Foxp3 est bloquée lors de l’utilisation d’un inhibiteur de Smad3
(Tone, Furuuchi et al. 2008). Ainsi, Smad3 et NFAT sont des facteurs de transcription clefs
pour l’induction de l’expression du gène Foxp3, et par conséquent pour diriger la
différenciation des Treg.
II.2.d.ii) CREB/ATF
L’engagement du TCR induit également l’activation du co-activateur CREB (cyclic
AMP response element binding protein)/ATF (activating transcription factor) capable de se
lier à une séquence activatrice de la transcription du gène de Foxp3 (Kim and Leonard 2007).
Cette région est un îlot CpG méthylé, ce qui empêche la liaison de CREB/ATF. Or il a été
montré que la présence de TGF-ȕ est associée à une diminution de la méthylation de cette
séquence et par conséquent avec une augmentation de la transcription de Foxp3. Ces études
étant réalisées sur des Treg naturels, suggèrent que le TGF-ȕ est impliqué dans
développement thymique des Treg, en accord avec une étude antérieure (Licona-Limon and
Soldevila 2007). Le signal produit par l’engagement du TCR active les facteurs de
transcription, et le TGF-ȕ permet l’accès de ces facteurs aux sites de liaison au niveau du gène
Foxp3. Une étude récente indique par ailleurs que le TGF-ȕ protège les thymocytes de la
sélection négative favorisant ainsi la sélection des Treg (Ouyang, Beckett et al. 2010).
II.2.d.iii) Voie NF-kB
Des études sur des souris déficientes en protéines impliquées dans la voie de
signalisation NF-kB dépendante du TCR (PKC-ș, Bcl10, CARMA1 et IkB kinase 2) montrent
un défaut important dans la différenciation des Treg (Schmidt-Supprian, Tian et al. 2004;
Medoff, Sandall et al. 2009). Une étude récente sur une mutation générée dans CARMA1
décrit un blocage complet de la différenciation thymique des Treg (Barnes, Krebs et al. 2009).
Alors que les iTreg sont capables de se développer, les Treg sont absents dans ces souris,
suggérant une voie de signalisation différente impliquant CARMA1, et donc le facteur de
transcription NF-țB, pour les Treg. L’activation de la voie NF-țB par CARMA1 pourrait agir
comme un facteur de survie, prévenant l'apoptose des Treg en développement. De manière
intéressante, Alegre et son équipe ont montré que l’apport d’un signal de survie, via la
surexpression de Bcl2 ou d’une forme constitutivement active de STAT5, à des thymocytes
45
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
déficients en CARMA1 ne compense pas le défaut de Treg, suggérant un rôle de CARMA1
dans les phases précoces de développement thymique des Treg (Molinero, Yang et al. 2009).
II.2.d.iv) Voie Pi3K/AKT/mTOR et les facteurs Foxo.
Une des voies importantes en aval du TCR est la voie Pi3K, dont on a parlé
précédemment. Dans un modèle murin, il a été montré que la proportion de Treg dans la rate
et dans les ganglions lymphatiques de souris présentant une forme inactive de la sous-unité
p110į de la Pi3K est considérablement réduite en dépit de l’augmentation de la sélection
intra-thymique des Treg. La voie Pi3K a donc un rôle inhibiteur sur l’induction des Treg. En
revanche, cette voie de signalisation aurait un rôle activateur indispensable en ce qui concerne
les fonctions suppressives des Treg. En effet, les Treg isolés à partir de ces souris présentent
des fonctions suppressives atténuées lors de tests fonctionnels in vitro et n’assurent pas une
protection contre la colite expérimentale lors d’expériences in vivo de transferts adoptifs de
LT (Patton, Garden et al. 2006). De plus, l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques de la
voie Pi3K/AKT permet de favoriser l’induction de Foxp3 chez des LT activés (Sauer, Bruno
et al. 2008). L’inhibition de mTOR, provoque également l’augmentation d’expression de
Foxp3 et l’expansion de Treg (Battaglia, Stabilini et al. 2005). Enfin, l’activation prolongée
de Pi3K et donc d’AKT inhibe l’expression de Foxp3 dans le thymus (Haxhinasto, Mathis et
al. 2008).
Des études récentes ont démontré le rôle des facteurs de transcription Foxo dans cette
voie de signalisation (Ouyang, Beckett et al. 2010). Foxo sont connus pour être régulés par la
voie Pi3K/AKT. AKT est capable de phosphoryler Foxo et ainsi de favoriser son exclusion
nucléaire et donc son inactivation. Ouyang et son équipe ont montré par l’intermédiaire de
souris déficientes pour Foxo1 et/ou Foxo3 que ces facteurs représentent des liens moléculaires
entre la voie Pi3K-AKT-mTOR et la transcription de Foxp3, gène sur lequel Foxo possède un
site de fixation (Ouyang, Beckett et al. 2010).
II.2.d.v) Signalisation de l’IL-2 : rôle de STAT5
En plus de la signalisation par le TCR, d’autres voies de signalisation sont impliquées
dans le contrôle de l’expression de Foxp3. Parmi elles, la voie de signalisation du récepteur à
l’IL-2. Le groupe de Negrin a disséqué le mécanisme sous-jacent en révélant que la
stimulation du récepteur à l’IL-2 induit l’activation chez les Treg de la voie STAT5, au
détriment de la voie AKT/mTOR, préférentiellement stimulée dans les Tconv (Haxhinasto,
46
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Mathis et al. 2008). La phosphorylation plus élevée de PTEN assurerait chez les Treg
l’inactivation de la voie AKT/mTOR. En accord avec ces observations, le groupe de Benoist a
démontré que cet effet est indispensable à la différenciation des Treg puisque AKT inhibe
l’induction de Foxp3 dans le thymus (Zeiser, Leveson-Gower et al. 2008)
II.3 Mécanismes de suppression
La fonction suppressive des Treg peut représenter une cible pour le développement de
nouveaux traitements des maladies immunes. Les mécanismes de suppression mis en jeu par
ces cellules sont encore mal connus. Par ailleurs les résultats des études réalisées dans des
systèmes-modèles in vitro, ne sont pas forcément indicatifs des mécanismes réellement mis en
jeu in vivo. Ces études indiquent en tout cas que les Treg sont capables d’effectuer leur rôle
suppresseur sur différents types de cellules immunitaires, telles que les cellules T, B, NK et
NKT (Azuma, Takahashi et al. 2003; Ghiringhelli, Menard et al. 2005; Lim, Hillsamer et al.
2005). Elles peuvent aussi agir par l’intermédiaire de cellules dendritiques, en les rendant
« tolérogènes » (Misra, Bayry et al. 2004). Par ailleurs, on sait que l’effet suppresseur des
Treg est médié par l’engagement de leur TCR (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 2001). Nous
décrirons dans ce chapitre les principaux mécanismes de suppression (Figure 8).
II.3.a) Mécanismes dépendants d’un contact cellulaire
II.3.a.i) Granzyme B et CD95/CD95L : cytolyse de la cible
Un des mécanismes de suppression des Treg est la lyse des cellules cibles. Grossman
et al. ont démontré que les Treg humains activés expriment le(s) granzyme(s) A et/ou B et
peuvent tuer plusieurs types de cellules immunes autologues de manière dépendante de la
perforine mais indépendante de CD95/CD95L (Grossman, Verbsky et al. 2004). De plus,
l’équipe de Zhao a rapporté que les Treg murin activés étaient capables de supprimer la
prolifération des LB grâce à un mécanisme impliquant le granzyme B et la perforine. (Zhao,
Thornton et al. 2006) alors que Gondek et al. ont décrit un mécanisme de suppression des
Tconv dépendant du granzyme B, mais indépendant de la perforine (Gondek, Lu et al. 2005).
Toutes ces études sont réalisées avec des Treg activés in vitro. L’équipe de Cao s’est
intéressée au rôle des granzymes, in vivo (Cao, Cai et al. 2007). Les auteurs ont pu montrer,
sur un modèle murin, que la voie de signalisation perforine/granzyme était importante pour
l’activité suppressive des Treg envers les cellules NK et LT CD8+. Il serait nécessaire de
47
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
mieux comprendre, in vivo, le rôle de cette voie de signalisation dans la fonction suppressive
des Treg sur d’autres cellules telles que les Tconv et les LB.
II.3.a.ii) CTLA-4 : action sur les CD par l’intermédiaire de CD80/CD86
L’expression constitutive par les Treg d’une molécule inhibitrice de l’activation T
comme CTLA-4 a très vite attiré l’attention des chercheurs, d’autant que ses ligands, CD80 et
CD86, sont exprimés par les CPA et les LT CD4+ activés. In vitro, de nombreuses études ont
démontré que les Treg étaient capables de réguler négativement l’expression de molécules de
co-stimulation à la surface des CD humaines et murines (Serra, Amrani et al. 2003; Misra,
Bayry et al. 2004). En étudiant la fonction biologique de CTLA-4, l’importance de cette
molécule dans la fonction suppressive des Treg semble évidente. En effet, la déficience de
CTLA-4 chez la souris conduit au développement de pathologies auto-immunes multi-organes
(Waterhouse, Penninger et al. 1995). In vivo, une équipe a montré que la délétion de CTLA-4
à la surface des Treg, chez la souris de 7 semaines, induisait une auto-immunité systémique
(Wing, Onishi et al. 2008). En revanche, cette délétion sélective n’a pas d’effet sur le
développement et l’homéostasie des Treg. CTLA-4 présent à la surface des Treg peut agir de
plusieurs manières dans l’induction de mécanismes régulateurs.
CTLA-4 peut interagir avec les molécules accessoires CD80 et CD86 à la surface des
CD pour empêcher leur surexpression et donc limiter la maturation des CD, les rendant
incapables d’activer les Tconv naïfs par l’intermédiaire de CD28 (Onishi, Fehervari et al.
2008). La nature biochimique du signal déclenché lors de la liaison CTLA-4/CD80/CD86
paraît complexe et reste encore mal comprise (Takahashi, Tagami et al. 2000).
Un autre mécanisme possible est représenté par l'induction d’IDO (indoléamine 2,3dioxygénase) qui dépend d’une forte expression de CTLA-4 à la surface de Treg (Grohmann,
Orabona et al. 2002). L’IDO active la dégradation du tryptophane et la mort cellulaire par
privation de cet acide aminé indispensable et par production de kynurénine, un composé proapoptotique (Fallarino, Grohmann et al. 2003).
II.3.a.iii) CD39 / CD73 : un rôle sur le catabolisme de l’ATP
Dans le système immunitaire, l’ATP extracellulaire représente un indicateur de l’état
des tissus. L’ATP est fortement concentré dans les cellules, et est libéré dans le milieu
extracellulaire lors de dommages cellulaires. La liaison de l’ATP extracellulaire aux
récepteurs purinergiques P2 entraîne une augmentation de l’expression de CD86 à la surface
48
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
des CD. Le nucléoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (NTPDase1), ou CD39, est une
ectoenzyme, liée à la membrane, qui hydrolyse l’ATP et l’ADP extracellulaires en AMP. Ce
dernier peut être clivé par CD73 pour former de l’adénosine. CD39 est exprimé à la surface de
cellules B, des CD, tous les Treg murins et environ 50% des Treg humains (Borsellino,
Kleinewietfeld et al. 2007; Deaglio, Dwyer et al. 2007). Ainsi, l’inactivation catalytique de
l’ATP extracellulaire par le CD39 pourrait être un autre mécanisme anti-inflammatoire utilisé
par les Treg, en empêchant la co-stimulation des CD. De plus, la fixation de l’adénosine sur
son récepteur A2A, exprimé par les Tconv, induit une élévation intracellulaire d’AMP
cyclique qui inhibe les fonctions des Tconv.
In vitro, les Treg murins déficients en CD39 possèdent une activité suppressive
réduite, et ces souris sont incapables de prévenir le rejet d’allogreffe (Deaglio, Dwyer et al.
2007). Ces études suggèrent que l’hydrolyse de l’ATP et/ou la génération d’adénosine par
l’expression de CD39 et CD73 représente(nt) un mécanisme important d’immunorégulation.
Une étude récente montre le rôle des Treg CD39+ dans le contrôle de Th17 et dans le contrôle
de la SEP. Les auteurs suggèrent que les Th17 des patients SEP ne sont pas résistants à la
suppression des Treg, mais qu’une sous-population de Treg CD39+ possède une activité
régulatrice réduite vis-à-vis de ces cellules (Fletcher, Lonergan et al. 2009).
II.3.b) Mécanismes dépendants de cytokines
Les cytokines inhibitrices TGF-ȕ, IL-10 et l’IL-35 exprimées par les Treg, semblent
jouer un rôle majeur dans les mécanismes de suppression. De manière intéressante, le concept
d’un facteur soluble responsable de l’effet suppresseur des Treg est encore controversé. En
effet, certains considèrent le contact cellulaire comme indispensable à la suppression.
Cependant, de plus en plus d’études décrivent l’importance des cytokines dans la suppression
de réponses immunes par les Treg in vivo (Sojka, Huang et al. 2008; Vignali, Collison et al.
2008).
Bien que la neutralisation de l’IL-10 ou du TGF-ȕ n’abolisse pas la suppression in
vitro (Takahashi, Kuniyasu et al. 1998), ces deux cytokines ont été les premiers facteurs
solubles à être impliqués dans la suppression des Treg.
L’IL-10 a été impliquée dans de nombreux modèles. In vivo, Asseman et al. ont
montré que les Treg déficients en IL-10 sont incapables de supprimer l’IBD induite chez des
souris (Asseman, Mauze et al. 1999). Le blocage du récepteur à l’IL-10 permet aussi d’abolir
49
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
l’inhibition de l’IBD par les Treg (Read, Malmstrom et al. 2000). Kingsley et al. ont montré
que l’IL-10 était impliquée dans l’inhibition par les Treg du rejet de greffe de peau,
l’administration d’anticorps anti-IL-10 bloquants accélérant le rejet (Kingsley, Karim et al.
2002). Les Treg infiltrant la lamina propria intestinale ou le système nerveux central peuvent
respectivement inhiber le développement de la colite et de l’EAE par une sécrétion locale
d’IL-10. De plus, l'analyse des différentes populations de Treg montre que les Treg infiltrant
l’intestin produisent de l’IL-10 au contraire des Treg spléniques, ces données suggérant que
l’environnement influence le profil de sécrétion des Treg et les fonctions effectrices
suppressives mises en place (Uhlig, Coombes et al. 2006). Les premières cibles de l’IL-10
sont les cellules myéloïdes dont elle restreint l’expression des cytokines pro-inflammatoires,
des chimiokines, des molécules de CMH de classe II et de co-stimulation (Moore, de Waal
Malefyt et al. 2001). Une partie de l’effet de l’IL-10 pourrait également découler de
l’induction de lymphocytes Tr1 ou de cellules dendritiques tolérogènes, cellules qui
amplifieraient la suppression en produisant elles-mêmes cette cytokine (Kryczek, Wei et al.
2006; Roncarolo, Gregori et al. 2006). Il faut toutefois remarquer que, par opposition à ses
propriétés immunosuppressives, l’IL-10 a un effet stimulateur sur la prolifération et la
cytotoxicité des LT CD8+ ainsi que sur la prolifération et la maturation des LB (Moore, de
Waal Malefyt et al. 2001). De plus, des Treg déficients en IL-10 sont tout à fait capables de
contrôler une gastrite auto-immune induite par la déplétion de Treg (Suri-Payer and Cantor
2001). Ceci souligne le rôle spécifique des molécules solubles en fonction du type de réponse
immune à contrôler.
Le TGF-ȕ est une autre cytokine immunosuppressive majeure. Ses fonctions en lien
avec le système immunitaire sont multiples. Il intervient notamment dans la maturation des
cellules dendritiques, la prolifération et la différenciation des LT, les fonctions cytotoxiques
des LT CD8+ et des NK. Dans le domaine des populations régulatrices, il participe à la
génération de novo de iTreg à partir de LT CD4+ Foxp3- périphériques (Chen, Kuchroo et al.
1994; Chen, Jin et al. 2003). Dans le modèle de la colite, l’expression d’un dominant négatif
du récepteur TGF-ȕRII par les LT CD4+ colitogènes a montré que ceux-ci doivent être
sensibles au TGF-ȕ pour être inhibés. L’origine du TGF-ȕ est encore aujourd’hui
controversée. Ainsi, dans le même modèle de colite, l’équipe de Powrie a montré que cette
cytokine n’était pas produite par les cellules régulatrices (Fahlen, Read et al. 2005) alors qu’à
l’inverse, le groupe de Flavell a montré qu’elles étaient à l’origine de cette production (Li,
Wan et al. 2007). En s’appuyant sur des marquages en cytométrie, Nakamura et al. ont émis
50
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
l’hypothèse que le TGF-ȕ produit se retrouverait adsorbé à la surface des Treg et serait
présenté à la cellule-cible par contact (Nakamura, Kitani et al. 2001). Ce concept est étayé par
le fait que le TGF-ȕ est sécrété sous une forme inactive qui doit être clivée pour acquérir son
activité biologique. Il a été récemment découvert que l'activation du TGF-ȕ par les cellules
dendritiques, impliquant l’intégrine Įvȕ8, est essentielle pour induire et/ou maintenir les Treg
et prévenir l'auto-immunité (Travis, Reizis et al. 2007). Chez les Treg, la molécule
équivalente a été identifiée comme la furine (Pesu, Watford et al. 2008).
L’IL-35, composée de deux chaînes, IL-12Į et IL-27ȕ, a rejoint l’IL- 10 et le TGF-ȕ
en tant que cytokines impliquées dans les fonctions des Treg (Travis, Reizis et al. 2007). Son
expression semble spécifique aux Treg, car l'expression de l'IL-27ȕ est régulée par Foxp3. En
son absence, les Treg sont incapables d'endiguer la prolifération homéostatique de LT
transférés dans un animal immunodéficient et de protéger la souris du développement de la
colite induite par transfert de LT naïfs dans des receveurs Rag1-/-. Par ailleurs, elle est la
seule cytokine dont le défaut est responsable de la perte de fonction suppressive vis-à-vis des
LT CD4+ in vitro (Vignali, Collison et al. 2008).
Figure 8. Mécanismes de
suppression des Treg.
Les Treg sont capables de
contrôler les populations T
effectrices (cellules vertes)
de plusieurs manières : en
induisant la mort cellulaire
(tête de mort), en déréglant
le
métabolisme,
en
sécrétant des cytokines qui
inhibent les Teff (sens
interdit), ou en empêchant
la maturation des CD.
Adapté de Sakaguchi 2008
Eur J Immunol.
51
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
II.4 Fonctions physiologiques et physiopathologiques
Les sous-chapitres précédents ont permis de mettre en avant le rôle crucial des Treg
dans l’homéostasie générale de l’organisme grâce à leur fonction physiologique principale : le
maintien de la tolérance périphérique au soi. Il existe d’autres situations physiologiques ou
physiopathologiques dans lesquelles les Treg vont jouer un rôle important. Ce rôle peut être
positif dans le cadre de la tolérance foeto-maternelle ou lors de la modulation des réponses
anti-infectieuses mais il peut être également néfaste dans le cadre de l’immunosurveillance
anti-tumorale (Figure 9).
Figure 9. Fonctions physiologiques et physiopathologiques des Treg.
Rôle des Treg en fonction du type de réponse immune contrôlée. Ces cellules préviennent
les réponses allogèniques (fœtus, greffe, GVH), les maladies auto-immunes, les réponses
allergiques, et limitent l’inflammation. En ce qui concerne les réponses anti-infectieuses,
l’effet des Treg est intermédiaire; en effet, il est bénéfique en limitant l’inflammation, en
prévenant un épuisement du système immunitaire. En revanche, les Treg peuvent avoir un
effet délétère en favorisant la persistance du pathogène. Enfin, les Treg ont un rôle néfaste
au cours des cancers en inhibant les réponses anti-tumorales.
II.4.a) Tolérance foeto-maternelle
La grossesse peut être comparée au succès d'une greffe semiallogénique naturelle.
Pour cela, le système immunitaire maternel assure la tolérance vis-à-vis de l'expression par le
fœtus d’alloantigènes paternels (Tafuri, Alferink et al. 1995). Le fœtus est protégé des
attaques du système immunitaire maternel par plusieurs mécanismes dont la barrière
transplacentaire (Le Bouteiller 2003) et l’expression de la molécule CD95L (Aluvihare,
52
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
Kallikourdis et al. 2005). En 2004, Aluvihare et al. ont montré, dans un modèle murin, qu’il y
avait de manière indépendante des alloantigènes, une expansion systémique du pool
périphérique de Treg maternels durant la période de gestation. Leur absence conduit à un
avortement chez la souris, qui correspond à un rejet immunologique du fœtus (Aluvihare,
Kallikourdis et al. 2004). Une autre équipe a observé chez la souris l’augmentation du
compartiment Treg durant la période physiologique de gestation (le niveau systémique des
estrogènes est élevé) ou lors d’un traitement à l’E2 (17-beta estradiol) (Aluvihare,
Kallikourdis et al. 2004). Ces données expliquent donc l’augmentation du nombre de Treg
circulants durant la grossesse et de plus, permettent de mieux comprendre le rôle protecteur de
l’E2 dans le développement de pathologies auto-immunes (Polanczyk, Yellayi et al. 2004).
Cependant, le mécanisme par lequel les Treg peuvent contrôler les alloantigènes paternels
reste mal compris. Il est possible que la fonction protectrice des Treg durant la grossesse soit
due au moins en partie à l’induction d’IDO par les Treg au niveau des cellules
trophoblastiques et des CPA (Munn, Zhou et al. 1998).
II.4.b) Modulation des réponses immunitaires anti-infectieuses
Lors d’une infection, le système immunitaire adaptatif se met en place. De nombreuses
cellules immunitaires sont recrutées et activées afin de protéger l’organisme. Durant cette
réponse, des réactions immunitaires dites croisées contre des antigènes du soi peuvent se
développer, et induire des pathologies auto-immunes. Afin d’éviter ces réponses délétères,
l’organisme a développé des mécanismes de contrôle dans lesquels les Treg Foxp3+ jouent un
rôle capital (Mills 2004). Un exemple bien documenté à ce jour est le cas de l’infection
gastro-intestinale bactérienne par Helicobacter hepaticus reponsable d'une inflammation
intestinale. Le transfert de LT CD4+ isolés à partir d’une souris IL-10-/- infectée par
Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- infectée par cette même bactérie permet le
contrôle de l’infection, mais se traduit par l’apparition d’une colite inflammatoire. Le transfert
de LT CD4+ totaux isolés à partir d’une souris WT infectée par Helicobacter hepaticus dans
une souris RAG-/- infectée par la même bactérie va également permettre le contrôle de
l’infection mais en induisant une réponse immunitaire contre le pathogène moins importante
et en évitant le développement de la colite. Ce travail montre l’importance de la génération
d’un pool de Treg spécifique de l’antigène qui va moduler la réponse immunitaire antibactérienne via un mécanisme dépendant de l’IL-10 (Kullberg, Jankovic et al. 2002). L’action
suppressive des Treg dans le contrôle de la réponse inflammatoire a depuis été décrite, dans
d’autres modèles infectieux tels les modèles d'infections par Pneumocystis carinii, Candida
53
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
albicans, Leishmania major, le virus de l’hépatite C et le virus de l’herpès (Belkaid and Rouse
2005).
Une conséquence de la modulation des réponses anti-infectieuses par les Treg va être
de prolonger la survie de l’agent infectieux dans l’organisme et même, dans certains cas, de
favoriser la persistance à long terme de l’agent pathogène. Ce phénomène, illustré par le
modèle murin d’infection par Leishmania major, va créer un nouvel état d’homéostasie pour
l’organisme. Ainsi, en 2002, Yasmina Belkaid et al. ont montré que la persistance de
Leishmania major au niveau de la peau de souris C57BL/6 après résolution de la phase
«aigüe» de l’infection était due à l’action endogène des LT CD4+CD25+ régulateurs. Au
cours du processus infectieux, les Treg s’accumulent au niveau du derme des souris infectées
et inhibent via des mécanismes dépendants et indépendants de l’IL-10 les réponses effectrices
des LT CD4+CD25- conventionnels visant à éliminer le parasite. Bien que l’activité
suppressive des Treg permette la survie du pathogène, ce mécanisme conduit à la persistance
des antigènes parasitaires en périphérie et à la mise en place d’une mémoire immunitaire
efficace en cas de réinfection par le même pathogène (Belkaid, Piccirillo et al. 2002). Depuis,
le groupe de Yasmina Belkaid a montré en 2006, dans ce même modèle, que c’était la
chimiokine CCR5 qui était responsable du recrutement des Treg au niveau du derme
infectieux (Yurchenko, Tritt et al. 2006). Ils ont de plus montré, après avoir réalisé des tests
fonctionnels ex vivo, que la majorité des Treg recrutés au niveau du derme de souris infectées
par Leishmania major étaient spécifiques des antigènes du parasite (Suffia, Reckling et al.
2006). Les Treg sont donc capables de réguler l’amplitude des réponses immunitaires
effectrices, évitant ainsi l’apparition de lésions tissulaires immunopathologiques aux dépens
toutefois d’un contrôle total de l’infection.
II.4.c) Effet délétère sur l’immunité anti-tumorale
Les réactions inflammatoires survenant au cours des cancers sont induites, à l'inverse
de ce qui est observé au cours des pathologies infectieuses, par des cellules du soi qui
subissent des divisions anarchiques et incontrôlées. L’origine endogène des tumeurs rend la
génération d’une immunité anti-tumorale difficile. Malgré l’existence d’antigènes tumoraux
(antigènes EBV dans certains lymphomes, des formes mutées de p53 dans certains
carcinomes épithéliaux, etc), correspondant à un "soi modifié", la mise en route d'une réponse
immunitaire antitumorale efficace est aléatoire du fait de nombreux mécanismes d’évasion au
système immunitaire. Les tumeurs en particulier génèrent un micro-environnement
suppresseur grâce à la production de cytokines aux propriétés immunosuppressives, telles
54
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
l’IL-10 (Salazar-Onfray 1999) et le TGF-ȕ (Li, Sanjabi et al. 2006; Li, Wan et al. 2007). Les
tumeurs sont également capables de sécréter des facteurs de croissance endothéliaux comme
le VEGF (Vascular endothelial growth factor) qui permet d’induire des processus de
néoangiogenèse favorisant la croissance tumorale. D’autre part, le VEGF, sécrété localement
par les cellules tumorales, inhibe la maturation des CD affectant ainsi l’activation locale des
LT (Gabrilovich, Chen et al. 1996).
Des travaux récents semblent montrer que l’obstacle majeur à la mise en place de
stratégies efficaces d’immunothérapie anti-tumorale est dû à la présence des Treg, contrôlant
l’activation des Tconv anti-tumoraux. L’élimination sélective des Treg par l’injection entre
autres, d’anticorps déplétants anti-CD25 et anti-FR4, favorise une diminution de la croissance
tumorale et le rejet de la tumeur (Zou 2006; Yamaguchi, Hirota et al. 2007). Les Treg
infiltrent massivement les tumeurs solides et leur nombre est considérablement augmenté au
niveau des ganglions lymphatiques drainant ces sites tumoraux. L’expansion périphérique de
la population de Treg se fait indépendamment du thymus au niveau des organes lymphoïdes
secondaires et ne requiert pas de prolifération cellulaire. Il s’agirait majoritairement d’une
conversion de LT CD4+CD25-Foxp3- en Treg CD4+CD25+Foxp3+ induite de manière
active par la tumeur (Valzasina, Piconese et al. 2006). En 2007, Liu et al. ont montré que
c’était le TGF-ȕ produit par les cellules tumorales qui induisait cette conversion de LT
CD4+CD25-Foxp3- effecteurs en Treg CD4+ CD25+ Foxp3+. Ils ont, de plus, montré que le
traitement des souris avec un anticorps bloquant anti-TGF-ȕ permettait d’inhiber ce processus
de conversion et d’induire une immunité anti-tumorale efficace (Liu, Wong et al. 2007). En
plus de la fonction jouée par le TGF-ȕ dans l’induction de Treg, le groupe de Zitvogel a
montré que, lors d’une réponse immunitaire anti-tumorale (après transferts adoptifs des
différents types cellulaires dans une souris nude), le TGF-ȕ produit par les Treg et fixé à leur
surface permettait d’inhiber les fonctions effectrices et cytotoxiques des NK vis-à-vis des
cellules tumorales (Ghiringhelli, Menard et al. 2005). Parallèlement, le groupe de Von
Boehmer a montré dans un modèle tumoral murin que les Treg inhibent la cytotoxicité des LT
CD8+ via la production de TGF-ȕ in vivo. En effet, l'activité cytotoxique des LT CD8+
exprimant un dominant négatif du TGF-ȕRII, insensibles à la signalisation induite par le TGFȕ, n'est plus inhibée par les Treg. Dans cette situation, le rétablissement de la cytotoxicité est
associé à un rejet de la tumeur (Chen, Pittet et al. 2005).
En accord avec ces travaux expérimentaux, l’impact des Treg sur l’immunité antitumorale en pathologie humaine est maintenant bien documenté (Zou 2006; Curiel 2007). En
2001, Woo et al. ont observé pour la première fois que des patients atteints de cancers des
55
Introduction, Chapitre II : Les lymphocytes T régulateurs Foxp3+
poumons et de cancers ovariens présentaient un nombre supérieur de Treg par rapport à celui
observé chez des individus sains (Woo, Chu et al. 2001). Depuis, de nombreux types de
cancers où la fréquence des Treg dans le sang est supérieure à celle observée chez un donneur
sain ont été référencés : cancer du sein, cancer colorectal, cancer œsophagien, mélanomes,
cancer pancréatique, leucémies, cancer du rein etc... Toutes les investigations cliniques
réalisées à ce jour dans ce domaine indiquent que ces Treg possédant des propriétés
suppressives in vitro sont un obstacle majeur à une réponse immunitaire anti-tumorale
efficace chez ces patients (Zou 2006).
Comprendre les mécanismes d’actions employés par les Treg dans l’inhibition des
réponses immunitaires anti-tumorales est un enjeu crucial dans la mise en place de stratégies
thérapeutiques anticancéreuses (Curiel 2007). L’IL-2 est une cytokine assurant la prolifération
des LT, elle est utilisée en thérapeutique humaine notamment chez des patients atteints de
tumeurs rénales ou de mélanomes afin de favoriser les réponses immunitaires anti-tumorales.
Cependant, seulement 7% des patients voient leur tumeur régresser. Une des raisons de ce
faible taux de régression est que l’IL-2 favorise l’expansion des Treg chez ces patients et de
ce fait la progression de la tumeur (Ahmadzadeh and Rosenberg 2006). L’expression
constitutive et forte de CD25 (chaîne Į du récepteur à l’IL-2) à la surface des Treg par rapport
aux LT conventionnels leur confère un avantage prolifératif. L’établissement de stratégies
thérapeutiques visant à inhiber de manière sélective les Treg spécifiques d’antigènes
tumoraux permettrait donc d’induire une réponse immunitaire efficace contre les tumeurs sans
pour autant risquer le développement de pathologies auto-immunes dues à une rupture de
tolérance (Curiel 2007).
Le rôle majeur des Treg dans l'homéostasie du système immunitaire est donc
maintenant bien établi. L'implication de déficits qualitatifs ou quantitatifs de ces cellules dans
la physiopathologie de nombreuses maladies offre de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans
cette optique, il est primordial de mieux connaître la biologie des Treg, leur développement et
leur mode de fonctionnement. Les modèles animaux de maladies auto-immunes représentent
un modèle de choix pour atteindre ces objectifs et offrent en particulier dans ce domaine la
possibilité d’étudier le contrôle génétique du développement thymique des Treg et de leurs
fonctions.
56
Chapitre III _ Dérégulation du système immunitaire : autoimmunité et allergie.
L’homéostasie du système immunitaire est primordiale pour la défense de l’organisme
contre des pathogènes extérieurs, mais aussi pour prévenir les réponses vis-à-vis du soi. La
dérégulation du système immunitaire mène à des réponses effectrices inadaptées, responsables
de diverses pathologies. Dans ce chapitre, nous aborderons deux exemples liés à un
comportement inadapté des cellules immunes. L’activation des lymphocytes spécifiques de
composant du soi provoque des maladies auto-immunes, telle que la sclérose en plaques. Les
allergies, en revanche, sont causées par des réponses exacerbées vis-à-vis d’antigènes
extérieurs, normalement non pathogènes, les allergènes.
III.1 Auto-immunité du système nerveux central : la sclérose en plaques
La prévalence des maladies auto-immunes dans la population générale est voisine de 6
à 7%. Ces maladies traduisent la rupture des mécanismes de tolérance immunitaire. Ceux-ci
contrôlent à l'état physiologique le niveau d'activation des LT et LB périphériques vis-à-vis
des autoantigènes exprimés par les tissus de l'organisme. Il existe une grande variété de
maladies auto-immunes selon la nature de l’autoantigène ciblé.
Une réponse auto-immune T dirigée contre des antigènes dérivés du système nerveux
central est responsable de différentes pathologies, telles que la sclérose en plaques (SEP), la
neuromyélite optique (maladie de Devic) ou l’encéphalomyélite aiguë disséminée. La SEP est
la plus courante de ces maladies, affectant plus d’un million de personnes à travers le monde.
C’est en 1838 que Carswell décrit pour la première fois, sur autopsie, les lésions de la moelle
épinière de la maladie. Mais ce n’est qu’en 1868 que le docteur Charcot, fondateur de la
neurologie moderne, donne une description des lésions observées dans la SEP et lui attribue
définitivement son nom. Il a été depuis établi que la SEP est une maladie auto-immune
inflammatoire du système nerveux central (SNC), responsable de la démyélinisation de la
substance blanche, ralentissant ainsi la transmission de l’influx nerveux.
Il est possible de distinguer plusieurs formes cliniques de SEP (Figure 10) : les SEP à
forme rémittente-récurrente (RR-MS) et les SEP progressives primaires (PP-MS). Ces deux
formes peuvent être considérées comme deux maladies à part entière car très hétérogènes sur
le plan radiologique, histologique et clinique (Lucchinetti, Bruck et al. 2000; Sospedra and
57
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Martin 2005). Notons que la RR-MS peut évoluer en forme progressive secondaire (PS-MS)
lorsque la maladie se stabilise pour suivre une évolution progressive et lente. La forme la plus
fréquente (85% des cas) est la forme RR-MS qui va présenter une évolution par poussées,
tandis que les 15% restants sont des formes PP-MS présentant une évolution plus linéaire de
la maladie (Vollmer 2007).
Figure 10. Différentes formes de SEP
A. Evolution de la maladie lors d’une SEP récurrente rémittente (RR-MS). Cette évolution se
caractérise par l’apparition de poussées, suivies de phases de rétablissement
B. Evolution de la SEP lors d’une forme progressive secondaire (PS-MS). Après l’évolution RR,
la dégradation neurologique se fait de façon progressive et lente.
C. Evolution de la maladie dans sa forme primaire progressive (PP-MS). Il y a une lente
détérioration de la situation neurologique sans poussées clairement identifiées.
III.1.a) Aspects épidémiologiques
Aujourd’hui, la SEP affecte environ 2,5 millions de personnes à travers le monde
(80 000 personnes en France). Chaque année, une moyenne de 120 personnes pour 100 000
habitants sont nouvellement diagnostiquées (Compston and Coles 2002). 70% des nouveaux
patients sont des personnes jeunes, ayant entre 20 et 40 ans. La SEP représente la cause
majeure de handicap dans cette tranche d’âge.
De façon similaire aux autres maladies auto-immunes humaines, les femmes sont plus
fréquemment touchées que les hommes dans la SEP, le ratio femme/homme est de 2/1. De
plus, plusieurs études à travers le monde suggèrent que, durant les 50 dernières années,
l’incidence de la maladie a augmenté (Barnett, Williams et al. 2003), cette augmentation étant
plus rapide chez les femmes (Wallin, Page et al. 2004; Orton, Herrera et al. 2006).
En 1938, Steiner fut l’un des premiers à noter l’existence d’un gradient de distribution
nord/sud. Actuellement, la prévalence de la maladie dans la population générale est de 60 à
200 patients atteints de SEP pour 100 000 personnes en Europe et en Amérique du nord, alors
58
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
que dans les zones de faible prévalence comme le Japon, la prévalence est environ 10 fois
moins importante (Rosati 2001).
Cependant, au sein d’un même pays et donc pour une même latitude, de fortes
variations de prévalence sont observées. Ainsi, la variation de la répartition géographique de
la SEP trouve probablement son explication dans l’association de facteurs environnementaux
et d’une susceptibilité génétique particulière. La SEP se développerait chez des personnes
génétiquement
susceptibles,
lorsqu’elles
sont
mises
en
présence
de
facteurs
environnementaux favorisants ou déclenchants.
III.1.a. i) Facteurs génétiques
Les formes familiales de SEP représentent environ 15 % des cas. Le risque relatif de
SEP est augmenté de 20 à 40 fois chez les apparentés du premier degré de patients par rapport
à la population générale (Sadovnick, Yee et al. 2000). Pour les demi-frères ou demi-sœurs, le
risque est significativement plus faible. Le risque de récurrence chez les enfants issus de
couples de parents atteints simultanément de SEP est 10 fois plus important que chez les
enfants dont un seul des parents est atteint. Enfin, il existe un degré de concordance plus élevé
chez les jumeaux monozygotes, aux alentours de 25 % contre 6 % chez les jumeaux
dizygotes. De plus, il existe une plus forte probabilité chez les patients SEP d’être atteints
d’autres maladies auto-immunes par rapport aux individus sains, c’est ce qu’on appelle le
clustering familial (Barcellos, Kamdar et al. 2006). Toutes ces données apportent clairement
les preuves d’une implication forte des facteurs génétiques dans la susceptibilité à la SEP.
Cette maladie fait parti des maladies auto-immunes complexes. Ces maladies sont
multigéniques, c'est-à-dire que plusieurs variations génétiques (peu soumises à une pression
de sélection) sont responsables de la prédisposition génétique à leur développement. Les
polymorphismes de ces gènes, pris individuellement, semblent n’avoir qu’un faible effet sur
la prévalence de la maladie. Ils pourraient agir soit indépendamment soit en épistasie
(Oksenberg, Baranzini et al. 2001).
Beaucoup d’efforts sont fournis pour identifier ces gènes de susceptibilité. Depuis
1973, il est reconnu que la présence de l’allèle HLA-DR2 confère une susceptibilité
importante à la SEP (Jersild, Ammitzboll et al. 1973). Ainsi, comme d’autres maladies autoimmunes (diabète de type 1, polyarthrite rhumatoide…), certains allèles du CMH sont
associés à la SEP (Jagodic, Colacios et al. 2009). Bien que la région du CMH soit la seule
région du génome conférant un risque majeur dans le développement de la SEP, il est
59
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
également clair que d’autres variants génétiques contribuent à la susceptibilité de la maladie.
Durant ces deux dernières années, au moins 16 gènes autres que le CMH ont été identifiés
comme étant associés à la SEP. Ils peuvent être classés comme gènes immunologiques,
neurologiques ou gènes n’ayant aucun lien évident avec la maladie (Fugger, Friese et al.
2009). La majorité des gènes immuns concernés codent pour des protéines importantes dans
l’activation des LT tels que les récepteurs à l’IL-2 et l’IL-7, la transduction du signal tel que
la tyrosine kinase 2 (TYK2), pour des cytokines tels que l’IL-10 et l’IL-12 ou pour des
molécules d’adhésion telles que CD58 et CD226. Cependant, l’implication de beaucoup
d’entre eux n’a pas été confirmée (Figure 11). Il faut par ailleurs noter que de tels variants
génétiques associés à la maladie ne sont pas nécessairement des causes, mais peuvent être
simplement des marqueurs de la maladie.
Figure 11. Les principaux gènes associés à la susceptibilité à la SEP.
Les gènes associés à la SEP ont été classés en fonctions du nombre et du type d’études où ils ont été
identifiés. Les variants identifiés sont indiqués ainsi que la fonction protéique principale mise en
cause. Le risque conféré est donné en Odds ratio, qui est défini comme le risque d’un individu d’avoir
la maladie associé à un variant génétique donné, comparé à un individu qui n’a pas ce variant. Adapté
de Fugger et al. 2009, Nat. Rev. Immunol.
Bien que la génétique ait un poids important dans le contrôle de la susceptibilité à la
SEP, elle n’explique pas tout. Le niveau de concordance chez les jumeaux monozygotes n'est
60
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
que de 25%, ce qui suggère l’intervention de facteurs environnementaux, comme le proposait
Steiner, dès 1938.
III.1.a.ii) Facteurs environnementaux
L’influence d’un ou plusieurs facteurs environnementaux sur la susceptibilité à la SEP
a été envisagée suite aux résultats obtenus par des études de migration de population entre des
pays de prévalence différente. Ces études montrent que les adolescents migrant avant l’âge de
15 ans acquièrent la prévalence du pays d’accueil, contrairement aux migrants adultes qui
conservent la prévalence du pays d’origine, suggérant un facteur environnemental
particulièrement
important
lors
de
l’adolescence
(Marrie
2004).
Si
les
études
épidémiologiques ont contribué à apporter des arguments en faveur du rôle de facteurs
environnementaux, elles n’ont cependant mis en évidence aucun agent spécifique associé à la
SEP. Ces dernières années, trois principaux facteurs environnementaux ont été identifiés, une
infection par le virus Epstein-Barr (EBV), un manque de vitamine D, et le tabac (Ascherio
and Munger 2007; Giovannoni and Ebers 2007; Ascherio and Munger 2008).
Figure 12. Principaux facteurs de risque
La SEP résulte d’interactions complexes entre des facteurs environnementaux et des facteurs
génétiques. Les principaux facteurs sont représentés sur ce schéma.
Infections virales et SEP ?
En accord avec les études de migrations, il est probable qu’un agent infectieux soit
impliqué durant l’enfance, bien avant le développement de l'auto-immunité (James 1988). Il
existe des observations suggérant un lien entre le développement d’une infection et
l’apparition ou l’exacerbation de maladies auto-immunes telles que la SEP (James 1988;
61
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Gilden 2005). La recherche d’un agent infectieux se poursuit depuis plus de 20 ans, sans
conclusions formelles.
Le virus d’Epstein-Barr est le candidat principal. Bien que la quasi-totalité de la
population mondiale soit infectée par ce virus, la comparaison des patients SEP à des
personnes témoins, montre des différences entre les deux groupes. Presque 100% des patients
SEP sont infectés par le virus alors que « seulement » 90% des personnes saines pour la SEP
sont séropositives à l’EBV (Ascherio and Munger 2007). Cette différence est encore plus
marquée chez les enfants, comme l’a montré une étude des formes infantiles de SEP (Pohl,
Krone et al. 2006). La mononucléose infectieuse aigüe est la manifestation clinique d’une
infection aigüe par l’EBV. Il est intéressant de noter que la SEP et la mononucléose partagent
des distributions géographiques de prévalence similaire (Ascherio and Munger 2007). Une
méta-analyse de l’association entre la SEP et la mononucléose infectieuse révéla un risque
relatif 2,3 fois plus élevé de développer la SEP chez les personnes ayant eu une manifestation
clinique, par rapport à des personnes infectées de manière silencieuse par le virus (Thacker,
Mirzaei et al. 2006). Ainsi, le risque de SEP serait presque nul pour les personnes non
infectées par le virus ; il serait intermédiaire pour les personnes infectées par l’EBV durant
leur enfance (infection silencieuse), et deviendrait important chez les personnes infectées
durant leur adolescence ou à l’âge adulte (manifestation de mononucléose virale) (Pohl 2009).
Bien que l’EBV soit l’agent pathogène privilégié dans l’hypothèse d’une implication
virale, d’autres pathogènes ne peuvent pas être exclus. Ces dernières années, l’éventuelle
implication du virus herpétique humain 6 (HHV6) a été proposé (Wilborn, Brinkmann et al.
1994). Ce virus, en partie neurotrope (Braun, Dominguez et al. 1997), pourrait être un des
agents possibles de la SEP. En effet, il a été mis en évidence une corrélation entre le taux
d’IgM anti-HHV-6 et l’exacerbation des signes cliniques ainsi que l’apparition de la maladie
(Lighvani, Frucht et al. 2001; Soldan, Fogdell-Hahn et al. 2001; Villoslada, Juste et al. 2003).
Notons que, dans toute ces études, on ne peut pas formellement exclure que les associations
observées soient les conséquences plutôt que les témoins d'agents causaux de la maladie.
Reste encore la question de l’événement déclenchant. Une hypothèse pour la survenue
de cette pathologie est le « mimétisme moléculaire », où des LT activés par des antigènes
étrangers au soi, réagissent contre des antigènes du soi (Oldstone 1998; Fairweather, Kaya et
al. 2001; Ohashi 2002; Gronski, Boulter et al. 2004). Ceci s’explique par la ressemblance
entre, d’une part, l'épitope d'un agent pathogène et d’autre part, l'épitope d'un autoantigène.
62
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
La vitamine D et le tabac, deux agents impliqués dans la susceptibilité de la SEP.
La recherche de facteurs de risques environnementaux non infectieux s'est développée.
Deux agents ressortent des nombreuses études, la vitamine D et le tabac.
Chez l’homme, la source majeur de vitamine D provient de sa synthèse dans la peau,
provoquée par l’exposition au soleil (UVB) (Holick 2008). Le manque de vitamine D est un
probable facteur de risque pour la SEP (VanAmerongen, Dijkstra et al. 2004; Kantarci and
Wingerchuk 2006; Kimlin 2008). Le possible rôle de la vitamine D dans la SEP repose en
premier lieu sur l'influence de la latitude sur la prévalence de la SEP (Gale and Martyn 1995).
Il a été montré que l’exposition lumineuse qui est fonction de la latitude affecte directement le
taux sérique de vitamine D (Holick 2008). Il existe une corrélation inverse entre la prévalence
de la SEP et l’exposition à la lumière du soleil (van der Mei, Ponsonby et al. 2001). Par
ailleurs les femmes ont généralement un niveau sérique de vitamine D plus faible que les
hommes (Yetley 2008), et une forte concentration sanguine en vitamine D est associée à un
risque moindre de développer une SEP (Munger, Levin et al. 2006). Enfin, des études
pratiquées sur des populations dont l’alimentation comprenait des aliments naturellement
riches en vitamine D (Finlandais, Inuits) suggèrent que ce facteur alimentaire pourrait
expliquer la faible incidence de la SEP dans ces populations (Ebers 2008). En conclusion
l'ensemble de ces observations suggère fortement un lien entre le niveau de vitamine D et le
développement de la SEP.
Le principal effet biologique de la vitamine D est transmis par son récepteur (VDR)
appartenant à la superfamille des récepteurs aux stéroïdes. Ce récepteur est exprimé dans
différentes cellules du SNC, mais aussi du système immunitaire telles les monocytes, les CPA,
ou les lymphocytes activés. L'activation du récepteur régule la transcription de nombreux
gènes des cellules immunes impliqués dans leur prolifération et leur différenciation. Il a été
montré que la vitamine D a des effets anti-inflammatoires caractérisés par la réduction de
l'expression des molécules de CMH-II, des molécules de co-stimulation, et des cytokines proinflammatoires dans les monocytes ou les CPA. (Smolders, Damoiseaux et al. 2008). Une
autre étude a mis en évidence que la vitamine D inhibe la polarisation des LT CD4+ vers un
profil cytokinique Th1 (IFN-Ȗ et TNF-Į) (Muthian, Raikwar et al. 2006) et favorise la
polarisation vers un profil cytokinique Th2 (IL-4, IL-5 et IL-13) (Boonstra, Barrat et al.
2001). Notons que chez des patients atteints de SEP, la vitamine D pourrait favoriser le
développement de Treg produisant de l’IL-10 et du TGF-β (Correale, Ysrraelit et al. 2009).
63
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Le rapport entre la consommation de tabac et la SEP reste controversé, certaines
études montrant une association (Pekmezovic, Drulovic et al. 2006), d'autres non (Casetta,
Granieri et al. 1994). Le tabac contient une multitude de composés qui peuvent expliquer une
susceptibilité accrue à la SEP, mais aussi la progression plus rapide de la maladie chez les
fumeurs. Certains de ces composés sont connus pour avoir un effet neurotoxique. C’est le cas
en particulier de l’oxyde nitrique (NO). Il est connu que fumer augmente le niveau de NO
plasmatique (Zhou, Yan et al. 2000). Il est raisonnable de penser que cette augmentation se
fait aussi au niveau du SNC où se situent les lésions de démyélinisation. Dans le SNC, les
neurones sont des cellules très sensibles à la présence de NO (Kapoor, Davies et al. 2003). Le
NO peut ainsi conduire à une dégénérescence axonale ou à un blocage du signal électrique.
Par ailleurs, il est établi que certains composés du tabac affectent le système immunitaire
(Arnson, Shoenfeld et al. 2010), la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE)
(Hawkes 2007) et favorisent les infections virales et bactériennes (Stampfli and Anderson
2009), facteurs pouvant jouer un rôle dans la susceptibilité à la SEP.
III.1.b) Physiopathologie de la maladie : apport des modèles animaux à la
compréhension de la maladie humaine
La séméiologie de la SEP est extrêmement polymorphe. Ceci tient au caractère
disséminé des lésions qui peuvent toucher toutes les structures myélinisées du système
nerveux central. Il y a tout de même une prédilection pour les structures les plus myélinisées,
à savoir le nerf optique, le tronc cérébral, la moelle… Le malade peut ressentir des troubles
sensitifs, c’est-à-dire des fourmillements, des sensations d’engourdissement des membres ou
de la face. Parfois, une baisse de l’acuité visuelle, des déficits moteurs peuvent survenir, ainsi
que des troubles de l’équilibre, accompagnés d’une grande fatigue.
III.1.b.i) L’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle de SEP.
Pour mieux comprendre le développement et la physiopathologie de la SEP, des
modèles animaux et notamment des modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale
(EAE) ont été développés chez le rat et la souris.
L’EAE peut être induite activement ou passivement chez certaines souches de rats ou
de souris (Mason 1991; Swanborg 2001).
L’induction active de la maladie consiste à administrer par voie sous-cutanée chez
l’animal susceptible un homogénat de moelle épinière ou des antigènes de la myéline
64
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
dit « encéphalitogènes » émulsionnés en adjuvant de Freund complet (CFA). Les protéines
de la myéline les plus couramment utilisées sont la protéine basique de la myéline (MBP), la
protéine protéolipidique (PLP), la glycoprotéine oligodentrocytaire de la myéline (MOG), ou
des peptides immunodominants dérivés de ces protéines. L’induction et l’évolution aiguë ou
chronique de l’EAE dépendent de trois facteurs : la souche de l’animal, l’antigène et
l’adjuvant utilisé. Les rats LEW, par exemple, développent une maladie monophasique 10
jours après l’immunisation avec la MBP. La maladie dure 5 à 6 jours. Ultérieurement les
animaux deviennent résistants à une deuxième immunisation avec le même antigène. En
revanche, cette résistance n'est pas observée si la deuxième immunisation est effectuée avec
un antigène de la myéline différent comme la MOG (Johns, Kerlero de Rosbo et al. 1995). Par
ailleurs, alors que l’immunisation à l'aide d'adjuvant complet de Freund (contenant une
suspension de mycobactéries) induit l’EAE, l'utilisation d’adjuvant incomplet de Freund
(dépourvu de mycobactéries) ne permet pas d'induire la maladie, mais induit, au contraire, un
état de tolérance en activant des populations lymphocytaires suppressives.
Il est également possible d’induire l’EAE passivement, en injectant, par voie
intraveineuse ou intrapéritonéale, à un receveur syngénique sain des lymphocytes T
encéphalitogènes. Ces lymphocytes sont issus de la rate ou de ganglions d’un animal
syngénique préalablement sensibilisé, puis stimulés in vitro avec le même antigène que celui
qui a servi pour la sensibilisation. Une maladie similaire à l’EAE active, aussi bien au niveau
des signes cliniques qu’histologiques, se développe environ vers le quatrième jour après le
transfert.
Les études réalisées dans ces modèles ont contribué de manière décisive à une
meilleure compréhension de la pathogenèse de la SEP (Hemmer, Cepok et al. 2002).
III.1.b.ii) Auto-immunité et SEP
Il existe des évidences quant à l’implication de l’auto-immunité dans la SEP : un lien
évident du CMH de classe II avec la susceptibilité génétique (Oksenberg and Hauser 2005),
une action bénéfique de certains médicaments immuno-modulateurs ou immunosuppresseurs
(Horga, Castillo et al. 2010), ou encore la présence de nombreuses cellules immunitaires
spécifiques d’antigènes dans le SNC (Fletcher, Lonergan et al.). En effet, chez les patients, on
retrouve des anticorps dirigés contre des constituants de la myéline, en particulier MOG
(glycoprotéine de la myéline et de l'oligodendrocyte), PLP (protéine protéolipidique) et MBP
(protéine basique de la myéline) (Link, Baig et al. 1990). Les LT effecteurs spécifiques de la
MBP de la PLP et de la MOG sont également retrouvés dans le sang et le liquide céphalo65
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
rachidien des patients atteints de SEP (Link, Baig et al. 1990). Ces observations confortent le
rôle pathogène de l’auto-immunité dans la SEP (Lundmark, Duvefelt et al. 2007).
III.1.b.iii) Différentes étapes de la SEP au niveau cellulaire
Le CNS est protégé par un endothélium composé de cellules endothéliales reliées entre
elles par des jonctions serrées : c’est la barrière hémato encéphalique ou BHE. Cette barrière
anatomique isole la substance grise du reste de l'organisme. Ainsi, en situation normale, les
LT ne peuvent pas traverser cette BHE.
L’enchaînement des différents phénomènes qui conduisent aux lésions du SNC semble
être le suivant. Le consensus général est que la SEP débute par la formation de lésions
inflammatoires aiguës, caractérisées par la rupture de la BHE. Le passage de molécules
sécrétées ou de cellules immunitaires activées en périphérie est alors possible. Des LT
spécifiques d’auto-antigènes du SNC sont présents dans le sang périphérique d’individus sains
(Liblau, Tournier-Lasserve et al. 1991). Ces lymphocytes auto-réactifs, potentiellement
dangereux, restent normalement inactifs. La rupture de tolérance provoque l’inhibition du
contrôle de ces cellules auto-agressives. Celles-ci, une fois activées sont capables de traverser
la BHE. A ce stade, les LT autoréactifs rencontrent des CPA résidentes, telles que les cellules
microgliales, qui présentent l’antigène. Ceci va conduire les LT à produire des cytokines et
des chimiokines pro-inflammatoires. Ce contexte inflammatoire va induire l’expression de
molécules d’adhésion à la surface de l’endothélium et provoquer ainsi un recrutement massif
de cellules immunitaires dans le SNC. Ces cellules sont responsables de la destruction locale
de la gaine de la myéline. En effet, des lymphocytes spécifiques de la myéline sont activés
chez des patients atteints de SEP alors qu’ils sont inactifs chez des contrôles sains
(Bieganowska, Ausubel et al. 1997).
III.1.b.iv) Les acteurs cellulaires de la formation et du développement des lésions
Bien que les LT CD8+ soient la sous-population prépondérante de LT trouvée dans les
lésions cérébrales de patients SEP (Junker, Ivanidze et al. 2007), il est établi que les LT CD4+
sont les principaux acteurs pathologiques. Depuis de nombreuses années, l’activation de LT
CD4+ spécifiques d’antigènes du SNC et leur différenciation en Th1 étaient connues pour être
cruciales dans le développement de la SEP. Cette théorie largement acceptée était fondée sur
l’étude de modèles murins développant l’EAE (Sospedra and Martin 2005). Ces cellules
provoquent des dommages à la myéline de manière directe grâce à des cytokines
66
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
proinflamatoires, ou bien de manière indirecte en recrutant d’autres cellules immunes tels que
les LB, les macrophages et les cellules NK (Zappulla, Arock et al. 2002; Marik, Felts et al.
2007).
Le rôle fonctionnel accordé aux Th1 dans l’EAE a été reconsidéré depuis la
découverte d’une nouvelle sous-population de LT CD4+, les Th17 (Korn, Bettelli et al. 2009).
Ainsi, l’inflammation serait plutôt induite par cette sous-population Th17, capables de
sécréter de l’IL-17 sous le contrôle de l’IL-23. L’IL-17 et l’IL-22, sécrétées par les Th17
seraient impliquées dans l’ouverture de la BHE (Kebir, Kreymborg et al. 2007), permettant
l’entrée des lymphocytes auto-réactifs, vis-à-vis d’antigènes de la myéline, dans le SNC
(Tzartos, Friese et al. 2008). En effet, la BHE chez les patients atteints de SEP exprime
fortement les récepteurs à l’IL-17 et l’IL-22, et la fixation de leur ligand augmente la
perméabilité de la barrière. Les Th17 pourraient alors recruter d’autres cellules impliquées
dans la réponse inflammatoire conduisant à la destruction de la myéline et/ou directement tuer
les neurones par l’intermédiaire de Granzyme B ou d’autres enzymes cytosoliques (Kebir,
Kreymborg et al. 2007). Des débats sont apparus quant au rôle de l’IL-17 dans l’EAE (Haak,
Croxford et al. 2009), mais une expression élevée de l’IL-17 a été détectée dans les cellules
dérivées du CSF de patients atteints de SEP (Matusevicius, Kivisakk et al. 1999) et une
augmentation significative de LT CD4+ et CD8+ producteurs d’IL-17 a été observée dans des
lésions cérébrales de ces patients (Tzartos, Friese et al. 2008), suggérant un rôle clef de cette
cytokine dans la pathologie. Notons que les LT CD4+ et LT CD8+ chez les patients
expriment l’IL-17, alors que dans l’EAE et les contrôles sains, seuls les LT CD4+
l’expriment. Au total, l’ensemble de ces données suggère fortement que les Th17 jouent un
rôle crucial dans la physiopathologie de l’EAE et de la SEP, sans pour autant exclure le rôle
des Th1 (Figure 13).
De manière intéressante, il a été montré que les LT auto-réactifs isolés de patients
atteints d’une maladie auto-immune ont un seuil d’activation plus faible que les LT d’un sujet
sain. Par ailleurs, les LT CD4+ auto-réactifs de ces patients présenteraient une sensibilité
moindre à l’apoptose via la surexpression d’une molécule de signalisation : l’arrestine bêta 1
(Shi, Feng et al. 2007). Ces deux phénomènes pourraient s’associer pour favoriser la présence
et le développement de la population de LT auto-réactifs chez les patients, en comparaison des
sujets sains.
67
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Figure 13. Physiopathologie de la SEP
Apres s’être activés et différenciés dans les organes lymphoïdes secondaires, les cellules Th17 autoréactives migrent dans les vaisseaux sanguins. L’expression du récepteur CCR6 leur permet de
migrer à travers la BHE (1). Une fois dans le SNC, les cellules se réactivent au contact de la microglie,
et sécrètent des cytokines pro-inflammatoires qui vont commencer à dégrader la gaine de myéline, et
des cytokines, chimiokines et métalloprotéases qui vont favoriser la perméabilité de la BHE (2). Des
cellules du système immunitaire migrent à travers la BHE (3), s’activent et se différencient en fonction
des cytokines présentent dans le milieu (4). Les Th2 sécrètent de l’IL-4 et de l’IL-5 qui vont activer les
LB et favoriser leur différenciation en plasmocytes producteurs d’anticorps auto-spécifiques. Les Th1
et Th17 secrètent des cytokines pro-inflammatoires qui participent à la destruction de la gaine de
myéline. Enfin, des TCD8 sont capables de s’activer au contact des astrocytes via les molécules
d’HLA-I et participent à la démyélinisation (5). Les cellules de la microglie participent également à
cette destruction. Adapté de Noseworthy et al. New England Journal of Medicine, 2000.
Au rôle des cellules de l’immunité adaptative, s’ajoute celui des cellules du système
immunitaire inné (microglies, mastocytes…). Ces cellules pourraient aussi jouer un rôle dans
68
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
la progression de l’inflammation via la production de composés réactifs de l’oxygène ou
l’implication de récepteurs membranaires de mort cellulaire (Sospedra and Martin 2005).
III.1.b.v) Le rôle des Treg dans l’EAE et la SEP
Une altération des mécanismes d’immuno-régulation peut mener à un enrichissement
en cellules auto-réactives, et éventuellement à des maladies auto-immunes telles que la SEP.
Bien qu’une dérégulation immunitaire ait été décrite quelques fois chez des patients atteints
de SEP, la plus importante avancée dans ce domaine a été faite dans les années 1990, lors de
la découverte des Treg.
Les premières évidences expérimentales quant au rôle des Treg dans l’EAE découlent
de travaux où ces cellules sont éliminées grâce à un anticorps anti-CD25. La déplétion de ces
Treg augmente la sévérité et la mortalité de la maladie lors d’une immunisation avec de la
PLP (Zhang, Koldzic et al. 2004). De plus, le transfert adoptif de Treg confère une protection
significative contre l’EAE induite par immunisation avec de la MOG (Kohm, Carpentier et al.
2002). Dans ce modèle, la population des Th1 auto-réactifs redevient normale, alors que la
population. Enfin, l’infiltration du SNC est diminuée. Ces travaux apportent la preuve d’un
rôle des Treg dans cette maladie, mais ne permet pas de comprendre leur mécanisme d’action.
Chez l’homme, une étude publiée en 2004, rapporte un défaut fonctionnel des LT
CD4+CD25+ isolés du sang circulant de patients atteints de RR-MS (Viglietta, Baecher-Allan
et al. 2004). Les Treg de patients atteints de SEP possèdent une capacité inhibitrice vis-à-vis
des cellules effectrices 3 fois inférieure aux Treg de sujets sains. Depuis, d’autres travaux ont
confirmé et complété ces résultats (Haas, Hug et al. 2005; Venken, Hellings et al. 2006). Par
contre, les patients atteints de SP-MS ont des Treg parfaitement fonctionnels, suggérant une
possible restauration des fonctions dans les phases tardives de la maladie (Venken, Hellings et
al. 2006).
Pour compléter les études fonctionnelles de cette population régulatrice, l’expression
de Foxp3 a également été évaluée chez des patients SEP. Le niveau de Foxp3 a été mesuré par
RT-PCR ou western blot, et ces études ont souligné une plus faible expression de Foxp3 chez
les patients RR-MS comparés aux contrôles sains et aux patients SP-MS (Tejada-Simon, Zang
et al. 2003; Huan, Culbertson et al. 2005; Venken, Hellings et al. 2006). Cependant, la
diminution d’expression de Foxp3 peut être le reflet d’une réduction de fréquence de cellules
Foxp3+ parmi les CD4+CD25+, ou bien le reflet d’une diminution de l’expression de Foxp3
au niveau cellulaire. Venken et son équipe ont répondu à cette interrogation en faisant des
analyses en cytométrie de flux sur des groupes de patients SEP, de patients atteints d’autres
69
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
maladies neuro-dégénératives, et de sujets sains (Venken, Hellings et al. 2008). Ces résultats
confirment une différence dans le nombre de LT CD4+CD25+Foxp3+ dans le sang des
patients RR-MS et des sujets sains. De plus, ils ont pu mettre en évidence une plus faible
expression de Foxp3 (au niveau cellulaire) chez ces mêmes patients RR-MS, ce qui évoque la
possibilité d’une dysfonction des Treg chez ces patients. Enfin, ces mêmes auteurs soulignent
une accumulation de Treg dans le liquide céphalo-rachidien des patients RR-MS, qui pourrait
être le témoin d’une réaction visant à réguler négativement une inflammation locale du SNC
de ces patients.
Des études récentes, utilisant le marqueur CD127 pour purifier les Treg vont à
l’encontre des travaux précédents (Michel, Berthelot et al. 2008). En effet, selon les auteurs,
les Treg CD4+CD25+ contiennent des Tconv CD4+CD25+CD127high, qui vont rendre les
résultats des tests d’inhibition de prolifération inexacts. Lorsque les auteurs purifient les Treg
CD4+CD25highCD127Low, ils ne montrent pas de différences de proportion ni de fonction des
Treg entre des patients atteints de SEP et des individus sains (Michel, Berthelot et al. 2008).
De plus, ces travaux soulignent le rôle pathogène des CD4+CD25highCD127high dans la
pathogénèse de la SEP. En effet, ces cellules proliféreraient plus et sécrèteraient plus de
cytokines pro-inflammatoires chez les patients atteints de SEP comparés à des patients atteints
de l’Herpes virus (Michel, Berthelot et al. 2008).
Les travaux récents de Fletcher et al. ont mis en avant l’importance d’une souspopulation de Treg Foxp3+CD39+ dans la SEP. Ils ont dans un premier temps montré la
capacité des Treg CD39+ à contrôler la sous-population Th17, et ont de plus constaté que les
Foxp3+CD39- produisaient de l’IL-17. Les auteurs ont observé une diminution de quantité de
ces Treg CD39+, et une diminution de leur pouvoir de contrôle sur les Th17 chez les patients
SEP (Fletcher, Lonergan et al. 2009). Ces travaux sont particulièrement intéressants pour des
visées thérapeutiques. Le transfert de la population CD39+ dépourvue des Treg Foxp3+CD39productrice d’IL-17 devrait être plus efficace que le transfert de la population Treg Foxp3+
totale pour traiter les patients atteints de la SEP.
III.2 Maladies allergiques
III.2.a) Généralités
L’atopie se définit comme la prédisposition génétique à devenir sensibilisé et à
produire des anticorps de classe IgE en réponse à l’exposition à des allergènes (Johansson and
70
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Lundahl 2001). C’est sur ce terrain qu’apparaissent, sous l’effet de facteurs d’environnement
(allergènes), l’asthme allergique, la dermatite atopique (DA, eczéma infantile) et la rhinite
allergique (rhume des foins) qui sont les trois facettes de ce qu’il est convenu d’appeler la
« marche atopique ». Les personnes atopiques sont ainsi caractérisées par des taux sériques
élevés d’IgE, à la fois totales et spécifiques d’allergènes. La prévalence des maladies
allergiques a augmenté de façon importante dans le monde occidental depuis les années 1960
conduisant certains auteurs à utiliser le terme d’état épidémique. Aujourd’hui, plus de 10%
des enfants des pays « du nord » sont atteints d’asthme et 20% souffrent de DA dans certains
pays. Il est aujourd’hui admis que le mode de vie occidental et la société de consommation
sont reliés à l’augmentation de la prévalence des maladies allergiques poussant de nombreux
groupes à chercher à identifier les facteurs environnementaux responsables de ces effets.
Parmi ceux-ci, l’alimentation et la sédentarisation ainsi que l’hygiène et la pollution qui
caractérisent notre société font figure de candidats majeurs (Devereux 2006).
Le développement des maladies allergiques repose sur un fort déterminisme génétique.
La première étude visant à identifier les loci et les gènes responsables de l’atopie a été réalisée
à la fin des années 80. Depuis, un grand nombre de travaux ont permis de mettre en évidence
le caractère complexe de l’état atopique avec l’identification de plusieurs loci et voies
physiopathologiques impliqués. Enfin, il faut noter que si certaines études estiment à 30% la
proportion de la population présentant un caractère atopique, tous ne vont pas développer de
maladies allergiques, ce qui suggère que les forts taux d’IgE sont plus un facteur de risque
important qu’un agent causatif. Ces dernières années plusieurs travaux ont montré un rôle
critique des épithéliums et de leur fonction de barrière dans le développement des symptômes
allergiques (Holgate, Roberts et al. 2009).
L’atopie et les maladies allergiques répondent donc à la définition des phénotypes et
pathologies multifactorielles, résultant d’interactions multiples et complexes entre différents
facteurs environnementaux et plusieurs gènes.
III.2.b) Développement de l’atopie : production des IgE
Les IgE sont les médiateurs majeurs des mécanismes impliqués pendant la phase
initiale des maladies allergiques. Ces immunoglobulines se lient aux mastocytes, présents
dans la peau et les muqueuses, grâce aux récepteurs Fc à haute affinité (FcİRI). La
pénétration d’allergènes spécifiques des IgE à travers les surfaces épithéliales induit le
pontage des récepteurs FcİRI. Ce phénomène peut se dérouler dans les différents organes
71
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
cibles de l’allergie : les poumons (asthme allergique), la peau (dermatite atopique), ou le nez
(rhinite) et induit en quelques minutes la dégranulation des mastocytes et la synthèse de
médiateurs lipidiques. Cette réaction d’hypersensibilité de type I correspond à la phase
précoce de la réaction allergique (Turner and Kinet 1999). Les cytokines et les chimiokines
produites lors de la phase précoce vont être responsables de l’initiation de la phase tardive en
permettant le recrutement et l’activation d’autres cellules parmi lesquelles des éosinophiles et
des lymphocytes Th2, qui constituent les infiltrats inflammatoires allergiques.
Les lymphocytes Th2 sont au cœur de l’atopie et des maladies allergiques (Figure 14).
En effet, les signaux nécessaires pour la commutation isotypique des LB, mais de façon plus
générale pour leur activation complète, sont fournis par les LT CD4+ et dépendent à la fois de
médiateurs solubles et d’interactions cellulaires. Ce processus implique que pour qu’un LB
puisse produire des Ac spécifiques d’un antigène donné, un LT CD4+ spécifique du même
antigène ait été au préalable activé. Quand un LB naïf reconnaît un antigène via son BCR
(IgM membranaire), l’antigène est internalisé puis présenté sous forme peptidique par les
molécules de CMH II aux lymphocytes auxiliaires. L’interaction avec une cellule TH de
même spécificité conduit à la mise en place d’une synapse immunologique facilitant les
contacts moléculaires entre des protéines membranaires et la sécrétion polarisée de cytokines
vers la cellule cible. Comme vu précédemment, les cytokines nécessaires dans la production
des IgE sont l’IL-4 et l’IL-13 qui sont les cytokines signatures des Th2. Ces cellules
expriment également CD154 (CD40 Ligand) et sont donc parfaitement qualifiées pour induire
la commutation isotypique vers les IgE. De façon cohérente, des polymorphismes dans les
molécules GATA-3, le facteur de différenciation clé des Th2, ont été associés au
développement de l’asthme et au niveau sérique des IgE (Pykalainen, Kinos et al. 2005).
72
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Figure 14. Mécanismes mis en jeu dans l’atopie
(1) Les allergènes sont capturés par les cellules dendritiques et présentés aux LT naïfs. (2) Les
cytokines présentes dans le milieu favorisent une différenciation en Th2 qui sécrètent de l’IL-4,
nécessaire pour la production d’IgE par les LB différenciées (3) Les IgE spécifiques des allergènes se
lient aux récepteurs de haute affinité (FcİRI) exprimés par les mastocytes. (4) La fixation des
allergènes induit une activation des mastocytes, (5) qui libèrent dans le milieu des médiateurs de
l’inflammation.
III.2.a) Les facteurs génétiques dans l’atopie et les maladies allergiques
Des polymorphismes géniques associés à l'atopie et aux maladies allergiques ont pu
être identifiés par différentes approches : (i) gène candidat, approche fondée sur les études
fonctionnelles réalisées chez l'homme et les modèles expérimentaux, (ii) analyse de liaison et
clonage positionnel, approche fondée sur la localisation d'une région chromosomique
contrôlant un phénotype allergique et (iii) études d'association sur l'ensemble du génome,
approche systématique faisant appel aux techniques de génotypage à haut débit (Vercelli
2008). Ces polymorphismes peuvent être schématiquement regroupés en trois groupes.
(1) Le premier groupe de gènes est impliqué dans l'initiation de la réponse immunitaire
et l'induction de la réponse adaptative. Il touche les cellules de l'immunité innée et en
particulier les cellules dendritiques. Ainsi l'inflammation allergique et la production d'IgE sont
modulées par des polymorphismes dans les gènes codant pour des PRR comme CD14
(Baldini, Lohman et al. 1999), les TLR 2, 4, 6 et 10 (Werner, Topp et al. 2003; Eder,
Klimecki et al. 2004; Tantisira, Klimecki et al. 2004) et les NLR Nod1 et Nod2 (Hysi,
73
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Kabesch et al. 2005). Des variants des cytokines immunorégulatrices IL-10 et TGF-ȕ
influencent également la susceptibilité à l'allergie (Hobbs, Negri et al. 1998). Enfin à la
frontière entre l'immunité innée et adaptative, les molécules de CMH II sont associées à la
réponse IgE spécifique d'allergènes (Shiina, Inoko et al. 2004).
(2) Le second groupe comprend des gènes importants dans la différenciation Th2 et les
fonctions effectrices lymphocytaires, pour exemple, des variants de GATA-3 (Pykalainen,
Kinos et al. 2005), IL4 (Hysi, Kabesch et al. 2005), IL-4RĮ (Loza and Chang 2007), STAT6
(Hysi, Kabesch et al. 2005) ont été associés à l'atopie et à l'allergie. Les variants de ces gènes
peuvent modifier le niveau d'expression des ARNm ou l'activité biologique des protéines. En
accord avec le rôle critique de la voie Th1 dans le contrôle de la différenciation et des
fonctions effectrices des Th2, les gènes TBX21 (qui code pour T-bet) et IL12ȕ (qui code pour
la sous unité IL12p40) sont également liés au caractère allergique (Morahan, Huang et al.
2002; Tantisira, Klimecki et al. 2004). Enfin le gène MS4A2 (ou encore FCER1B) qui code
pour la chaîne B du récepteur FceR1 a été associé par plusieurs groupes indépendants à la
susceptibilité à l'asthme allergique (Shirakawa, Li et al. 1994).
(3). Le troisième groupe est composé de gènes intervenant dans les fonctions des
épithéliums avec en premier lieu le rôle de barrière. La filaggrine est une protéine contenue
dans les kératinocytes de la couche granuleuse qui permet l'arrangement des filaments de
kératine et participe à la formation de l'enveloppe cellulaire de la couche cornée. Le gène de
cette protéine qui participe à la fonction de la barrière cutanée appartient au complexe de
différenciation épidermique du chromosome 1q21. Des mutations de la filaggrine ont été
mises en évidence de façon significative dans les cas de DA, d'asthme et d'atopie. Les enfants
porteurs d'une mutation présentent un risque augmenté de développer une DA. En revanche,
en l'absence de DA, la présence de mutations n'est pas associée à un risque d'asthme (Morar,
Cookson et al. 2007). La protéine SPINK5 dont certaines mutations sont responsables du
syndrome de Netherton est un inhibiteur de protéase à sérine qui joue un rôle important dans
le contrôle des processus de desquamation de l'épiderme (Descargues, Deraison et al. 2005).
Des mutations de cette protéine ont été associées à l'asthme et l'eczéma (Walley, Chavanas et
al. 2001).
L'épithélium joue également un rôle important dans l'initiation des réponses immunes
en produisant, en réponse à des agressions, des chimiokines et des cytokines qui permettent le
recrutement et l'activation des cellules de l'immunité innée. Les gènes codant pour les
protéines CCL5, CCL11, CCL24 et CCL26, qui sont de puissants agents contrôlant la
74
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
migration des éosinophiles, ont tous été impliqués dans la susceptibilité aux maladies
allergiques (Vercelli 2008).
Figure 15. Principaux facteurs de risque
L’atopie repose sur des facteurs environnementaux et génétiques représentés sur ce schéma.
III.2.b) Rôle de l’environnement dans l’allergie
L’augmentation de l'incidence des maladies allergiques dans les pays occidentaux
durant les dernières décades a conduit certains épidémiologistes à proposer l’hypothèse
hygiéniste. Selon cette hypothèse, moins les enfants sont exposés à des infections durant leur
premières années, plus ils sont susceptibles de développer des maladies allergiques. Les
données épidémiologiques sur lesquelles repose cette théorie montrent une incidence réduite
de sensibilisation allergique parmi les enfants ayant de nombreux frères et sœurs, à l'origine
de nombreuses infections au cours des premières années de vie. Il existe une corrélation
inverse entre l'incidence des maladies allergiques et, non seulement la taille de la fratrie, mais
aussi d'autres indicateurs de l'exposition à des pathogènes au cours de l'enfance, comme le
respect de règles d'hygiène élémentaires et les vaccinations (Kramer, Heinrich et al. 1999).
Les fondements immunologiques de l'hypothèse de l'hygiène semblent être un développement
inapproprié des réponses Th2 du fait de moindres réponses Th1 en rapport avec une
exposition insuffisante aux microorganismes de l'environnement.
III.2.c) Treg et allergies
Le syndrome IPEX encore appelé XLAAD (X-linked Auto-immunity and Allergic
Dysregulation), dû à une mutation invalidant le gène Foxp3, s'accompagne de manifestations
allergiques, avec un eczéma sévère, des taux sériques élevés d'IgE, une éosinophilie et des
75
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
allergies alimentaires (Chatila, Blaeser et al. 2000; Wildin, Ramsdell et al. 2001). Les Treg
contrôlent donc non seulement le développement des maladies auto-immunes, mais aussi
celui de l’allergie. Il est établi que les Treg suppriment les propriétés inflammatoires et les
capacités des CD à activer les Tconv, et rendent les CD tolérogènes (Wing, Onishi et al.
2008). De plus, les Treg suppriment directement l’activation des Th2 spécifiques des
allergènes, et donc réduisent la production des cytokines mises en jeu dans la phase effectrice
de la réaction allergique. Ces cellules agissent également au niveau des mastocytes,
basophiles et éosinophiles en les inhibant. Les Treg peuvent aussi bloquer l’influx des Tconv
vers les tissus enflammés, et ceci de manière dépendante des cytokines (Ring, Schafer et al.
2006). Les Treg agissent aussi directement sur les LB en inhibant leur production d’IgE et en
favorisant la production d’IgG4 (Meiler, Klunker et al. 2008). Enfin il a été montré dans un
modèle murin que les Treg spécifiques d’antigène suppriment l’inflammation du poumon
dirigée par les Th17, avec pour conséquences la suppression du recrutement des LB et la
diminution des concentrations des IgA et des IgM dans les voies respiratoires (Jaffar, Ferrini
et al. 2009) (Figure 16).
Deux études indépendantes mettent en évidence un défaut de régulation des réponses
Th2 par les Treg de patients atopiques (Grindebacke, Wing et al. 2004; Ling, Smith et al.
2004). Ce défaut de régulation pourrait être une conséquence d'un problème fonctionnel des
cellules Treg, d'une résistance des Tconv Th2 aux mécanismes régulateurs ou d’un
déséquilibre du rapport Treg/Tconv dû à une diminution du nombre des Treg ou a une plus
grande proportion de cellules effectrices CD4+CD25+ étudiée. En accord avec l'hypothèse
hygiéniste, des infections fortes et répétées seraient nécessaires à la mise en place efficace du
compartiment Treg. Les modèles murins montrent la nécessité de stimulations répétés afin de
générer des cellules régulatrices (Apostolou and von Boehmer 2004). Notons qu’une étude
récente montre l’association d’un polymorphisme de Foxp3 avec le développement de
manifestations allergiques durant l’enfance (Bottema, Postma et al. 2010).
Au total, les mécanismes cellulaires à l’origine des maladies allergiques dans un
contexte génétique prédisposant (atopie) pourraient mettre en jeu une diminution des
cytokines Th1 couplée à une déficience des Treg, suite à des infections microbiennes réduites
dans l'enfance.
76
Introduction, Chapitre III : auto-immunité et allergies
Figure 16. Implication des Treg dans le contrôle des maladies allergiques
Les Treg sont impliqués dans divers mécanismes permettant d’empêcher les réponses immunes
dérégulées dirigées contre des allergènes. D’après Palomares, Eur J. Immunol 2010.
L'hétérogénéité des populations génétiques et la variabilité des facteurs d'environnement rend
difficile l'identification des gènes responsables de maladies multifactorielles telles que les
maladies immunes. L'utilisation de modèles murins permet de contourner ces difficultés
(lignées pures génétiquement homogènes, environnement contrôlé). La connaissance des
régions de synténie des génomes humains et animaux permet l'application des résultats
expérimentaux à l'Homme. C'est cette approche qui a été suivie dans le laboratoire en utilisant
le modèle des rats BN-LEW. Le chapitre suivant décrit les grandes lignes de cette approche et
les caractéristiques des modèles d’EAE et d'atopie qui ont été étudiés chez les rats LEW et
BN.
77
78
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
Chapitre IV_Déterminisme génétique des maladies multifactorielles
Les maladies multifactorielles résultent d’interactions complexes entre des facteurs
environnementaux et des facteurs génétiques. Les facteurs environnementaux sont très
variables : conditions climatiques, alimentaires, exposition à des produits toxiques ou à divers
agents infectieux. Les facteurs génétiques, quant à eux, sont par définition multiples et
peuvent varier en fonction de l'origine des populations. Ainsi, la sensibilité à une même
maladie sera différente chez deux individus distincts, du fait d’une combinatoire de plusieurs
gènes spécifiques à chaque individu. De plus, cette maladie se déclenchera et évoluera sous
l'effet de facteurs d'environnement, également différents. Dans ces conditions l'identification
des gènes de susceptibilité à une maladie donnée est extrêmement difficile en pathologie
humaine. L'enjeu est pourtant majeur compte tenu de l'importance en santé publique des
maladies multifactorielles. C'est le cas en particulier des maladies immunes qui touchent 20%
de la population. Le développement des techniques de génotypage, de séquençage à haut débit
et des méthodes d'analyse bioinformatique, permettront certainement dans l'avenir des progrès
importants dans l'identification des gènes des maladies multifactorielles.
Le recours aux modèles animaux reste de nos jours, et restera certainement dans
l'avenir, indispensable pour identifier des gènes et comprendre le fonctionnement des voies de
signalisation auxquelles ils appartiennent dans les cellules et l'organisme entier. La
compréhension de la physiopathologie des maladies multifactorielles est une étape majeure
dans le développement de mesures de prévention et de thérapeutiques innovantes. C'est cette
stratégie qui est suivie dans le laboratoire et qui est présentée ci-dessous.
IV.1 Intérêt des modèles animaux
Du fait du développement des méthodes de génomique comparative, la connaissance
des régions de synténie entre les génomes humains et ceux des organismes modèles (souris,
rats, singes) permet d’envisager l’application des résultats expérimentaux à la pathologie
humaine. Les avantages des modèles animaux sont multiples :
- l’utilisation de souches consanguines (homozygotes) élimine les problèmes liés à
l’hétérogénéité génétique ;
- l’environnement des animaux est contrôlé, ce qui minimise l’effet de ce facteur sur le
phénotype étudié ;
79
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
- le grand nombre d’individus à chaque génération grâce à la possibilité des croisements ; et le
grand nombre d’animaux dans chaque expérience permet une étude statistique afin d’obtenir
des résultats significatifs.
- la stratégie de clonage positionnel et les méthodes de génomiques fonctionnelles permettent
l’identification formelle du gène dans la pathologie ;
-
les
modèles
animaux
permettent
ensuite
de
comprendre
les
conséquences
physiopathologiques des variants identifiés et les mécanismes par lesquels ces variants
modulent la sensibilité à la maladie ;
- ils permettent ensuite de développer et de tester les nouvelles approches thérapeutiques
éventuellement issues de ces nouvelles connaissances
En pratique deux étapes expérimentales sont essentielles pour identifier les gènes de
contrôle des maladies (Lagrange and Fournie 2010). La première est une analyse de liaison
réalisée le plus souvent dans une population de rats ou de souris hybrides de deuxième
génération. Cela permet d'identifier les loci de caractères quantitatifs (QTL – quantitative trait
locus), c'est-à-dire de localiser les gènes de contrôle dans des intervalles de 10-40 cM. La
deuxième étape est la dissection génétique de ces loci, réalisée à l'aide d'une collection de rats
ou souris congéniques. Elle permet d'affiner la localisation du ou des gènes de contrôle dans
des intervalles de l'ordre ou inférieur à une Mb. Ces intervalles ne contiennent plus en
moyenne que 10-20 gènes, et l'identification, parmi ces gènes, de celui ou de ceux
responsable(s) du contrôle, fait alors appel à des techniques de génomique fonctionnelle
rendues possibles du fait du petit nombre de gènes à étudier. Ce sont ces deux étapes que nous
détaillons ci-dessous.
IV.1.a) Identification de QTL
La primo-détection de QTL passe par la mise en place de dispositifs expérimentaux.
En croisant deux souches consanguines homozygotes P1 et P2, on obtient une population F1
dans laquelle les individus sont tous génétiquement identiques (hétérozygotes pour l’ensemble
du génome). Ainsi, tous les descendants F1 issus du croisement d’une souche P1 homozygote
M1Q1/M1Q1 avec une souche P2 homozygote M2Q2/M2Q2 sont hétérozygotes
M1Q1/M2Q2.
C’est en seconde génération de croisement que la co-ségrégation des allèles du
marqueur M au QTL Q peut être observée. Les dispositifs expérimentaux pour un premier
balayage de tout le génome diffèrent selon l'utilisation des animaux F1. Les plus fréquemment
utilisés sont les cohortes d’animaux hybrides de deuxième génération F2. Ils sont issus
80
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
d’intercroisements d’individus F1 ou d’animaux issus de croisement en retour (« backcross ») entre des animaux F1 et une des deux lignées parentales ayant permis la génération
des F1.
IV.1.a.i) L'intercroisement (croisement F2)
Les croisements entre souches consanguines constituent en pratique des dispositifs de
référence pour la détection de QTL dans les espèces modèles. Une souche est considérée
comme consanguine quand, à partir d’un couple ancestral, elle a fait l'objet au moins 20
générations de croisements frère-sœur. L’utilisation de ces lignées fixées évite les problèmes
de l’hétérogénéité génétique. De plus, le choix des souches parentales peut être réalisé en
fonction du caractère étudié. L’utilisation d’espèces modèles, telles que le rat ou la souris,
permet d’avoir à disposition des cartes génétiques très denses en marqueurs et/ou en gènes.
Toutes ces caractéristiques, contribuent à rendre les études génétiques plus faciles à partir
d’animaux consanguins que chez l’homme. Elles expliquent ainsi la mise en œuvre de
nombreux modèles expérimentaux d’études de pathologies humaines à caractère complexe
(Encinas, Weiner et al. 1996).
IV.1.a.ii) Le rétrocroisement ou back cross de première génération (BC1)
Après production d’une génération F1, les animaux sont croisés en retour sur une des
populations parentales, désignée population receveuse ou “parent récurrent” afin d’obtenir
une population BC1 (back-cross de première génération). En prenant pour parent récurrent, le
parent récessif P1, la moitié des descendants BC1 produits sont homozygotes M1Q1/M1Q1 et
la moitié sont hétérozygotes M1Q1/M2Q2. On comparera les moyennes du niveau
d’expression du phénotype d’intérêt des individus M1M1 et des individus M1M2.
La population back-cross permet de comparer au QTL le génotype homozygote récessif
(Q1Q1) avec le génotype hétérozygote (Q1Q2). L’effet estimé du QTL correspond à la
différence entre la moyenne de l’hétérozygote Q1Q2 et celle de l’homozygote Q1Q1. Mais si
le rétrocroisement est effectué sur le parent homozygote dominant Q2Q2, il n’y a plus de
différence de phénotype chez les individus BC1 puisque chacun d’eux possède au moins un
allèle dominant Q2.
Lorsqu’il y a dominance/récessivité entre les deux allèles du QTL, le protocole backcross, réalisé sur le parent homozygote récessif (Q1Q1), est plus puissant que le protocole F2
81
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
pour détecter des QTL. Le nombre de descendants nécessaire pour estimer la dominance dans
un protocole back-cross est alors deux fois moins important que dans un protocole F2.
Un premier balayage de tout le génome permet donc de mettre en évidence un certain nombre
de QTL. En effet, quel que soit le croisement utilisé, des QTL sont presque toujours détectés.
Le passage à l’étape suivante, à savoir la cartographie fine des QTL, est plus délicat. Suite au
premier balayage du génome, les intervalles de confiance des QTL détectés sont importants
(de l’ordre de 20 à 40 centiMorgans en moyenne). Il existe différents dispositifs permettant
d’aboutir à une réduction de la zone de localisation des QTL détectés lors d’une primodétection. Certains d’entre eux sont décrits dans le chapitre suivant.
IV.1.b) Localisation fine de QTL
Les programmes dits de "primo-détection" s’avèrent en général très fructueux.
Cependant la localisation d’un QTL dans un intervalle de l’ordre de 20 à 40 cM contenant
plusieurs centaines de gènes ne permet pas d’aborder l’étape de l’identification du gène
(Wenderfer, Slack et al. 2000). La précision de la localisation des QTL est limitée par le
nombre d'événements de recombinaison survenus dans la population étudiée. Augmenter la
taille de la population F2 ou BC1 d'une part et la densité de marqueurs d'autre part, permet
d'améliorer la précision de la localisation d'un QTL, mais cette méthode a ses limites et un
coût souvent rédhibitoire. De plus, les résultats obtenus ces dernières années montrent que les
effets génétiques mis en évidence dans le cadre des programmes de détection de QTL sont
souvent dus à un ensemble de gènes localisés dans un même QTL. Ce type d'observation a été
fait en particulier dans les modèles murins de diabète, de lupus ou d’épilepsie (Legare,
Bartlett et al. 2000). Par ailleurs, les effets d’un QTL peuvent varier en fonction de la forme
allélique d’un autre gène situé sur un autre locus (épistasie) (Fijneman, de Vries et al. 1996).
Les limites des programmes de primo-détection de QTL évoquées ci-dessus soulignent
l'intérêt d'une localisation plus précise des QTL. Cet objectif devient une nécessité si l'on
cherche à identifier le ou les gènes responsable(s). Les approches utilisables, que ce soit le
clonage positionnel ou la recherche de candidats positionnels, ne sont en effet envisageables
qu'au sein de programmes de cartographie fine de QTL où la résolution est proche d’1 Mb.
Les procédures qui permettent de diminuer l’intervalle de localisation d’un QTL se basent sur
le principe de la dissection génétique du chromosome (GCD: Genetic Chromosome
Dissection), méthode proposée à l’origine par des généticiens dont le modèle d’étude était la
drosophile. Ainsi, l’information apportée par l’étude des marqueurs génétiques est utilisée
pour construire des chromosomes recombinants au niveau de régions d’intérêt spécifique. Le
82
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
QTL est attribué à telle ou telle région spécifique en fonction des effets quantitatifs exprimés
par les différentes lignées recombinantes. Dans la grande majorité des cas, cette méthode de
cartographie fine utilise l'accumulation des événements de recombinaison au cours des
générations, qui se traduit par une réduction de la taille des fragments de chromosomes en
déséquilibre de liaison. Il convient par ailleurs de noter que, contrairement à la primodétection, la cartographie fine de QTL est une approche ciblée, limitée le plus souvent à une
région unique du génome (ou quelques régions en cas d'interactions de gènes). Elle implique
un choix préalable, qui n'est ni trivial ni anodin, des régions du génome à étudier de façon
prioritaire. Elle nécessite également de disposer de réseaux denses de marqueurs dans les
régions étudiées.
IV.1.c) Identification du ou des gène(s) d’intérêt
IV.1.c.i) Les lignées congéniques
Les lignées congéniques ou lignées quasi-isogéniques (NIL=Nearly Isogenic Line)
sont obtenues à partir d'une souche consanguine pour laquelle une région chromosomique a
été remplacée par celle d'une autre souche consanguine. L’intervalle d’un QTL d’une souche
donneuse est introduit dans une souche receveuse sous le contrôle de marqueurs (Marker
Assisted Selection :M.A.S.) à l’aide de croisements en retour successifs, effectués sur la
souche receveuse. Le génotypage de marqueurs au niveau de la région d’étude permet
d’identifier les animaux porteurs de la région à introduire et de les sélectionner comme
parents de la génération suivante. Par cette méthode dite “classique”, la sélection des animaux
pour le croisement en retour suivant s’effectue uniquement au niveau de la région d’intérêt. Il
est en général nécessaire d’effectuer une dizaine de générations de croisements en retour
successifs, suivi d’un croisement consanguin pour obtenir des animaux congéniques. La
production de ces lignées nécessite alors 3 à 4 ans.
83
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
receveur
Donneur
Souches
parentales
consanguines
X
c
Hybride F1
X
Croisement et retour
de l'individu F1 sur la
souche receveuse
X
Croisement en
retour succesifs
(6>n>8)
Selection
assistée par
marqueur
X
Inter-croisement
Frère-soeur
Lignée congéniques
(individus homozygotes)
Figure 17. Génération de lignées congéniques.
Les lignées congéniques sont obtenues à partir d'une souche consanguine (jaune) dans laquelle une
région chromosomique est remplacée par celle provenant d'une autre souche (bleue). Ainsi, l'intervalle
de localisation d'un QTL provenant d'une souche donneuse est introduit dans le génome de la souche
receveuse. A partir d'une population F1, plusieurs croisements en retour (BC ou backcross) sont
effectués avec la souche receveuse. A chaque génération sont sélectionnés les descendants ayant
hérité de la région d’intérêt à l'état hétérozygote et ayant la plus forte proportion du génome receveur
pour tout le reste du génome. Entre 6 et 8 (génome receveur =99.99%) croisements en retour suivi
d'un croisement frère-sœur sont nécessaires pour obtenir une lignée congénique par le protocole «
speed congenics ».
Pour produire plus rapidement ces lignées, Wakeland et coll. ont proposé d’utiliser un
protocole de M.A.S. étendu à l’ensemble du génome. Il s’agit de la stratégie de “Speed
Congenics” (Wakeland, Morel et al. 1997) (Figure 17). Elle permet de sélectionner les
descendants ayant hérité de la région d’intérêt à introduire et ayant la plus forte proportion du
génome receveur pour tout le reste du génome (fond génétique). La production de lignées
congéniques par cette méthode est plus rapide que par la méthode classique. Elle permet de
diminuer le nombre de générations nécessaires pour l'obtention des lignées congéniques. Une
lignée congénique pure diffère de la souche parentale uniquement aux environs du QTL. En
pratique, il est nécessaire de disposer de marqueurs répartis sur l’ensemble du génome, pour
84
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
vérifier la pureté du terrain génétique d’une lignée congénique. Une couverture du génome
par 200 marqueurs répartis de manière homogène est en pratique suffisante; elle permet de
vérifier que, statistiquement, la pureté du fond génétique de la lignée obtenue est au moins
égale à 99.5%.
IV.1.c.ii) Les sous-lignées ou lignées congéniques spécifiques d'un intervalle (ISCS)
Les lignées congéniques spécifiques d'un intervalle (ISCS: Interval-Specific Congenic
Strain) sont obtenues en recherchant des individus recombinants dans l'intervalle de
localisation du QTL. L’objectif est d’obtenir un sous-ensemble de lignées congéniques
présentant des recombinaisons régulièrement réparties dans l'intervalle de localisation du
QTL. Ainsi les ISCS permettent d’obtenir des animaux recombinants à des endroits différents
au sein d’un même QTL et donc de restreindre l’intervalle de localisation du QTL en
éliminant les zones n’ayant aucun effet sur le phénotype (Figure 18).
Les sous-lignées sont produites à partir d’une lignée congénique qui sera rétrocroisée
avec la souche receveuse. Les animaux recombinants sélectionnés seront intercroisés (frèresœur) pour obtenir des animaux homozygotes. Les ISCS peuvent également être produites à
partir d’un croisement entre deux lignées congéniques. Darvasi a proposé cette stratégie
expérimentale pour cartographier un QTL dans un intervalle de 1 cM (Darvasi 1997). Pour
atteindre cette résolution, il est nécessaire de disposer d’une carte génétique à haute densité en
marqueurs dans la région du QTL.
La dissection génétique à l’aide de lignées et sous lignées congéniques est une
approche puissante pour identifier les gènes impliqués dans les modèles animaux de maladies
multifactorielles humaines. Ceci permet d'entreprendre des études chez l'homme sur les gènes
orthologues.
85
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
Lignée
Souche
congénique receveuse
F1
X
1cM
F1
X
BC
F2
1/2
1/4
1/4
BC puis
croisement
frère-sœur
sous-lignées
congéniques
homozygotes
Génotypes
recombinants
(§2%)
Figure 18. Génération de sous lignées congéniques
Un croisement de rats F1 (congénique x parent) permet l'obtention d'une population F2 dans laquelle
des individus recombinants dans la région d'intérêt peuvent être sélectionnés par génotypage. Un
croisement en retour ou back cross (BC) de ces rats avec la souche parentale permet d'obtenir des
rats hétérozygotes mâles et femelles porteurs d'un intervalle réduit de la région d'intérêt. Des
croisements frère-sœur de ces rats conduisent à l'établissement de sous-lignées congéniques.
IV.2 Le modèle BN-LEW
Le modèle des rats BN-LEW est un modèle de choix, sans équivalent chez la souris
pour l'étude des maladies immunes (Bernard, Fournie et al. 2010; Lagrange and Fournie
2010). Ces deux souches s'opposent quant à l'orientation des réponses immunes et à leur
sensibilité vis-à-vis des maladies immunes. Le rat LEW, prédisposé à développer des
réponses T de type Th1, est sensible aux maladies auto-immunes dites spécifiques d'organe,
telle l’EAE, modèle de SEP. Par contre il est résistant aux désordres immunopathologiques de
type Th2. Inversement, le rat BN prédisposé aux réponses T de type Th2, est sensible aux
maladies allergiques et aux désordres induits par les sels d'or ou de mercure mais est résistant
à l'EAE.
Dans le modèle BN-LEW, nous avons suivi la stratégie classique pour identifier les
gènes de contrôle de la réponse IgE et de l'EAE.
86
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
IV.2.a) Réponse IgE – loci Aiid (Atps-induced immunological disorders)
Comme décrit précédemment, la prédisposition génétique à développer des réponses
IgE exagérées, appelée atopie, joue un rôle majeur dans les maladies allergiques. Les IgE
déclenchent en effet les réactions d’hypersensibilité vis-à-vis d’allergènes chez les patients
allergiques (Ishizaka and Ishizaka 1971). Nous avons utilisé le modèle de la maladie induite
chez le rat BN par injections de sels d'or ou de mercure.
L’injection chronique de sels d’or induit, chez le rat BN, une splénomégalie et une
hypertrophie de toutes les chaînes ganglionnaires. Ces dernières sont associées à une
activation polyclonale des lymphocytes B liée à la génération de LT auto-réactifs anti-classe
II du CMH. Cette activation des cellules B s’accompagne d’une augmentation considérable
des concentrations sériques d'IgE (Tournade, Guery et al. 1991) de la production d’autoanticorps dirigés en particulier contre la laminine et l'ADN, et d'une néphropathie). Cette
pathologie est transitoire puisque les rats BN sont capables de réguler définitivement les
désordres immunopathologiques induits par les sels d’or au bout de 5 semaines environ. Ils
sont ensuite résistants à toute réinjection. Plusieurs études réalisées dans un modèle proche de
celui des sels d’or, le modèle du mercure, ont montré que les Th1 et les LT CD8+ jouent un
rôle dans la phase de régulation de la maladie et dans la résistance à la réinduction de la
maladie (Mathieson, Stapleton et al. 1991). Au contraire, les rats LEW sont résistants au
développement de ces manifestations (Tournade, Guery et al. 1991). Ils présentent une
activation polyclonale B mais qui est différente de celle observée chez les rats BN. En effet,
chez les rats LEW, les injections de sels d'or ou de mercure n'ont pas d'effet significatif sur les
concentrations sériques d'IgE, et les taux d'autoanticorps induits par ces injections sont bien
plus faibles que ceux observés chez les rats BN. Notons que dans le modèle mercuriel, les rats
LEW présentent une augmentation du nombre de LT CD8+ ainsi qu’une immunosuppression
induite par des Treg (Pelletier, Pasquier et al. 1988).
Dans le modèle des sels d’or, l’équipe a identifié trois loci de susceptibilité appelés
Aiid1, Aiid2 et Aiid3 (ces loci ont été récemment re-baptisés Iresp1, Iresp 2 et Iresp 3 –Iresp:
Immune Response). Iresp1, sur le chromosome 20 contrôle la cinétique de la réponse IgE, et
en partie le taux d’auto-anticorps anti-ADN et les dépôts glomérulaires dans les artérioles. Ce
locus contient la région du CMH, molécule associée à la susceptibilité à développer de
nombreuses maladies auto-immunes que ce soit chez le rat, la souris ou l’homme, en
particulier l’EAE chez les rongeurs, et la SEP chez l’homme. Iresp2, sur le chromosome 10 et
Iresp3 sur le chromosome 9 (c9) contrôlent la concentration des IgE sériques, la production
87
Introduction, Chapitre IV : génétique des maladies multifactorielles
d'auto-anticorps anti-laminine et les dépôts glomérulaires d'IgG. Iresp2 comprend le "cluster"
des gènes de cytokines dont plusieurs gènes candidats comme l’IL-4, IL-5, IL-13 ou encore
l'IRF-1 (IFN regulatory factor-1) (Frazer, Ueda et al. 1997). Chez, l’homme, ce "cluster" est
localisé sur le chromosome 5 en 5q31 et a été associé à l'atopie (Munn, Zhou et al. 1998).
Chez la souris, un locus contrôlant l'équilibre Th1/Th2 in vitro a été décrit dans la région
synténique de Iresp2, sur le chromosome 11 (Guler, Gorham et al. 1999). Les études
ultérieures ayant montré que parmi ces trois loci, Iresp3 jouait un rôle prépondérant (Mas,
Cavailles et al. 2004), c'est sur ce locus que nous avons centré les recherches.
IV.2.b) Encéphalomyélite auto-immune expérimentale – loci Eae
A l'époque où nous avions localisé Atps3, le groupe de Tomas Olsson (Stockholm) avait,
dans une cohorte de rats F2 (DAxBN), identifié en tête du c9 un QTL (Eae4) contrôlant la
sensibilité du rat DA (Dark Agouti) à l'EAE (Dahlman, Jacobsson et al. 1999). Ayant posé
l'hypothèse que la même région et peut être le même gène pouvait contrôler la sensibilité du
rat BN à l'atopie et celle du rat LEW (et DA) à l'EAE, nous avons poursuivi les études sur
l'EAE dans les lignées congéniques que nous avions créées pour réaliser la dissection
génétique de Atps3. Les études réalisées dans notre équipe devaient rapidement montrer
qu'effectivement Eae4 co-localisait parfaitement avec Atps3.
Les résultats présentés ont été à la base de mon travail de thèse.
88
+\SRWKqVHVHW2EMHFWLIV
+\SRWKqVHVHW2EMHFWLIV
L'objectif général des recherches de notre équipe est d'identifier les gènes et les
mécanismes mis en jeu dans le développement des maladies immunes.
La co-localisation de plusieurs loci qui contrôlent la susceptibilité à des maladies
d’origine immune (autoimmunité, allergie) dans une région chromosomique relativement
petite nous a conduits à émettre l'hypothèse suivante : la région chromosomique télomérique
du chromosome 9 du rat contient un gène ou un ensemble de gènes exerçant un effet majeur
sur le contrôle des réponses immunes et leur orientation vers un phénotype de type Th2 ou
Th1. Cette hypothèse se trouvait renforcée par les études menées en parallèle dans notre
équipe, qui avaient montré que la même région contrôlait le niveau d'expression de l'isoforme
CD45RC de la phosphatase CD45 à la surface des LT CD4+ et LT CD8+ (locus Cec1 rebaptisé Cdexp1 -CD45RC expression on CD4 and CD8 T cells) (Subra, Cautain et al. 2001;
Xystrakis, Cavailles et al. 2004). Cette isoforme permet de séparer chacune des populations
CD4 et CD8 en deux sous-populations exprimant CD45RC soit faiblement (CD45RClow) soit
fortement (CD45RChigh). Ces phénotypes "low et high" sont associés avec des profils
cytokiniques et des fonctions différentes. La sous-population CD45RClow produit
préférentiellement les cytokines de type 2, en particulier l'IL-4 mais aussi l'IL-10 et contient
entre autre, les Treg. La sous-population CD45RChigh exprime préférentiellement les
cytokines de type 1, en particulier l'IFN-γ, et exerce des fonctions effectrices ou cytotoxiques.
Sur la base de ces travaux antérieurs de l'équipe, mon travail de thèse a eu les objectifs
suivants :
(1) Réaliser la dissection génétique de la région Eae4/Atps3/Cdexp1 afin de localiser avec
précision le ou les gènes de contrôle. Pour cela une collection de lignées réciproques
BN.LEW et LEW.BN, congéniques pour différents segments de cette région, a été
créée.
(2) Etudier les mécanismes mis en jeu pour le contrôle des phénotypes étudiés et en
particulier rechercher si la région étudiée contrôle le profil cytokinique et/ou la
population ou les fonctions des lymphocytes Treg chez les rats BN et LEW.
(3) Identifier le ou les gène(s) et leurs mécanismes d'action cellulaire.
89
±•—Ž–ƒ–•
Résultats
ARTICLE 1 : Un rôle pour VAV1 dans l’EAE et la SEP.
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique
qui résulte d’interactions complexes entre les facteurs génétiques et les facteurs
d’environnement.
L’hétérogénéité
des
populations
et
la
variabilité
des
facteurs
environnementaux rendent difficile la caractérisation des gènes impliqués dans la SEP. Les
modèles murins apportent des avantages majeurs permettant de contourner ces difficultés.
Des études antérieures sur une population hybride de deuxième génération de rats
BNxDA avaient permis au groupe de Tomas Olsson d’identifier un locus de contrôle de
l’Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale, un modèle animal de la SEP, à l’extrémité
du chromosome 9 (nommé Eae4).
La génération de lignées de rats de fond génétique LEW, congéniques pour cette
région du chromosome 9 d'origine BN, a permis de montrer qu’Eae4 contrôlait aussi la
susceptibilité à l'EAE chez le rat LEW et de réduire la taille de ce locus à environ 1 cM. Des
résultats similaires ont été obtenus avec les rats congéniques de fond génétique DA. L’étude
du profil cytokinique des LT CD4+ a montré qu’Eae4 contrôlait le profil cytokinique des
lymphocytes T, en particulier la sécrétion de TNF et d'IFN-γ. Par cartographie haplotypique
chez plusieurs souches de rats, le contrôle de ce profil cytokinique associé à la sensibilité à
l'EAE a été rapporté à Vav1 pour lequel un polymorphisme responsable du remplacement
d'une arginine par un tryptophane a été découvert (polymorphisme R63W).
Sur la base de ces travaux, des études d'association ont été réalisées en collaboration sur 7
cohortes européennes. Ces études ont montré une association de l’haplotype CA rs2546133rs2617822, dans le premier intron de VAV1, avec la SEP. L'haplotype CA est associé à une
augmentation de l’expression de l’ARN messager de VAV1, et à une augmentation de TNF et
d’IFN-Ȗ dans le liquide céphalo-rachidien et le sang des patients atteints de SEP. Ces résultats
permettent de conclure que VAV1 joue un rôle central dans le contrôle de la maladie en
contrôlant la production de cytokines pro-inflammatoires impliqués dans la pathogénèse de
cette maladie.
91
A Role for VAV1 in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis and
Multiple Sclerosis
Maja Jagodic, et al.
Sci Transl Med 1, 10ra21 (2009);
DOI: 10.1126/scitranslmed.3000278
A complete electronic version of this article and other services, including high-resolution figures,
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Supplementary Material can be found in the online version of this article at:
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Science Translational Medicine (print ISSN 1946-6234; online ISSN 1946-6242) is published weekly, except the
last week in December, by the American Association for the Advancement of Science, 1200 New York Avenue
NW, Washington, DC 20005. Copyright 2009 by the American Association for the Advancement of Science; all
rights reserved. The title Science Translational Medicine is a registered trademark of AAAS.
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RESEARCH ARTICLE
GENETICS AND AUTOIMMUNE DISEASE
A Role for VAV1 in Experimental Autoimmune
Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis
Maja Jagodic,1* Celine Colacios,2,3* Rita Nohra,1 Anne S. Dejean,2,3 Amennai Daniel Beyeen,1
Mohsen Khademi,1 Audrey Casemayou,2,3 Lucille Lamouroux,2,3 Christine Duthoit,2,3
Olivier Papapietro,2,3 Louise Sjöholm,1 Isabelle Bernard,2,3 Dominique Lagrange,2,3 Ingrid Dahlman,1
Frida Lundmark,4 Annette B. Oturai,5 Helle B. Soendergaard,5 Anu Kemppinen,6 Janna Saarela,6
Pentti J. Tienari,7 Hanne F. Harbo,8 Anne Spurkland,9 Sreeram V. Ramagopalan,10
Dessa A. Sadovnick,11 George C. Ebers,10 Maria Seddighzadeh,12 Lars Klareskog,12 Lars Alfredsson,13
Leonid Padyukov,12 Jan Hillert,4 Michel Clanet,2,3,14 Gilles Edan,15 Bertrand Fontaine,16,17,18
Gilbert J. Fournié,2,3* Ingrid Kockum,1* Abdelhadi Saoudi,2,3* Tomas Olsson1*†
Multiple sclerosis, the most common cause of progressive neurological disability in young adults, is a chronic inflammatory disease. There is solid evidence for a genetic influence in multiple sclerosis, and deciphering the causative genes could reveal key pathways influencing the disease. A genome region on rat chromosome 9 regulates
experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Using interval-specific congenic rat
lines and association of single-nucleotide polymorphisms with inflammatory phenotypes, we localized the gene
of influence to Vav1, which codes for a signal-transducing protein in leukocytes. Analysis of seven human cohorts
(12,735 individuals) demonstrated an association of rs2546133-rs2617822 haplotypes in the first VAV1 intron with
multiple sclerosis (CA: odds ratio, 1.18; CG: odds ratio, 0.86; TG: odds ratio, 0.90). The risk CA haplotype also
predisposed for higher VAV1 messenger RNA expression. VAV1 expression was increased in individuals with
multiple sclerosis and correlated with tumor necrosis factor and interferon-g expression in peripheral blood and
cerebrospinal fluid cells. We conclude that VAV1 plays a central role in controlling central nervous system immunemediated disease and proinflammatory cytokine production critical for disease pathogenesis.
INTRODUCTION
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease that damages
myelin sheaths and nerve fibers. There are, at present, no preventive
strategies, and available therapies either are only modestly effective or
can result in rare but serious adverse events (1). There is solid evidence
for a genetic influence in MS (2), and deciphering the causative genes
could reveal key pathways influencing the disease. However, variants of
1
Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Karolinska Institutet,
S-17176 Stockholm, Sweden. 2Institut National de la Santé et de la Recherche
Médicale, U563, F-31000 Toulouse, France. 3Université Toulouse III Paul Sabatier, F-31000
Toulouse, France. 4Department of Clinical Neuroscience, Division of Neurology, Karolinska
Institutet, S-17186 Stockholm, Sweden. 5Danish Multiple Sclerosis Research Center,
University of Copenhagen and Rigshospitalet, DK-2100 Copenhagen, Denmark. 6Department of Molecular Medicine, Institute of Molecular Medicine Finland, National Public
Health Institute, FIN-00290 Helsinki, Finland. 7Department of Neurology, Helsinki University
Central Hospital and Molecular Neurology Programme, Biomedicum, University of
Helsinki, FIN-00290 Helsinki, Finland. 8Department of Neurology, Oslo University Hospital
Ullevål and University of Oslo, N-0407 Oslo, Norway. 9Department of Anatomy, Institute of
Basal Medical Science, University of Oslo, N-0317 Oslo, Norway. 10Wellcome Trust Centre
for Human Genetics and Department of Clinical Neurology, University of Oxford, OX3 7BN
Oxford, UK. 11Department of Medical Genetics and Faculty of Medicine, Division of
Neurology, University of British Columbia, V6T 2B5 Vancouver, British Columbia, Canada.
12
Department of Medicine, Rheumatology Unit, Karolinska Institutet, S-17176 Stockholm,
Sweden. 13Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, S-17177 Stockholm,
Sweden. 14Hôpital Purpan, Service de Neurologie, F-31300 Toulouse, France. 15CHRU de
Pontchaillou, Service de Neurologie, F-35033 Rennes Cedex 09, France. 16Institut National de
la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 975, F-75013 Paris, France. 17Université Pierre et
Marie Curie-Paris 6, F-75013 Paris, France. 18Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Groupe
Hospitalier Pitié-Salpêtrière, F-75013 Paris, France.
*These authors contributed equally to this work.
†To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]
genes affecting MS are likely to be numerous and each may confer only
a modest effect (3). This is probably why only a few MS genes, namely,
human leukocyte antigens (HLA) class II genes, IL7R, IL2R, CLEC16A,
CD58, and EVI5-RPL5, have been unambiguously identified, whereas a
few more await confirmation (4–8). Even less is known about the mechanisms used by genetic variants in the pathogenesis of MS. Identifying additional risk genes and understanding their mechanisms of action
through functional studies are critical steps toward disease prevention
or therapy, but progress has been difficult.
Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a model for MS,
has increased our understanding of disease mechanisms and is a valuable tool to devise and test potential therapies (9). EAE has also been
useful for dissecting the genetic control of neuroinflammation (10–13).
The relevance of animal models to further the understanding of human
diseases relies on cross-species conserved mechanisms. In this regard,
there are several examples of disease genes defined in rodent models that
also associate with human diseases; examples include CD36 in insulin
resistance, dyslipidemia, and hypertension, and Fcgr3 in systemic lupus
erythematosus and autoimmunity (14). We previously identified a significant quantitative trait locus (QTL), Eae4, on rat chromosome 9 in the
intercross between the EAE-susceptible Dark Agouti (DA) and the EAEresistant Brown Norway (BN) strains (10). BN alleles at Eae4 confer less
severe disease and a lower number of interferon-g (IFN-g) mRNAexpressing cells in the central nervous system (CNS) (10). This QTL
colocalizes with a series of QTLs that regulate other immune-mediated
diseases or phenotypes, such as arthritis (15, 16), gold salt–triggered
glomerulonephritis (17), immunoglobulin E response (18), and
www.ScienceTranslationalMedicine.org
9 December 2009
Vol 1 Issue 10 10ra21
1
Downloaded from stm.sciencemag.org on October 10, 2010
(Published 9 December 2009; Volume 1 Issue 10 10ra21)
CD45RC T cell subsets (19, 20), and so may plausibly control immune
regulation.
Here, we localized Eae4 to the Vav1 gene, which codes for a guanine
nucleotide exchange factor (GEF), an intracellular signal-transducing
protein specific for hematopoietic cells (21). The human VAV1 gene
affected the expression of VAV1 mRNA and was associated with MS.
VAV1 expression was increased in peripheral blood mononuclear cells
(PBMCs) and cerebrospinal fluid (CSF) cells in patients with MS and
correlated with tumor necrosis factor (TNF) and IFN-g expression. Thus,
on the basis of genetic studies in rat EAE, we identify VAV1 as a genetic risk factor for MS, which regulates proinflammatory cytokines that
underlie the susceptibility for CNS inflammatory disease.
RESULTS
Refinement of Eae4 QTL to a ~1-centimorgan region
To identify the gene underlying Eae4, we created DA.BN-Eae4 (DA.BN)
and LEW.BN-Eae4 (LEW.BN) congenic rats. A region encompassing
Eae4 was transferred from the EAE-resistant BN strain into the EAEsusceptible DA and LEW strains by marker-assisted selective breeding.
In the two chronic disease models, whole spinal cord (WSC) and myelin
oligodendrocyte glycoprotein (MOG)–induced EAE in DA rats, BN alleles at Eae4 conferred better recovery from disease with a significantly
lower cumulative clinical score (P < 0.03 in WSC-EAE and P < 0.05 in
MOG-EAE), and in two of four experiments, there was lower mortality
(P < 0.001) relative to the susceptible DA strain (Fig. 1, A and B, and
table S1). In the monophasic myelin basic protein (MBP)–induced EAE
in LEW rats, BN alleles at Eae4 conferred significantly lower incidence
(P < 0.05) and milder disease (P < 0.008) relative to the susceptible LEW
alleles (Fig. 1C and table S1). Therefore, alleles from the resistant BN
strain at Eae4 conferred less severe disease.
To narrow the Eae4 interval, we created interval-specific congenic
lines (Fig. 1, D and F, and fig. S1). In the DA/BN strain combination,
the R25 congenic line displayed significantly less severe EAE (P < 0.05)
relative to the susceptible background DA strain, whereas R15 did not
differ from DA, thus narrowing Eae4 down to a ~2-centimorgan (cM)
region (Fig. 1E and table S1). In the LEW/BN strain combination, the
Ra congenic line displayed disease severity similar to that of the parental
LEW strain, narrowing Eae4 down to a ~1-cM region that was within
the 2-cM region defined in the DA/BN combination (Fig. 1G). The clinical data were in accordance with the histopathological examination of
the CNS. MBP-immunized LEW.BN rats had significantly lower
numbers of CD4 T cells and CD8 T cells than susceptible LEW and
Ra rats (Fig. 1, H to J; P < 0.05). Together, these data show that susceptibility to EAE is influenced by gene(s) located in the 1-cM interval
between D9Wox24 and D9Got8 markers (Fig. 1, D and F).
Influence of Eae4 on encephalogenicity and cytokine profile
of MBP-specific CD4 T cells
We performed adoptive transfer experiments in rats to investigate
whether Eae4 affects the encephalogenicity of donor-derived T cells
www.ScienceTranslationalMedicine.org
Absolute
numbers (x106)
Cumulative EAE score
EAE score
W
LE
Absolute
numbers (x106)
LE Ra
W
.B
N
Cumulative EAE score
DA
R1
5
R2
5
EAE score
EAE score
Fig. 1. Effect of Eae4 on clinical disease
*
**
**
A 4
B
C 3
2
and refinement to ~1-cM region. (A to C)
DA
DA
LEW
DA.BN
DA.BN
LEW.BN
EAE development in DA (n = 22) and
3
2
DA.BN(Eae4) (n = 11) rats after injection of
2
1
100 mg of rat WSC homogenate in CFA
1
(A), in DA (n = 11) and DA.BN(Eae4) (n =
1
11) rats after injection of 15 mg of recom0
0
0
binant rat MOG in IFA (B), and in LEW (n =
0
5 10 15 20 25 30
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
5) and LEW.BN(Eae4) (n = 5) rats after
Post-WSC immunization (days)
Post-MOG immunization (days)
Post-MBP immunization (days)
injection of 10 mg of guinea pig MBP in
D
E
F
G
CFA (C). Data represent mean clinical EAE
score ± SEM. Alleles from the resistant BN
D9Wox24
D9Wox24
*
60
**
15
MJ2170
MJ2170
Eae4
strain at Eae4 conferred significantly (P <
Eae4
D9Got8
D9Got8
40
0.05) less severe disease relative to suscep10
D9Rat44
D9Rat44
D9Rat139
D9Rat139
tible DA (A and B) and LEW (C) alleles from
20
D9Wox17
5
D9Wox17
days 17 (A) and 33 (B) and on days 11 to
D9Got15
D9Got15
16 (C) after immunization. (D and F) Genet0
D9Got22
D9Got22
0
D9Wox19
D9Wox19
LEW Ra LEW.BN
DA R15 R25
ic maps of interval-specific congenic lines
used to narrow down Eae4 in the DA (D)
and LEW (F) strain background. Black bars,
H
I
J
DA or LEW genome; white bars, BN ge*
0.4
*
6
nome; gray bars, undetermined origin. Ge4
netic distances (in centimorgans) between
0.2
markers were derived from 794 (DAxPVG)
2
G10 rats. (E and G) Mean cumulative EAE
score ± SEM in parental DA (E) and LEW (G)
0
0
LEW Ra LEW.BN
LEW Ra LEW.BN
LEW
Ra
LEW.BN
strains and in congenics. Down-regulation
of EAE severity by the fragment contained
within R25 (n = 11) relative to DA (n = 15) (P <
0.05) but not R15 (n = 6) (E). This interval was further narrowed down with Ra
nification, ×200). (I and J) Mean absolute numbers ± SEM of CD4 (I) and CD8
and LEW.BN congenics (G). (H) H&E staining of spinal cord sections from
(J) T cells that infiltrated the spinal cords of LEW (n = 7), LEW.BN (n = 3), and
LEW, Ra, and LEW.BN rats 12 days after immunization with MBP in CFA (magRa (n = 7). *P < 0.05, **P < 0.01.
9 December 2009
Vol 1 Issue 10 10ra21
2
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RESEARCH ARTICLE
RESEARCH ARTICLE
3
B 5
*
4
EAE score
4
5
6
7
8
9
Time after transfer (days)
3
2
1
0
3
6
4
2
0
10
Ra
LEW.BN
4
5
6
7
8
9 10
Time after transfer (days)
**
Ra
LEW.BN
D
50
40
40
**
30
20
10
0
0
Ra
F
E
Medium
MBP
80
LEW Ra LEW.BN
20
*
120
30000
LEW.BN
*
Ra LEW.BN
G 8000
*
16
12
8
20000
10000
6000
4000
2000
4
0
0
0
Ra
LEW.BN
Ra LEW.BN
Ra LEW.BN
EAE score
Cumulative EAE score
Fig. 2. Influence of Eae4 on the encephalogenicity and cytokine profile
of MBP-specific T cells. (A) Draining lymph nodes were collected from
MBP-immunized rats on day 12 after MBP challenge, and unfractio16
4
nated lymph node cells were stimulated in vitro with MBP (2 mg/ml)
12
3
for 3 days. Viable leukocytes (25 × 106) were injected intravenously into
each naïve syngeneic LEW recipient (n = 5 for each experimental
8
2
group). (B and C) MBP-specific T cell lines (2.5 × 106) generated after
4
1
three (B) (n = 4) or four (C) (n = 8 and 7) rounds of stimulation with
MBP as described in Materials and Methods were injected intra0
0
venously into each naïve syngeneic LEW. The results are expressed
Ra LEW.BN
3
4
5
6
7
8
9 10
in the left panels as the mean daily clinical score of each experimental
Time after transfer (days)
group, and in the right panels as the median of cumulative disease
score of each experimental group ± SEM. (D to G) Lymph node cells were collected from MBP-immunized rats on day 12 after MBP challenge and
stimulated in vitro with MBP (20 mg/ml) for 48 hours. (D) Proliferation was assessed with an 18-hour [3H]thymidine pulse added after 48 hours of culture. (E to G) Tissue culture supernatants were assayed after 48 hours of culture for TNF (E), IFN-g (F), and IL-17 (G) with luminex multiplex kits. Results are
expressed as mean concentrations ± SEM (n = 4 and 7) and represent three independent experiments. *P < 0.05, **P < 0.01.
C 5
20
**
www.ScienceTranslationalMedicine.org
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0
*
TNF (pg/ml)
1
*
8
IL-17 (pg/ml)
2
Identification of Vav1 by single-nucleotide polymorphism–
phenotype analysis across rat strains
We generated a congenic rat line harboring a 117-kb region from the susceptible LEW strain on the resistant BN background that comprised four
genes (Fig. 3, A and B). The EAE-resistant BN background precluded testing of the influence of the region on EAE. However, the analysis of TNF
secretion by naïve splenocytes stimulated with concanavalin A (Con A)
showed that TNF expression correlated with EAE severity in all screened
interval-specific congenic lines (fig. S1 and table S1). Investigation of TNF
production confirmed that the 117-kb region affects TNF concentrations,
with susceptible LEW alleles driving higher TNF concentrations relative
to BN-resistant alleles (Fig. 3B; P < 0.009). We therefore focused on the
four genes contained in this region: complement 3 precursor (C3), G
protein–coupled receptor 108 (Gpr108), Cdc42-interacting protein 4
(Trip10/Cip4), and Vav1 oncogene (Vav1) (the homologous region is
at MMU17: 57.34 to 57.47 Mb, NCBIm37 assembly) (24). Because
mRNA expression of these four genes was similar in parental and congenic strains (fig. S2), we investigated differences in single-nucleotide
[3H]Thymidine
(counts/minute x 103)
EAE score
**
experiments demonstrated that Eae4 contains gene(s) that modulate
proinflammatory cytokine production and the encephalogenicity
of myelin-specific T cells.
IFN-γ (pg/ml)
LEW
Ra
LEW.BN
Cumulative EAE score
A 3
Cumulative EAE score
or the susceptibility of target organs to neuroinflammation. Classic EAE
developed in all naïve LEW rats given 25 × 106 MBP-stimulated
draining lymph node cells obtained from LEW or Ra rats immunized
with MBP (Fig. 2A). By contrast, LEW rats receiving MBP-stimulated
lymph node cells obtained from immunized LEW.BN rats developed
mild EAE (Fig. 2A; P < 0.05). This compromised ability of lymph node
cells from LEW.BN-resistant rats to transfer EAE was a stable phenomenon that persisted despite repeated in vitro stimulation with MBP
autoantigen. Indeed, MBP-specific T cell lines derived from LEW.BN
rats, after three rounds (Fig. 2B; P < 0.03) or four rounds (Fig. 2C;
P < 0.006) of stimulation, had a reduced capacity to induce EAE relative to those obtained from Ra rats. These effects were also observed when LEW.BN rats were used as recipients, thus excluding
a possible difference in the susceptibility of LEW and LEW.BN target
organs to neuroinflammation (table S2). Because of the role of inflammatory cytokines in EAE (22, 23), we investigated the influence
of Eae4 on cytokine production by myelin-specific T cells. Lymph
node T cells from MBP-immunized LEW.BN rats proliferated less
(Fig. 2D; P < 0.01) and produced significantly lower amounts of
TNF (Fig. 2E; P < 0.006) and IFN-g (Fig. 2F; P < 0.01) than did
cells from MBP-immunized Ra rats. The production of interleukin17 (IL-17) was similar in both strains (Fig. 2G). Together, these
polymorphisms (SNPs) by sequencing their coding regions. We identified 18 SNPs between DA and BN strains (Fig. 3A). These SNPs were
then genotyped in six additional rat strains, previously used to identify
QTLs that regulate different proinflammatory cytokine–dependent
diseases. Strains that showed linkage (QTL) at Eae4 should have different variants (nucleotides) at the SNP(s) underlying the Eae4 gene.
Conversely, strains that showed no linkage (no QTL) should have
shared nucleotide at the same SNP. The SNP in exon 1 (CGG→TGG)
of Vav1, which results in an Arg→Trp substitution at position 63
(R63W) in the conserved calponin homology domain, is the only polymorphism that fulfills these criteria (Fig. 3A). It differs between
strains in which there was evidence for linkage to inflammatory diseases,
such as DA/BN, LEW/BN, and BB/BN (10, 15–19), and it is shared
among all other strains in which there was no evidence for linkage
(11–13, 25–28) (fig. S3). The BB/BN cross used to identify the Cia15
locus that controls collagen-induced arthritis (15), which strongly associates with TNF concentrations, is especially informative, as Vav1 is
the only gene in the Eae4 region that differs between BB and BN
strains (Fig. 3A).
A
QTL
15
17, 18, 19, Fig.1
10, 16, Fig.1
975/325
1209/403
1296/432
1308/336
2886/962
4069/1357
Gpr108 519/173
913/305
918/306
1380/460
1503/501
Trip10 958/320
Vav1
187/63
522/174
570/190
1919/640
+187
ex9
ex11
ex12
ex12
ex23
ex33
ex6
ex8
ex8
ex13
ex15
ex9
ex1
ex5
ex6
ex20
3' UTR
nd nd ++ ++ +++ +
E3 F344 ACI PVG BB BN
C
C
C
C
C
G
A
G
T
C
G
G
G
C
T
G
A
C
T
T
C
C
T
T
T
T
G
G
A
A
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
G
G
C
C
T
T
G
G
C
C
C
C
26
12, 27
25, 28
11
fig. S3
13
C
C
C
C
C
G
A
G
T
C
G
G
G
C
T
G
A
C
**
200
0
1200
800
1000
2.7 0.1 3.1
Vav1
500
β-Actin
0
F
DA
R25
*
*
400
nd
A
Co
n
m
e
α- d
CD
3
0
T
C
T
C
C
A
G
A
C
T
A
A
A
T
C
A
A
T
CD4
*
LEW BN DA
PMA/Iono
www.ScienceTranslationalMedicine.org
DA
R25
*
50
40
30
20
10
0
*
ed
CD
3
Co
n
A
1600
*
m
E
*
DA
AC
I
PV
G
DA BB
.B
N
LEW BN BN.LEW
T
C
T
C
C
A
G
A
C
T
A
A
A
C
T
G
A
T
D
*
**
C
C
C
C
C
G
A
G
T
C
G
G
G
C
C
A
A
C
PMA/Iono
α-
400
C
C
C
C
C
G
A
G
T
C
G
G
G
C
T
G
A
C
No QTL
C
TNF (pg/ml)
TNF (pg/ml)
B
syn
syn
syn
syn
syn
T-A
syn
syn
syn
syn
syn
V-I
R-W
syn
syn
T-N
-
[3H]Thymidine
(cpm x 103)
117-kb region
TNF ++ ++
Gene pos (bp/aa) Exon Function DA LEW
162/54
ex2
syn
C3
C
C
TNF (pg/ml)
Fig. 3. Refinement of Eae4 to the Vav1 gene. (A) SNP map of
the Eae4 candidate genes located within the 117-kb region in
eight inbred rat strains. The limits of the 117-kb region are indicated by arrows on the left. Arrows on the top and below indicate strain combinations in which there was evidence for a
QTL in the Eae4 region (10, 15–19) (Fig. 1) and in which a QTL
was not detected (11–13, 25–28) (fig. S3), respectively. UTR, untranslated region. Relative concentrations of TNF are given at
the top for each strain [exact values are given in (C)]; nd, not
determined. The box indicates the SNP in exon 1 of Vav1. (B)
Mean concentrations of TNF (pg/ml) ± SEM production by naïve
splenocytes from LEW (n = 8), BN (n = 7), and the 117-kb BN.
LEW congenic line (n = 4) after stimulation with a T cell mitogen, Con A. (C) Mean concentrations of TNF (pg/ml) ± SEM analyzed in five selected inbred strains and in the DA.BN congenic
line (n = 3 to 4 rats per group) in naïve splenocytes stimulated
with Con A. (D) Lysates of CD4 T cells purified from lymph
nodes were prepared and immunoblotted with monoclonal
antibodies against Vav1 and b-actin to control for the amount
of protein loaded per lane. The numbers represent quantification of the Vav1 signal on the blots normalized to the b-actin
signal in each sample. The data represent three independent
experiments. (E and F) Regulation of lymphocyte proliferation
and TNF concentrations by Eae4 is dependent on the TCR stimulation and can be bypassed by stimulus acting downstream of
Vav1. (E) Mean concentrations of TNF (pg/ml) and (F) proliferation [counts per minute (cpm)] ± SEM by naïve T cells stimulated with a-CD3 (5 mg/ml), Con A (2.5 mg/ml), and increased
concentrations of PMA-ionomycin (Iono) (low: PMA, 0.5 ng/ml,
and ionomycin, 10 ng/ml; medium: PMA, 5 ng/ml, and ionomycin,
100 ng/ml; high: PMA, 50 ng/ml, and ionomycin, 1 mg/ml) in the
susceptible parental DA strain and the protected DA.BN-R25
congenic line (n = 4). Proliferation was assessed with an 18-hour
[3H]thymidine pulse added after 48 hours of culture; results are
expressed as the mean [3H]thymidine incorporation (cpm), and
TNF concentrations were assessed after 18 hours of culture with
standard ELISA. *P < 0.05, **P < 0.01.
Moreover, the polymorphism causing the R63W substitution in
Vav1 was the only SNP that correlated with TNF concentrations, with
R63 predisposing for high TNF expression and W63 predisposing for
low TNF expression in different rat strains (Fig. 3C). In agreement with
these data, we showed that W63 was also associated with a decrease in
Vav1 protein expression in CD4 T cells (Fig. 3D), thymocytes, and
MBP-specific T cell lines (fig. S4).
Additional functional studies support Vav1, at the same time giving
evidence against other candidate genes. Differences in TNF production
and proliferation between the susceptible DA and the resistant R25 strain
were observed in T cells (Fig. 3, E and F) and splenocytes (fig. S5) after
a-CD3 or Con A stimulation. By contrast, direct stimulation of protein
kinase C (PKC), using phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)–ionomycin,
thereby bypassing all events upstream of this kinase, including Vav1, caused
no difference between the two strains. These data point to a difference in
signal transduction upstream of PKC, and among the four genes, Vav1 is
the strongest candidate (29). Therefore, from these experiments, we concluded that Vav1 variants predispose for inflammatory disease and decided to investigate whether VAV1 is associated in humans with MS.
9 December 2009
Vol 1 Issue 10 10ra21
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RESEARCH ARTICLE
Association of VAV1 with MS
We first investigated the syntenic human 19p13.3 region comprising VAV1 by testing association of 47 tagging SNPs (tSNPs) in a
case-control study consisting of 1039 patients with MS and 1206
controls from Sweden (fig. S6A and table S3). We observed evidence
for association for several SNPs and haplotypes in the VAV1 gene
(Fig. 4A) (tables S4 and S5), most apparent in haplotype block 6
but also in haplotype blocks 10 and 11, and for rs2617818 that maps
A
TRIP10 SH2D3A
0.001
1
VAV1
2
3
4 6
5
8
7
10
9
11
P value
0.01
0.1
1
0
20,000
B
40,000
60,000
80,000
Distance from rs310141 (bp)
D
C
CA haplotype
100,000
CG haplotype
TG haplotype
Swedish I
Swedish II
Norwegian
Danish
Finnish
French
Canadian
Summary
0.79 1.00 1.26 1.58
0.63 0.79 1.00 1.26
0.63 0.79 1.00 1.26 1.58
Fig. 4. Association of VAV1 with MS. (A) Single-marker associations with MS.
Nominal P values are plotted against the distance (in base pairs) from
rs310141. The association analysis was carried out with Unphased version
3.0.13 (50). For all but the French and Canadian MS study, the P value
corresponds to a test of the hypothesis of equal minor allele frequencies
among patients and controls. For the French and Canadian MS study, the
P value corresponds to a test of distortion of transmission to affected offspring away from expected 50% transmission. The number of individuals included in each group was as follows: Swedish MS (solid diamonds), 1039
patients and 1206 controls; Norwegian MS (open triangles), 548 cases and
554 controls; Danish MS (solid triangles), 512 cases and 553 controls; Finnish
MS (solid circles), 811 cases and 1100 controls; French MS (open squares), 592
trio families; and Canadian MS (open circles), 52 cases and 1056 nuclear families. Lines represents solid spine of linkage disequilibrium blocks in the first
Swedish cohort estimated in Haploview version 4.0 (49). (B to D) Joint analysis
of association for rs2546133-rs2617822 haplotypes with MS. (B) Association of
CA haplotype in seven cohorts [overall OR, 1.18; 95% confidence interval (CI),
1.09–1.28; P < 2 × 10−5, test of overall association]. (C) Association of CG
haplotype (overall OR, 0.86; 95% CI, 0.77–0.95; P < 0.002, test of overall association). (D) Association of TG haplotype (overall OR, 0.90; 95% CI, 0.81–1.01;
P < 0.02, test of overall association). A fixed-effect Mantel-Haenszel metaanalysis and Woolf’s test for heterogeneity were performed. In all cases, test
of heterogeneity was nonsignificant. The P values for overall association of
these haplotypes are from a joint association test in Unphased version
3.0.13 using study cohort as a covariate (50).
between blocks 4 and 5. Markers in these regions were then tested in
a set of 592 trio families from France, where only association to
haplotype block 6 was confirmed (Fig. 4A and table S6).
Markers in the block 6 haplotype were analyzed in an additional
2546 patients and 3943 controls from Sweden, Norway, Denmark,
and Finland and 1056 families from Canada (amounting to 12,735 individuals) (tables S7, S8, S9, and S11). We tested association to haplotypes formed by rs2546133 and rs2617822. The common CA haplotype
(~85%) had a higher frequency among cases or was overtransmitted to
cases in six of seven cohorts, and a joint analysis of all cohorts resulted in
P < 2 × 10−5 [odds ratio (OR), 1.18] (Table 1 and Fig. 4B). Both the CG
and TG haplotypes were less frequent among patients relative to controls
and showed a decreased transmission to patients with ORs of 0.86 (P <
0.002) and 0.90 (P < 0.02), respectively (Table 1 and Fig. 4, C and D).
Although the statistical support for the block 6 haplotype is strong, all
cohorts have not been run with all markers and a possibility of additional associations in the VAV1 gene remains.
To estimate the probability that the association between MS and
VAV1 is false, we calculated the false-positive report probability
(FPRP) according to the three factors that determine its magnitude,
namely (i) the previous probability of a true association of the tested
genetic variants with the disease (p), (ii) the observed P value, and (iii)
the statistical power to detect the OR of the alternative hypothesis at
the given P value (30). Given a p value in the range of 0.01 to 0.002, a
conservative estimate for our data, we found a FPRP below 10%, suggesting that our reported association is true (Supplementary Material).
We therefore conclude that there is a likely association of VAV1
rs2546133-rs2617822 haplotypes in intron 1 with MS.
VAV1, TNF, and IFN-g expression in MS
We next demonstrated that the CA haplotype in VAV1 intron 1,
which was associated with an increased risk for MS, was also associated with increased VAV1 mRNA expression in PBMCs in individuals with MS and controls (P < 0.0008 in dominant model) (Fig.
5A) and in individuals with MS separately (P < 0.03 and P < 0.0003
in additive and dominant model, respectively) (Fig. 5B).
We then investigated expression of VAV1 mRNA and correlation
to TNF and IFN-g expression in individuals with MS. VAV1 mRNA
was significantly (P < 0.0001) up-regulated in mononuclear cells of
MS patients relative to controls in peripheral blood (Fig. 6A) and
CSF (fig. S6A). Up-regulation of TNF and IFN-g was also greater
(P < 0.0001) in MS patients relative to controls (Fig. 6, B and C,
and fig. S6, B and C). Moreover, mRNA expression of VAV1 and
TNF (r2 = 0.61, P < 0.0001) and VAV1 and IFN-g (r2 = 0.40, P <
0.0001) were correlated both in MS peripheral blood cells (Fig. 6, D
and E) and in CSF cells (fig. S7, D and E). Together, these data provide
additional support for VAV1 contributing to MS pathogenesis.
DISCUSSION
We identified Vav1 as a major gene underlying Eae4 effect. In rats, the
Vav1 R63W variant is associated with the control of Vav1 protein
abundances, proinflammatory lymphocyte activation, and neuroinflammation. Similarly, we found that human VAV1 variants are associated with VAV1 expression and MS susceptibility. Furthermore, a
central role for VAV1 is supported by its up-regulation in MS and
by its correlation with TNF and IFN-g expression in peripheral blood
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Vol 1 Issue 10 10ra21
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RESEARCH ARTICLE
RESEARCH ARTICLE
For the French and Canadian MS study, the P value corresponds to a
test of distortion of transmission to affected offspring away from
expected 50% transmission. The overall test of association with MS
was carried out with a joint association test using study cohort as a
covariate.
CA
Patients/
transmitted
Cohort
n
%
CG
Controls/
transmitted
n
P
%
Patients/
transmitted
n
%
TG
Controls/
transmitted
n
Patients/
transmitted
P
%
Controls/
transmitted
P
n
%
n
%
0.04
107
5.4
233
6.1
0.26
0.45
74
5.6
93
7
0.14
0.13
67
6.3
75
7.2
0.43
0.88
84
8.5
82
7.8
0.54
*
Sweden I
1738
88.5
3702
86.1
0.01
111
5.6
304
7.1
Sweden II
1148
87.1
1127
84.8
0.1
91
6.9
103
7.7
Norwegian
917
86.7
874
83.4
0.09
72
6.8
89
8.6
Danish
832
84.6
901
85.5
0.57
67
6.8
70
6.6
†
Finnish
1444
94.8
1786
94.3
0.57
47
3.1
63
3.3
0.7
33
2.2
45
2.4
0.69
French‡
948
50.5
928
49.5
0.31
103
50.5
101
49.5
0.92
106
45.7
126
54.3
0.16
Canadian‡
1430
51.6
1339
48.4
0.002
139
46.2
162
53.8
0.01
148
49
154
51
0.12
Overall MS
8893
86.8
11120
85.2
0.00002
666
6.5
967
7.4
0.002
659
6.4
910
7.0
0.02
*Sweden I contains Sweden I and all Swedish RA controls.
†Genotypes for rs2546133 were imputed with the IMPUTE program and haplotype structure from HapMap.
‡Transmitted and untransmitted haplotypes to affected individuals.
and in the CSF cells of MS patients. Thus, our data illustrate the power
of using genetic studies in rat models of inflammatory disease to define critical genes central to human pathogenesis.
VAV1 is a cytoplasmic GEF for Rho family guanosine triphosphatases, known to be important for development and activation of T and
B cells (21, 31). Activation of VAV1 leads to induction of Ca2+ flux
and activation of nuclear factor κB, nuclear factor of activated T cells,
and extracellular signal–regulated kinase–mitogen-activated protein
kinase pathways. In addition to T and B cell receptors, activation of
VAV1 occurs downstream of other receptors, including FcɛRI, FcgRI/
II/III, integrins, growth factor, cytokine, and chemokine receptors. A
potential role of VAV1 in EAE has been indicated by the resistance of
Vav1 knockout mice to EAE induction (32). Nevertheless, it is difficult
to draw conclusions from Vav1 gene deletion experiments because
this leads to reduced numbers of T and B cells and severely impairs
their functions (31). The reported disease protection is likely related to
the general dysfunction of lymphocytes and does not necessarily implicate Vav1 as the susceptibility gene. Our study provides strong
evidence for natural variants of Vav1 being instrumental for EAE
pathogenesis. Among the four genes localized in the 117-kb interval,
Vav1 was the only gene that displayed differences in protein abundances. Moreover, only the R63W polymorphism in Vav1 showed
strong correlation with TNF concentrations and conformed well to
previously identified inflammatory QTLs (10, 15–19). Functionally,
we show that Eae4 effect is dependent on T cell receptor (TCR) stimulation and can be bypassed by a stimulus acting downstream of Vav1
(Fig. 3, F and G). The Vav1 R63W variant causes a defect in T cell
proliferation and TNF and IFN-g production, affecting their ability
to cause T cell infiltration in the CNS and EAE disease. This is in
agreement with initially reported linkage of Eae4 with the number of
IFN-g–expressing cells in the CNS during EAE (10). Thus, the
consequences of complete gene deletion are very different from
our demonstration here that the naturally occurring genetic variants of Vav1 affect the outcome of lymphocyte activation and their
ability to transfer disease.
Having localized the regulation of rat inflammatory disease to Vav1,
we studied the human ortholog. Combined analysis of seven independent cohorts comprising 12,735 individuals showed a positive association with MS for the CA haplotype and negative association for the
CG and TG haplotypes. The ORs conferred by these haplotypes are in
the range that is expected for non-HLA genes, as demonstrated for
IL7R and IL2R (3, 6, 8). Furthermore, the detected significance for
the size of material used in our study conforms well to theoretical calculations of expected P values at these particular ORs (33). FPRP calculation supports the validity of the reported association.
A role of VAV1 in MS is further confirmed by higher VAV1 expression in MS patients and by the correlation between VAV1 and
proinflammatory cytokine expression. This was demonstrated not only in peripheral blood but also in cells from the CSF. Moreover, higher
VAV1 mRNA expression is conferred by the MS-predisposing VAV1
haplotype, with P < 3 × 10−4 in 368 MS patients, comparing different
VAV1 haplotypes. The lack of association in the MS genome-wide association study (GWAS) (6) can be explained by the gap of 25.8 kb
between the markers included in VAV1 intron 1 in the first MS
GWAS. The linkage disequilibrium between haplotype block 6 and
the closest markers included in the screen was also low (fig. S6, B
and C). In subsequent MS GWAS screens, the association to VAV1
could have been missed because there was poor coverage of the intronic VAV1 region, for which we report an association with MS (4, 5,
34). The linkage disequilibrium between the markers included in
this screen and those that we find associated in this study was
low (r2 < 0.10). Of note is that C3, GPR108, and TRIP10 were not
associated with MS in any of the MS GWASs (4–6, 34). Further
support for VAV1 being instrumental in inflammatory disease derives
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Table 1. Association of haplotypes formed between rs2546133 and
rs2617822 with MS. Haplotype estimation and association analysis
was carried out with Unphased version 3.0.13 (50). For all but the
French and Canadian MS, the P value corresponds to a test of the hypothesis of equal minor allele frequencies among patients and controls.
RESEARCH ARTICLE
Dominant
Additive
Dominant
Fig. 5. Association between VAV1 mRNA expression and VAV1
rs2546133-rs2617822 haplotypes. Association of rs2546133-rs2617822
haplotypes with VAV1 mRNA expression was estimated in PBMCs of
all individuals (n = 551) (A) and individuals with MS (n = 368) (B). Analysis was performed with the haplo.score command in the Haplo Stats
package in R (R Foundation for Statistical Computing) using both additive and dominant models. MS-predisposing CA haplotype (black bars)
conferred higher VAV1 mRNA expression. *P < 0.05, ***P < 0.005.
from modest associations with type 1 diabetes and Crohn’s disease in
the Wellcome Trust GWAS (35). Cbl-b, which is a negative regulator
of Vav1 (36), has been implicated in type 1 diabetes (37). The evidence for a role of VAV1 in several inflammatory diseases in humans
is consistent with the overlap of Eae4 with QTLs that regulate many
inflammatory phenotypes and diseases in rodents (10, 15–20).
A straightforward interpretation of our findings is that the diseasepredisposing variant of Vav1 allows a more potent activation of pathogenic autoreactive lymphocytes producing proinflammatory cytokines,
which promote a more severe clinical disease and relapses. The activation by Vav1 likely involves a whole series of inflammatory mediators,
many of which can be important effectors in MS-EAE. However, two
important proinflammatory mediators were indeed measured and
increased as a consequence of Vav1 activity: TNF and IFN-g. This finding is of particular interest in view of the overall important role of these
cytokines in CNS inflammation. TNF was initially thought to promote
EAE (23) and demyelination (38), whereas other studies revealed contradictory anti-inflammatory roles in the CNS (39). A disease-promoting
role for IFN-g has been suggested by increased concentrations of this
cytokine in MS, specifically by myelin antigen–specific T cells (40), and
treatment of MS with the cytokine exacerbates the disease (41). In contrast,
IL-17, argued to be the prime disease-mediating cytokine in EAE (22, 42),
is produced in similar quantities by MBP-specific T cells independent of
their encephalogenicity in our experiments. Thus, our findings showed
that VAV1 is a genetic risk factor for MS that controls activation of T cells
characterized by up-regulated expression of important T helper 1 cytokines, TNF and IFN-g, critical for pathogenesis of this disease.
***
0.25
0
C
***
0.18
0.14
0.10
0.06
IFN-γ vs. GAPDH
*
B
3.5
2.5
1.5
0.5
0.04
0.02
0
MS
OND
n = 417 n = 143
0.02
0
MS
OND
n = 417 n = 143
D
***
0.10
0.08
0.06
0.04
MS
OND
n = 417 n = 143
E
0.10 P < 0.0001
r = 0.40
n = 412
0.2 P < 0.0001
r = 0.61
n = 416
0.1
0
0
0.5
VAV1
1.0
0.05
0
0
0.5
VAV1
1.0
Fig. 6. (A to C) VAV1, TNF, and IFN-g mRNA expression in MS. VAV1 (A), TNF (B),
and IFN-g (C) mRNA expression was higher in mononuclear cells from peripheral
blood of individuals with MS (n = 417) relative to individuals with other noninflammatory neurological disorders and healthy controls (OND) (n = 143).
(D and E) VAV1 mRNA expression levels correlated with TNF (D) and IFN-g
(E) mRNA expression levels in mononuclear cells from peripheral blood of
MS individuals. Expression was measured with quantitative real-time PCR
and normalized with GAPDH. ***P < 0.0001.
LEW.BN-Eae4 strains, respectively. The genetic background of rats was
also screened with 100 and 220 markers for DA.BN-Eae4 and LEW.BNEae4 strains, respectively. After the complete removal of the donor
genome outside the congenic fragment, two heterozygous rats were intercrossed to produce the homozygous strains DA.BN-Eae4(N7F1) and
LEW.BN-Eae4(N9F1). The BN.LEW-117-kb was created with the same
strategy. All breeding and experimental procedures were carried out in
accordance with European Union guidelines and approved by local ethics
committees (Stockholm North in Sweden and Comité d’éthique pour
l’expérimentation animale Midi-Pyrénées in France).
MATERIALS AND METHODS
Genotyping of animals
Primer sequences were retrieved from Rat Genome Database (43), except for MJ2170 (forward, 5′-TCTAGTTGACAATTAGTCTACTC-3′;
reverse, 5′-AGTAAGTAATAACTCAGAAATAT-3′), and purchased
from Proligo. Genotypes were determined by polymerase chain reaction
(PCR) as described (10, 17). We predicted the most probable marker
order with 794 (DAxPVG.1AV1)G10 rats.
Animals
DA.BN-Eae4 and LEW.BN-Eae4 congenic strains were developed
in Sweden and France, respectively. DA and BN rats from Sweden were
originally obtained from Zentralinstitut für Versuchstierzucht. BN and
LEW rats from France were obtained from Centre d’Elevage Janvier. Both
congenic lines were developed with the speed congenic strategy. Briefly, in
each backcross generation, rats for further breeding were selected on the
basis of genotyping of 8 and 23 microsatellite markers in the congenic
region, from marker D9Wox24 to D9Rat20, for DA.BN-Eae4 and
Induction of EAE, clinical evaluation, and histology
To induce active EAE, we injected rats with 100 mg of spinal cord (WSC)
homogenate with Mycobacterium tuberculosis, strain 37 H37Ra (20 mg/ml;
Difco Laboratories), 15 mg of recombinant MOG in saline emulsified
(1:1) with incomplete Freund’s adjuvant (IFA) (Sigma-Aldrich) subcutaneously in the dorsal tail root, or in the hind footpads with 10 mg of
guinea pig MBP emulsified in IFA containing M. tuberculosis (2 mg/ml).
A total of 100 ml of MBP-CFA (complete Freund’s adjuvant) was divided equally between the rear footpads.
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Additive
***
IFN-γ
***
CA
CG
TG
TNF
1
0
-1
-2
A
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
VAV1 vs. GAPDH
3
2
CA
CG
TG
TNF vs. GAPDH
B
5
4
Relative VAV1 expression
Relative VAV1 expression
A
RESEARCH ARTICLE
Proliferative response and cytokine assays
Popliteal lymph node cells, collected 12 days after immunization with
MBP, were stimulated with MBP (20 mg/ml) in 96-well culture plates
(Costar). Proliferation was measured by [3H]thymidine incorporation
during the last 18 hours of a 72-hour culture period. Forty-eight hours
after MBP stimulation, supernatants were removed and IFN-g, TNF,
and IL-17 were measured by luminex multiplex kits (Bio-Rad).
In another set of experiments, splenocytes or MACS-sorted T cells
from naïve rats were either left unstimulated or stimulated with Con A
(2.5 mg/ml; Sigma-Aldrich) for 6 or 18 hours at 37°C and 5% CO2. Levels
of TNF were measured in supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Sequencing
The sequencing templates were amplified from the genomic DNA, and
the sequencing reaction was carried out with the BigDye Terminator
version 3.1 (Applied Biosystems) and recorded on ABI3100 (Applied
Biosystems). Sequences were analyzed with Vector NTI software
(InforMax). SNPs were first detected between the DA and the BN
strain in the complete coding sequence and untranslated regions of
all genes in the region defined by C3 and Vav1.
Western blot
Cells were harvested in ice-cold lysis buffer containing a cocktail of protease and phosphatase inhibitors (Complete Mini, EDTA-free; Roche),
10 mM tris-HCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, and
1 mM DTT. The protein was then denaturated and separated on 10%
NuPAGE midi gels (Invitrogen) and blotted onto nitrocellulose membranes with a semidry transfer apparatus. Membranes were probed with
the appropriate antibody for 1 hour at room temperature (Vav1 antibody, clone D7, Santa Cruz Biotechnology; b-actin antibody, clone
AC-15, Sigma) before incubation with a horseradish peroxidase–
conjugated secondary antibody against mouse immunoglobulin G (IgG)
(Amersham). They were developed with SuperSignal West Pico chemiluminescent substrate according to the manufacturer’s instructions
(Pierce) and quantified with Scion Image software.
Preparation of PBMCs
The MS cohort for the expression study consisted of 417 subjects (mean
age, 40.6 years; range, 16 to 73 years; 65.9% females and 34.1% males;
94% with and 6% without IgG oligoclonal bands in CSF) fulfilling the
McDonald criteria for MS (46). The individuals with other neurological
diseases or healthy controls consisted of 143 subjects (mean age, 39.1
years; range, 14 to 80 years; 75.5% females and 24.5% males; all without
IgG oligoclonal bands in CSF). Peripheral blood was sampled in sodium
citrate–containing cell preparation tubes (Vacutainer CPT) and CSF in
siliconized glass tubes or polypropylene tubes. CSF samples were immediately centrifuged, and pellet was recovered and stored at −80°C.
PBMCs were separated by density gradient centrifugation, pelleted,
and stored at −80°C.
Relative quantification of mRNAs by real-time quantitative
reverse transcription PCR
Total RNA was extracted (PicoPure RNA Isolation kit, Arcturus Bioscience) and deoxyribonuclease treated (Qiagen). Reverse transcription
was performed with 10 ml of total RNA (5 to 10 ng), random hexamer
primers (0.1 mg) (Gibco BRL), and SuperScript Reverse Transcriptase
(200 U; Gibco BRL). Real-time PCR was performed with an iQ5 iCycler
Detection System (Bio-Rad) with a three-step PCR protocol (95°C for
10 min followed by 50 cycles of 95°C for 15 s, 60°C for 30 s, and 72°C for
30 s) with SYBR Green fluorophore. Primers were designed with the
Primer Express software (Perkin-Elmer) (Supplementary Material),
and TNF, IFN-g, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH) have been reported (47). Relative quantification of mRNA
concentrations was performed with the standard curve method, with
amplification of target mRNA and GAPDH mRNA. The standard
curves were created with five serial 10-fold dilutions. The relative amount
of mRNA in each sample was calculated as the ratio between the target
mRNA and the corresponding endogenous control GAPDH mRNA.
Statistical analysis
Differences in EAE incidence and mortality were tested with Fisher’s exact test. Differences in maximum score, cumulative score, onset, cytokine
concentrations, and proliferation were tested with a nonparametric
Mann-Whitney U test. To confirm significant differences, we used the
Kruskall-Wallis test with Dunn’s correction for each rat experiment. Differences in cytokine expression between patients and controls were
tested with the Mann-Whitney U test, whereas the Spearman rank test
was used for analysis of correlation. All comparisons were performed
with GraphPad Prism version 3.0.
The probability of observing three crosses with a QTL and a sequence
difference and five crosses without QTL and sequence difference for the
R63W SNP in Vav1 exon 1 was estimated with the binominal distribution,
estimating the expected proportion in sequence difference as that observed
in all theoretically possible crosses of the strains included in Fig. 3A.
Clinical material for association studies
The first Swedish MS case-control study consisted of 1039 subjects originating from Sweden or other Nordic countries (table S3). The patients
fulfilled the McDonald criteria for MS (46) and were recruited by neurologists at the Karolinska University Hospital. There were two control
cohorts; the first sample consisted of 752 blood donors and the second
cohort consisted of 454 female blood donors. These subjects lived in the
Stockholm area and originated from Sweden or other Nordic countries.
A follow-up study included an additional 2546 patients and 3943
controls from Sweden, Norway, Denmark, and Finland, and 1648
families from Canada and France. For further details, see table S3.
Oral and/or written informed consent was given from all individuals
involved in the study. The local ethics committees in Sweden, Norway,
Denmark, Finland, France, and Canada have approved the study.
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To induce passive EAE, we adoptively transferred immune lymph
nodes from MBP-immunized donors or MBP-specific T cell lines into
naïve syngeneic LEW recipients as described (44). Rats were weighed
and scored daily for clinical signs: 0, normal; 1, limp tail; 2, hindlimb
weakness; 3, unilateral hindlimb paralysis; 4, bilateral hindlimb paralysis;
and 5, bilateral hindlimb paralysis and incontinence (death). The results
are expressed either as the mean daily clinical score of each experimental
group or as the mean of cumulative disease score of each experimental
group, calculated as the sum of the daily disease scores for each individual
animal.
For histology, rats were killed on day 12 after MBP immunization,
and their spinal cords were embedded in paraffin. Paraffin sections
were stained with hematoxylin and eosin (H&E). We also quantified
leukocyte infiltration of the spinal cord of diseased rats on day 12 after MBP immunization as described (45).
RESEARCH ARTICLE
Genotyping of human material
SNPs were genotyped with the TaqMan method (Applied Biosystems).
Of the 40 selected assays, two could not be designed, and seven SNPs
were either not polymorphic or had assays that did not result in clear
distinction between the alleles. The remaining 31 SNPs were analyzed
in all MS patients in the first Swedish cohort and the first set of blood
donor controls. It should be noted that these 31 SNPs do not extract all
the common haplotypes in this genetic region. Four SNPs (rs2546133,
rs308197, rs308194, and rs331679) were genotyped twice in the first
MS cohort. The concordance between the two runs was 98.2%. All discordant genotypes were checked. If the quality differed, the best was
kept; if it was not obvious that one was better than the other, both were
removed from the analysis. All markers were tested for Hardy-Weinberg
equilibrium; one marker (rs339404) showed an increase and one a decrease (rs2660485) in observed homozygotes relative to expected
among controls (P < 0.02 and P < 0.05, respectively). All other markers
were in Hardy-Weinberg equilibrium. Eight markers (rs2617818,
rs2546133, rs2617822, rs2617823, rs164022, rs3786688, rs308194,
and rs331679) were genotyped in the second set of blood donor controls. An additional 18 SNPs were added in regions, which in the initial
association analysis showed evidence of association or which had been
reported to be coding SNPs. These were genotyped in both the Swedish
cohort 1a and the Swedish cohort 1b.
Association analysis
The initial association analysis was performed by testing for difference
in allele frequency between patients and controls with single-marker
analysis in Haploview version 3.32. This was followed by an association
analysis for haplotypes within blocks of high linkage disequilibrium. A
permutation test (n = 10,000) as implemented in Haploview was used to
correct for multiple comparison, including both individual markers and
haplotypes. The evidence of association was also estimated with the Unphased program version 3.0.13 (50) and PLINK with similar results. The
results found with Haploview are presented in the text unless otherwise
stated. Unphased version 3.0.13 was used to perform a joint test of association for all the MS cohorts; the study cohort was used as a covariate
(50). A fixed-effect Mantel-Haenszel meta-analysis and Woolf’s test for
heterogeneity were performed with the meta.MH command in rmeta
package in R. Association analysis between VAV1 mRNA concentrations and haplotype was performed in the Haplo Stats package
(v1.2.1) in R with the haplo.score command.
SUPPLEMENTARY MATERIAL
www.sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/1/10/10ra21/DC1
Materials and Methods
Fig. S1. Fine mapping of Eae4 using interval-specific congenic lines and influence of Eae4 on
TNF expression.
Fig. S2. mRNA expression of candidate genes in 117-kb region.
Fig. S3. Log-likelihood plot showing no evidence of QTL regulating EAE between DA and PVG.
AV1 rat strains.
Fig. S4. VAV1 expression is influenced by the Eae4 locus.
Fig. S5. Lymphocyte proliferation and TNF concentrations are dependent on the TCR stimulation and can be bypassed by stimulus acting downstream of Vav1.
Fig. S6. Linkage disequilibrium and allelic associations.
Fig. S7. VAV1, TNF, and IFN-g mRNA expression in CSF cells.
Table S1. EAE development in Eae4 congenic strains and interval-specific congenic lines.
Table S2. Adoptive EAE transfer experiments.
Table S3. Patient and control material included in the genetic association.
Table S4. Association of markers in the first Swedish multiple sclerosis cohort.
Table S5. Haplotype association in the first Swedish multiple sclerosis cohort.
Table S6. Association of markers in French multiple sclerosis cohort.
Table S7. Association of markers in Swedish multiple sclerosis cohort II.
Table S8. Association of markers in Norwegian multiple sclerosis cohort.
Table S9. Association of markers in Danish multiple sclerosis cohort.
Table S10. Association of markers in Finnish multiple sclerosis cohort.
Table S11. Association of markers in Canadian multiple sclerosis cohort.
References
REFERENCES AND NOTES
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9 December 2009
Vol 1 Issue 10 10ra21
9
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Haplotype tagging
Genotypes available at the HapMap (48) from Caucasian families for
SNPs covering the TRIP10, SH2D3A, and VAV1 genes were used for
identifying tSNPs. One hundred and thirteen SNPs from rs340139 to
rs461970 were used to identify tSNPs. We used TAGGER in Haploview
version 3.32 (49) and ENTROPY as implemented in Marker software
for identifying tSNPs in an unstructured way not limited by recombination block structure, which resulted in only 40 tSNPs.
13. K. Becanovic, E. Wallstrom, B. Kornek, A. Glaser, K. W. Broman, I. Dahlman, P. Olofsson,
R. Holmdahl, H. Luthman, H. Lassmann, T. Olsson, New loci regulating rat myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol.
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51. Acknowledgments: We thank R. Liblau and D. Brassat for helpful comments; the French
network of genetic studies on MS (ReFGenSEP) for their contribution and discussion;
I. Rebeix for the care of the biological resource center on MS genetics; Association de
Recherche sur la Sclérose en Plaques (ARSEP), Association Française contre les Myopathies
(AFM), Centre d’Investigation Clinique Pitié-Salpêtrière, and Généthon for financial support and help; the Zootechnic unit members Institut Fédératif de Recherche 150 for
handling the rats; the members of the MGEN consortium, I. Elovaara, K. Koivisto, T. Pirttilä,
M. Reunanen, and I. Rautakorpi, for ascertaining the Finnish MS samples; the Norwegian
Bone Marrow Donor Registry for collaboration in Norwegian control material; and Ullevål
University Hospital Scientific Advisory Council for support to the Oslo MS Genetics Group,
Norway.
Funding: Swedish Research Council, The Wadsworth Foundation, Söderbergs Foundation,
Petrus and Augusta Hedlunds Foundation, Bibbi and Niels Jensens Foundation, Montel
Williams Foundation, Åke-Wibergs Stiftelse, Swedish Foundation for Neurologically
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Vol 1 Issue 10 10ra21
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RESEARCH ARTICLE
RESEARCH ARTICLE
DNA cohort. I.K. performed human association analysis and contributed to the preparation of
the paper. T.O., G.J.F., and A.S. coordinated the project, designed the research, analyzed the
data, and wrote the paper.
Competing interests: The authors have no conflicting financial interest.
Accession numbers: The SNPs can be found at the National Center for Biotechnology
Information (from 179320110 to 179320127).
Submitted 20 July 2009
Accepted 18 November 2009
Published 9 December 2009
10.1126/scitranslmed.3000278
Citation: M. Jagodic, C. Colacios, R. Nohra, A. S. Dejean, A. D. Beyeen, M. Khademi,
A. Casemayou, L. Lamouroux, C. Duthoit, O. Papapietro, L. Sjöholm, I. Bernard, D. Lagrange,
I. Dahlman, F. Lundmark, A. B. Oturai, H. B. Soendergaard, A. Kemppinen, J. Saarela,
P. J. Tienari, H. F. Harbo, A. Spurkland, S. V. Ramagopalan, D. A. Sadovnick, G. C. Ebers,
M. Seddighzadeh, L. Klareskog, L. Alfredsson, L. Padyukov, J. Hillert, M. Clanet, G. Edan,
B. Fontaine, G. J. Fournié, I. Kockum, A. Saoudi, T. Olsson, A role for VAV1 in experimental
autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Sci. Transl. Med. 1, 10ra21 (2009).
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Disabled, King Gustaf V:s 80-year foundation, EURATools (LSHG-CT-2005-019015), Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637), Fondation Courtin, AFM, Agence Nationale de Recherche
(ANR-06-MIME-020-01), ARSEP, Fondation pour la Recherche Médicale, région Midi-pyrénées, Multiple Sclerosis Societies of Canada and the United Kingdom, Danish Multiple Sclerosis Society, and Warwara Larsen Foundation. C.C. is supported by a grant from ARSEP.
T.O. received unrestricted grant support for CSF studies in general reported in the paper, but
not in particular for the findings in this study, from Biogen Idec, Merck Serono, and SanofiAventis.
Author contributions: M.J., C.C., R.N., O.P., A.S.D., A.D.B., and I.B. designed the research, performed in vivo and in vitro experiments, analyzed the data, and contributed to the preparation of the paper. A.C. and C.D. conducted the biochemistry experiments and contributed
to adoptive transfer experiments. M.J., A.D.B., and R.N. performed sequencing. M.K. performed human expression analysis. M.J., C.C., R.N., L.L., A.D.B., L.S., F.L., and M.S. performed
the genotyping of the Swedish, Danish, Norwegian, and French MS cohorts. M.C., G.E., and
B.F. built the French MS DNA cohort. D.L., G.J.F., M.J., and I.D. generated and characterized
congenic rats. A.B.O. and H.B.S. built the Danish MS DNA cohort. A.K., J.S., and P.J.T. built
and genotyped the Finnish MS DNA cohort. H.F.H. and A.S.9 built the Norwegian MS DNA
cohort. D.A.S., G.C.E., and S.V.R. built and genotyped the Canadian MS DNA cohort. L.K., L.A.,
and L.P. built the Swedish rheumatoid arthritis controls. T.O. and J.H. built the Swedish MS
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11
Résultats
ARTICLE 2 : Identification d’un locus de 117 kilobases qui
contrôle l’atopie chez le rat.
Les maladies allergiques et l’atopie se définissent comme la prédisposition génétique à
développer des réponses IgE exacerbées suite à l’exposition à des allergènes. Le contrôle
génétique de ces réponses IgE peut être exploré à l’aide du modèle des rats LEW-BN traités
par des sels de métaux lourds. Précédemment, notre groupe avait identifié sur l’extrémité
acrocentrique du chromosome 9 du rat, un locus de 1.2 cM nommé Iresp3 (Immune response
locus 3) qui contrôle la production d’IgE en réponse à un sel d’or, l'aurothiopropanol
sulfonate. A l’aide de lignées et sous-lignées congéniques, nous avons affiné la localisation
d’Iresp3 à 117 kb. Nous avons montré que cette région contrôle la production d’IgE et le
développement d’une néphropathie avec syndrome néphrotique, suite à des injections de sels
de mercures (HgCl2) chez le rat BN. La déplétion des lymphocytes T CD8 chez les rats
résistants, exprimant Iresp3 d’origine LEW restaure partiellement la production d’IgE mais
n'a pas d'effet sur la protection vis-à-vis de l'atteinte rénale. L’analyse de la production de
cytokines sous stimulation polyclonale, a montré que les lymphocytes exprimant Iresp3
d’origine LEW produisent des quantités importantes d’IFN-Ȗ, d’IL-17 et d’IL-10 comparés
aux lymphocytes exprimant Iresp3 d’origine BN. Ces résultats suggèrent qu’un (des)
variant(s) génique(s) contrôle(nt) des fonctions lymphocytaires. Un polymorphisme non
synonyme dans l’exon 1 de Vav1 a été identifié, et pourrait être responsable de la modulation
de la réponse IgE et de la maladie rénale provoquées par le traitement aux sels de métaux
lourds. Le contrôle de la réponse IgE par la voie de signalisation impliquant Vav1 pourrait
donc jouer un rôle dans les pathologies humaines allergiques.
93
Résultats
*Manuscript
!"#$%&'('%)*%+*,-!*.+%/.-01#("2)3%456778$96:;6<.=<9>2+?
Positional Identification of a Vav1 Genetic Variant Associated with Atopy and
Autoimmune Nephropathy in Rats
Short title: Association of Vav1 Variant with Atopy
Olivier Papapietro1 , Céline Colacios1 , Christophe Pedros1, Audrey Casemayou1, Isabelle
Bernard1, Valérie Garcia1$, Dominique Lagrange1, Bernard Mariamé1, Olivier Andreoletti2,
Abdelhadi Saoudi1# and Gilbert J. Fournié1#*.
1 INSERM, U563, F-31000 Toulouse, France and University Toulouse III Paul Sabatier, F31000 Toulouse, France
2 UMR INRA ENVT 1225, Interactions Hôte Agent Pathogène, Ecole Nationale Vétérinaire
de Toulouse, 31000 Toulouse, France
*
Corresponding author: e-mail: gilbert.fournie@ inserm.fr.
These authors contributed equally to this work
#
$
: A.S. and G.J.F. contributed equally to this work
Present address: Laboratoire d'allergie (M-4211-K), Centre de Recherche du CHUM,
Hopital Notre Dame, Montreal, Quebec, H2L 4M1 Canada
1
ABSTRACT:
The genetic predisposition to become IgE-sensitized to allergens, also known as atopy, plays
a major role in allergic diseases. The genetics of atopy can be investigated using the BN and
LEW rat strains. BN rats develop a dramatic IgE response to heavy metals like mercury and
gold salts sensitization, whereas the LEW rats do not. Using this rat model, we identified
previously a locus on chromosome 9 named Iresp3 (Immune response locus 3) that directs the
gold salt-triggered IgE response. We have generated interval-specific congenic lines to
narrow down Iresp3 to a small region. We found that BN rats congenic for a 117-kb region of
LEW origin did not develop the IgE response triggered by gold salts or mercuric chloride
(HgCl2) administration. These congenic rats were also protected from the HgCl2-triggered
autoimmune-mediated glomerulopathy. CD8+ cells depletion partly restored the IgE response
in these HgCl2-treated rats, but did not affect the protection against the kidney disease. The
resistance provided by the LEW 117-kb region was associated with an increased capacity of
stimulated CD4+ and/or CD8+ T cells to produce IFN- , IL-17 and IL-10. Among the four
genes of the Iresp3 117-kb locus, we identified non-synonymous polymorphisms, in C3 and
in Vav1.
Several arguments argue for a prominent role of Vav1, a major regulator of
lymphocyte functions, in the control of the IgE response and nephropathy triggered by
xenobiotics. Thus, control of IgE synthesis by a Vav1 pathway may be critical in the
pathogenesis of allergic diseases.
2
AUTHOR SUMMARY
Allergic diseases result from excessive immune reactions against environmental compounds,
called allergens. Immunoglobulins E are products of immune cells reacting with allergens,
which mediate these immune reactions. The genetic predisposition to develop such
immunoglobulin E-mediated reactions is called atopy. The identification of genes underlying
this predisposition is important to understand the mechanisms by which allergic diseases
develop. We used a rat model to identify such genes. Under treatment with heavy metals, the
BN rat develops a high immunoglobulin E response and an autoimmune-mediated
nephropathy while the LEW rat does not. In this BN-LEW rat model, we had previously
found on chromosome 9, a region that controls these features. Using BN rats in which
various parts of the LEW chromosome 9 regions had been introduced into the BN genome,
we now localised this control within a tiny segment. Among the 4 genes contained in this
segment, we found coding polymorphisms in the C3 and Vav1 genes. Several arguments from
the literature and from our own works argue for a prominent role of Vav1 in the control of the
IgE response and of the associated nephropathy. Thus Vav1 could play an important role in
atopy and allergic diseases in humans, which should now be examined.
3
INTRODUCTION:
Atopy, the genetic predisposition to become IgE-sensitized to allergens commonly present in
the environment [1], plays a key role in allergic diseases [2]. Two major obstacles to
understanding allergic diseases are identifying the risk genes and analyzing their
mechanisms of action. It is difficult to achieve these goals in humans due to the genetic
heterogeneity of populations and to the variability of environment. Animal models of human
diseases, particularly in rodents, help to overcome these problems. They can be used for
functional studies under stable environmental conditions. Such investigations may help
identify disease-associated human orthologous genes and pathways [3].
BN rats are used to study atopy and allergic diseases [4,5,6]. Injecting these rats with
mercury or gold salt triggers a T-cell dependent polyclonal activation of B cells that leads to
a dramatic increase in serum IgE concentration and to an autoimmune glomerulopathy [7,8].
Humans exposed to mercury and rheumatoid patients treated with gold salts can develop
similar features [9,10]. The IgE response induced by mercury or gold salts in the BN rat is
mediated by autoreactive T cells [11,12]. These T cells secrete type-2 cytokines [13] that
play a key role in the regulation of IgE synthesis [14]. LEW rats do not produce the gold or
mercury salt-induced IgE response [15]. Thus the combination of BN and LEW strains is a
good model to investigate the genetics of atopy [16]. Using this model we previously
identified a locus on chromosome 9 that plays an important role in the control of the IgE
response triggered by the gold salt aurothiopropanol sulfonate (atps). This locus was named
Iresp3 for immunoglobulin response QTL 3! [17,18]. We have now used a new set of
*
Iresp3 has also been called Atps3 for aurothiopropanol sulfonate QTL 3 and Aiid3 for aurothiopropanol
4
BN.LEW congenic lines and sub-lines to further explore the genetic control of this hyper IgE
response and the involved mechanisms . We have narrowed down Iresp3 to a 117-kb region
and found that it controls the cytokinic profiles of CD4 and CD8 T cells. Among the 4 genes
contained in this region, we discovered non-synonymous polymorphisms in C3 and Vav1.
Several arguments argue for a prominent role of the Vav1 variant in the control of the IgE
response and of the associated nephropathy. This study highlights the possible role of Vav1
pathways in IgE responses and pathogenesis of allergic diseases.
sulfonate-induced immunological disorder QTL 3 (http://rgd.mcw.edu/rgdweb/search/qtls.html?100)
5
RESULTS:
A 117-kb interval on chromosome 9 controls the IgE response induced in BN rats by
injections of gold or mercury salts.
We first determined whether the IgE response induced by mercuric chloride (HgCl2)
injections was controlled by Iresp3. We used two congenic lines (BN.LEWc9-B and
BN.LEWc9-I) characterized by the introgression of a nearly identical 1.2 cM region of the
LEW resistant strain into the susceptible BN genomic background (Table S1). The IgE
concentration in the serum of these congenic rats treated with atps or HgCl2 was much lower
than the concentration in the serum of BN rats (Figure 1A and 1B, and Figure S1). As
expected, LEW rats showed no IgE response to this treatment. These results extended our
previous observations and showed that the IgE response to atps or HgCl2 are both controlled
by the Iresp3 locus.
To localize Iresp3 more precisely, we backcrossed BN.LEWc9-B and BN.LEWc9-I rats with
BN rats and generated a set of five congenic sub-lines, characterized by genomic
recombination within the 1.2 cM interval (Table S1). Four congenic sub-lines (BN.LEWc9Bc,-Bf,-Ia,-Ib) showed lower IgE responses to atps or HgCl2 injections than did BN rats
(Figure 1C and 1D). By contrast, the IgE response of the BN.LEWc9-Be rats was similar to
that of the parent BN rats. Thus, this genetic dissection narrowed down the genomic region
that controls the IgE response to the 117-kb segment that characterizes the BN.LEWc9-Bf
sub-line (Figure 1E and 1F, Table S1). According to our genetic map and the physical map
(available on NCBI Map Viewer with Celera Assembly), this 117-kb interval contains four
genes, C3 (complement 3 precursor), Gpr108 (G protein-coupled receptor 108), Cip4/Trip10
(Cdc42-interacting protein 4), and exons 1 to 15 of Vav1. We sequenced the coding regions of
6
these four genes in BN.LEWc9-Bf, BN and LEW rats and identified two non-synonymous
polymorphisms in exon 32 of C3 (LEW vs. BN: c.4066 A>G; p.Thr1356Ala) and in exon 1 of
Vav1 (LEW vs. BN: c.187 C>T; p.Arg63Trp).
The LEW 117- kb interval also protects BN rats from HgCl2-induced nephropathy.
BN rats treated with HgCl2 not only produce the dramatic IgE response, they also develop an
immune-mediated glomerulopathy characterized by IgG1 deposits along the glomerular
basement membrane, complement activation, heavy proteinuria, and production of antilaminin and anti-DNA auto-antibodies [7,19,20]. We therefore investigated the influence of
the 117-kb region from LEW rats on these features. BN.LEWc9-Bf rats did not develop
glomerulopathy when treated with HgCl2 (Figure 2A). They showed no albuminuria (Figure
2B) and their serum C3 concentration was normal (Figure 2C). Circulating anti-laminin and
anti-DNA antibody concentrations were also not elevated (Figure 2D and 2E). Lastly, the
BN.LEWc9-Bf congenic rats did not show the decrease in body weight that occurred in the
BN rats (mean % + SD change in body weight: day 28/day 0; BN.LEWc9-Bf: 101 + 12, n=5
vs. BN: 71 + 3, n=4: p = 0.016). Thus, the LEW 117-kb region had a dramatic effect on the
immune disorders triggered by HgCl2 injections. It prevented both the IgE response and the
immune-mediated glomerulopathy that occur in BN rats.
The 117-kb locus controls the IgE response partly through a CD8-dependent mechanism.
The well established role of CD8+ T cells in regulating IgE production [21] suggested that
these cells may be involved in the resistance of BN.LEWc9-Bf rats to HgCl2-induced
immunological disorders. We treated HgCl2-injected BN.LEWc9-Bf rats with an anti-CD8
antibody that removed ~85 % of the CD8 T cells (Figure 3A). This treatment partly restored
the IgE response (Figure 3B) but did not restore the production of anti-laminin and anti-DNA
7
antibodies (Figure 3C and 3D) or the development of glomerular lesions. Thus, the LEW 117kb interval prevents the IgE response and the glomerulopathy in HgCl2-treated rats and
removing CD8+ cells partly restores the IgE response.
The LEW 117-kb interval controls the cytokine profiles of CD4+ and CD8+ T cells
We investigated the cellular mechanisms responsible for the resistance of the BN.LEWc9-Bf
rats to HgCl2-induced immunological disorders by comparing the cytokine production by
stimulated T cells from BN and BN.LEWc9-Bf rats. CD4+ and CD8+ T cells isolated from the
two strains were stimulated in vitro for 48 hours with anti-TCR and anti-CD28 antibodies.
Results are shown on figure 4. Stimulated CD4+ and CD8+ T cells from BN.LEWc9-Bf rats
proliferated slightly more than did T cells from BN rats (CD4+: p=0.009; CD8+: p=0.038).
Cytokine production differed greatly. CD4+ and CD8+ T cells from BN.LEWc9-Bf rats
produced more IFN- (CD4+: p=0.01; CD8+: p=0.032) and IL-17 (CD4+: p=0.001; CD8+:
p=0.016) than CD4+ and CD8+ T cells from BN rats. This increase was more pronounced for
CD8+ T cells (IFN- : x~5; IL-17: x~100) than for CD4+ T cells (IFN- : x~2 ; IL-17: x~15).
Moreover CD4+ T cells from BN.LEWc9-Bf rats produced more IL-10 than did T cells from
BN rats (p=0.016). IL-10 was undetectable in cultures of CD8+ T cells and IL-4, IL-5, IL-6
and IL-13 were undetectable in culture of both CD4+ and CD8+ T cells of either strain. The
differences in cytokine production led us to envision the effect of neutralizing antibodies on
the development of HgCl2-induced immune disease in BN.LEWc9-Bf rats. Since neutralizing
anti-rat IL-10 and IL-17 Ab were not available, we only analysed for the impact of the antiIFN- Ab treatment. Anti-IFN- mAb had no effect on the resistance of HgCl2-injected
BN.LEWc9-Bf rats to develop the IgE response and to produce anti-laminin autoantibodies
(Figure S2). Thus, the control by the LEW Ireps3 region of the HgCl2-triggered immune
8
disorders is not mediated by IFN- .
DISCUSSION:
LEW and BN rats, which have opposing susceptibilities to various immunemediated diseases, provide a powerful model for investigating the pathogenesis and genetics
of these diseases [16]. This study examines the genetic control of xenobiotic-induced atopy.
We used a set of interval-specific congenic rat lines to map the Iresp3 locus that controls the
heavy metal-induced immunological disorders to a 117-kb region on chromosome 9. We
demonstrated that this locus controls the cytokinic profiles of CD4+ and CD8+ T cells, and
the HgCl2-triggered IgE response and glomerulopathy.
Iresp3 was one of the three loci identified by linkage analysis in (LEW x BN) F2
rats, in the model of gold salt-induced atopy [17,22]. It was found to have a much greater
effect than the other two [18]. This locus was fully included within Cia15 (collagen-induced
arthritis QTL 15, [23]) and Eae4 (Experimental autoimmune encephalomyelitis QTL 4,
[24]), two quantitative trait loci (QTL) of autoimmune diseases. Cia15, which was described
in a (BBDR x BN) cross, controls joint/bone inflammation in a collagen-induced model of
arthritis. Eae4, which was described in a (DA x BN) cross, controls brain/spinal cord
inflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Our results show that
the 117-kb region on chromosome 9 that controls the IgE response and glomerulopathy
produced in rats by injecting HgCl2 also influences the cytokinic profiles of their CD4+ and
CD8+ T cells. These data indicate that the identified region on chromosome 9 could influence
the immune system and thus the susceptibility to various immune-mediated diseases by
shaping the cytokinic repertoire of immune cells.
The cytokinic profile of immune cells, which is tightly controlled in a complex
9
manner, plays a central role in orchestrating immune responses [25]. We have shown that the
opposing effects of the LEW and BN Iresp3 loci on the HgCl2-triggered immune disorders
are associated with different cytokine profiles of CD4+ and CD8+ cells. Our in vitro studies
in an APC-independent system indicate that stimulated CD4+ and CD8+ T T cells bearing the
LEW Iresp3 locus secrete greater amounts of INF- and IL-17 than do cells bearing the BN
Iresp3 locus. Stimulated CD4+ T cells bearing the LEW Iresp3 secrete also more IL-10 than
do cells bearing the BN Iresp3. The roles of these three cytokines in Th2-driven allergic
immune responses have been shown to be complex. Overall, IFN-
and IL-10 have
protective effects while IL-17 has a dual role [26,27,28]. We provided evidence that the 117kb region of LEW origin prevents the IgE response and nephropathy in an IFN- independent manner. The cellular pathway by which Iresp3 mediates IgE suppression may
involve various other mechanisms [29,30,31,32].
We found that CD8+ depletion partly restores the Iresp3-controled production of IgE
in response to HgCl2. The role of CD8+ T cells in the IgE response has been studied in model
HgCl2-induced immune disorders. CD8+ T cells have been shown to suppress the IgE
response in the model system of induced neonatal tolerance to heavy metals [33]. Mercury
induced a CD8-dependent immunosuppression in LEW rats [15] that controls the
susceptibility to autoimmune diseases [12,34]. However, CD8+ T cell depletion did not
abrogate the LEW resistance to the HgCl2-triggered IgE response [35]. This inability to
produce an IgE response may be related to the non-permissive genomic background of the
LEW strain. Indeed, CD8+ cell depletion did induce a significant IgE response to HgCl2 by
the BN.LEWc9-Bf congenic cells, which have the BN permissive genomic background. This
agrees well with the finding that CD8+ T cells suppress IgE production in BN rats and
10
normalize airway responsiveness in an experimental model of asthma [36,37,38]. In contrast,
CD8+ cell depletion does not restore the susceptibility to autoantibody production and
glomerulopathy. This agrees with studies on HgCl2-treated mice that have shown that the
mechanisms involved in the IgE response and glomerulonephritis are different [39].
We found two non-synonymous polymorphisms in the four genes located within the
117-kb sequence, one in exon 32 of C3 and the other in exon 1 of Vav1. C3 is involved in B
cell activation, T cell-dependent antibody response and tolerance to self antigens [40,41,42].
It also has a role in promoting Th2 effector functions, particularly the IgE response in asthma
[43]. However, le polymorphism of C3 is unlikely to play a major role in the HgCl2-triggered
response since depletion of complement with cobra venom factor has no effect on the
mercury-induced disease [44]. By contrast, several observations support the involvement of
Vav1. First this Rho guanine nucleotide exchange factor, which is specifically expressed in
hematopoietic cells, plays a key role in T cell activation and differentiation [45]. Second,
while no difference is observed in mRNA expression between BN and LEW rat, there is a
four-fold reduction in Vav1 protein expression in BN parental T cells as compared to T cells
from the BN.LEWc9-Bf rats [46], this quantitative feature being likely to affect Vav1dependent signaling pathways in hematopoietic cells. Third, in T cells, Vav1 controls the
function of transcription factors known to modulate cytokine gene expression [47]. Fourth,
in agreement with this latter observation, Th2 response is impaired in patients with Vav1deficient common variable immunodeficiency [48]. Finally, we have recently identified Vav1
as the gene directing the susceptibility to EAE in the Eae4 locus, through its effects on the
production of Th1 cytokines by myelin-specific T cells; on these bases, subsequent
association studies in humans have demonstrated its role in multiple sclerosis [46]. Taken
11
together, these data indicate that the LEW Vav1 variant predisposes to Th1-mediated EAE
and protects from Th2-mediated HgCl2-induced IgE response and immune-mediated
glomerulopathy, while the BN Vav1 variant has opposite effects.
In conclusion, this study illustrates the power of the BN-LEW rat model for
deciphering the genetic control of immune diseases. This experimental approach
complements genome-wide association studies for identifying new candidate genes, as shown
by our investigations on EAE and multiple sclerosis [46]. The results indicate that the same
gene can have opposing effects in different immune-mediated diseases. They also show that a
single gene can direct a major effect on traits under multigenic control. More specifically, the
present study highlights the involvement of the Vav1 pathway in atopy and allergic diseases.
Its role in humans should now be examined.
Materials and Methods
Rats
The rats were housed in polystyrene cages containing low-dust cottonwood bedding, with free
access to water and standard rodent chow, under specific pathogen-free conditions and a 12-h
light/dark cycle,. The rats used in this study were males or females 7-13 weeks old at the start
of the experiment. All breeding and experimental procedures were carried out in accordance
with European Union guidelines and were approved by our local ethics committee.
Specific pathogen-free (SPF) BN rats were obtained from Centre d’élevage R. Janvier (Le
Genest St.Isle, France). The BN.LEWc9 congenic lines were produced as described [18].
Congenic sub-lines were produced by backcrossing F1 hybrids, made by crossing the
congenic line with the recipient strain, with the recipient strain. Litter mates from these
backcrosses that showed recombination events within the Iresp3 locus were selected by
12
genotyping using a set of polymorphic microsatellite markers. The sequences of the forward
and reverse primers of the microsatellite markers defining the congenic lines and sub-lines
(see table 1) are the following: D9Wox24: cctgggaatttcattcttgg; agctgtcctctgaccttcaca.
D9Cel12: ctgtaggccctcacaccacaca; gctcgaaatgcccctcttatc . D9Cel13: cacctccacaggtgcttcacacat;
gtgtgggtgtttttccagcctact.
D9Cel1:
tggtgagatcgttgatctgaggaa;
gggcagaggtagtctcagtcaatg.
D9Cel16: tgtgaccgagtgtgtaagaa; gatactcaatgtggacctct. D9Cel17: tgggactctgtcaccaggactc;
tgactctgaattccactcgcac. D9Cel6: ttgaatggtgcattttgttct; cccagcctttgagctgttta. Genomic DNA was
prepared and genotyping was performed as described in [18]. The selected recombinant rats
were then backcrossed with the recipient strain. The male and female rats produced by this
backcross that were heterozygous for the reduced introgressed region were intercrossed to fix
the recombinant chromosome in the homozygous state. The progeny of this intercross, that
were homozygous for the region, were selected for brother-x-sister mating to found the new
congenic sub-line.
13
Experimental protocols
Rats were injected s.c. with atps (Allochrysine, Solvay Pharma, Paris, France; 20 mg/kg body
weight) or with HgCl2 (Sigma; 0.5 mg/kg body weight) three times a week for 5 weeks. Rats
were weighed and bled retro-orbitally under anesthesia before the first injection, then once a
week until sacrifice. Night urine samples were collected in metabolic cages on days 13, 20, 27
after beginning the injections. CD8+ T cells were depleted by injecting i.v. OX8 mAb (0.5
mg/injection) on day -1 and then weekly. OX21 was used as an isotype control. Depletion
was checked by analyzing the PBMC by flow cytometry on day 14. IFN- was blocked by
injecting rats i.p. with 5mg of DB1-mAb (5mg) on day 0 and then with 3mg DB1-mAb three
times a week, according to the protocol validated in previous works [49].
Antibodies
The mAbs used for flow cytometry and for purifying and activating of T cell subpopulations
were: W3/25 (anti-rat CD4), OX6 (anti-rat MHC class II), OX33 (anti-rat B220), OX8 (antirat CD8 ), OX21 (anti-human C3b inactivator), R73 (anti-rat TCR !), V65 (anti-rat TCR
"#), JJ319 (anti-rat CD28), 341 (anti-rat CD8b), and 3.2.3 (anti-rat NKR-P1). The hybridomas
OX6 and OX8, were kindly provided by Dr. D. Mason (Medical Research Council Cellular
Immunology Unit, Oxford, U.K.) and the hybridomas JJ319, V65, and R73 by Dr. T. Hünig
(Virology and Immunology Institute, Würzburg, Germany). The conjugated anti-rat mAbs
used for flow cytometry were: FITC-conjugated 3.4.1, PE-conjugated R73 (BD Pharmingen,
New Jersey, USA) and APC-conjugated W3.25 (AbD Serotec, Oxford, UK). For ELISA we
used MARE, MARG1 and, as secondary antibody, peroxidase-conjugated-MARK (LOIMEX, Louvain, Belgium). IgG deposits in kidneys were detected with anti rat IgG-FITC
(Bethyl Laboratories, Montgomery, USA), and C3 was detected with mouse anti-C3
complement rat antibody (12E2, Abbiotec, San Diego, USA) and Alexa Fluor® 488 goat
14
anti–mouse IgG antibody (InvitrogenTM).
ELISA.
Enzyme immunoassays were used to measure serum concentration of IgE, IgG1, anti-laminin
and anti-DNA [50].
Albuminuria was measured on urine samples collected overnight in metabolic cages on days
13, 20 and 27 using a competitive ELISA. Microtiter plates (Becton Dickinson, New Jersey,
USA) were coated by incubation for 2h at 37°C with rat albumin (Sigma-Aldrich, L’Isled’Abeau-Chesnes, France); 2µg/ml in carbonate buffer 0.05M pH 9.6), then treated for 1h at
37°C with PBS containing 0.1% casein (PBSC). Urine samples or standards (1/10 final
dilution) were pre-incubated 2h at 37°C with a rabbit anti-rat albumin antiserum (The Binding
Site, Birmingham, UK), diluted 1/1000 in PBSC. These mixtures of urine and anti-albumin
were then incubated in coated plates for 1 h at 37°C. The plates were then washed (PBSTween 20) and bound anti-rat albumin antibodies revealed using a peroxidase-labelled antisheep IgG antibody (Jackson) [50].
Histological and immunohistochemical analysis.
Kidney biopsies were fixed for 24h in formalin, dehydrated for 24 h in 70% ethanol and
embedded in paraffin. Paraffin-embedded sections were stained with hematoxylin-eosin and
examined by light microscopy. Immunohistochemical analyses were done on snap-frozen4µm-thick sections.
Purification of CD4+ and CD8+ T cells.
Spleen cells were teased apart in RPMI (Sigma-Aldrich). Erythrocytes were lysed with NH4Cl
type ACK buffer, and the remaining cells were washed twice with RPMI. T cells were
negatively selected from spleen cells using anti-mouse IgG magnetic microbeads (Dynal,
Oslo, Norway). Briefly, cells were washed with RPMI and incubated for 20 min on ice with a
15
mixture of the mAbs OX6, OX33, 3.2.3, and V65. They were then washed and incubated with
anti-mouse IgG-coupled microbeads under agitation, T cells were purified by magnetic
depletion. The purity of the negatively selected cells was checked by flow cytometry using
triple staining with 3.4.1-FITC, R73-PE, and W3/25-APC (85-90%). CD4+ and CD8+ T cells
were purified from total T cells by staining with R-73-PE, W3/25-APC 3.4.1-FITC. They
were separated on a FACSARIA II SORP (BD Biosciences). The CD4+ and CD8+ T cell
subsets were over 98% pure.
Study of cytokine production under T cell stimulation.
Purified CD4 or CD8 T cells (105 cells) in RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies, Cergy
Pontoise, France) containing 10% FCS, 1% sodium pyruvate, 1% nonessential amino acids,
1% L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin, and 2 x 10–5 M 2-ME were incubated for 48h
with plate-bound anti-TCR mAb and soluble anti-CD28 mAb [51]. The medium was then
removed and stored at –20°C. The cytokine profiles were determined using the rat cytokine/
chemokine panel multiplex (MilliplexTM, Millipore) on a Luminex 100 IS System. The
cytokines investigated were IL-2, IL-4, IL-10, IL-17 and IFN- . Cell proliferation was
measured by the (3H)-thymidine uptake during the last 18 h in culture and results are
expressed as the mean counts/minute of triplicate cultures.
Data analyses
Differences between groups were assessed using the Mann-Whitney non-parametric test (twotailed).
Acknowledgements
We thank the staff of the Zootechnic unit for the breeding care of the rats, and the staff
of the flow cytometry platform at the Institut Fédératif de Recherche 150 and the staff of the
16
GenoToul anexplo platform at the Toulouse Genopole" for their help in cellular and
immunological investigations. The English text was edited by Dr Owen Parkes.
None of the authors has any conflicting financial interests.
Supporting Information
Figure S1. IgE response induced by Atps or HgCl2 injection in BN.LEWc9-I congenic
line. Rats were injected subcutaneously three times a week with aurothiopropanol sulfonate
(atps) at 20mg/kg (A) or mercuric chloride (HgCl2) at 0.5mg/kg (B). IgE concentrations at
the peak of the response to Atps at day 7 (A) and to HgCl2 at day 14 (B). The microsatellite
markers that define the BN.LEWc9-I congenic line are indicated in Table 1. All means
shown are ± SEM.
Figure S2. In HgCl2-treated BN.LEWc9-Bf rats, the IFN- neutralization does not
restore the IgE response. BN.LEWc9-Bf rats were i.p. injected with DB1 (or control PBS)
on day-1 at 5mg/rat then at 3mg/rat every week during two weeks. IgE concentration (A)
and anti-laminin antibody level (B) in serum of control BN rats (n=3), PBS treated
BN.LEWc9-Bf (n=4) and DB1 treated BN.LEWc9-Bf rats (n=4). All means shown are ±
SEM.
Table S1. Genetic map of BN.LEWc9 congenic lines and sub-lines used for Iresp3
genetic dissection.
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Figures legends
Figure 1. Genetic dissection of the Iresp3 locus using congenic sub-lines.
Rats were injected subcutaneously three times a week with aurothiopropanol sulfonate (atps)
20
at 20mg/kg (A, C, E) or mercuric chloride (HgCl2) at 0.5mg/kg (B, D, F). A, B: mean IgE
concentrations ± SEM in BN (n=4), LEW (n=4) and BN.LEWc9-B congenic rats (n=4)
treated with atps (A) or HgCl2 (B). C, D: mean IgE concentrations ± SEM in five BN.LEWc9
congenic sub-lines (n#$% treated with atps (C) or HgCl2 (D); the genetic maps of these
congenic sub-lines are drawn schematically in E and F and are given in Table S1. E,F: IgE
concentrations at the peak of the response to atps at day 7 (E) and to HgCl2 at day 14 (F),
according to the genetic map of the congenics; each point represents the value found in one
rat Columns: black = BN genome; white = LEW genome. On the left are indicated the
microsatellite markers that define the congenic lines and sub-lines as indicated in Table S1.
Figure 2. BN.LEWc9-Bf congenic rats are protected from the HgCl2-triggered
nephropathy. BN and BN.LEWc9-Bf rats were injected subcutaneously three times a week
with HgCl2 at 0.5mg/kg. A: histopathological features in glomeruli at day 28; upper part,
staining for IgG deposits; middle part, staining for C3 deposits; lower part, hemoxylin-eosin
(H&E) staining. B : albuminuria at day 28 (n=9). C: C3 concentrations at day 14 (n=4). D:
anti-DNA antibody at day 14 (A.U.: arbitrary units) (n=9). E: anti-laminin antibody at day
14 (n=9) (A.U.: arbitrary units). All means shown are ± SEM.*: p<0,05; **: p<0,01. ***:
p<0,001.
Figure 3. In HgCl2-treated BN.LEWc9-Bf rats, CD8 depletion restores partly the IgE
response.
BN and BN.LEWc9-Bf rats were injected sub-cutaneously three times a week with mercuric
chloride at 0.5mg/kg and weekly injected with anti-CD8 antibody (OX8 0.5mg/rat) or with
PBS or with a non-reactive control antibody (Anti-Human Factor I, OX21, 0.5mg/rat). A:
Control of CD8 depletion at day 14 by flow cytometry; B: IgE concentration at 21 days in
21
BN (black columns).and BN.LEWc9-Bf (white columns).rats treated with PBS or OX21
(control) or 0X8 (anti-CD8) and injected with HgCl2 ; C and D: anti-laminin and anti-DNA
antibody levels in serum at 21 days of BN (black columns).and BN.LEWc9-Bf (white
columns).treated with PBS or OX21 or 0X8 and injected with HgCl 2; points represent
individual rats (n=3–8) ; columns show the means.
Figure 4. The 117-kb interval impacts on the cytokine profiles of CD4+ and CD8+ T cells.
Purified CD4+ or CD8+ T cells were stimulated with plate-bound anti-TCR mAb and soluble
3
anti-CD28 mAb. Proliferation was measured by the degree of ( H)-thymidine uptake during
the last 18 h of the 48 h culture period and results were expressed as mean counts/minute of
triplicate cultures. Cytokines production was measured after 48 h for IFN- , IL-17, and IL-10
with luminex multiplex kits. Results are expressed as mean concentrations ± SEM (n = 4-6).
*: p<0,05; **: p<0,01.
22
Figure 1
!"#$%&'('%)*%+*,-!*.+%/"01('2%/"01('345.6.6"')(*76+8
A
B
12
IgE (mg/ml)
IgE (mg/ml)
4
3
2
1
0
4
0
7 14 21 28 35
Days
D
1.5
1
0.5
7
14 21 28
Days
6
IgE (mg/ml)
2
IgE (mg/ml)
8
0
0
C
BN
BN.LEWc9-B
LEW
BN.LEWc9-Bc
4
BN.LEWc9-Be
BN.LEWc9-Bf
2
BN.LEWc9-Ia
BN.LEWc9-Ib
0
0
0
7
14 21 28 35
Days
7
14 21 28
Days
F
2
5
1.6
4
IgE (mg/ml)
IgE (mg/ml)
E
0
1.2
0.8
0.4
0
3
2
1
0
D9Wox24
D9Wox24
D9Cel12
D9Cel12
D9Cel1
D9Cel1
D9Cel13
D9Cel13
D9Cel16
D9Cel16
D9Cel17
D9Cel17
D9Cel6
D9Cel6
B
Bc Be Bf Ia Ib
BN.LEWc9-
B
Bc Be Bf Ia Ib
BN.LEWc9-
Figure 1
Figure 2
!"#$%&'('%)*%+*,-!*.+%/"01('2%/"01('345.6.6"')(*76+8
A
IgG
C3
H&E
BN
Bf
B
100
1
80
0.8
C3 (mg/ml)
Albuminuria (mg/24H)
C
60
40
20
BN Bf
***
100
80
60
40
20
0
BN
Bf
0.4
0
BN Bf
**
E
anti-DNA (A.U)
anti-laminin (A.U)
D
0.6
0.2
UD
0
*
100
80
60
40
20
0
BN
Bf
Figure 2
Figure 3
!"#$%&'('%)*%+*,-!*.+%/"01('2%/"01('345.6.6"')(*76+8
A
B
10000
PBS
0 102
103
104
IgE (µg/ml)
11.4
105
CD8
1000
100
OX8
1.8
10
0 102
103
104
CD8
C
105
OX21 OX8
PBS
OX21 OX8
PBS
OX21 OX8
D
200
200
anti-DNA (A.U)
anti-laminin (A.U)
PBS
150
100
50
150
100
50
0
0
PBS
OX21
OX8
PBS
OX21 OX8
PBS
OX21 OX8
Figure 3
Figure 4
!"#$%&'('%)*%+*,-!*.+%/"01('2%/"01('345.6.6"')(*76+8
0
IFN- (U/ml)
Proliferation
(cpmx103)
CD8
T cells
100
0
10
5
25
*
200
15
0
BN Bf
300
20
1200
800
400
1600
0
200
*
20
15
10
5
BN Bf
800
400
0
*
160
120
80
40
0
*
1200
BN Bf
BN Bf
0
BN Bf
*
IL-10 (pg/ml)
100
1600
UD
BN Bf
BN Bf
1600
IL-10 (pg/ml)
200
*
IL-17 (pg/ml)
25
IL-17 (pg/ml)
**
IFN- (U/ml)
CD4
T cells
Proliferation
(cpmx103)
300
1200
800
400
0
UD UD
BN Bf
Figure 4
Résultats
ARTICLE 3 : Le polymorphisme R63W contrôle les fonctions de
Vav1 et le développement des cellules T régulatrices Foxp3+.
L’homéostasie du système immunitaire est contrôlée en périphérie par des
lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3+ régulateurs (Treg). Les Treg sont capables de contrôler
l’activation et la prolifération des LT conventionnels (Tconv) CD4+CD25- via des
mécanismes suppresseurs encore mal compris. Le défaut quantitatif ou qualitatif des Treg
engendre des désordres immunologiques comme illustrés chez les patients IPEX ou les souris
Scurfy (mutation dans le facteur de transcription Foxp3).
Dans cette étude, nous avons identifié sur le chromosome 9 du rat, un locus qui
contrôle la taille de la population Treg, sans affecter leurs fonctions suppressives ni le
compartiment Tconv. Ce locus nommé Fort1 (Foxp3 Regulatory T cells, locus 1) contient 4
gènes dont Vav1, un facteur d’échange nucléotidique essentiel au développement et à la
fonction des lymphocytes T. L’établissement d’une carte haplotypique chez 6 souches
différentes de rats a permis d’associer la différence quantitative de Treg au polymorphisme
non synonyme dans l’exon 1 de Vav1, conférant la substitution d’une arginine par un
tryptophane en position 63 (R63W). La présence d’un tryptophane (Vav-63W) est associée à
une proportion et un nombre absolu de Treg augmentés dans le thymus et en périphérie. Elle
s'associe également à une quantité moindre de protéine Vav1 dans les cellules immunes, à une
hyperphosphorylation de Vav1 sur des groupements tyrosine, et à une augmentation de son
activité GEF (Guanine Exchange Factor). La diminution de la quantité protéique pourrait
avoir des conséquences fonctionnelles du fait d’une altération des fonctions adaptatrices de
Vav1. Ce dysfonctionnement pourrait expliquer la diminution de l'influx calcique dans les
cellules possédant la variant Vav1-63W, après engagement du TCR
En conclusion, ce travail montre que Vav1 est un nouvel acteur dans la génération
thymique des Treg et suggère qu’une variation quantitative ou fonctionnelle de Vav1 pourrait
contribuer aux maladies d’origine immunes.
95
.
The p.Arg63Trp polymorphism controls Vav1 functions and Foxp3 regulatory T cell
development
Céline Colacios1,2,3*, Audrey Casemayou1,2,3*, Anne S. Dejean1,2,3, Frédérique GaitsIacovoni4, Christophe Pedros1,2,3, Isabelle Bernard1,2,3, Dominique Lagrange1,2,3, Marcel
Deckert5, Lucille Lamouroux1,2,3, Maja Jagodic6, Tomas Olsson6, Roland S. Liblau1,2,3,
Gilbert J. Fournié1,2,3≠ and Abdelhadi Saoudi1,2,3≠§
1
Inserm, U1043, Toulouse, France; 2CNRS, U5282, Toulouse, France; 3Université de
Toulouse, UPS, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP), Toulouse, France.
4
INSERM UMR1048, Institut des maladies métaboliques et cardiovasculaires Toulouse,
France.
5
INSERM U1038, 06202 Nice, France and Université Nice Sophia-Antipolis, 06202 Nice,
France.
6
Department of Clinical Neuroscience, Center for Molecular Medicine, Neuroimmunology
Unit, Karolinska Institutet, S-17176 Stockholm, Sweden
* and ≠ These authors contributed equally to the work
§
Corresponding author: Dr Abdelhadi Saoudi, INSERM U1043, Hôpital Purpan,
BP 3028, 31024 Toulouse Cedex 3, France.
Phone: 33-562-744-512; Fax: 33-562-744-558; E-mail: [email protected]
Condensed title: Vav1 controls regulatory T cells development.
Total number of characters: 30267
Text: 24636; Fig. 1: 1250; Fig.2: 1250; Fig.3: 1250; Fig.4: 1250; Table 1: 1250
1
Abstract
CD4+ regulatory T cells (Treg) expressing the transcription factor Foxp3 play a pivotal role in
maintaining peripheral tolerance by inhibiting the expansion and function of pathogenic
conventional T cells (Tconv). In this study, we show that a locus on rat chromosome 9
controls the size of the natural Treg compartment. Fine mapping of this locus with intervalspecific congenic lines and association studies using single nucleotide polymorphisms
identified a non synonymous single nucleotide polymorphism in the Vav1 gene that leads to
the substitution of an arginine by a tryptophan (p.Arg63Trp). This p.Arg63Trp polymorphism
is associated with increased proportion and absolute numbers of Treg in thymus and
peripheral lymphoid organs, without impacting on the size of the Tconv compartment. This
polymorphism is also responsible for Vav1 constitutive activation, revealed by its tyrosine
174 hyperphosphorylation and increased guanine nucleotide exchange factor activity.
Moreover, it induces a marked reduction in Vav1 cellular contents and a reduction of calcium
flux after TCR engagement. Together, our data reveal a key role for Vav1-dependent T cell
antigen receptor signaling in natural Treg development.
2
Introduction
Naturally derived regulatory T cells (Treg) are generated in the thymus and play a
pivotal role in preventing pathological immune responses including autoimmunity,
inflammation and allergy (Sakaguchi et al., 2008). Foxp3, a member of the forkhead
transcription factors, has been identified as the master regulator for the development and
function of Treg (Zheng and Rudensky, 2007). Deficiencies in Foxp3 cause a lethal
lymphoproliferative disorder in scurfy mice and are associated with immunodysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy and X-linked syndrome in humans. Studies using Foxp3–
GFP reporter mice revealed that Foxp3 expression is associated with suppressor activity
irrespective of CD25 expression (Fontenot et al., 2005). Finally, the maintenance of Foxp3
expression in mature Treg is needed to maintain the transcriptional and functional program
established during Treg development. These findings demonstrate that Foxp3 acts as a Treg
cell lineage specification factor, programming the development and the suppressive activity of
Treg.
Thymic differentiation of Treg is instructed by the intensity of signaling via the TCR
and is regulated by costimulatory receptors such as CD28 and cytokines, including IL-2
(Josefowicz and Rudensky, 2009). TCR signaling controls Treg and Tconv development
differently. Treg development is favored under conditions of TCR signaling with high
strength that promotes negative selection of Tconv (Carter et al., 2005; Hsieh et al., 2004;
Jordan et al., 2001). In addition, deficiency of several pleiotropic signaling molecules,
including TAK1, Bcl10, CARMA1, PKCθ, IKK-β, c-Rel, LAT and Foxo1/Foxo3a proteins
severely impairs Treg cell development, whereas it only marginally affects Tconv
development (Gupta et al., 2008; Koonpaew et al., 2006; Medoff et al., 2009; Ouyang et al.,
2010; Wan et al., 2006). However, the signaling pathways precisely involved in Treg
development remain poorly characterized.
3
Vav1 is a key signal transducer downstream of the TCR and is mandatory for the
development and activation of T cells (Turner and Billadeau, 2002; Tybulewicz, 2005). In the
present study, we demonstrate a major role for Vav1 protein in natural Treg development. The
analysis of the genetic factors responsible for the difference in the size of the Treg
compartment between two rat strains led to the identification of a non-synonymous
polymorphism in the first exon of Vav1, responsible for the substitution of an arginine by a
tryptophan at position 63 (p.Arg63Trp or R63W). Associated with this substitution, we
observed an increased proportion and absolute numbers of Treg in peripheral lymphoid
organs, which most likely result from an increased output of Treg from the thymus. The
Vav1-W63 variant is constitutively active and its cellular protein levels are markedly reduced.
This is associated with decrease in calcium mobilization under TCR activation. Thus, our
study highlights the importance of Vav1 in Treg development and the role that Vav1signaling alterations could play in susceptibility to immune diseases.
4
Results and discussion
BN rats have higher proportions and absolute numbers of CD4+Foxp3+ Treg than LEW
rats. We investigated CD4+Foxp3+ Treg development in LEW and BN rats, two strains that
differ strikingly in their susceptibility to immune diseases (Fournié et al., 2001). Flow
cytometry analysis of CD4+Foxp3+ T cells in PBMC, LN and spleen revealed that the
proportion (Fig. 1A) and absolute numbers (Fig. 1B) of Foxp3+ cells among CD4+ T cells
were significantly higher in BN than in LEW rats. Similar results were observed in double
positive (DP) CD4+CD8+ and single positive (SP) CD4+CD8- thymocytes (Fig. 1C, 1D)
suggesting that these differences were probably acquired early during thymic ontogeny. To
assess whether this difference was intrinsic to hematopoietic cells or due to extrinsic factors,
hematopoietic progenitor cells from either LEW or BN bone marrow were differentiated in
the same thymic (LEW x BN) F1 environment. While similar levels of chimerism were
achieved in (LEW x BN) F1 recipients regardless of the donor origin, higher percentages of
CD4+Foxp3+ donor T cells were found in PBMC, LN and spleen from F1 rats receiving BN
bone marrow cells (Fig. 1E). Thus, the difference in size of the Treg compartment between
LEW and BN rats is controlled by factors that are intrinsic to hematopoietic cells.
Fort1, a 117 kb locus on chromosome 9, controls the size of the natural Treg population.
We previously identified a 17 cM interval on chromosome 9 (c9) that controls the size of the
CD45RClow CD4+ population in BN and LEW strains (Subra et al., 2001). Since Foxp3+ T
cells were restricted to this population (Fig. S1), we reasoned that the genetic control of Treg
population might also be located in this interval. Using a panel of BN congenic lines and sublines for various LEW genomic regions of c9 (BN.LEWc9), we identified an interval of 117
kb that exerts a major effect on the proportion of CD4+Foxp3+ T cells (Fig. 2A, 2B). Indeed,
while the size of the Treg population was unchanged in BN.LEWc9-C, -H and -Be congenic
5
lines when compared to BN rats, it was markedly reduced in -Ia, -B, -Bc and -Bf congenic
lines, reaching values close to those found in LEW rats. Results were similar when CD4+
Foxp3+ T cells were analyzed in LN, spleen or thymus (unpublished data). By contrast, this
locus, named Fort1 for Foxp3+ regulatory T cell locus 1, did not influence the size of the
conventional CD4+Foxp3- compartment (Fig. S2). We then tested if Fort1 had an impact on
the suppressive function of the Foxp3+ CD4+ T cells, using an in vitro assay. Purified
CD4+CD25+ T cells from BN and Bf rats did not proliferate when cultured with allogenic Tcell depleted APC, indicating that they are anergic (Fig. 2C). Importantly, they suppressed the
proliferation of naïve CD4+ T cells from (LEW x BN) F1 rats with similar efficacy, thus
showing that the in vitro suppressive potential of Treg is independent of the genomic origin of
Fort1 (Fig. 2D). Moreover, by using LEW.BNc9 and DA.BNc9 congenics (LEW or DA
congenic rats for BN Fort1) and BN-1L rats (BN rats congenic for LEW MHC), we further
demonstrated that the control of Fort1 on the size of the Treg compartment was independent
of the genetic background and MHC haplotype (Fig. S3). Thus, the 117 kb Fort1 region
contains a gene, or a set of genes, that exerts a pivotal control on the size of Treg
compartment.
Identification of a Vav1 polymorphism that controls the size of the Treg compartment.
Physical and high-density marker genetic maps of the 117 kb Fort1 region were constructed
using Celera and NCBI rat genome databases. We identified four genes within Fort1: C3
(complement 3 precursor), Gpr108 (G protein coupled receptor 108), Trip10/Cip4 (Cdc42interacting protein 4), and Vav1 (Fig. 2B). Since we did not find any differences in mRNA
expression of these four genes between LEW, BN and BN.LEWc9-Bf CD4 T cells (Fig. S4),
we investigated differences in single nucleotide polymorphisms (SNPs) by sequencing their
coding regions. The 15 SNPs identified were then genotyped in the smallest congenic line
(Bf) and in four additional rat strains (DA, PVG, BB, ACI). No polymorphism was found in
6
Trip10 gene and the polymorphisms found in Gpr108 were synonymous, thus rendering
improbable the involvement of these genes (Table 1). Conversely, identification of two nonsynonymous SNPs in C3 and Vav1 made them strong candidates for the control of Treg
development. Vav1 appeared to be the strongest candidate gene since it is specifically
expressed in hematopoietic cells (Katzav et al., 1989), and Fort1 control is intrinsic to
hematopoietic cells (Fig. 1E), whilst C3 is mainly produced is the liver (Alper et al., 1969). A
further argument for excluding the involvement of the C3 non-synonymous polymorphism is
based on the haplotypic mapping conducted in 6 rat strains and in the BN.LEWc9-Bf
congenic since the percentage of Foxp3+ CD4+ T cells found in the BB rats is similar to that
found in all the tested strains except the BN strain (Table 1). Hence, the c.244C>T SNP in
exon 1 of Vav1 is the only SNP that correlates with the Treg phenotype. This SNP results in
the substitution of an arginine (R) by a tryptophan (W) in BN Vav1 at position 63 in the N
terminal calponin homology (CH) domain (p.Arg63Trp or R63W). Altogether, these results
strongly suggest that the Vav1 R63W polymorphism plays a prominent role in the control of
Foxp3+ CD4+ T cells, in the absence of involvement of the three other genes present in the
117 kb interval.
The Vav1 R63W polymorphism controls Vav1 cellular protein levels. We next analyzed the
impact of the Vav1 R63W polymorphism on Vav1 protein expression. We used rat CD4+ T
cells expressing the Vav1-W63 (BN rats) or the Vav1-R63 (LEW, BN.LEWc9-Bf rats)
variants. Immunoblotting revealed that levels of Vav1 were markedly lower in thymic and
peripheral BN CD4+ T cells (Fig. 2E). The same difference was also observed in CD4+CD25+
(Treg) and in CD4+CD25- (Tconv) (Fig. S5). To test if the reduced Vav1 protein expression is
the direct consequence of the R63W polymorphism, we performed experiments in HEK293
cells transfected with plasmids coding for human VAV1-R63 (wild type), VAV1-W63
(mutated), or the oncogenic human VAV1 (VAV1-∆CH) that lacks the first 67 N-terminal
7
amino acids and is known to be constitutively active. The protein levels of VAV1 was lower
in HEK293 cells transfected with VAV1-W63 when compared to that of HEK293 cells
transfected with VAV1-R63 (Fig. 2F). A similar observation was made in HEK293 cells
transfected with plasmids coding for rat Vav1 variants (unpublished data). The decreased
VAV1 protein expression is also found in HEK293 cells transfected with VAV1-∆CH (Fig.
2F). Thus, these data show that the Vav1 R63W polymorphism impact on cellular content of
Vav1 and suggest that the Vav1-W63 variant might share biochemical and functional
properties with the constitutively active VAV1-∆CH.
Vav1 R63W polymorphism influences Vav1 functions. Vav1 functions as a guanine
exchange factor (GEF) for small GTPases thereby facilitating their transition from an inactive
(GDP-bound) to an active (GTP-bound) state. Vav1 is also an adaptor molecule that
participates in protein-protein interactions. Following TCR engagement, Vav1 is rapidly
phosphorylated, in particular in tyrosine 174 (Tyr174), which is crucial to Vav1 activities
(Aghazadeh et al., 2000; Lopez-Lago et al., 2000). To analyze the impact of Vav1 R63W
polymorphism on Vav1 functions, we first performed biochemical studies in HEK293 cells
transfected with plasmids coding for human VAV1-R63 (wild type), VAV1-W63 (mutated),
or the constitutively active VAV1 (VAV1-∆CH). Both VAV1-W63 and VAV1-∆CH show
increased phosphorylation on total tyrosines (Fig. 3A) and Tyr174 (Fig. 3B) and displayed
enhanced GEF activity (Fig. 3C) as compared to VAV1-R63. This increased GEF activity
resulted in elevated activation of Rac1 (Fig. 3D), the VAV1 preferential downstream
effectors, but also a stronger activation of RhoA (~17-fold compared with ~3-fold for Rac1)
(Fig. 3E). Confocal examination of transiently transfected HEK293 cells showed that VAV1R63 did not induced major morphological changes whereas the expression of VAV1-W63
induced lamellipodia formation and pronounced rounding of the cell body as a results of actin
cytoskeleton contractility (Fig. 3F). These morphological changes are reminiscent of what
8
was observed for VAV1-∆CH (Fig. 3F and (Lopez-Lago et al., 2000)). Together, these data
demonstrate that the VAV1-W63 mutation leads to its constitutive activation.
To analyze the impact of TCR engagement on Vav1 activities, we also performed
biochemical analysis on purified CD4+ T cells from BN (Vav1-W63) and BN.LEWc9-Bf
(Vav1-R63) rats. In agreement with our results on HEK293 cells, we showed that Vav1 in BN
CD4+ T exhibits an increased global phosphorylation on Vav1 tyrosines (Fig. 4A) and Tyr174
(Fig. 4B) as compared to Bf CD4+ T cells, both at basal state and following TCR engagement.
The activation of Rac1 (Fig. 4C) and RhoA (Fig. 4D) GTPases was, however, modest as
compared to transfected HEK293 cells expressing similar levels of Vav1 protein. These data
suggest that the increased Vav1-W63 activity in the CD4+ T cell might be counterbalanced by
the decrease in Vav1 protein amount, thus maintaining GEF activity close to physiological
levels. Using confocal microscopy, we next showed that localization and recruitment of
Vav1-W63 to TCR-inducible complexes are not altered since we observed similar colocalization of Vav1 in BN and Bf CD4+ T cells (Fig. 4E). Recently, it has been shown that
many critical events involved in T cell activation, such as TCR-triggered calcium flux, were
mediated by a GEF-independent function of Vav1 that can act as an adaptor (Miletic et al.,
2009; Saveliev et al., 2009). We therefore assessed the effect of R63W polymorphism on Ca2+
flux in thymic and peripheral CD4+ T cells. CD4+ T cells bearing Vav1-W63 (BN rats) had
lower TCR-induced Ca2+ flux than those bearing Vav1-R63 (Bf and LEW rats) (Fig. 4F).
Together, these data show that the Vav1 R63W polymorphism has major consequences on
Vav1 biochemical properties, triggering a state on constitutive activation that leads to the
imbalance between Vav1 GEF-dependent (Rac1 and RhoA activation) and GEF-independent
(Ca2+ flux) functions.
9
A recent report described the process of cooperative autoinhibition maintaining Vav1 protein
in an inactive state and shed light on the molecular mechanisms whereby the Vav1-W63
variant might modify Vav1 functions (Yu et al., 2010). This work showed that the CH domain
plays a key role in strengthening the interaction of the catalytic Dbl homology (DH) domain
with an helix of the adjacent acidic domain, which leads to the autoinhibition of the GEF
activity. This core inhibitory interaction is relieved by phosphorylation of Tyr174. The
phosphorylation of two other tyrosines, Tyr142 and Tyr160, modulates the CH-inhibitory
helix by making Tyr174 more accessible to kinases. Of peculiar interest, the side chain of
Tyr160 is in contact with Arg63 in the CH domain (Yu et al., 2010). Based on these data, we
hypothesize that replacement of the basic arginine by the hydrophobic tryptophan in position
63 might induce a modification of the tertiary structure that could make Tyr174 more
accessible to phosphorylation. This mechanism would fully account for the similar behavior
of the Vav1-W63 and Vav1-∆CH variants. The activation of Vav1-W63 is associated with a
~4-fold reduction of protein expression that might maintain Vav1 GEF activity close to
normal levels but would impact on Vav1 GEF independent functions as revealed by the
reduction of Ca2+ flux. Together with recent studies showing that Vav1 GEF activity is not
required for the development of CD4+CD25+ T cells (Saveliev et al., 2009), these
observations suggest that Vav1-W63 could influence Treg development through an effect on
Vav1 GEF independent functions.
The link between the Vav1-W63 variant and the development of the Treg remains
unknown. The size of Treg compartment can be altered through modulations of the strength of
TCR signals. For example, enrichment in Treg was observed when TCR signaling was
enhanced by the loss of the tyrosine phosphatase SHP-1, a negative regulator of TCRmediated signaling (Carter et al., 2005). Enrichment was also observed when developing T
cells were exposed to their cognate peptides with high-avidity interactions (Cabarrocas et al.,
10
2006; Jordan et al., 2001; van Santen et al., 2004). Thus, in rats carrying the Vav1-W63
variant, the increased development of Treg might result from Vav1-W63 dependent
modifications in signaling pathways downstream the TCR.
Given the link existing between Treg defects and autoimmunity (Sakaguchi et al.,
2008), our findings may have important implications. We recently provided evidence that
Vav1 plays a central role in susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis
(Jagodic et al., 2009). Our present findings suggest that this may be related to the effects of
Vav1 on the Treg compartment. Thus, genetic or acquired alterations in Vav1-dependent
signaling could impact on the susceptibility to immune-mediated diseases through effects on
Treg development.
11
Experimental Procedures
Animals. All breeding and experimental procedures were carried out in accordance with
European Union guidelines and were approved by the local ethics committee. Rats were kept
under specific pathogen-free conditions. Lewis (LEW), Brown-Norway (BN) and Dark
Agouti (DA) rats were obtained from Centre d’Elevage Janvier (Le Genest St Isle, France).
(LEW x BN) F1 rats and congenic lines were produced in our animal facility. The BN
congenic lines for LEW chromosome 9 (BN.LEWc9) used in this study are summarized in
Table S1 and were developed in our laboratory as described (Mas et al., 2004). The
LEW.BNc9 and DA.BNc9 congenic lines for BN chromosome 9 and the BN congenic for
LEW MHC (BN-1L) were described previously (Cautain et al., 2001; Jagodic et al., 2009).
The animals used in this study were 8–12 weeks of age.
Antibodies, cell staining and flow cytometry. The mAbs used for flow cytometry or
purification of T cell subpopulations were as follows: W3/25 (anti-rat CD4), OX6 (anti-rat
MHC class II), OX8 (anti-rat CD8), OX12 (anti-rat kappa light chain), OX22 (anti-rat
CD45RC), OX39 (anti-rat CD25), R73 (anti-rat TCRαβ), V65 (anti-rat TCRγδ), 3.4.1 (anti-rat
CD8αβ) and 3.2.3 (anti-rat NKR-P1). The hybridomas OX6, OX7, OX8, OX12, OX22,
OX39, OX40, OX85 and W3/25 were kindly provided by Dr D. Mason (Oxford, UK) and the
hybridomas JJ319, V65, and R73 by Dr T. Hünig (Würzburg, Germany). The mAbs used for
flow cytometry were fluorochrome conjugates either prepared in our laboratory or purchased
from BD Biosciences and eBioscience. The biotinylated mAbs 42-3-7 (RT1-An haplotype)
and 163-7F3 (RT1-Al haplotype) were kindly provided by Dr. H. Kunz (Pittsburgh, PA).
Foxp3 intracellular expression was detected using APC labeled anti-mouse/rat Foxp3 Staining
Set from eBioscience (San Diego, CA, USA), according to their standard protocol. Data were
12
collected on FACS-Calibur or LSRII cytometers (Becton Dickinson, San Jose, CA) and
analyzed using Flowjo or Cell Quest software package (Becton Dickinson).
Bone-marrow chimeras. (LEW x BN) F1 rats were lethally irradiated (950 rads) one day
prior to bone marrow transplantation. Recipient rats were given 108 viable nucleated bone
marrow cells intravenously. Fourteen weeks post-engraftment, the PBMC, spleen and lymph
nodes were analyzed for T cells of donor or recipient origin by using RT1-A haplotypespecific mAbs and for expression of Foxp3 in CD4+ T cells of donor origin.
Purification of T cell subsets. Rat CD4+ T cells were negatively selected from lymph node
and spleen cells by using a cocktail of the following mAbs: OX6, OX8, OX12, 3.2.3, and
V65. After washing and incubating with anti-mouse IgG magnetic microbeads (Dynal, Oslo,
Norway), CD4+ T cells were purified by magnetic depletion. Both OX8 and W3/25 were
added to the cocktails for the purification of a ‘non-T cell’ fraction that included B cells and
monocytes/macrophages. SP CD4+ thymocytes T cells were negatively selected from thymus
using OX8 mAb and anti-mouse IgG magnetic microbeads (Dynal, Oslo, Norway). The purity
of CD4+ T cells was higher than 92%. For Treg purification, negatively selected CD4+ T cells
were stained with 341-FITC (anti-rat CD8β), R73-APC (anti-rat TCRαβ), W3/25-PB (anti-rat
CD4), and OX39-PE (anti-rat CD25) and were electronically sorted using a FACS Aria IISorp (BDbioscience). The purity of the cells was higher than 99%.
Proliferative responses, Treg suppression assays. For Treg suppression assays, purified
(LEW x BN) F1 CD4+CD45RChigh T cells (105/well) were stimulated with irradiated
allogeneic APC (0.5x105/well; T cell-depleted splenocytes from DA rats) alone or in presence
of decreased numbers of FACS-sorted BN or Bf CD4+CD25+ Treg and cultured in 96-well
plates for 72 hours. Proliferation was analyzed by [3H]thymidine incorporation during the last
18 hours.
13
Sequencing. The sequencing templates were amplified from genomic DNA and the
sequencing reactions were carried out using the BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems)
Products were separated and recorded on an ABI 3100 (Applied Biosystems). Sequences were
analyzed with Vector NTI software (InforMax). SNPs identified by comparing LEW and BN
coding sequences and UTRs of all genes in the region of 117 Kb were subsequently typed in
additional rat strains using the same procedures.
Plasmids, DNA Constructs, Mutagenesis and transfection. Studies were performed using
human VAV1 to benefit from the availability of a positive control, the oncogenic human
VAV1 (VAV1-∆CH) that lacks the first 67 N-terminal amino acids (VAV1-∆CH) and known
to be constitutively active. pEF-VAV1-myc plasmid encoding either human VAV1 cDNA or
oncogenic human VAV1 were described previously (Deckert et al., 1996). The mutation in
human VAV1 at the position c.244C>T (R63W) of the sequence coding for the R63W
substitution was introduced by site-directed mutagenesis using the QuickChange II XL SiteDirected Mutagenesis kit (Stratagene), following the manufacturer's instructions. Mutation
was
introduced
using
the
following
GAGGTCAACCTGtGGCCCCAGATGTCCC-3’
primers,
and
forward:
reverse:
5’5’-
GGGACATCTGGGGCCaCAGGTTGACCTCA-3’. The lower case letters indicate the
mutations. The nucleotide sequence of each construct was verified by DNA sequencing.
HEK293 fibroblasts were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented
with 10% fetal calf serum (FCS). HEK293 were transfected using Effectene (Qiagen,
Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Experiments were carried
out 20h post transfection.
Relative quantification of mRNAs by real-time quantitative RT-PCR. Total RNA was
extracted by RNeasy mini kit (Qiagen). Reverse transcription was performed using
Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Real-time PCR was performed on LC480
14
(Roche) using PCR Syber Green kit (Roche). The relative amount of mRNA in each sample
was calculated as the ratio between the target mRNA and the corresponding endogenous
control GAPDH mRNA.
Calcium flux. CD4+ T cells or CD4+SP thymocytes were loaded at 37°C for 30 min with the
fluorescent calcium indicator Indo-1 (Invitrogen) at 5 µM. The cells were then washed and
incubated with 10 µg/ml anti-TCR mAb (R73) at 37°C for 15 min. Calcium influx was
measured by flow cytometry on a LSR II (Becton Dickinson). Baseline levels were measured
for 50–100s, at which time rabbit anti-mouse (Sigma-Aldrich) was added at 50 µg/ml as a
cross-linker. Events were recorded for an additional 150–200s. Finally, ionomycin was added
at 2 µg/ml to all samples to verify Indo-1 labeling. Relative calcium concentrations were
measured as the ratio between the calcium-bound dye and the calcium-free dye. Data were
analyzed using FlowJo software.
Immunoblotting and Immunoprecipitation. Vav1 protein expression and phosphorylation
were analyzed on lysates from rat CD4+ T cells or from HEK293 cells 20 h after transfection
with 2µg of human wild type VAV1-R63, the mutated VAV1-W63 or oncogenic VAV1-∆CH
plasmids. In some experiments, rat CD4+ T cells were stimulated with anti-TCR mAb (R73)
used at 10µg/ml and rabbit anti-mouse at 50µg/ml for 1 min at 37°C. Total cellular proteins
were extracted with ice-cold lysis buffer containing 10 mM Tris HCl, 1% Triton X100, a
cocktail of protease inhibitors (complete Mini, EDTA-free, Roche), 50mM NaF, 1mM
Na3VO4, and 1mM DTT. For immunoprecipitation, clarified homogenates were incubated
overnight at 4°C with the antibodies and a mix of protein A/G sepharose beads. After washes,
proteins were eluted with Laemmli buffer and analyzed by SDS-PAGE followed by Western
blotting on Immobilon-P membranes (Millipore) with appropriate antibodies (Vav-1 antibody,
Santa Cruz, clone D7; β-Actin antibody, Sigma, clone AC-15; phosphotyrosine antibody,
15
Upstate Biotechnology, clone 4G10; phosphotyrosine 174 of Vav1 antibody, Santa Cruz).
Immunoreactive bands were detected by chemiluminescence with the SuperSignal detection
system (Pierce Chemical Co, Rockford, IL). Bands intensities were quantified using the Scion
Image software.
GTPase pull down assays. HEK293 cells were transfected with 1µg of wild type VAV1R63, or 2µg of mutated VAV1-W63 or 2µg of oncogenic VAV1-∆CH. 3h post transfection,
cells were serum-starved overnight before being processed. The amounts of GTP-bound
active Rac1 or RhoA were determined by GST pull-down assay. Cells were lysed in ice-cold
lysis buffer (50mM Tris-base pH 7.4, 500mM NaCl, 10mM MgCl2, 2.5mM EGTA, 1% Triton
X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, and a tablet of
protease and phosphatase inhibitors) and clarified lysates were incubated with 30µg GSTPBD (PAK1 Binding Domain for Rac1) or GST-RBD (Rhotekin Binding Domain for RhoA)
bound to glutathione sepharose at 4°C for 30min. Beads were washed with 50mM Tris-base
pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 5mM EGTA, 1% triton X-100 and GTP-bound GTPases
eluted with Laemmli buffer and subjected to SDS–PAGE followed by western blotting.
Active VAV1 was purified using the nucleotide-free mutant Rac1G15A (Cell Biolabs Inc.)
that displays a strong affinity for active GEFs (Garcia-Mata et al., 2006). VAV1 was detected
by western blotting using VAV1 antibody (Santa Cruz Inc., D7 clone) on pull down cell
extracts.
Immunofluorescence staining. Freshly isolated CD4 T cells were incubated for 15min with
mouse anti-rat TCR (10µg/ml) at 4°C. CD4 T cells were then stimulated or not with a goat
anti-mouse IgG (50µg/ml) for 15 min. Cells were fixed with 4% PFA and plated on Poly-DLornithine (0.5 mg/ml; Sigma-Aldrich) for 15 min. Upon washing with PBS, cells were
permeabilised with 0,1% Triton 100X, saturated with 1% BSA and incubated with antibody
16
against Vav1 (Santa Cruz Biotechnology; 1/200 dilution) for 20min at room temperature.
Secondary antibodies used were Alexa Fluor 594-conjugated streptavidin and Alexa Fluor
488-conjugated anti-rabbit (Invitrogen). HEK293 transfected with different variants of VAV1
were cultured on polyornithine-coated coverslips, fixed and permeabilised as described above.
Actin was visualized with a phalloidin-alexa Fluor 488. The preparations were analyzed by
confocal microscopy using a Zeiss LSM710 equipped with a 63x objective. Images were
processed with ImageJ.
Statistical analysis. Statistical analyses were carried out by using the GraphPad Instat
statistical package. Data were expressed as means ± SEM. The significance of differences
observed between two groups was analyzed by the Mann-Whitney test. When more than two
groups were investigated simultaneously, the Kruskall-Wallis test was first performed.
17
Acknowledgements
We thank the staff of the different platforms of our research center (Flow cytometry, Imaging
and animal housing) for excellent assistance that was instrumental for the proper realization of
this work. We thank Daniel Gonzalez-Dunia and Etienne Joly for critical reading of the
manuscript and insightful comments. The authors have no conflicting financial interests.
This work was supported by INSERM, the Arthritis Fondation Courtin, Association Française
contre les Myopathies, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-GENO-041-01),
Association de Recherche sur la Sclérose En Plaques, Fondation pour la Recherche Médicale
(FRM), Association de la Recherche contre le Cancer, Région Midi-Pyrénées and Fight-MG
(FP7-Health-2009-242210). A.C. is supported by a grant from Fondation pour la Recherche
Médicale. T.O. and M.J. received grant support from Neuropromise (LSH-CT-2005-018637),
EURATools (LSHG-CT-2005-0190115) and the Swedish research Council and the Söderberg
foundation.
Author contributions
C. Colacios and AS. Dejean designed the research, generated bone marrow chimeras,
performed flow cytometry experiments and analyzed the data. A. Casemayou and F. GaitsIacovoni designed and conducted the biochemistry and cell signaling experiments. I. Bernard
conducted the purification of T cell subsets. C. Pedros performed the suppression assays. D.
Lagrange, M. Jagodic and G. Fournié generated and characterized the congenic rats. L.
Lamouroux and M. Jagodic performed the sequencing, mutagenesis and PCR. M Deckert
provided human Vav1 plasmids. R. Liblau and T. Olsson contributed to the design of
experiments. G. Fournié and A. Saoudi coordinated the project, designed the research and
wrote the paper.
18
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energetic mechanisms of cooperative autoinhibition and activation of Vav1. Cell
140:246-256.
Zheng, Y., and A.Y. Rudensky. 2007. Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage. Nat
Immunol 8:457-462.
23
Figure legends
Figure 1. BN and LEW rats exhibit different proportions and numbers of natural
Foxp3+ regulatory T cells. (A) Representative flow cytometry profiles of Foxp3+ T cells in
CD4+-gated lymphocytes in PBMC, lymph nodes (LN) and spleen from LEW and BN rats.
The values on each cytometry profile represent the mean percentages of Foxp3+ cells in the
CD4+ T cell population (mean ± SEM, n=4). Data are representative of four independent
experiments. (B) Absolute numbers (mean ± SEM) of Foxp3+ CD4+ cells in the LN and
spleen from BN (black columns, n=6) and LEW (white columns, n=10) rats. (C)
Representative flow cytometry profiles of Foxp3 expression in double positive (DP)
CD4+CD8+ and single positive (SP) CD4+CD8- thymocytes from naive BN and LEW rats.
The value on each profile represents the percentages of Foxp3+ thymocytes (mean ± SEM;
n=6). (D) Absolute numbers of Foxp3+ cells in DP CD4+CD8+ and SP CD4+ thymocytes from
BN (black columns, n=6) and LEW (white columns, n=6) rats. Columns represent the means
± SEM. Data are representative of three independent experiments. (E) Percentages of Foxp3+
cells among CD4+ T cells of donor origin (BN: black columns; LEW: white columns) in
PBMC, LN and spleen originating from (LEW x BN) F1 recipients of bone marrow from BN
or LEW rats 14 weeks post-engraftment. The columns represent the mean ± SEM (n=6 rats
per group). Data are representative of two independent experiments. **p<0.01.
Figure 2. Fort1, a 117 kb locus of chromosome 9, controls the proportion of CD4+Foxp3+
Treg and Vav1 protein expression. (A) Percentages of Foxp3+ cells among blood CD4+ T
cells from the BN parental strain and a series of BN.LEWc9 congenic lines and sub-lines.
Each point represents the value found in individual rats (n=4 to 9). (B) Genetic maps of
congenic lines. Microsatellite markers are indicated on the left. Black, white and grey
segments indicate chromosomal regions of BN, LEW or undetermined origin, respectively.
24
The double arrow represents the 117kb interval of the Fort1 locus. Physical map of the Fort1
117kb region constructed using information from Celera Genomics' genome assembly
available in the NCBI rat genome resource. The microsatellite markers used are indicated at
the top. Black, white and grey colors indicated the regions of BN, LEW and undetermined
genomic origin, respectively. The four genes, C3, Gpr108, Trip10 and Vav1, located within
the 117kb interval are indicated below. (C) BN (in black) or Bf (in white) CD25+ and CD25FACS sorted T cells were cultured for 3 days with allogeneic APC. Proliferation was assessed
with an 18-hour [3H]thymidine pulse added after 48 hours of culture. (D) Suppressor activity
of CD4+CD25+ Tregs was measured by T-cell proliferation assay. Tregs from BN (in black)
or Bf (in white) were cocultured with effector T cells (CD4+CD45RChigh from F1 rats) at
various ratios of Treg/Teff. The proliferation level of responder cells alone was assigned a
value of 100%. Results are representative of two independent experiments. (E) Western blot
analysis of Vav1 protein expression in thymic (left panel) and lymph node (right panel) CD4+
T cell lysates from LEW, BN and Bf rats. ß-actin was used as a loading control. (F) Western
blot analysis of VAV1 protein in HEK293 cells transfected with plasmids encoding human
wild type VAV1 (VAV1-R63), mutated VAV1 (VAV1-W63) or oncogenic VAV1 (VAV1∆CH). ß-actin was used as a loading control. In each case, results show one blot of a
representative experiment (top panels) and a graph (lower panels) representing the mean ±
SEM of 3 to 6 independent experiments. **p<0.01.
Figure 3. Biochemical analyses of VAV1 in HEK293 cells transfected with VAV1
variants reveals that VAV1-W63 is constitutively active. (A, B) Analysis of VAV1
phosphorylation in HEK293 transfected with different human VAV1 plasmids. VAV1 was
immunoprecipitated and immunoblotted with anti-phosphotyrosine 4G10 mAb (A) or antiphosphoVAV1(Y174) Ab (B). After stripping, membranes were probed with anti-VAV1 Ab.
(C) Analysis of GEF activity of VAV1 using pull-down with Rac1G15A agarose beads on
25
serun-starved HEK293 cells transfected with different human VAV1 plasmids. (D, E)
Analysis of Rac1 or RhoA activities HEK293 cells transfected with different VAV1 variants
using pull-down assay to detect relative amounts of Rac1-GTP (D) or RhoA-GTP (E). Total
Rac1 and RhoA levels were used as loading controls. In each case, results show one blot of a
representative experiment (top panels) and a graph (lower panels) representing the mean ±
SEM of 3 to 4 independent experiments. *p<0.05 ; **p<0.01. (F) Confocal analysis of
HEK293 cells transfected with different VAV1 variants. Actin was visualized with
phalloidin-Alexa Fluor 488. Representative images of three independent experiments are
shown.
Figure 4. In primary CD4 T cells, Vav1 R63W polymorphism affects Vav1
phosphorylation, Rac1/RhoA GTPases activities and calcium flux under TCR
stimulation. (A, B) Analysis of Vav1 phosphorylation by immunoblot with antiphosphotyrosine 4G10 mAb (A) or anti-phosphoVav1(Y174) Ab (B) in BN (Vav1-W63) and
Bf (Vav1-R63) lymph node CD4+ T cells stimulated (stim) or not (unstim) with anti-TCR
mAb. Lysates were probed with anti-Vav1Ab. (C, D) Analysis of Rac1 or RhoA activation in
serum-starved BN and Bf CD4+ T cells stimulated (stim) or not (unstim) with anti-TCR mAb
using pull down assay to detect the relative amounts of Rac1-GTP (C) or RhoA-GTP (D).
Total Rac1 and RhoA levels were used as loading controls. In each case, results show one blot
of a representative experiment (top panels) and a graph (lower panels) representing the mean
± SEM of 3 to 5 independent experiments. (E) Confocal microscope analyses of CD4+ T cells
of BN and Bf rats that were stimulated or not with anti-TCR mAb. Cells were staining for
TCR (in red) and Vav1 (in green) using the appropriate second reagents. Line scan analysis
indicates the distribution of the TCR (red) and Vav1 (green) along the white line.
Representative images of three independent experiments are shown. (F) Analysis of calcium
influx in purified CD4+ T cells from LEW, BN, Bf lymph nodes (left panel) or thymus
26
(middle panel) loaded with Indo-1 and incubated with an anti-TCR mAb. Analyses were first
done in the absence rabbit anti-mouse (RAM) immunoglobulin cross linker to measure the
baseline calcium level in unstimulated CD4+ T cells. Flow was halted for addition of the
RAM (50 µg/ml, first arrow). The increase in intracellular calcium flux was then recorded in
real time over 200s. Cell flow was again halted for addition of ionomycin (Iono, second
arrow) to measure the maximal signal from the Indo-1 indicator. Data are representative of
three independent experiments involving a total of five or six rats per strain. These data are
expressed in the right panel as percentages of the variation of maximum calcium flux
observed in the Bf congenic sub-line compared to the BN (left) and to LEW (right) parental
strains.
27
Table 1. Vav1 variants control the percentage of CD4+ Foxp3+ regulatory T cells
DNA level
Gene
1
C3
Genotypes
exon/nucleotide
2
Vav1
6
BN
LEW
Bf
5
DA
PVG
BB
ACI
p.=
T
C
C
C
C
T
C
Ex9 / c.1018 T>C
p.=
C
T
T
T
C
C
C
Ex11 / c.1252 C>T
p.=
T
C
C
C
C
T
C
Ex12 / c.1339 T>C
p.=
C
T
T
T
C
C
C
Ex12 / c.1369 T>C
p.=
C
T
T
T
C
C
C
p.=
A
G
G
G
G
A
G
p.Thr1356Ala
G
A
A
A
A
G
A
Ex6 / c.536 G>A
p.=
A
G
G
G
G
A
G
Ex8 / c.930 T>C
p.=
C
T
T
T
T
C
T
Ex8 / c.935 C>T
p.=
T
C
C
C
C
T
C
p.=
A
G
G
G
G
A
G
p.=
A
G
G
G
G
A
G
-
-
-
-
-
-
-
-
T
C
C
C
C
C
C
Ex13 / c.1397
G>A
Ex15 / c.1520
G>A
Trip10
3
Ex2 / c.205 C>T
Ex23 / c.2929
G>A
Ex32 / c.4109
A>G
Gpr108
Protein
4
Ex1 / c.244 C>T
6
p.Arg63Trp
6
Ex5 / c.579 C>T
p.=
C
T
T
T
C
T
T
Ex6 / c.627 G>A
p.=
A
G
G
G
A
G
G
17.0
±0.2
8.9
±0.9
11.1
±0.5
10.3
±0.3
7.6
±0.2
11.0
±0.2
9.9
±0.5
+
% CD4
+7
Foxp3
1/ Genes found in the 117 kb interval
2/ SNPs found in exons. The exon number and the position of the SNP in the cDNA of the gene are given
3/ Effect of the SNP: p.= indicate a synonymous mutation without effect on the primary structure of the protein ;
when the SNP is non synonymous the position and the amino acid substitution according to the nucleotide
mutation are given
4/ Genotypes of BN-type or similar to BN genotype are in bold
5/ Bf: BN.LEWc9-Bf congenic line
6/ This mutation in the first exon of Vav1 is the only mutation associated with the high (BN genotype) or low
+
+
(other strains genotypes) percentage of CD4 Foxp3 T cells
7/ mean + s.e.m. (n>4)
B
BN
LEW
12.8±0.6
8.1±0.3
PBMC
Cell number
LN
Nr of CD4+ Foxp3+
T cells (x106)
A
6
**
4
2
0
BN
13.2±0.6
9.6±0.2
SPLEEN
Nr of CD4+Foxp3+
T cells (x106)
LN
16.4±0.5
11.0±0.2
SPLEEN
20
15
10
5
0
BN
LEW
0.5±0.03
0.1±0.01
20
DP
8.0±0.1
LEW
D
BN
3.3±0.7
CD4+ SP
Nr of Foxp3+
thymocytes (x106)
Cell number
**
25
Foxp3
C
LEW
BN
LEW
**
15
10
**
5
0
DP
CD4+ SP
Foxp3
E
% of CD4+ Foxp3+
donor T cells
16
**
**
**
BN
F1 (LEWxBN)
LEW
F1 (LEWxBN)
12
8
4
0
PBMC
LN
SPLEEN
Figure 1
% CD4+ Foxp3+ T cells
A
B
14
D9Cel1
12
D9Cel16
D9Cel11
C3
10
D9Cel2
Gpr108
8
Trip10
Fort1 117kb
D9Wox24
2.4 cM
D9Cel13
D9Cel1
D9Cel16
D9Cel17
D9Cel9
D9Cel6
D9Got 5
D9Cel17
D9Cel9
C
BN
Ia
B
Bc
BN.LEWc9
D
Be
40
30
20
10
0
BN
75
Bf
50
25
0
CD25+ CD25- CD25+ CD25T CD4 BN
T CD4 Bf
CD4 Thymus
LEW
BN
Bf
Bf
100
Inhibition (%)
CPM X1000
H
ns
50
E
1/2
1/4
1/8
F
CD4 Lymph Nodes
LEW
BN
Bf
VAV1
˟-actin
˟-actin
%&!'()*
0
1.0
0.5
0
**
**
1.5
+ #$%&!'()*
0.5
1.5
!"#$%&!'()*
!"#$%&!'()*
1.0
**
63
-.
W
,
&
#
V1
+
VA
63
1-R
V
VA
Vav1
**
1/16 1/32
Treg/Teff ratio
Vav1
1.5
D9Cel3
D9Cel15
Vav1
D9Rat44
D9Got 9
C
D9Cel10
**
ns
1.0
0.5
0.0
Figure 2
A
63 W63 $%& B
R
#
V1 AV1 ! "
A
IP:VAV1 V
IP:VAV1
V
VAV1
VAV1
p-VAV1 / VAV1
ns
**
40
30
20
10
0
D
63 W63 $%&
R
#
V1 AV1 ! "
A
V
V
WB: anti-Rac1
C
WB : anti-VAV1
63 W63 $%&
R
#
V1 AV1 ! "
A
V
V
PD Rac1 G15A
(Active VAV1)
Total Extract
(Total VAV1)
8
*
ns
GEF activity of VAV1
p-Y174
p-Y174 VAV1 / VAV1
p-Tyr
63 %&
63
-R 1-W "#$
1
V !
V
VA VA
6
4
2
0
F
VAV1
12
8
4
0
Actin
PD Rac1
(Rac1-GTP)
Total extract
(Total Rac1)
R63
Rac1-GTP/Total Rac1
9
6
3
0
E
63 W63 $%&
R
#
V1 AV1 ! "
A
V
V
WB: anti-RhoA
W63
PD RhoA
(RhoA-GTP)
RhoA-GTP/Total RhoA
Total extract
(Total RhoA)
30
20
10
0
Figure 3
A
B
IP:Vav1
Unstim
Stim
BN Bf
BN Bf
C
Unstim
BN Bf
IP:Vav1
Stim
BN Bf
Unstim
WB: anti-Rac1 BN Bf
p-Y174
PD Rac1
(Rac1-GTP)
Vav1
Vav1
Total extract
(Total Rac1)
60
40
20
0
*
40
20
0
D
RhoA-GTP/Total RhoA
BN
Stim
BN Bf
PD RhoA
(RhoA-GTP)
Total extract
(Total RhoA)
**
8
6
4
2
0
Stim
Unstim
E
Unstim
WB: anti-RhoA
BN Bf
Bf
BN
Bf
TCR
Vav1
20
15
10
F
Merge
5
0
TCR
VAV1
RAM
Iono
150
100
LEW
Bf
BN
50
0
TCR
VAV1
RAM
Calcium flux (AU)
Calcium flux (AU)
*
60
Iono
150
LEW
Bf
BN
100
50
0
0
100
200
time (sec.)
300
0
100
200
300
time (sec.)
TCR
VAV1
% variation of
maximum calcium flux
p-Vav1/Vav1
*
p-Y174 Vav1/Vav1
*
80
Rac1-GTP/Total Rac1
p-Tyr
-
Stim
BN Bf
TCR
VAV1
+125
+100
+75
+50
+25
0
-25
LN Thymus LN Thymus
Bf vs. BN
Bf vs. LEW
Figure 4
A
CD45RClow
BN
54
46
40
CD45RChigh
0.8
Foxp3
CD45RC
B
CD45RClow
LEW
29
CD45RC
71
28
CD45RChigh
0.6
Foxp3
Figure S1. CD4+ Foxp3+ T cells are contained within the CD45RClow subset. To
purify CD4+ T cells, spleen and lymph node cells from naive BN (A) and LEW (B)
rats were depleted of CD8+ and TCR ! T cells, B cells, monocytes and NK cells
using a standard negative selection procedure. Purified CD4 T cells were further
fractionated by magnetic beads on the basis of their expression of CD45RC using
FITC-conjugated OX22. The purified CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cell subsets
were incubated with anti-CD4, anti-TCR"# and anti-Foxp3 Abs and analyzed by flow
cytometry. Results are presented as flow cytometric profiles of Foxp3 expression by
CD4 +CD45RC T cell subsets. Results are representative of four independent
experiments.
**
Absolute numbers of
CD4+Foxp3- T cells (x107)
Absolute numbers of
CD4+Foxp3+ T cells (x106)
5
**
4
3
2
1
0
BN
B
C
3
ns
ns
2
1
0
BN
B
C
Figure S2. Fort1 controls Treg numbers with no effect on the size of Tconv
compartment. Absolute numbers (mean ± SEM; n=5) of Foxp3+ and Foxp3- CD4+ T
cells in LN of BN, and BN.LEWc9-B (B) and BN.LEWc9-C (C) congenic rats (the
genetic map of B and C congenic lines are given in Figure 2). **: p<0.01; ns: not
significant. Results are representative of three independent experiments.
RT1 Background
Strains
Fort1
BN
BN
BN
BN
LEW
LEW
LEW
LEW
LEW.BN
BN
LEW
LEW
Ra (LEW.BN)
LEW
LEW
LEW
DA
DA
DA
DA
R25 (DA.BN)
BN
DA
DA
R50 (DA.BN)
DA
DA
DA
BN-1L (BN.LEW)
BN
LEW
BN
0
5
10
% CD4+ Foxp3+ T cells
15
Region origin
Figure S3. Fort1 controls CD4+ Foxp3+ (Treg) numbers independently of the
genetic background and the MHC. Mean percentage ± SEM of Foxp3+CD4+ T
cells (n=4 to 6 rats per strain) in peripheral blood of naïve BN, LEW and DA strains,
in LEW.BN and DA.BN congenic lines for the BN Fort1 locus and in BN.LEW
chromosome 20 congenic line for the RT1 locus (MHC region). Colors of the column
indicate the Fort1 genomic origin: Black=BN; white=LEW; grey=DA. The description
of the congenic lines and sub-lines according to the international nomenclature*,
which use the most distant markers that define the introgressed region of the
congenic, is:
LEW.BN=LEW.BN-(D9Wox24-D9Got22)
Ra=LEW.BN-(D9Got8-D9Got22)
R25=DA.BN-(D9Wox24-D9Rat44)
R50=DA.BN-(D9Got5-D9Mgh5)
BN-1L=BN.LEW-(D20Mgh5-D20Rat59)
*http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strains.shtml
1.0
0.5
0.0
LEW
BN
1.5
Vav1 mRNA
relative expression
Gpr108 mRNA
relative expression
ns
1.0
0.5
0.0
BN
ns
1.5
1.0
0.5
0.0
LEW
BN
1.5
ns
LEW
2.0
Bf
Trip10 mRNA
relative expression
C3 mRNA
relative expression
1.5
Bf
Bf
ns
1.0
0.5
0.0
LEW
BN
Bf
Figure S4. mRNA expression of the four genes within Fort1 117 kb region C3,
Gpr108, Trip10 and Vav1 mRNA expression was similar in CD4+ T cells in BN and Bf
rats (n=4 per group). Expression was measured with quantitative PCR and
normalized to LEW values. Results are representative of three independent
experiments.
A
B
CD4+ CD25Unstim
BN
CD4+ CD25+
Stim
Bf BN
Unstim
Bf
BN
pY174 - Vav1
Total Vav1
Total Vav1
- actin
- actin
1.5
!"#$% &"'()*
!"#$% &"'()*
pY174 - Vav1
1.0
0.5
Bf BN
Bf
1.5
1.0
0.5
0.0
25
20
15
10
5
0
BN
Bf
Unstim
BN
Bf
Stim
p-Y174 Vav1 / Vav1
p-Y174 Vav1 / Vav1
0.0
Stim
5
4
3
2
1
0
BN
Bf
Unstim
BN
Bf
Stim
Figure S5. Vav1 expression and phosphorylation in CD25- and CD25+ CD4 T
cells in BN and BN.LEWc9-Bf (Bf) rats. Western blot analysis of pY174-Vav1
phosphorylation and Vav1 protein expression in CD25- (A) and CD25+ (B) CD4+ T
cells at the basal state (Unstim) and under stimulation with anti-TCR mAb (Stim). ßactin was used as a loading control. Signals of pY174-Vav1, total Vav1 and ß-actin
were recorded using an image analyzing system; relative amounts of total Vav1,
normalized against the amounts of ß-actin and relative amounts of pY174-Vav1 on
normalized total amounts of Vav1 were calculated by reference to the result obtained
at the basal state in CD4+ T cells from the Bf congenic rat, to which the value of 1
was arbitrarily given. Results are representative of three independent experiments.
Discussion
‹•…—••‹‘
Discussion
Des études d’association chez le rat, ont permis l’identification sur l’extrémité
télomérique du chromosome 9, de plusieurs QTL, contrôlant la susceptibilité à l’inflammation
du système nerveux central (Eae4), à l’arthrite induite par immunisation avec le collagène
(Cia15) et aux manifestations allergiques induites par les sels de métaux lourds (Aiid3
précédemment appelé Atps3 et nouvellement appelé Iresp3). De façon intéressante cette
région contrôle aussi la proportion des sous-populations TCD45RChigh et TCD45RClow (locus
nouvellement appelé Cdexp1), deux populations qui diffèrent par leur profil de production de
cytokines et par leurs fonctions. La co-localisation de ces loci suggère fortement que cette
région contient un ou plusieurs gène(s) ayant un rôle majeur dans l’homéostasie du système
immunitaire. Au cours de ma thèse, j’ai contribué à la dissection génétique de ces phénotypes
à l’aide de différentes lignées et sous-lignées de rats congéniques, qui nous ont permis
d’affiner le locus Atps3 à 117 kb et le locus Eae4 à ~1 cM. De plus, nous avons découvert que
la région de 117 kb contrôle la proportion et le nombre absolu des lymphocytes T régulateurs
Foxp3+ (locus baptisé Fort1) (Figure 19).
Figure 19. Représentation schématique
illustrant la localisation des loci en 2002 et
en 2010.
A gauche sont représentés les marqueurs
microsatellites bornes des loci. Les loci sont
notés en italique et leur taille ainsi que celle du
chromosome 9 sont à l’échelle.
98
Discussion
Cette étude de dissection génétique a été complétée par des études d'association des
SNPs des gènes présents dans la région de 117 kb, avec la sensibilité à développer des
maladies immunes, la capacité à produire des cytokines inflammatoires et la taille de la
population des Treg. Nous avons pu identifier chez le rat deux variants du gène Vav1
conférant des différences majeures au système immunitaire dans des conditions normales et
pathologiques. Nous avons montré que le variant Vav1-63W est associé à la susceptibilité des
rats BN aux désordres Th2, induits par les sels de métaux lourds (HgCl2 et Atps) et protège
les rats LEW de l’EAE. En revanche, le variant Vav1-R63 est associé à la susceptibilité des
rats LEW à l’EAE et à la protection des rats BN vis-à-vis des désordres Th2 (Figure 20). En
accord avec le rôle central des lymphocytes T dans ces pathologies, nous avons pu montrer un
impact majeur des variants de Vav1 sur (1) les fonctions du compartiment lymphocytaire T,
comme la production cytokinique des cellules T et (2) sur le développement de souspopulations lymphocytaires T, comme la proportion des Treg.
>t
E
sĂƌŝĂŶƚ
sĂǀϭ
Zϲϯ
ϲϯt
ŝŝĚ
dƌĞŐ
ннн
Ͳ
Ͳ
ннн
н
ннн
ZĠƉŽŶƐĞ
ŝŵŵƵŶĞ
dŚϭ
dŚϮ
Figure 20. Récapitulatif des caractéristiques immunitaires des rats LEW et BN.
A l’aide de chimères hématopoïétiques, nous avons montré que le contrôle de la
production d’IgE, de la proportion de CD45RChigh/low et du développement des Treg étaient
intrinsèques aux
cellules hématopoïétiques. De manière intéressante, l’expression
physiologique de Vav1 est restreinte au système hématopoïétique où la protéine joue un rôle
central dans l’activation et le développement des lymphocytes T (Tybulewicz, Ardouin et al.
2003). En effet, Vav1 participe à la transmission du signal du TCR et des molécules de costimulation permettant la différenciation et l’activation des lymphocytes T. D’autre part en
contrôlant le flux calcique, Vav1 intervient directement dans la régulation de la production de
cytokines (Costello, Walters et al. 1999). Enfin, des travaux décrivent un rôle encore plus
large de Vav1, avec un contrôle de l’activité transcriptionnelle et des capacités de migration
des cellules T (Haubert and Weckbecker 2010).
Après l’identification de Vav1 comme gène de contrôle de l’auto-immunité du SNC
chez le rat, nous avons étudié la protéine orthologue chez l’homme. L’analyse de 12 735
individus a permis de révéler une association de la SEP avec un haplotype CA (rs2546133 et
99
Discussion
rs2617822) dans l’intron 1 de VAV1. L’odds ratio de cet haplotype (1.18), est de l’ordre de
ceux retrouvés pour d’autres gènes en dehors du CMH, tel que les récepteurs à l’IL-7 ou à
l’IL-2 (Hafler, Compston et al. 2007; Lundmark, Duvefelt et al. 2007), appuyant le rôle de
l’haplotype CA de VAV1 dans le contrôle de la susceptibilité à la SEP. De plus, il existe une
association entre la forte expression d’ARNm de VAV1 et l’activation des lymphocytes T. En
effet l’expression de VAV1 est corrélée à l’expression de deux cytokines : l’IFN-γ et le TNF
dans le sang et le liquide céphalorachidien des patients.
Ces résultats prouvent l’intérêt des études génétiques réalisées dans un modèle
expérimental animal. En effet, les études de GWA n’ont pas révélé, à ce jour, d’association du
gène VAV1 avec la SEP. Ceci s’explique, soit par le fait qu’une région de près de 26 kb
incluant l’intron 1 de VAV1 n’a pas été couverte dans ces études, soit par le faible déséquilibre
de liaison entre l’haplotype CA et les autres marqueurs proches utilisés dans ces études. Ainsi,
nos travaux basés sur un modèle animal, nous ont permis de mettre en avant le contrôle de
plusieurs phénotypes par un seul gène, VAV1, renforçant son rôle comme acteur central du
système immunitaire.
Impact du polymorphisme au niveau cellulaire
Aspect quantitatif
L’analyse de l’expression de l’ARN messager de Vav1 ne révèle aucune différence en
fonction du polymorphisme exprimé chez le rat. En revanche, nous avons démontré que le
variant Vav1-63W est responsable d’une faible expression protéique dans les LT, mais aussi
dans d’autres cellules comme les LB ou encore les macrophages (figure 21). Nous n’avons
pas testé d’autres types cellulaires, mais nous pensons que cette différence quantitative doit
être retrouvée dans tout le compartiment hématopoïétique. De plus, cette différence
d’expression est observée dans la moelle osseuse, et dès le stade DN des thymocytes
impliquant une régulation précoce de la protéine, indépendante de toute activation (figure 21).
Enfin, nous avons également observé cette différence quantitative dans un modèle de cellules
HEK293, qui n’expriment pas de VAV1 endogène, transfectées par des plasmides codant
pour le VAV1 humain sauvage, le VAV1-63W ou la forme oncogénique de VAV1. Ces
résultats démontrent que la diminution de la quantité protéique du Vav1-63W est bien la
conséquence du remplacement d'une arginine (VAV1-R63) par un tryptophane (VAV1-63W).
Etant donné l’absence de différence au niveau ARN, ceci suggère un défaut de régulation
post-transcriptionnel dont le mécanisme reste à définir.
100
Discussion
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͘dŚLJŵŽĐLJƚĞƐE
sĂǀϭZϲϯ sĂǀϭtϲϯ
sĂǀϭZϲϯ sĂǀϭtϲϯ
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͘>LJŵƉŚŽĐLJƚĞ
sĂǀϭZϲϯ sĂǀϭtϲϯ
͘DĂĐƌŽƉŚĂŐĞ
sĂǀϭZϲϯ sĂǀϭtϲϯ
sĂǀϭ
ß Ͳd/E
Figure 21. Une région de 117 Kb contrôle l’expression de Vav1 dans différents types
cellulaires hématopoïétiques.
Les protéines totales sont extraites à partir de la moelle osseuse (A), des thymocytes DN
(B), des lymphocytes B (C) et des macrophages (D) isolés de rats congéniques naïfs
exprimant Vav1-63W ou Vav1-R63. Après séparation sur gel, les protéines sont transférées
sur membrane de nylon, et sont révélées à l’aide d’anticorps anti-Vav1, et anti-ȕ-actine. Ce
dernier sert de contrôle de charge. Des anticorps secondaires couplés à l’enzyme
peroxydases permettent une révélation en chimioluminescence.
Cette diminution d’expression peut être la conséquence d’une augmentation du
catabolisme, d’une diminution de la synthèse protéique, ou encore d’une différence de
localisation cellulaire. Cette dernière possibilité a été écartée suite à des expériences de
fractionnement cellulaire, qui ne montrent pas de différences importantes de localisation en
fonction du variant de Vav1 exprimé (figure 22). Des études supplémentaires seront
nécessaires pour élucider les mécanismes responsables de cette différence quantitative
observée en présence du polymorphisme Vav1-63W. Il existe plusieurs régulateurs négatifs
de Vav1, certains interfèrent avec la fonction protéique sans déstabiliser la protéine tel que
Cbl-b, Shia2 (Germani, Romero et al. 1999; Miura-Shimura, Duan et al. 2003), alors que
d’autres influencent la dégradation de la protéine tels que SOCS1 et hn-RNP-K (De
Sepulveda, Ilangumaran et al. 2000; Chang, Koike et al. 2009).
101
Discussion
͘LJƚŽƉůĂƐŵĞ
͘EŽLJĂƵ
͘DĞŵďƌĂŶĞ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
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WZW
sĂǀϭ
,^WϵϬ
ĂůŶĞdžŝŶĞ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
ssϭZϲϯ ssϭtϲϯ
Figure 22. Localisation cellulaire de Vav1 en fonction du variant exprimé.
Des cellules HEK293, n’exprimant pas Vav1 endogène, sont transfectées par des plasmides
codants pour le cDNA humain de Vav1-R63 ou Vav1-63W en utilisant le kit Jet-PEI
(PolyPlus). Après 24h de transfection, les différents compartiments cellulaires sont séparés à
l’aide du kit Calbiochem, puis les protéines de chaque fraction sont séparées sur gel. Après
transfert sur membrane de nylon, les protéines sont révélées par des anticorps anti-Vav1 et
des anticorps spécifiques de chaque fraction : anti-HSP90 (cytoplasme), anti-PARP (noyau),
anti-calnexine (membrane). Les anticorps secondaires sont couplés à des fluorochromes
permettant une révélation en bioluminescence.
SOCS1 est un régulateur négatif de Vav1 qui induit sa dégradation. En effet, il
interagit avec la partie N-terminale de Vav1 et favorise sa polyubiquitination. Cette
interaction se fait de manière indépendante de la phosphorylation de Vav1 (De Sepulveda,
Ilangumaran et al. 2000). Le polymorphisme R63W, qui se trouve dans la partie N-terminale
de Vav1, pourrait provoquer une différence de conformation protéique, comme le suggère les
études de structure du domaine CH, réalisées in sillico (figure 23), et ainsi favoriser des
interactions différentes, notamment avec ce régulateur négatif SOCS1. Nous pourrions
analyser le niveau d’ubiquitination de Vav1 en fonction des variants, et étudier l’interaction
de SOCS1 avec les différents variants de Vav1.
Récemment, une étude a impliqué hn-RNP-K comme inhibiteur de la dégradation de
Vav1 (Chang, Koike et al. 2009). Une diminution d’expression de cette protéine est associée à
une augmentation de la protéolyse de Vav1. Après activation du TCR, hn-RNP-K est modifié
rendant impossible l’interaction, et donc la protection de Vav1 de la protéolyse. L’interaction
de hn-RNP-K avec les différents variants de Vav1 doit être étudiée dans notre modèle. Nous
102
Discussion
pouvons poser l’hypothèse d’un défaut de liaison d’hn-RNP-K avec le variant Vav1-63W,
favorisant ainsi sa dégradation par protéolyse.
4.30A
LEW rat
11.20 A
BN rat
&ŝŐƵƌĞϮϯ͘DŽĚĠůŝƐĂƚŝŽŶĚƵĚŽŵĂŝŶĞ,ĚĞůĂƉƌŽƚĠŝŶĞsĂǀϭĚĞƐƌĂƚƐ>tĞƚE͘
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ƉƌĠƐĞŶƚĂŶƚĞŶǀŝƌŽŶϯϬйĚ͛ŚŽŵŽůŽŐŝĞĂǀĞĐůĞƐĚŽŵĂŝŶĞƐ,ĚĞƐƉƌŽƚĠŝŶĞƐsĂǀϭĚĞƐƌĂƚƐ>tĞƚE͘
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Outre l’hypothèse d’une augmentation de la dégradation de la protéine Vav1, nous
n’éliminons pas la possibilité d’une diminution de synthèse protéique. Pour tester cette
hypothèse, nous pourrions réaliser un test de traduction protéique in vitro, et comparer la
traduction des deux variants de Vav1.
En conclusion, nous n’avons pas encore élucidé les mécanismes responsables de la
différence d’expression des deux variants de la protéine Vav1.
Aspect qualitatif
Les rôles de Vav1 dans la biologie des LT sont remplis par deux types de fonctions
principales : une fonction d’échange nucléotidique (GEF), et une ou des fonctions de protéine
adaptatrice (Tybulewicz 2005). La génération de souris exprimant un Vav1 dont l’activité
GEF est inactivée, sans pour autant modifier la conformation protéique, a permis à l’équipe de
Tybulewicz de différencier les fonctions cellulaires dépendantes de l’activité GEF et celles
103
Discussion
dépendantes de l’activité adaptatrice (Saveliev, Vanes et al. 2009). Ainsi, l’activité GEF est
requise pour la sélection thymique, et l’activation optimale des LT impliquant les voies de
signalisation RAC1, AKT et des intégrines. En revanche, elle n’est pas nécessaire pour le flux
calcique, l’activation de ERK et de la polarisation cellulaire.
a) Fonction GEF
Initialement décrite pour cette fonction, la protéine Vav1 permet l’activation des
petites protéines G (Rho/Rac/Cdc42…) qui interviennent dans la dynamique du cytosquelette
d’actine et dans les processus de migration des lymphocytes. Nous avons montré que la
protéine Vav1-63W est hyperphosphorylée, de manière constitutive et après engagement du
TCR. Il est établi que la phosphorylation (notamment de la tyrosine 174), contrôle la
conformation de la protéine Vav1, et l’activation de la fonction GEF. Dans notre modèle,
l’hyperphosphorylation, qui caractérise le variant Vav1-63W, est associée à une augmentation
de l’activité GEF, suggérant que le variant Vav1-63W est constitutivement actif. Cette
observation est faite sur des cellules de rats, mais également dans le modèle HEK293
(déficient pour VAV1 endogène) transfecté par des plasmides exprimant VAV1 humain
sauvage ou muté. Les résultats dans ce modèle démontrent que la diminution de la quantité de
protéine observée, mais également l'augmentation de l'activité GEF, sont bien la conséquence
du polymorphisme R63W. Les résultats obtenus avec les cellules transfectées par le plasmide
codant pour VAV1 humain délété des premiers 67 aa, et qui est constitutivement actif,
confirment cette conclusion (Katzav, Martin-Zanca et al. 1989). Les fonctions cellulaires
décrites comme dépendantes de l’activité GEF sont la polymérisation d’actine, la sélection
thymique, l’activation et la différenciation des Tconv. La sélection thymique des Tconv est
normale quelque soit le variant de Vav1 exprimé. Cependant, nous avons une différenciation
Th2 plus importante chez les rats qui expriment Vav1-63W. Les patients déficients en VAV1
ont plus de Th1 et moins de Th2, ce qui suggère que le Vav1-63W est, non seulement
fonctionnel, mais également constitutivement actif. Il est possible que la diminution
quantitative de Vav1 soit compensée par son hyperactivité en ce qui concerne sa fonction
GEF. De manière concordante avec cette hypothèse, nous avons observé que les cellules
exprimant Vav1-63W ou Vav1 sauvage ont une quantité similaire de Vav1 phosphorylé
(figure 24). Ceci suggèrerait que les différences de phénotypes observées, seraient la
résultante d’une différence de protéine adaptatrice.
104
pVAV1 (MFI)
Discussion
700
600
500
400
300
200
100
0
Bf
BN
0
1 2 4 8
anti-TCR (min)
16
Figure 24. La phosphorylation de Tyr174 de Vav1 au niveau d’un ensemble de cellules
est la même quelque soit le variant de Vav1.
Des lymphocytes T CD4 ont été purifiés à partir de nœud lymphatiques de rats naïfs BN
(Vav1-63W, ronds noirs) et congéniques pour le locus de 117 Kb d’origine LEW (Vav1-R63,
ronds blancs). Les cellules sont incubées 20mn en présence d’anti-TCR (10 µg/ml), puis
stimulées à 37°C en présence d’un anticorps rabbit anti-mouse (50µg/ml) et d’anti-CD28 (0,2
µg/ml) pendant différents temps. Les cellules sont mises dans la glace, puis sont fixées avec
du méthanol pendant 20mn dans la glace. Les cellules sont ensuite perméabilisées en
présence de PFA 4%, puis marquées avec un anticorps anti-Tyr174-Vav1, qui sera révélé
avec un anticorps secondaire, couplé au fluorochrome Alexa-647. L’analyse des résultats se
fait sur le cytomètre LSRII.
b) Fonction de protéine adaptatrice
L’activité de protéine adaptatrice permet l’activation de nombreuses voies de
signalisation aboutissant à l’activation de plusieurs facteurs de transcription (AP-1, NFAT,
NF-kB). La faible quantité de Vav1 laisse envisager une activité de protéine adaptatrice
réduite. De manière cohérente, nous avons montré une réduction importante du flux calcique
après engagement du TCR dans les LT CD4+ exprimant Vav1-63W. Cette diminution du flux
calcique est retrouvée aussi bien en périphérie, qu’au niveau du thymus.
En conclusion, nous avons mis en évidence que le polymorphisme R63W a un impact
majeur sur la fonction de la protéine Vav1. Il en résulte une protéine Vav1 constitutivement
active, comme en témoigne la phosphorylation de Vav1 et l’augmentation de son activité
GEF. Cette hyperactivation est associée à une diminution d’expression protéique qui est
probablement responsable d'une diminution de la fonction adaptatrice de la protéine Vav1.
Ainsi, les conséquences fonctionnelles du polymorphisme R63W peuvent résulter de la
différence quantitative de Vav1 et/ou des modifications qualitatives, induites par les
changements des structures secondaire et tertiaire de Vav1. Enfin il est possible que ces
105
Discussion
différences de structure aient des effets sur la fonction de facteur de transcription qu'exerce
probablement Vav1 au niveau nucléaire.
Impact du polymorphisme au niveau de l’organisme en conditions normales
La différenciation des LT CD4+ naïfs en Tconv ou Treg est sous le contrôle de voies
de signalisation complexes, déclenchées lors de l’engagement du TCR, de la molécule de costimulation CD28 et de certains récepteurs aux cytokines. La protéine Vav1 joue un rôle
majeur dans l’intégration de signaux provenant de ces récepteurs, et est capable d’activer
différents facteurs de transcription, dont NFAT, NF-țB et AP-1 (Cao, Janssen et al. 2002).
Rôles de Vav1 dans le contrôle de la balance Th1/Th2
Nous avons identifié une association du polymorphisme R63W avec une plus forte
proportion de LT exprimant faiblement l’isoforme RC de la tyrosine phosphatase CD45,
correspondant principalement à des LT ayant un profil cytokinique de type Th2 (CD45RClow).
De plus, sous stimulation polyclonale, les LT exprimant le variant Vav1-63W expriment
fortement l’IL-4 et sécrètent de faibles taux d’IFN-γ, de TNF et d’IL-2.
En accord avec nos résultats, une étude sur des souris déficientes en Vav1 a décrit que
la protéine Vav1 est impliquée dans le contrôle de la balance Th1/Th2 et ceci, en favorisant
l’activation de c-Maf et la production d’IL-4 (Tanaka, So et al. 2005). De plus, les souris
déficientes en Vav1 ont un défaut de flux calcique en réponse à l’engagement du TCR et
produisent surtout des cytokines de type 1 (Tanaka, So et al. 2005). Ho et son équipe
démontrent que l’expression de c-Maf, et donc la différenciation des Th2, est dépendante de
la voie Vav1/Ca2+/NFAT (Ho and Glimcher 2002). Enfin, et concordant avec ces travaux
chez l’animal, il a été montré chez l’homme, qu’une déficience de VAV1 provoque un
syndrome d’immunodéficience, et un défaut de différenciation Th2 (Capitani, Amedei et al.
2010). L’ensemble de ces résultats suggère, non seulement, que la protéine Vav1-63W est
fonctionnelle, mais qu’elle est fortement activée, permettant une différenciation Th2, associée
à une inhibition de la différenciation Th1.
Le rôle du signal calcique et de NFAT dans la différenciation Th2 est complexe, et
l’activation d’un lymphocyte Th2 dépend d’une balance critique entre les différents membres
de la famille NFAT : NFATc1 favorise la différenciation Th2 et l’expression d’IL-4 (Yoshida,
Nishina et al. 1998) alors que NFATc2 et NFATc3 inhibent la différenciation Th2
(Rengarajan, Tang et al. 2002). Malgré une réponse calcique plus faible lors de l’engagement
106
Discussion
du TCR, la libération continue éventuelle de Ca2+ pourrait favoriser une translocation
nucléaire de NFATc1, et donc une différenciation Th2. L’analyse de l’expression et de la
localisation des différents membres de NFAT en fonction des deux variants de Vav1
permettraient d’étudier l’implication de cette voie dans la différence de production de
cytokines observée.
Plusieurs études montrent que Vav1 est retrouvé dans le noyau, où Vav1 participerait à
la formation des complexes de transcription de NFAT et AP-1 (Houlard, Arudchandran et al.
2002). Nous pouvons envisager d’autres rôles similaires pour Vav1 nucléaire, notamment visà-vis des facteurs de transcription spécifiques des sous-populations lymphocytaires T. GATA3 et un autre facteur de transcription indispensable à la différenciation Th2. Des études
préliminaires dans notre modèle de rat montrent que GATA-3 est surexprimé dans les
lymphocytes T exprimant Vav1-63W après engagement du TCR et du co-recepteur CD28.
Ces résultats suggèrent un rôle de Vav1 dans la différenciation Th2 grâce à une régulation
positive du facteur de transcription GATA-3. Pour finaliser l’étude sur les facteurs de
transcription, il serait également intéressant d’étudier l’expression de c-Maf, de T-bet (Th1) et
de RORȖt (Th17).
Rôles de Vav1 dans le contrôle de la balance Tconv/Treg
Nous avons décrit une association du variant Vav1-63W avec une plus forte
proportion et un nombre absolu plus élevés de LT CD4+Foxp3+ aussi bien dans le thymus,
qu’en périphérie. En revanche, le polymorphisme ne modifie pas la génération des Tconv.
Quelque soit le variant de Vav1, les capacités suppressives des Treg semblent équivalentes.
Vav1 aurait donc un rôle dans le développement des Treg, sans pour autant avoir d’impact sur
leurs fonctions régulatrices in vitro. Il serait utile de tester les fonctions régulatrices in vivo,
notamment en analysant les capacités des Treg à contrôler des réponses Th1 ou Th2 en
fonction du type de variant Vav1 exprimé.
Les mécanismes moléculaires impliqués dans la sélection thymique des Treg sont
encore largement discutés. Van Santen démontre que l’expression d’un TCR transgénique
spécifique de ligands exprimés par les cellules thymiques, favorise une augmentation de la
génération de Treg (van Santen, Benoist et al. 2004). De plus, un défaut de signalisation des
voies LAT/PLCȖ1 (Koonpaew, Shen et al. 2006) ou Raf/Mek/Erk (Willoughby, Costello et al.
2007) impliquées dans la signalisation du TCR, affecte négativement la génération des Treg.
Enfin, les souris déficientes pour SHP-1 qui est un régulateur négatif de la signalisation TCR,
ont une signalisation du TCR augmenté, et un pourcentage de Treg élevé (Carter, Calabrese et
107
Discussion
al. 2005). L’ensemble de ces études montre l’importance de l’intensité de la signalisation dans
la génération des Treg.
Nous
avons
observé
dans
notre
modèle
que
la
protéine
Vav1-63W,
hyperphosphorylée, favorise l’hyperphosphorylation de la PLCȖ1. En revanche, des résultats
préliminaires ne montrent pas de différence d’activation des MAPK ERK. Ainsi, la génération
plus importante des Treg chez les rats exprimant un Vav1-63W pourrait être due à
1’hyperphosphorylation de la PLCȖ1 qui traduit une signalisation TCR plus élevée. Des
études supplémentaires sont importantes pour confirmer ou infirmer l’implication de cette
voie dans la génération des Treg.
La voie AKT/mTOR a été décrite comme régulateur négatif de l’expression de Foxp3
(Haxhinasto, Mathis et al. 2008). Les auteurs décrivent que la voie AKT est moins activée
chez les Treg, comparée aux Tconv, et la régulation de cette voie doit permettre de maintenir
la balance Treg/Tconv. Dans nos travaux, nous n’avons observé aucune différence
d’activation d’AKT dans des LT CD4+ exprimant les différents variants de Vav1. Cependant,
nous avons travaillé sur une population LT CD4+ périphérique totale, et au vu de la capacité
de modulation de la voie AKT en fonction du type cellulaire et du niveau d’activation des
cellules, il faudrait peut-être travailler sur des populations LT CD4+CD25+ et LT
CD4+CD25- thymiques. Nous ne pouvons donc pas éliminer cette voie de signalisation des
hypothétiques voies contrôlées par Vav1 dans la génération des Treg.
Ces résultats confirment aussi, pour la première fois, un rôle de Vav1 dans le
développement des lymphocytes Treg Foxp3+. Pour étudier le rôle de Vav1 dans la
proportion de Treg Foxp3+ chez l’homme, une collaboration avec l’Etablissement Français du
Sang a permis de collecter une cohorte de 1000 individus sains. Une étude d’association entre
le pourcentage de cellules Foxp3+ dans le sang, analysé par cytométrie de flux, et des
polymorphismes dans le gène Vav1, va être réalisée.
Impact du polymorphisme au niveau de l’organisme en conditions
pathologiques
Les désordres immunologiques reposent, en partie, sur un déséquilibre des réponses
immunes effectrices. Le polymorphisme Vav1-63W étant associé, entre autre, à une déviation
phénotypique de type Th2, il est envisageable qu’il ait un impact sur les réponses immunes en
conditions pathologiques.
108
Discussion
Rôles de Vav1 dans le contrôle de l’EAE
Bien que de récentes études montrent l’implication des Th17 dans le développement
de cette maladie (Bettelli, Carrier et al. 2006), il est établi que les Th1 jouent un rôle dans
l’induction de l’inflammation en facilitant l’entrée des Th17 dans le SNC (O'Connor,
Prendergast et al. 2008). Nous avons montré qu’une région de 1cM (Eae4) contrôle la
susceptibilité des rat BN et LEW en agissant sur l’équilibre cytokinique. En effet, on observe
une diminution des cytokines pro-inflammatoires comme l’IFN-Ȗ et le TNF-Į chez les rats
ayant le locus protecteur Eae4 d’origine BN. Des expériences préliminaires de transferts
adoptifs de lignées T anti-MBP, transduites avec les différents variants de Vav1, nous ont
permis de confirmer de manière directe l’implication de Vav1 dans la susceptibilité à l’EAE
(Bernard et al, communication personnelle). De manière concordante avec ces résultats chez
le rat, nous avons démontré chez l’homme l’association d’un haplotype (CA) de VAV1 avec
la SEP. De plus, les lymphocytes des patients ayant cet haplotype CA, expriment plus
d’ARNm de Vav1 et produisent plus de cytokines inflammatoires.
En dehors de l’impact sur la production de cytokines inflammatoires par les
lymphocytes T, une autre possibilité est que Vav1 intervienne dans la capacité des LT autoréactifs à traverser la BHE. De manière intéressante, nous avons observé un plus grand
nombre de LT infiltrant le SNC chez les rats congéniques possédant Eae4 d’origine LEW
(sensibles à l’EAE) comparés à ceux ayant Eae4 d’origine BN (résistants). De plus, nous
avons remarqué, chez les rats ayant le locus Eae4 d’origine BN, une accumulation des LT
auto-réactifs dans les organes lymphoïdes secondaires, expliquant peut-être l’absence
d’induction de la maladie chez ces rats. Des résultats préliminaires utilisant des lignées T antiMBP transduites avec la GFP sont en accord avec cette hypothèse. En effet, après transfert
adoptif, les LT exprimant Vav1-63W sont retrouvés en quantité importante dans les organes
lymphoïdes secondaires, alors que les LT exprimant Vav1 sauvage ont migré dans le SNC
(Bernard et al. communication personnelle). Ces résultats suggèrent des capacités migratoires
différentes associées aux variants de Vav1.
Des études montrent que l’intégrine Į4ȕ1 et son ligand VCAM-1 sont impliqués dans
l’étape d’adhésion des LT à la BHE. En effet, il a été observé une absence de développement
d’EAE lors de l’injection d’anticorps dirigés contre la sous unité Į4 des intégrines (Yednock,
Cannon et al. 1992). Les intégrines composées de la sous unité ȕ1 sont exprimées à la surface
des LT circulants sous une forme de faible affinité pour leur ligand. Ce n’est qu’après un
signal de « inside out », transmis par exemple par des chimiokines ou le TCR, qu’elles
adoptent une conformation de forte affinité permettant l’adhésion cellulaire (Ley, Laudanna et
109
Discussion
al. 2007). Vav1 a été décrit comme étant une protéine clef dans l’activation de l’intégrine
Į4ȕ1 : cette protéine forme un complexe avec la Taline, une protéine assurant un lien entre les
sous-unités ȕ1 des intégrines, et le cytosquelette d’actine (Nayal, Webb et al. 2004; GarciaBernal, Parmo-Cabanas et al. 2009). Lors de l’activation par l’intermédiaire de la chimiokine
CCL12, Vav1 est phosphorylé, ce qui provoque sa dissociation du complexe Taline/intégrine
ȕ1 et permet l’activation complète de l’intégrine Į4ȕ1. De manière très intéressante, ils ont
montré que la formation du complexe Taline/intégrine ȕ1 nécessite la présence de la protéine
Vav1, puisque ce complexe est absent dans des cellules déficientes en Vav1. Dans notre
modèle, la protéine Vav1-63W est phosphorylée de manière constitutive, il est possible que
l’association Vav1-63W/Taline soit modifiée, ce qui perturberait la formation du complexe
Taline/intégrine ȕ1. Ainsi, l’activation de l’intégrine Į4ȕ1 ne pourrait pas avoir lieu chez les
rats exprimant le variant Vav1-63W. Chez ces rats, le trafic des LT au niveau de la BHE ne
serait pas ralenti, et le franchissement de cette barrière serait perturbé, expliquant en parti la
résistance de ces rats à l’EAE. Dans le but de mieux comprendre le rôle éventuel de
l’intégrine Į4ȕ1 dans notre modèle, il serait intéressant d’analyser l’association des différents
variants de Vav1 à la Taline. Nous pourrions également tester les capacités d’adhésion des LT
au ligand VCAM-1 en fonction de l’expression du variant de Vav1. Des études préliminaires
de transwell sur des LT CD4+ exprimant Vav1-63W, montrent un léger défaut de migration
comparé aux LT CD4+ exprimant Vav1 sauvage en réponse à la chimiokine CXCL12. Nous
voulons poursuivre ces expériences avec des tests de migrations plus physiologiques, utilisant
des cellules HUVEC (Masuyama, Yoshio et al. 1999).
De manière intéressante, nous avons décrit que les rats exprimant le variant protecteur
Vav1-63W, possèdent un pourcentage et un nombre absolu de Treg plus importants dans le
thymus et en périphérie, comparés aux rats exprimant Vav1 sauvage. L’élimination
fonctionnelle des Treg à l’aide d’anticorps anti-CD25 permet l’induction de la maladie chez
les rats exprimant Vav1-63W normalement résistant, montrant le rôle protecteur des Treg
dans ce modèle. (Figure 25, résultats fournis par C. Colacios).
110
Discussion
Figure 25. Les Treg sont responsables de la résistance des rats ayant le locus Eae4
d’origine BN.
(A) Carte génétique du rat LEW (Vav1-R63, sauvage) et du rat congénique LEW.BN.c9-C (C) (Vav1-63W). Le génome d’origine LEW est représenté en noir et celui d’origine BN est
représenté en blanc. A gauche sont notés les marqueurs microsatellites bornes. (B) Score
clinique des rats LEW (ronds noirs) et LEW.BN.c9-C (ronds blancs), après immunisation
avec de la MBP en présence de CFA. (C) Score clinique des rats LEW.BN.c9-C traités
(OX39, ronds noirs) ou non (ronds blancs) avec un anti-CD25 (1mg/ml OX39) 7 jours avant
immunisation avec de la MBP en présence de CFA. Les scores cliniques cumulés au cours
de la maladie sont représentés en (D).
Afin de confirmer directement le rôle de la protéine Vav1 dans le contrôle de l’EAE,
et d’analyser plus finement les mécanismes impliqués, nous avons commencé la construction
d’une souris KI pour la mutation 63W (collaboration Dr Bernard Malissen à Marseille). Nous
pourrions ainsi tester la susceptibilité de cette souris aux désordres immunologiques de types
Th1 (EAE), afin de prouver le contrôle de ce phénotype par le gène Vav1. De la même
manière, nous analyserons la proportion et le nombre absolu des Treg dans ces souris pour
confirmer le contrôle du développement de cette population par Vav1.
Rôles de Vav1 dans le contrôle des désordres Th2 induits par des sels de métaux lourds
Nos travaux montrent que le locus Iresp3 contrôle la sensibilité des rats à développer
une pathologie en réponse à l’injection de sels de métaux lourds. En effet, l’injection
111
Discussion
chronique de sels de métaux lourds aux rats BN induit l’augmentation sérique des taux d’IgE
et d’IgG1, la production d’auto-anticorps et une glomérulopathie. Les rats de fond génétique
BN, dont seul le locus Iresp3 de 117 kb est d’origine LEW, sont résistants à la pathologie
induite par l’injection de sels de métaux lourds. Ces travaux ont permis d’associer le variant
Vav1-63W à la sensibilité des rats aux sels de métaux lourds, alors que le Vav1 sauvage est
associé à une résistance. Cette susceptibilité corrèle avec des différences d’expression
cytokinique, puisque les LT exprimant Vav1-63W sécrètent moins d’IFN-Ȗ, d’IL-17 et d’IL10 comparés aux LT sauvages.
Malgré une expansion de la population des Treg, les rats BN développent des
désordres immunologiques de type Th2 sous l'effet des injections des sels de métaux lourds,
un résultat en apparence paradoxal. Nous avons démontré que la susceptibilité des rats BN
exprimant Vav1-63W est associée à une faible production d’IL-10, alors que la protection des
rats BN exprimant Vav1-63R (sauvage) est associée à une forte production d’IL-10. De
manière intéressante, des études chez l’homme et la souris dévoilent un rôle protecteur de
l’IL-10 vis-à-vis de l’allergie (Hawrylowicz and O'Garra 2005). Par ailleurs, l’expression de
Foxp3 n’est pas indispensable pour l’acquisition de fonctions régulatrices, notamment par
l’intermédiaire de l’IL-10 (Vieira, Christensen et al. 2004). Ces cellules régulatrices
productrices d’IL-10 sont générées in vitro et in vivo en présence de l’antigène et d’IL-10.
Dans notre modèle, nous pourrions donc envisager que les rats exprimant Vav1-63W, qui
sécrètent peu d’IL-10, auraient de ce fait un faible pouvoir régulateur vis-à-vis de l’atopie, et
développeraient des réponses Th2 exagérées en présence de sels de métaux lourds.
Les LT CD8 jouent également un rôle important pour contrôler les réponses immunes
de type2. En effet, un rôle régulateur des LT CD8+ a été mis en évidence dans un modèle de
rat nouveau né traité aux sels de mercure (Field, Caccavelli et al. 2003). Dans cette étude, la
résistance des rats est associée à une forte expansion des LT CD8+CD45RChigh producteurs
d’IFN-γ. De façon intéressante, dans notre modèle, les rats résistants à l’induction de la
maladie mercurielle ont une forte proportion de LT CD45RChigh, comparés aux rats sensibles.
Afin de tester l’éventuel rôle protecteur des LT CD8+CD45RChigh dans notre modèle, nous
avons éliminé les LT CD8+ chez les rats résistants par injection d’anti-CD8 lors du traitement
au mercure. La déplétion des LT CD8+ chez les rats résistants restaure une réponse IgE
significative mais plus faible que celles des rats BN sensibles, mais n’a pas d’effet sur la
production d’auto-anticorps et la glomérulopathie. Il faudrait compléter cette étude en
injectant aux rats sensibles des LT CD8+CD45RChigh de rat résistants.
112
Discussion
A ce jour, le paradoxe constitué par le développement d’une forte réponse Th2, malgré
une forte proportion de Treg n’est pas expliqué. Une première hypothèse serait que les
fonctions suppressives des Treg soient différentes en fonction du type de réponse effectrice à
contrôler in vivo. Cosmi et son équipe ont décrit dans un modèle in vitro, que des thymocytes
CD25+ sont capables d’abolir fortement la prolifération de Th1, alors que les capacités de ces
mêmes CD25+ sont moins efficaces sur des clones Th2 (Cosmi, Liotta et al. 2004). Les
auteurs suggèrent que la sensibilité plus faible des Th2 à la suppression exercée par les Treg
pourrait être due à la capacité de ces Th2 à produire et à répondre à des facteurs de
croissances autres que l’IL-2, tels que l’IL-4 et l’IL-9, ce qui n’est pas le cas des Th1. Afin de
tester cette hypothèse dans notre modèle, nous pourrions d’une part doser l’IL-9 sécrétée par
les LT exprimant les différents variants de Vav1 et d’autre part tester les capacités
suppressives des Treg Vav1-63W ou Vav1 sauvage à réguler la prolifération de clone Th1, ou
Th2, exprimant Vav1-63W ou Vav1 sauvage. Cette expérience permettrait de comprendre si
la régulation des Treg diffère en fonction du type de réponse Th1/Th2, ou si la susceptibilité
des Tconv à la régulation des Treg diffère en fonction du type de variant de Vav1 exprimé.
Une seconde hypothèse repose sur la possibilité d’un rôle direct des sels de métaux lourds sur
la fonction des Treg. De nombreuses études soulignent le rôle des sels de mercure sur
l’activation et la fonction les Tconv, sans en comprendre le mécanisme. Nous ne pouvons pas
exclure la possibilité d’un rôle toxique des sels de mercure sur les Treg exprimant
spécifiquement Vav1-63W. Pour cela, nous pourrions tester in vitro la capacité des Treg Vav1
sauvage ou Vav1-63W à contrôler la prolifération de LT sauvages en réponse ou non à un
traitement aux sels de mercure.
Sur la base de ces résultats, notre équipe va analyser VAV1 comme gène candidat dans
l’atopie chez l’homme. Pour cela, nous avons initié la création d’un réseau de recherche
clinique formé de notre équipe et de quatre centres de dermatologie pédiatrique coordonné par
le Dr F. Rancé (Hôpital des enfants, Toulouse) en vue de réunir une collection d'ADN et
d'étudier une cohorte de familles comportant au moins, un enfant atteint de dermatite atopique
(DA). La dermatite atopique, maladie inflammatoire cutanée prurigineuse d’évolution
chronique, atteint 20% des enfants dans les populations européennes. Comme la plupart des
maladies rencontrées en pathologie humaine, la DA est une maladie multifactorielle résultant
d'interactions complexes entre des facteurs génétiques et l'environnement (alimentation,
allergènes aériens et de contact, agents infectieux, stress). Les premiers résultats de
113
Discussion
génotypage suggèrent une association entre des polymorphismes dans le gène VAV1 et la
prédisposition à la DA.
En conclusion
De nombreuses études chez la souris montrent que des mutations, dans des molécules
de signalisation, peuvent conduire à des phénotypes auto-immuns plus ou moins sévères
(figure 26). Certaines de ces mutations ont été rapportées chez l’homme. Dans quelques cas,
ces mutations compromettent des rétrocontrôles négatifs, nécessaires à l’atténuation de la
signalisation transmise par le TCR., comme SHP-1. D’autres, en revanche vont inhiber des
contrôles positifs tels que ZAP-70. Quelque soit le type de mutation, il semble clair que
l’altération de régulateurs de la signalisation du TCR, peut contribuer à l’auto-immunité.
Parallèlement, il a été montré que la modification fonctionnelle de certaines molécules de
signalisation, impliquées dans la régulation du signal du TCR, joue également un rôle dans la
génération des Treg. L’ensemble de ces résultats montre l’importance de la signalisation du
TCR dans la génération des Treg, nécessaires au contrôle des lymphocytes autoréactifs, et
donc dans le contrôle du développement des maladies auto-immunes. L’altération du signal
TCR diminue le seuil de sélection négative : un thymocyte ayant une affinité TCR/CMHpeptide trop forte, éliminé en condition normale, sera sélectionné négativement dans le cas ou
la signalisation TCR est diminuée. Cette diminution du seuil de sélection négative va
entrainer une sélection plus importante de lymphocytes T auto-réactifs, capables d’induire des
pathologies auto-immunes. De plus, la sélection des Treg reposant sur une forte signalisation
du TCR, cette diminution de signalisation empêcherait la génération des Treg, favorisant là
aussi le développement d’auto-immunité.
Dans notre modèle, le polymorphisme R63W dans Vav1 conduit à des conséquences
quantitative et qualitative sur la protéine Vav1. Ceci conduit à des modifications de la
signalisation du TCR dont Vav1 est un composant central. La confrontation de notre modèle
avec les modèles existants dans la littérature, appuie le rôle de Vav1 dans la modulation des
fonctions des cellules du système immunitaire et dans la sensibilité aux maladies immunes.
Les pathologies observées chez les rats LEW et BN sont associées à (et peut être déclenchées
par) un déséquilibre des balances Th1/Th2 et/ou Tconv/Treg. D’une manière générale,
l’altération du signal transmis par l’engagement du TCR, joue probablement un rôle important
dans le développement de pathologies d’origine immune. Ainsi, des mutations dans les
protéines PTPN22, ZAP-70 et LAT, qui se traduisent par une diminution du « signal TCR »
114
Discussion
sont associées au développement de pathologies auto-immunes diverses. Mis à part l’étude de
LAT-Y136F, qui décrit une diminution des Treg et une perte de leur fonction suppressive, les
variants PTPN22-158T et ZAP-70-163C ne semblent pas associés à une modification des
populations régulatrices. On peut souligner que le variant PTPN22-158T est associé à une
diminution de flux calcique et d’expression d’IL-10, tout comme notre variant Vav1-63W. Au
total, il n'y a pas de corrélation systématique entre la survenue de pathologies immunes et un
défaut quantitatif ou qualitatif de la population des Treg Foxp3+. Cette absence de corrélation
est logiquement attendue dans la mesure où, d'une part il existe plusieurs populations de
lymphocytes régulateurs, et d'autre part, les voies de signalisation mises en jeu par le « signal
TCR », modulées par ces différentes mutations ou polymorphismes, sont présentes dans les
différentes populations lymphocytaires. Les phénotypes pathologiques observés sont donc la
conséquence d'interactions complexes entre différentes populations dont les fonctions sont
altérées ou modifiées, qu'il s'agisse de fonctions effectrices ou régulatrices.
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Figure 26. Molécules de signalisation dont l’altération est associée au développement
d’auto-immunité et/ou à la génération de Treg.
En conclusion, pris dans leur ensemble, les travaux réalisés durant ma thèse montrent
que Vav1, et les voies de signalisation auxquelles il participe, jouent certainement un rôle
majeur dans l'homéostasie du système immunitaire. Paradoxalement, à ce jour, les études
génétiques réalisées en pathologie humaine n'avaient pas identifié d'association entre des
polymorphismes de Vav1 et des pathologies immunes. Notre travail, et en particulier le travail
chez les patients atteints de SEP, illustre donc de manière exemplaire l’intérêt des modèles
animaux pour l’identification de gènes contrôlant la sensibilité à des maladies
multifactorielles, et la possibilité d'appliquer les résultats des recherches expérimentales à la
pathologie humaine, dans le cadre de ce qu'il est convenu d'appeler des recherches
115
Discussion
translationnelles. A l'heure actuelle, et malgré les progrès réalisés durant les dernières années
dans le domaine des études de génomique à grande échelle (GWA en particulier), l'étude des
modèles animaux reste donc, à notre avis, un outil important pour la recherche et la
compréhension des gènes, et des mécanismes physiopathologiques, mis en jeu dans le
déclenchement et l'évolution des maladies immunes. Ils offrent en outre la possibilité
(irremplaçable) d'analyser en profondeur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués
et permettent ultérieurement de tester l'efficacité des nouvelles approches thérapeutiques qui
peuvent en découler.
Ainsi, les études qui se poursuivent, visent à comprendre, aux niveaux moléculaire et
cellulaire, l'impact du polymorphisme R63W sur les voies de signalisation impliquant Vav1.
De même, nous étudierons au niveau de l'organisme entier, les conséquences des
dysfonctionnements qui découlent de ce polymorphisme R63W dans des modèles de maladies
auto-immunes et allergiques. Parallèlement, des études d'association sont réalisées en
pathologie humaine, en étudiant comme gènes candidats, non seulement Vav1, mais
également ses différents partenaires dans les voies de signalisation auxquelles il participe. Au
terme de ces études, il sera alors possible d'envisager de nouvelles voies thérapeutiques
fondées sur la modulation ciblée des fonctions de Vav1 et de ses voies de signalisation.
.
116
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AUTEUR : Audrey Casemayou
VAV1, UN ACTEUR MAJEUR DE L’HOMEOSTASIE DU SYSTEME IMMUNITAIRE
soutenue dans la salle J. Ruffié à Toulouse-Purpan le Mardi 16 Novembre 2010
DIRECTEURS DE THESE : Abdelhadi SAOUDI et Gilbert FOURNIE
RESUME EN FRANÇAIS
Les maladies auto-immunes et allergiques sont des maladies multifactorielles. Elles résultent
d’interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux. Le rat LEW est sensible, et le
rat BN résistant, aux maladies auto-immunes de type 1, comme l’encéphalomyélite auto-immune
expérimentale (EAE), modèle de sclérose en plaques (SEP). En revanche, le rat BN développe des désordres
allergiques de type 2 après injections chroniques de sels de métaux lourds, alors que le rat LEW est résistant
à l'induction de ces désordres. Les études génétiques dans ce modèle ont identifié à l’extrémité acrocentrique
du chromosome 9, une région contrôlant la sensibilité à l’inflammation du système nerveux central (locus
Eae4) et aux manifestations allergiques induites par les sels de métaux lourds (locus Iresp3). La colocalisation de ces loci suggère que cette région contient un gène ou cluster de gènes jouant un rôle majeur
dans l’homéostasie du système immunitaire.
Au cours de ma thèse, la dissection génétique de ces loci à l’aide de lignées et sous-lignées
congéniques de rats m'a permis d’affiner la localisation du locus Iresp3 à 117 kb et du locus Eae4 à 1cM. J’ai
montré que la région de 117 kb contrôle la proportion et le nombre absolu des lymphocytes T régulateurs
Foxp3+ (Treg) (locus Fort1). Par cartographie haplotypique de six souches de rats, le polymorphisme codant
pour la mutation p.Arg63Trp dans l’exon 1 de Vav1 a été associé à la proportion des Treg au sein des LT
CD4. Le variant Vav1W63 est associé à une faible quantité protéique, à une hyperphosphorylation des
tyrosines et à une augmentation de l’activité "facteur d’échange guanidique" de Vav1. Nous avons aussi
montré que ce variant est associé à une réduction du flux calcique dans les LT activés, phénomène
probablement lié à une réduction de l’activité adaptatrice de Vav1. Enfin, l’étude du gène orthologue chez
l’homme a montré une association entre un haplotype de l’intron 1 de VAV1 et la sensibilité à la sclérose en
plaques (SEP).
Ce travail souligne l'intérêt des recherches translationnelles allant des modèles expérimentaux à la
pathologie humaine. Les résultats obtenus ouvrent de nouvelles possibilités d'études sur le rôle des voies
cellulaires mettant en jeu Vav1 dans les cellules du système immunitaire avec à terme de possibles
retombées pour le traitement des maladies immunes, notamment de la SEP.
MOTS CLEFS : Vav1, Foxp3, lymphocytes T régulateur, auto-immunité, allergie, rat
DISCIPLINE : Immunogénétique
INSERM U563, CPTP
CHU Purpan, BP 3028
31024 Toulouse Cedex