/ . Embryo!, cxp. Morph., Vol. 11, Part 4, pp. 649-657, December 1963 Printed in Great Britain Sur les Structures Differenciees par FEctoderme de Batracien apres Irradiation aux Rayons X par MME. M. REYSS-BRION 1 Laboratoire d''Embryologie experimentale du College de France et du CNRS. (Directeur: Professeur Et. Wolff) AVEC UNE PLANCHE n'est capable de reagir a l'action des inducteurs que pendant un laps de temps assez court et bien determine. Waddington (1938) a denomme 'competence', cette reactivite de l'ectoderme caracterisque d'un stade du developpement embryonnaire. L'evolution de la competence ectodermique dans le temps a ete etudiee par de nombreux auteurs (Lehmann, 1929; Machemer, 1932; Holtfreter, 1938; Gallera, 1952). Plus recemment, Nieuwkoop (1958) a fait une etude tres complete, tant quantitative que qualitative, de la disparition progressive des structures cephaliques dans l'ectoderme vieilli. II a precise les stades du developpement auxquels le feuillet ectodermique n'est plus susceptible de reagir et a montre que l'aptitude a former des structures rhombencephaliques persiste plus longtemps que celle a former des structures archencephaliques. II nous a semble qu'il serait interessant de connaitre les variations de la reactivite de l'ectoderme, non seulement dans le temps, mais aussi apres des traitements susceptibles de modifier les structures cellulaires. C'est pourquoi nous avons repris ces recherches en utilisant un agent teratogene: les rayons X, et en elargissant notre etude aux structures spinocaudales. L'ECTODERME MATERIEL ET TECHNIQUES Nous avons opere sur de jeunes gastrulas de Pleurodeles et d'Axolotls. (Stade 8 a et b de Gallien et Durocher pour le Pleurodele. Stade 10-10^ de Harrison pour FAxolotl.) Ces oeufs reagissent de facon identique a une meme dose de rayonnement. Comme agent teratogene, nous avons utilise les rayons X. En effet, nous avons demontre precedemment qu'une irradiation aux rayons X de 1170 r. supprime la reactivite de l'ectoderme aux stimulus inducteurs (Wolff et Reyss-Brion, 1957). Nous avons pense qu'une diminution progressive de la dose de rayonnement apporterait des renseignements interessants sur la facon dont la reactivite decroit. 1 Author's address: Laboratoire d'Embryologie experimentale, College de France, 49 bis, Avenue de la Belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, France. MME. M. REYSS-BRION 650 La technique d'irradiation est la suivante: les oeufs degangues sont places dans une petite chambre cylindrique, a demi obturee par une lamelle de rhodoid mince, et remplie d'eau pure. L'ensemble est pose sur un plateau dont on peut regler la hauteur, et amene devant une source horizontale de rayons X. L'oeuf est done traverse lateralement par les rayons. Ceux-ci sont canalises par un localisateur dont la section est circulaire. En obturant, par un ecran de plomb, la moitie superieure ou inferieure de ce cercle, il est possible de proteger la moitie superieure ou inferieure de l'oeuf qu'on expose au rayonnement. Un dispositif de prisme permet de verifier que l'oeuf ne s'est pas deplace pendant l'irradiation (Fig. 1). M Ray. X-» O V////JI i /11 ii 11 n\ 1. Dispositif d'irradiation. L'oeuf (O) est place dans un microaquarium (M), pose sur un plateau (P) a hauteur reglable. Les rayons X sont canalises par un localisateur (L). Une lamelle de plomb (1) sert a obturer la moitie superieure ou inferieure de rorifice et permet d'irradier separement la moitie superieure ou inferieure de l'oeuf. TEXT-FIG. Nous avons utilise des doses de rayons X variant entre 1050 et 150 r. Dans un lot d'oeufs, nous avons irradie la calotte ectodermique en protegeant par un cache de plomb le pole vegetatif et la levre blastoporale dorsale. Dans un autre lot, l'oeuf est irradie in toto, ceci afin d'etre sur d'irradier toutes les cellules ectodermiques. Nous avons, par ailleurs, verifie qu'une irradiation de 1050 r. de la levre blastoporale dorsale, ne modifie pas son pouvoir inducteur. Les embryons sont eleves de 4 a 10 jours, puis fixes. Par suite d'un dereglement des appareils de mesure, les doses de rayons X indiquees dans mes publications anterieures sont inferieures a celles indiquees ici. RESULTATS J'ai irradie 371 jeunes gastrulas: dans 212 cas j'ai irradie uniquement la calotte ectodermique et dans 159 cas l'oeuf ete irradie in toto. Dans la premiere serie 130 survivent (66%) et dans la deuxieme 90 seulement (56%). L'ECTODERME DE BATRACIEN APRES IRRADIATION 651 J'ai condense dans le tableau les resultats obtenus dans ces deux groupes. On voit que les differentes structures disparaissent dans le meme ordre, mais que les pourcentages de cas positifs sont plus eleves dans le groupe des irradiations localisees, surtout en ce qui concerne les organes des sens. J'attribue cela a une survie meilleure dans ce groupe. Dans l'expose des resultats, je ne dissocierai pas ceux concernant une irradiation totale de l'oeuf de ceux obtenus apres une irradiation partielle. Pour apprecier les differences, il suffira de se reporter au Tableau 1. Voici ce qu'on obtient: Apres une irradiation de 1050 r., les formations archencephaliques et deuterencephaliques sont completement absentes. Au niveau de la moelle, on trouve quelques cellules neuroides plus ou moins dispersees dans 10 cas sur 41 (24,5 %), de la chorde dans 18 cas (44%) et des somites dans 17 cas (41,5%). Apres une irradiation de 800 r., on trouve des formations archencephaliques dans 11 cas seulement sur 39 (25%). Elles sont extremement reduites et generalement representees par une petite vesicule cerebrale isolee ou un amas de cellules a aspect ganglionnaire. Le deuterencephale est absent. La moelle est presente dans tous les cas, la chorde et les somites egalement. Apres une irradiation de 550 r., les formations archencephaliques sont presentes dans 44 cas sur 73 (60%) mais elles sont toujours peu developpees et atypiques (totalement depourvues d'organes des sens). Le deuterencephale semble absent. La moelle, la chorde et les somites sont presque normaux dans tous les cas. Apres une irradiation de 300 r., les formations archencephaliques restent atypiques dans 10 cas sur 29 (34,5%); mais sont typiques dans 17 cas (59%). On peut alors identifier du diencephale accompagne de vesicules optiques souvent rudimentaires et encore reliees au cerveau. Le deuterencephale est present dans 7 cas sur 21 (33,5%) mais sa structure est tres aberrante et il n'est accompagne d'otocystes que dans 1 cas. La moelle, les somites et la chorde sont presents dans 100% des cas. Ce n'est qiCapres une tresfaible irradiation: 150 r., que des formations archencephaliques vraiment importantes se differencient. Elles sont typiques dans 33 cas sur 38 (87%) et atypiques dans 5 cas seulement (13%). Les formations deuterencephaliques sont egalement representees dans 24 cas (63%) et sont accompagnees de vesicules auditives dans 13 cas (34%). La moelle, les somites et la chorde sont normaux dans tous les cas. J'ai schematise sur les Figs. 2 et 3 les cas les plus frequemment obtenus. Chaque schema a ete decalque sur une photo, les dimensions des differenciations indiquees sont done exactes. Pour une meme dose de rayons X, les 3 coupes successives proviennent d'un meme embryon. Les differentes structures obtenues ont ete difficiles a identifier car les embryons meurent precocement dans certains groupes, e'est le cas des embryons irradies aux fortes doses et celui des embryons irradies in toto. Au moment Irradiations du pole sup. M WW MO w» © LH © t^i Irradiations totales H - ^ 8 a TO M W U> 00 O ."^ S» nT X wouiowva' to ooooo si U> t o .&>>— — I >— i— V/i SO -P* tv) -ti. KJ\ 00 O O\ so L^ ©©©©© ON©©© o ooo -4 •— O © O r O O OO SO -J K) O O 5 - J ON Ul 00 TO" ON 5? f a > 5. C o\ i Io\ to to vJOOONOOO TO: IOtO^> —) 00 U O Ul 3 U>tO4^*^* >—' Ui ^O U O © SO © © U> o o o o *o o o o -^ ©©©© © © t,, © © so © © © — I TO- J to to 00 -J O SO ©©©l» ©©©-J ©OSO© ©©--4© NOi>iff-ssAa^[ 'n ' L'ECTODERME DE BATRACIEN APRES IRRADIATION 653 de la fixation, les structures nerveuses ne sont pas toutes bien differenciees. Afin d'obtenir une meilleure survie et une identification plus complete des organes, nous avons utilise la technique des greffes en parabiose (Burns, 1925), Niveau cerveau anterieur Niveau cerveau posterieur Niveau moelle TEXT-FIG. 2 Systeme nerveux. Chorde. Somites. Tube digestif. modifiee par Gallien (1957). Ce dernier auteur eut l'idee ingenieuse d'associer en parabiose un embryon sain a un embryon malforme. De cette facon, le premier subvient aux besoins du second, et on peut conserver ainsi des embryons qui auraient ete incapables de survivre seuls. Les embryons sont 42 MME. M. REYSS-BRION 654 eleves une quinzaine de jours, ce qui leur permet d'atteindre un stade auquel une bonne differentiation nerveuse est realisee. 82 Niveau cerveau anterieur Niveau cerveau posterieur Niveau moelle Q TEXT-FIG. 3 Systeme nerveux. Chorde. Somites. Tube digestif. Les premiers resultats obtenus par cette methode se superposent a ceux que nous venons d'exposer. Nous avons cependant reussi a identifier du deuterencephale apres une irradiation de 550 r.; alors que nous n'avions signale son apparition qu'apres 300 r. chez l'embryon eleve isolement. II n'est d'ailleurs / . Embryol. exp. Morph. Vol. 11, Part 4 M. REYSS-BRrON (Facing page 655) L'ECTODERME DE BATRACIEN APRES IRRADIATION 655 pas tres caracteristique, mais il est, dans quelques cas, accompagne d'une petite vesicule auditive, ce qui ne laisse aucun doute sur sa nature. II semblerait done, dans ce cas, que la disparition de l'archencephale et du deuterencephale soit presque simultanee. DISCUSSION On voit que l'ectoderme irradie perd progressivement sa competence vis a vis des inducteurs neuraux. Les difTerentes structures disparaissent dans l'ordre suivant: deuterencephale, archencephale, formations spinocaudales. En ce qui concerne les formations deuterencephaliques, il est difficile de se prononcer definitivement. En effet, dans quelques cas, l'examen histologique permet d'observer l'existence d'une vesicule archencephalique reduite (Planche, fig. 1), puis une interruption des structures nerveuses au niveau du deuterencephale (Planche, fig. 2) et enfin de la moelle, de la chorde et des somites qui se maintiennent jusqu'a l'extremite de la queue (Planche, fig. 3). Dans d'autres cas, au contraire, il n'y a pas d'interruption au niveau du rhombencephale; la vesicule archencephalique, si elle existe, est reduite, et Ton passe sans interruption aux structures spinocaudales. Cependant, rien ne permet d'affirmer que le cerveau posterieur existe quand il n'y a pas d'otocystes car la formation neurale qui se trouve a son niveau ressemble beaucoup a de la moelle (tube arrondi regulier, ou structure typique de moelle avec murs epaissis, plancher et plafond amincis). (Planche, fig. 5b.) II semblerait possible qu'en l'absence de structures deuterencephaliques, la moelle puisse s'etendre a un niveau ou normalement on ne la trouve pas. Ceci me parait peu probable, mais en presence de telles structures, je n'ai pas ose conclure positivement en faveur de deuterencephale. EXPLICATION DE LA PLANCHE FIG. 1. Embryon ayant recu 550 r. au pole superieur. II y a une ebauche de cerveau ant6rieur. FIG. 2. Le meme embryon au niveau du cerveau posterieur. Aucune differentiation nerveuse. FIG. 3. Le meme embryon, dans la region moyenne du tronc. Presence de moelle, chorde et somites. FIGS. 4, 5, 6. Parabiose d'un embryon ayant recu 300 r. au pole superieur avec un embryon sain. L'embryon normal figure sur les Figs. 4a, 5a, 6a; l'irradie sur les Figs. 4b, 5b, 6b. FIG. 4a et b. Coupes au niveau du cerveau anterieur. (a) Structures normales=Diencephale avec yeux; (b) Apres irradiation=Archencephale massif. FIG. 5a et b. Coupes au niveau du cerveau posterieur. (a) Deuterencephale accompagne d'otocystes—Chorde; (b) Les formations presentes au niveau du cerveau post. Ressemblent a de la moelle—Chorde. FIG. 6a et b. Coupes au njveau des formations spinocaudales. (a) Formations normales= Moelle, chorde, somites. Nageoire; (b) Apres irradiation, la nageoire est atrophiee, mais la moelle, la chorde et les somites sont bien representes. ' 656 MME. M. REYSS-BRION RESUME 1. Apres irradiation aux rayons X, l'ectoderme de jeune gastrula de Pleurodele et d'Axolotl perd progressivement son aptitude a former des structures nerveuses. L'ordre de disparition des differentes formations est le suivant: deuterencephale, archencephale, formations spinocaudales. 2. Le cerveau posterieur disparait apres des irradiations de 300 et 550 r., alors que le cerveau anterieur persiste, apres des doses de 550 et quelquefois 800 r. II est d'ailleurs tres reduit. Pour ces doses de rayons X, les formations spinocaudales sont presentes dans presque 100% des cas. Elles disparaissent a leur tour apres des irradiations de 1050 r. 3. A l'inverse de ce que Ton obtient en denaturant les inducteurs, ce sont done les structures cerebrales qui disparaissent les premieres lorsqu'on porte atteinte a l'integrite du tissu competent. SUMMARY On the structures differentiated from X-irradiated amphibian ectoderm 1. The ectoderm of the young gastrula of Pleurodeles and of axolotl loses the capacity to form neural structures after X-irradiation. With increasing doses the order in which structures fail to form is hindbrain, forebrain, and spinocaudal structures. 2. The hindbrain is not formed after irradiation by 300 r. and 550 r., although the forebrain survives after 550 r. and sometimes after 800 r. It is, however, much reduced in size. After such doses of X-rays spinocaudal formations are present in almost 100 per cent, of cases. They also are missing after doses of 1050 r. 3. In contrast to the findings using progressively more denatured inductors, it is therefore the brain structures which disappear first when the competent tissue is injured. TRAVAUX CITES BURNS, R. K. (1925). The sex of parabiotic twins in Amphibia. /. exp. Zool. 42, GALLERA, J. (1952). Inductions cephaliques dans l'ectoblaste vieillisant (Triturus 31-90. alpestris). Roux Arch. EntwMech. Organ. 146, 21-67. L. (1957). Parabiose de larves teratologiques chez le Triton Pleurodeles waltlii Michah. C. R. Soc. BioL, Paris, 151, 1085-87. GALLIEN, L. et DUROCHER, M. (1957). Table chronologique du developpement chez Pleurodeles waltlii Michah. Bull. BioL 91, 97-114. HOLTFRETER, J. (1938). Veranderungen der Reaktionsweise im alternden isolierten Gastrulaektoderm. Roux Arch. EntwMech. Organ. 138, 163-96. LEHMANN, F. E. (1929). Die Entwicklung des Anlagen muster im Ektoderm der Tritongastrula. Roux Arch. EntwMech. Organ. 117, 312-83. GALLIEN, L'ECTODERME DE BATRACIEN APRES IRRADIATION 657 MACHEMER, H. (1932). Experimentelle Untersuchungen iiber die Induktionsleistungen der oberen. Urmundlippe in alteren Urodelenkeimen. Roux Arch. EntwMech. Organ. 126, 391-457. NIEUWKOOP, P. D. (1958). Neural competence of the gastrula ectoderm in Amblystoma mexicanum. An attempt at quantitative analysis of morphogenesis. Ada Embryol. Morph. exp. 2, 13-53. WADDINGTON, C. H. (1938). Regulation of amphibian gastrula with added ectoderm. / . exp. Biol. 15, 377-82. WOLFF, Et. et REYSS-BRION, M. (1957). L'effet des rayons X sur la gastrula d'un Batracien urodele: Pleurodeles waltlii. C. R. Acad. Sci., Paris, 244, 3172-5. {Manuscript received 17 th April 1963)