Synthèse biologique de l`acide hippurique - ETH E

Synthèse biologique
de l'acide
hippurique
et
Phosphorylation biologique
de la thiamine
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Thèse No 2014
Synthèse biologique de l'acide hippurique
et
Plws|ilion lalion biologique de la thiamine
THÈSE
présentée
à l'Ecole
Polytechnique Fédérale,
Zurich
pour l'obtention
du
grade
de Docteur es Sciences
techniques
par
Hjalmar
Gaston MKI SKN
de nationalité danoise
Ing.-chimiste E. P. F.
Rapporteur
:
Corapporteur
:
Prof. Dr V.
Prelog
Prof. Dr L. Ruzicka
1953
Imprimerie Ganguin
et
Laubscher
S. A.
—
Montreux
Que Monsieur le Docteur Fr. Leuthardt, Professeur de
physiologique à l'Université de Zurich, veuille trouver
ici l'expression de ma vive reconnaissance pour les conseils
éclairés et l'extrême bienveillance qu'il a bien voulu me pro¬
diguer tout au long de l'exécution de ce travail.
En témoignage de profonde reconnaissance et de respec¬
Chimie
tueuse
affection.
A Monsieur le Docteur L. Ruzicka, Professeur
de la Faculté de Chimie de l'Ecole
Polytechnique
et
directeur
Fédérale de
Zurich, qui a eu l'amabilité d'être le coréférent et membre du
jury de cette thèse, j'exprime mes hommages reconnaissants.
A Monsieur le Docteur V.
de
Chimie
Prelog,
Professeur à la Faculté
organique de l'Ecole Polytechnique Fédérale
de
Zurich, qui a bien voulu accepter d'être le réfèrent et membre
du jury de la présente thèse, j'exprime mes remerciements et
mes
hommages
reconnaissants.
A la mémoire de
A
ma
Mère
et
à
mon
ma
Père
chère Edith
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INTRODUCTION
Les fonctions
chimiques
de la cellule
si l'on admet que les différents processus
ne
sont
chimiques
compréhensibles
sont
liés à la
que
structure
microscopique ou ultramicroscopique de la cellule. Depuis les travaux
classiques de Friedrich Miescher * sur la chimie du noyau cellulaire, on
de la cellule, certains
a essayé de localiser dans les différentes parties
constituants ou ferments. Récemment on a isolé, par centrifugations
fractionnées et par d'autres méthodes appliquées à des tissus homogé¬
néisés, des constituants morphologiquement bien définis de la cellide
(noyaux cellulaires, granules cytoplasmiques) et on les a obtenus assez
purs en grande quantité. De cette façon il a été possible d'analyser ces
constituants cellulaires et en particulier d'étudier leurs systèmes enzymatiques.
Au
cours
des deux dernières années, nous avons entrepris dans notre
la fonction des granules cytoplas¬
sur
laboratoire diverses recherches
miques (mitochondries) du foie. Ce travail fournit également une contri¬
bution à l'étude des systèmes enzymatiques dans la cellule hépatique.
La première partie de ce travail traite de la synthèse de l'acide
hippurique. Nous démontrons que les mitochondries sont le siège de
cette
réaction.
ferment,
une
de la cellule
Dans
la
seconde
partie,
transphosphorylase, qui
et
nous
se trouve
décrivons
dont l'action consiste à transporter le
l'acide adénosine
triphosphorique (ATP)
sur
un
nouveau
dans les fractions solubles
pyrophosphate
de
la thiamine.
9
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PREMIERE PARTIE
BIOLOGIQUE
SYNTHESE
nous
sommes
utilisant
rique
généisé. Cet homogénat
en
de Leuthardt
synthèse dans
une
proposés d'étudier la synthèse
système enzymatique le foie
comme
successives à 0° C.
el
en
et
nous
nous
coll. 3.
Les
nous
sur
Nous
en
la
les
avons
des fractions. Dans
fonctions chimiques
Comme
est
fractionnons
le
basant
la provenance de la glycine
d'autres acides aminés.
a)
HIPPURIQUE
Généralités
/.
Nous
DE L'ACIDE
par
de l'acide
hippu¬
cobaye homo¬
des centrifugations
2
Hogeboom et coll.
de
travaux
de
ensuite
cherché à localiser la
chapitre suivant, nous étudierons
remplaçant par des peptides et par
un
des mitochondries du
allons le montrer, la
synthèse
foie.
de l'acide
hippurique
jouent aussi un rôle
sont le siège de la phos-
localisée dans les mitochondries. Ces dernières
dans la formation de la cocarboxylase, car elles
phorylation oxydative de l'acide adénylique et fournissent ainsi l'ATP
Nous donnons, par
nécessaire à la phosphorylation de la thiamine.
conséquent, d'abord quelques détails sur la fonction des granules
cytoplasmiques.
Par centrifugation du foie homogénéisé on obtient facilement deux
fractions de particules : 1. un sédiment constitué par des granules visibles
3 ,m),
au microscope (diamètre environ 0,5
large granules des auteurs
mitochondries de la cellule
les
essentiellement
contient
anglo-saxons, qui
obtient par centrifu¬
à
on
2.
un
duquel
partir
hépatique ;
surnageant
gation prolongée, à grande vitesse de rotation (24.000-100.000 g), des
microparticules ultramicroscopiques désignées par Claudei comme
recherles
somes
Chantrenne6,
Brachet1). D'après
(Claude 4, Sternh,
-
«
»
«
»
U
ches de Brachet
de
et
ses
élèves
dernières
tances
ne
représentant
un
de
fractions
pas seulement
sont
fraction contiendrait la
cette
plus grande
de la cellule.
partie de l'acide ribonucléique
L'analyse des différentes
granules
a
montré
que
ces
accumulation de différentes subs¬
une
matériel de réserve, mais
qu'elles
constituent de
vrais organes chimiques, contenant des systèmes enzymatiques importants
de la cellule. Ainsi se confirme l'hypothèse émise, il y a soixante-cinq ans
déjà,
par R. Altmann
couvertes
Dans
nos
considéré les
a
granules cytoplasmiques
10
dé¬
comme
culièrement intéressés
collaborateurs
8, qui
les organes du métabolisme cellulaire.
recherches ce sont les mitochondries qui nous ont
lui,
par
(morphologie
furent les
Hertwig9). Hogeboom
voir
à établir
parti¬
et
ses
méthode permettant
de mitochondries intactes gardant leurs carac¬
d'obtenir des suspensions
tères morphologiques. Ces
premiers
auteurs
observations de Guillermond
n
se
sont
une
appuyés
sur
les
anciennes
le chondriome des cellules
végétales,
hypertonique de saccharose comme liquide de
suspension. Dans des solutions d'électrolytes, les mitochondries s'altèrent
et s'agglutinent. Dans ces conditions il est impossible de les séparer des
et ont
utilisé
une
sur
solution
autres constituants
du tissu. Dans
nos
recherches
citrulline, la détermination colorimétrique
pas pu être faite. De ce fait nous avons
mannite. En outre la mannite n'est pas
mitochondries,
ce
qui évite
une
en
sur
la formation de la
présence de saccharose
n'a
remplacé le saccharose par la
attaquée par les ferments des
complication
des processus
enzymatiques
étudiés.
0.
Warburg (1913)
12
semble être le premier à avoir démontré
expérimentalement la participation des granules cytoplasmiques du foie
à la respiration cellulaire. Il trouva qu'une suspension de granules pré¬
parées à partir du foie de cobaye absorbe de l'oxygène. Des travaux
récents confirment en effet que les granules cytoplasmiques sont le siège
principal de la respiration cellulaire. Schneider et coll. 13 ont montré
succinodéhydrase se trouve exclusivement localisée dans les mito¬
hépatiques. Des recherches ultérieures ont révélé
que les granules cytoplasmiques contiennent la totalité des enzymes du
cycle des acides tricarboxyliques et qu'elles sont aussi le siège de l'oxy¬
dation des acides gras (Mùller et Leuthardt u, Leuthardt et Mauron 15,
Kennedy et Lehninger 16). La figure 1 montre l'oxydation du pyruvate
et de divers produits intermédiaires du cycle tricarboxylique au
moyen
d'une suspension de mitochondries.
L'oxydation du pyruvate et des différents acides carboniques inter¬
médiaires représente la source d'énergie la plus importante pour la
phosphorylation oxydative dans la cellule hépatique. Les mitochondries,
que la
chondries des cellules
en
fournissant continuellement l'ATP, jouent donc
processus de la vie cellulaire utilisant des liaisons
un
rôle dans
tous
les
phosphatées riches en
selon Lipmann 1?). Le rôle que
énergie (« energy rich phosphate bonds
jouent les mitochondries dans les réactions dépendant de l'ATP se montre
»
12
purification de certains enzymes
homogénéisé ou des extraits non
purifiés, on trouve que les mitochondries sont indispensables. Dans
l'extrait brut, l'ATP est continuellement hydrolyse par l'action de l'adénosine triphosphatase (ATP-ase). Dans ces conditions il faut, pour
maintenir un taux suffisant en ATP. le système phosphorylant des
façon
d"une
très
nette
au
solubles. Si l'on travaille
cours
avec
de la
du tissu
Une fois que le système enzymatique a été séparé de
l'ATP-ase, l'ATP ajouté n'est utilisé que par le système étudié ; il y a
une réaction stoechiométrique entre l'ATP et les substances en question.
Un exemple du cas précité sera décrit dans ce travail ; un autre est donné
par la synthèse de la glutamine (Frei et Leuthardt 18, Speck 19).
mitochondries.
b)
formation
Rôle de la
de l'acide
hippurique.
La synthèse de l'acide hippurique à partir de glycocolle et
benzoïque nécessite la formation d'une liaison peptidique.
réaction peut être
considérée, dans
un
certain sens,
de l'acide
Or
cette
modèle de la
comme
synthèse d'une liaison peptidique. On s'est déjà souvent demandé si la
synthèse peptidique dans l'organisme est simplement l'inverse de l'hydro¬
lyse et dépend des mêmes peptidases. Les travaux de Bergmann 20 et de
ses élèves parlent en faveur de cette dernière hypothèse. Ces auteurs ont
décrit la formation de peptides à partir de certains acides aminés subs¬
titués (principalement des dérivés carbobenzoxy ou anilides), en présence
de protéinases. Cependant les conditions dans lesquelles ces synthèses
fermentatives
ont lieu ne peuvent pas être comparées directement aux
physiologiques. Il ne s'agit pas de substances naturelles. La
formation des produits finaux est favorisée par leur faible solubilité.
Il est possible que, dans certains cas particuliers, des peptides puissent
ainsi être synthétisés dans les cellules vivantes. Dans la règle, la synthèse
des peptides à partir des acides aminés étant un processus exergonique,
l'état d'équilibre serait déjà atteint après la formation de très petites
quantités de peptides. La synthèse peptidique doit donc être liée à un
processus exergonique et pour autant qu'on le sache aujourd'hui, elle
nécessite la présence de l'ATP. La synthèse de l'acide hippurique en est
On connaît un ferment, l'hippuricase (ou histozyme) qui
un exemple.
hydrolise l'acide hippurique. La synthèse à partir du glycocolle et de
l'acide benzoïque se fait cependant par un système enzymatique plus
complexe.
Au point de vue physiologique, la synthèse de l'acide hippurique
appartient aux réactions désignées sous le nom de réactions de désintoxi¬
conditions
de détoxication. On groupe sous ce
lesquelles interviennent des susbtances
cation
dans
ou
(Williams21).
formés
ne
Le
sont
terme
pas
de
toujours
désintoxication
moins
toxiques
terme
l'organisme
produits
produits initiaux.
étrangères
est
que
les réactions
toutes
inexact.
les
à
Les
13
Ils peuvent même l'être davantage. Souvent les produits introduits dans
l'organisme sont transformés en dérivés plus solubles (formation d'acides
glucuroniques conjugés ou de sulfates conjugés).
Le couplage de l'acide benzoïque avec le glycocolle pour former de
l'acide hippurique, qui sert chez les herbivores à l'élimination des grandes
quantités d'acide benzoïque formé dans l'intestin, est un des processus
de désintoxication les plus répandus. On connaît d'autres réactions
similaires. C'est ainsi que dans l'organisme du lapin l'acide pyridine-acarboxylique se couple avec le glycocolle pour donner de l'acide a-pyridinurique. Les dérivés phénylés des acides gras subissent d'abord une
/î-oxydation et se transforment finalement en acide benzoïque ou phénylacétique (Knoop 22).
Chez l'homme, le lapin, la chèvre et le porc, l'acide benzoïque
administré se combine en majeure partie avec le glycocolle et s'élimine
sous forme d'acide hippurique. Le chien élimine environ 80 % de l'acide
benzoïque administré comme acide libre. Comme l'acide benzoïque,
l'acide phénylacétique est en général couplé à la glycine et s'élimine
sous forme d'acide phénacétique. Chez l'homme ainsi
que chez le chim¬
panzé, l'acide phénylacétique se combine avec la glutamine pour former
la
N-phénacétyl-glutamine (Thierfelder et Sherwiti23). Chez les oiseaux
qui remplace le glycocolle pour former de la dibenzoyl-
c'est l'ornithine
ornithine. Des essais in vivo
ont
montré que par administration de fortes
doses d'acide
benzoïque il y a plus de glycocolle excrété (sous forme
d'acide hippurique) qu'il n'y en a à disposition dans les protéines. C'était
la première preuve directe de la synthèse d'un acide aminé dans l'orga¬
nisme animal. L'excès de glycocolle doit provenir d'autres sources, car
cet acide aminé ne se trouve
pas élaboré dans l'organisme en quantités
suffisantes. Chez le chien, la formation de l'acide hippurique a lieu dans
le rein, l'animal néphrectomisé est incapable de le
synthétiser 2i. Chez
le rat, le cobaye et le lapin, la synthèse se fait
également dans le foie,
qui en général est le siège principal des réactions de désintoxication.
L'acide
hippurique
est
un
constituant normal des urines.
Il
se
trouve
petite quantité chez l'homme, en quantité plus élevée chez les herbi¬
vores, dont le régime contient des corps générateurs d'acide benzoïque.
en
c)
Synthèse
de l'acide
hippurique.
En incubant des coupes de rein ou de foie de cobaye, de lapin ou
de rat, dans une solution appropriée contenant de l'acide benzoïque,
Borsook et Dubnoff25 ont observé une formation d'acide hippurique.
Ces auteurs ont établi que la synthèse est accompagnée d'une
augmen¬
tation de
l'énergie libre. Ils trouvent pour la réaction : benzoate (aq) +
+ 2670 Cal. à 38° C.
glycine (aq)
hippurate (aq), la valeur de A F
Cela veut dire que la synthèse ne représente pas simplement l'inverse
=
14
=
de
l'hydrolyse. Cette dernière peut se faire spontanément par l'hippusynthèse doit être liée à une réaction libérant de l'énergie.
D'après les observations de Borsook et Dubnoff23 cette énergie doit
provenir d'une oxydation car la synthèse est inhibée par une solution de
KCN, 0,001 M. Avec la méthode des coupes, il n'a pas été possible de
pousser plus loin l'étude des différentes étapes de la synthèse enzymatique. Cette dernière est limitée par la perméabilité des surfaces cellu¬
laires. L'étude approfondie des facteurs influençant la
synthèse, ne
pouvait se faire qu'en utilisant des homogénats de tissus. Borsook et
Dubnoff 26 furent les premiers à obtenir une formation d'acide hippurique
à partir de benzoate et de glycine en utilisant un homogénat de foie de
cobaye, préparé d'après la méthode de Potter et Elvehjem 27. L'addition
à leur milieu d'incubation de cétoglutarate et d'acide
adénylique avait
pour effet de doubler la quantité d'acide hippurique synthétisé. Cohen
et Me Gilvery28 étudièrent la synthèse de l'acide
p-amino-hippurique
dans des homogénats de foie de rat. Ces auteurs ont établi
que la synthèse
dépend de l'acide adénosine-triphosphorique. En fractionnant l'homogénat de foie de rat par centrifugation, ils purent démontrer que la
synthèse de l'acide p-amino-hippurique était liée aux particules insolubles
de la cellule hépatique.
ricase mais la
d) Formation
de la
glycine.
La glycine nécessaire à la synthèse de l'acide hippurique peut être
formée à partir d'autres acides aminés. Leuthardt 29 ainsi que Borsook
2o
et Dubnoff
ont obtenu en présence de coupes de foie de cobaye une
synthèse considérable d'acide hippurique en remplaçant la glycine par
I-glutamine, la d, I-sérine, la l-proline, l'oxyproline, l'acide aspartique
Shemin 30, confirmant les résultats de Leuthardt
et l'acide glutamique.
et Glasson sl, prouva par la suite à l'aide de la 1-sérine marquée (N15 dans
le groupe aminé et C13 dans le groupe carboxylique) que cet acide aminé
est transformé en glycine par la scission entre les atomes a et /5 de la
la
chaîne carbonée. La réaction
et
et
Greenberg
83
ont
du formiate
prouvé
marqué.
la
Selon Siekevitz
et
réversible. Sakami
synthèse
Sakami
position /? de la serine peut
choline.
est
:i2
de la 1-sérine à
ainsi que Siekevitz
partir du glycocolle
s~
a
également trouvé que l'atome
être fourni par les groupes méthyl de
Greenberg
33
l'atome
en
position
a
de
en
la
la-
glycine fournit du formiate qui se condense avec une seconde molécule
de glycine pour donner de la serine. La synthèse de la serine à partir
de la glycine est également prouvée par les constatations de Winnick
34
el coll.
montrant que la radioactivité de la glycine marquée (C14) se
retrouve surtout
coll.
en
35
dans la serine des protéines. Récemment Braunstein et
un travail sur la synthèse enzymatique de la glycine
publièrent
utilisant des coupes de tissus de différentes espèces d'animaux. Ils
15
trouvèrent
synthèse
la
qu'en présence de coupes de foie de rat
de l'acide hippurique, la glycine pouvait
ou
cobaye, dans
remplacée par
de
être
36
ont trouvé
expériences in vivo, Abbott et Lewis
la sarcosine (mais non la N, N-diméthylglycine ou la bétaïne) aug¬
la thréonine. Par des
que
mente
également la quantité d'acide hippurique excrétée chez le lapin.
ingérer de la sarcosine marquée (N15 du groupe aminé) Bloch
En faisant
et
Schœnheimer
3?
ont
confirmé les résultats d'Abbott
Partie
//.
et
Lewis 36.
expérimentale
a) Matériel.
Animaux
:
Nous
avons
utilisé des
rats
que
des
albinos adultes de 150-200 gr.
avaient reçu une
cobayes de 200-300 gr. Les animaux
nourriture optimale et furent mis à jeun environ 36
l'expérience.
ainsi
Substrats
:
Le benzoate de Na ainsi
que
à 40 heures
le fumarate de Na
avant
sont
des
produits commerciaux recristallisés. La glycine, l'acide glutamique,
la thréonine, la sarcosine, la leucyl-glycyl-glycine, la leucyl-glycine, le
glutathion sont des produits Hoffmann La Roche. L'acide /3-oxyglutamique fut préparé selon la méthode de Harington et Randall 38. L'acide
adénosine-triphosphorique (ATP) est préparé selon les méthodes combi¬
nées de Needman, Kerr et Le Page 39. Le cytochrome C est préparé à
partir de cœur de cheval selon la méthode de Keilin et Hartree 40, et
gardé en solution. Une partie de ce produit nous a été fourni par la
Robapharm, Bâle.
Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau bidistillée et leur
pH ajusté à 7,5. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon
phosphate de K et de pH 7,5.
-
b) Préparation des suspensions enzymatiques.
Toute la
à l'aide d'un
préparation
centrifugeur
des différentes fractions s'effectue à 0° C.
et
Après la mort de l'animal, le foie est
immédiatement mis dans la glace. L'homogénéisation du tissu s'effectue
pendant au moins 45 secondes dans l'appareil de Potter et Elvehjem 27,
contenant du KCl isotonique comme milieu de suspension. L'homogénat
ainsi obtenu
est
filtré à
à froid.
travers
deux couches de gaze. La
des différentes fractions s'effectue selon le schéma I.
16
préparation
SCHEMA
10
ce.
I
Homogénat de foie de 20
au KCl isotonique
centrifugé pendant
15
min.
(3500
X
y
r
Résidu
+
3
ec.
g)
Surnageant
mannite isot.
chauffé pendant 5 min.
bain-marie à 100° C.
centrifugé pendant
10 min. (3500 X g)
au
centrifugé pendant 10
min.
i
Y
Y
Y
Surnageant
Résidu
Résidu
J-
2
ce.
isot.
7 min.
Y
Surnageant
mannite
Kochsaft
«
»
centrifugé
(3500 X g)
Y
Y
Surnageant
Résidu
-
2,5
ce.
mannite isot.
centrifugé pendant
1 min. (3500 X g)
Y
Y
Surnageant
Résidu
Suspension de
(Noyaux, débris cellulaires)
mitochondries
=
«
Culot
»
cobaye à 20 % sont centrifugés
(3500 X g). Le surnageant est décanté
pour la préparation soit du jus bouilli (« Kochsaft »), soit d'un
surnageant dialyse. Le foie de cobaye contient une substance de coloration
10
ce.
pendant
et gardé
d'un
homogénat
15 minutes à 4600
verte, de densité
trouvons
résidu,
d'un
car
est
un
de foie de
t.
m.
peu inférieure
mitochondries. De
aux
après la première centrifugation
un anneau
homogénat
vert
dont
l'épaisseur
à l'autre. Cet
et
anneau est
comme
couche
ce
fait
nous
supérieure du
l'intensité de coloration varient
éloigné
au
moyen d'une
pipette,
couche contient des corps inhibiteurs de la réaction étudiée. Il
dans bien des cas impossible, même avec plusieurs lavages à la mannite
cette
isotonique, d'éloigner complètement
chondries ainsi obtenue
reste
suspension de mitochondries
ce
corps et la
verdâtre. Pour
est
peu
active,
notre
dans
suspension de mito¬
synthèse une telle
certains
cas
même
11
totalement inactive. La
nature
de la bile
qu'il provient
(voir
dans les foies des animaux
manque
en
carottes
et
du corps inhibiteur est inconnue. Il semble
33). Il est particulièrement abondant
page
recevant
hiver, quand les cobayes
du foin. Peut-être
de l'herbe dans leur nourriture, il
sont nourris
avec
des
betteraves, des
s'agit-il d'un produit de dégradation
de la
chlorophylle.
on ajoute 3 ce. d'une solution de mannite isotonique et
suspension homogène. Cette dernière est centrifugée pen¬
Au résidu
on
refait
une
t. m. Le surnageant est décanté. La troisième
dure que 7 à 9 minutes. Une partie des mitochondries
ne se sont pas sédimentées et le surnageant blanc-verdâtre est décanté.
Ce n'est qu'après la quatrième centrifugation que nous obtenons, selon
dant 10 minutes à 4600
centrifugation
ne
procédé, une suspension de mitochondries presque blanche. Le
microscopique (microscope à contraste de phase) révèle une
suspension homogène de particules dans laquelle on ne trouve que rare¬
ment un noyau ou une hématie (fig. 2). L'activité des suspensions dépend
du nombre des granules par unité de volume, mais leur dénombrement
direct est très difficile. Dans quelques expériences nous avons comparé
la densité optique des suspensions (mesurée à 375 m/u à l'aide du pho¬
tomètre de Beckmann) avec leur teneur en azote. Le dosage de la densité
optique pour différentes dilutions de la même suspension, montre que
ce
contrôle
la densité optique est une fonction linéaire de la concentration de la
suspension, donc du nombre des particules. La figure 3 montre qu'en
moyenne la densité optique est également proportionnelle à la teneur en
azote.
Ceci permet d'utiliser l'azote
nombre des
particules
contenues
dans
mesure
approximative
suspension.
comme
une
du
c) Incubation.
Le volume final par essai
est
L'incubation s'effectue dans des
Ces derniers
d)
sont
agités pendant
Extraction de l'acide
Après
de 4 ce. La phase gazeuse est de l'air.
erlenmeyers d'une capacité de 25 ce.
45 minutes à 38° C.
hippurique.
l'incubation la réaction
est arrêtée par l'adjonction de 1 ce.
% d'acide métaphosphorique. Après centrifugation
des protéines on prélève 4 ce. que l'on pipette dans un petit appareil
d'extraction du type Kutscher-Steudel d'une capacité d'environ 6 ce.
On ajoute 0,2 ce. d'ILiSC^ N. Les tubes d'extraction sont refroidis à l'eau
froide afin d'éviter une hydrolyse. L'extraction dure 5 heures. Le résidu
de l'extrait éthéré est dissout dans 3 ce. d'HCl azéotropique. Le ballon
est muni d'un réfrigérant à reflux et on fait bouillir la solution pendant
2 heures. Après hydrolyse l'HCl est complètement éliminé au vide à
100° C. Le résidu sec est dissout dans 10 ce. d'eau distillée. On agite
d'une solution de 10
18
solution en présence de 0,5 gr. de permutite de Na pour éloigner
l'NHfj. La solution est filtrée et une partie aliquote du filtrat sert à la
cette
glycine
détermination de la
forme de N aminé.
sous
e) Dosage de la glycine.
Méthode I
(voir Russel 41).
—
Dans
cette
méthode
nous
avons
utilisé
i2
(coloration orange en
pour le dosage de la glycine le réactif de Folin
milieu alcalin avec l'acide a-naphto-quinone-sulfonique). Avec chaque
série de
densité
les extinctions d'une solution
dosage,
des solutions
optique
est
test sont
mesurée à l'aide du
déterminées. La
spectrophotomètre
de Beckmann.
En utilisant cette méthode de dosage, il est important de refroidir
récipients à extraction susmentionnés, dès que les essais contiennent
de l'acide glutamique ou de la glutamine, sinon ces derniers se trans¬
forment en acide a-pyrrolidonecarboxylique (Wilson et Cannan43) qui
est extrait en partie et qui après hydrolyse apparaît sous forme d'azote
les
aminé.
Méthode II.
toutes
—
La méthode I n'est pas spécifique puisqu'elle englobe
qui sont extraites par de l'éther et qui par hydrolyse
les substances
donnent des groupes aminés libres. D'autre part, dans nos recherches,
travaillons avec des homogénats de tissu et il fallait établir la
nous
formation de
glycine
Krueger 44, qui est
à
partir d'autres acides
aminés. C'est la méthode
modification de celle de Alexander
et coll. 45,
employée. Cette méthode se base sur le fait
qu'une solution diluée de glycine donne à l'ébullition en présence de
ninhydrine (hydrate de tricétohydrindène) 1 mol. de formaldéhyde par
mol. de glycine (Mac Fadyenie). D'après Eegriwe41 l'aldéhyde formique
condense à 100° C. dans un milieu d'HgSC^ conc. avec de l'acide
se
chromotropique pour donner une coloration d'un violet intense. Les
détails du procédé sont ceux proposés par Krueger. Le rendement de la
première méthode est de 80 à 90 %, tandis que la seconde méthode nous
permet de retrouver 90 à 97 % de l'acide hippurique ajouté.
de
que
nous
avons
une
finalement
///.
a)
Résultats
Conditions de synthèse.
Borsook
Dubnoff
et
discussion
Dépendance
de VATP.
26
ont prouvé pour la première fois la possibilité
synthèse de l'acide hippurique dans le tissu homogénéisé (foie de
28
cobaye) et la nécessité de l'addition de l'ATP. Cohen et Me Gilvery
et
d'une
19
ont précisé les conditions de la synthèse
zoïque. Nous prouvons dans ce travail
en
que
utilisant l'acide
p-aminoben-
les mêmes conditions
sont
synthèse de l'acide hippurique à partir de l'acide
de
la
et
benzoïque
glycine, dans le foie de cobaye. En exprimant l'activité
de la synthèse par le rapport : jumol. acide hippurique formé / mgr. N,
nous observons que, dans les mêmes conditions d'expérience, une sus¬
pension de mitochondries préparée à partir d'un foie de rat est aussi
active qu'une même suspension préparée à partir d'un foie de cobaye
(tableau 1). Le dosage de la glycine a été fait dans ces deux cas selon
nécessaires pour la
TABLEAU 1
Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ;
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate
de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Dosage selon la
acide
méthode I.
Essais
Conditions
fiM..
acide
blanc
Rat
glycine
0,49
0,54
3,04
glycine
1,00
2,03
4,91
benzoate
benzoate
Cobaye
+
blanc
benzoate
benzoate
la méthode I. Il
ceci
surtout
est
pour
cobaye. Dans
+
hippurique
formé
Activité
0,22
0,24
1,35
0,42
0,85
2.05
à remarquer que les valeurs à blanc sont élevées et
essais contenant des mitochondries de foie de
les
extrayons, avec l'éther, après déprotéinihydrolysée, libère de l'azote aminé. C'est la
raison pour laquelle nous avons préféré la méthode II décrite plus haut.
La constatation la plus importante concernant la synthèse de l'acide
hippurique, est sa dépendance de l'ATP. Cette synthèse présente un
nouvel exemple d'une réaction endergonique couplée avec la déphosphorylation de l'ATP. Le tableau 2 montre l'activité des mitochondries en
sation,
une
ces
essais
nous
substance qui,
fonction de la concentration de l'ATP. Les mitochondries ainsi que la
solution surnageante contiennent des ferments hydrolysant l'ATP. Pour
maintenir une concentration suffisante en ATP, il faut ajouter un
substrat oxydable permettant la rephosphorylation oxydative de l'acide
adénylique (Millier et Leuthardt48).
comme substrat oxydable.
20
Nous
avons
utilisé
le
fumarate
TABLEAU 2
Suspension de mitochondries 0 5 ce. Acide benzoïque 0.001 M. ; glycine 0,015 M. ;
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; cytochrome C 0,0000145 M.
L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume
final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C.
fiM.
«M. ATP par essai
formé
0
0,15
0.5
0.20
1.0
0,40
1,10
3,05
3,0
6,0
b) Localisation
de la
Pour obtenir la
Me
Gilvery28
synthèse.
p-amino-hippurique,
de l'acide
synthèse
travaillé
avaient
hippurique
acide
des
avec
homogénats
lavés
Cohen
et
et
avaient
particules insolubles de l'homo¬
hippurique, à partir de benzoate
différentes fractions résultants des centrifugations
constatons que le système de synthèse se trouve
trouvé que cette synthèse était liée aux
génat. En étudiant la synthèse de l'acide
et
de
glycine, dans les
l'homogénat, nous
de
mitochondries, ceci aussi bien pour des mitochondries
partir d'un foie de rat que d'un foie de cobaye (tableau 3).
localisé dans les
préparées
à
TABLEAU
3
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5.
Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Hc
homogénat complet ; M
=
=
mitochondries
;
S
=
surnageant ;
C
=
culot.
«M.
acide
+4
Hc
ac.
ac.
benzoïque
benzoïque
+
Rat
Cobaye
Rat
0,112
0,760
2,55
0,028
0,133
1,25
0,730
0,358
glycine
0,083
0,304
3,94
0,054
0,092
2,06
2,220
0,566
0,179
0,195
0,068
0,072
0,230
0,645
0,155
glycine
M
M
+
M
4-
ac.
ac.
benzoïque
benzoïque
+
benzoïque
benzoïque
4-
glycine
0,112
0,158
0,179
benzoïque
+
glycine
0,340
S
S
4
ac.
S
4-
ac.
C
4-
ac.
Activité
Cobaye
Hc
Hc
hippurique
formé
Additions
0.108
21
La faible activité
deux
ces
Il
dans le surnageant et le culot est
reste de mitochondries.
retenue
possible
est
de
déterminer
approximativement
mitochondries dans les différentes fractions
la
succinodéhydrase (méthode
ls
coll.
due, dans
fractions, à la présence d'un
cet
enzyme
se
trouve
de
est
méthode
cette
Potter*9).
van
la
de
quantité
déterminant l'activité de
Selon Schneider
et
uniquement dans les mitochondries. Or
l'activité des différentes fractions
mitochondries. Par
en
proportionnelle
nous
avons
à leur teneur
trouvé
quantité de mitochondries (ou débris de mitochondries)
en
qu'une
certaine
reste,
après le
fractionnement par centrifugation, dans le liquide surnageant.
En considérant l'activité de la synthèse, nous constatons qu'elle
élevée dans les essais
plus
essais contenant de
contenant
l'homogénat complet.
substrat
mitochondries que dans
Par contre, dans les essais
est
les
les
qui
du benzoate, la synthèse d'acide
l'homogénat complet qu'avec les mito¬
chondries. Le surnageant contient donc des substances qui, avec le
benzoate, donnent de l'acide hippurique. En prenant comme système
contiennent
ne
hippurique
est
comme
plus forte
avec
enzymatique les fractions
que
de
suivantes
:
mitochondries seules,
mitochon¬
+ surnageant, mitochondries + Kochsaft, et comme substrat du
benzoate seul, nous avons constaté que la synthèse de l'acide hippurique
dries
TABLEAU 4
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide
iumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de
mitochondries ;
pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 et 90 min. à 38° C. M
=
S
surnageant ;
=
M
K
S
=
Kochsaft.
K
Benzoate
Glycine
45
+
+
1,610
+
+
+
+
Incubation
Incubation
22
-h
+
+
+
+
+
+
+
min.
+
90
+
+
+
+
+
+
+
—
/uM.
hippurique
0,279
0,312
0,009
0,387
0,413
0,013
0,780
r
min.
acide
+
0,221
3,200
+
0,805
+
2,64
+
+
-L-
0,155
3,18
Activité
0,179
0,243
0,198
0,212
0,840
0,091
2,010
0,433
0,722
0,008
1,710
est
plus importante
le surnageant
dans les essais
contenant
en
plus
des mitochondries,
le Kochsaft. Ces deux dernières fractions contiennent
ou
précurseur thermostable de la glycine. La vitesse de synthèse à partir
ce précurseur est plus lente qu'à partir de la glycine (tableau 4). En
outre la quantité d'acide hippurique formée à partir de ce précurseur
varie d'un animal à l'autre et peut atteindre après 90 minutes d'incu¬
un
de
bation des valeurs considérables.
c) Effet
des
Nous
fractions dialysées.
dialyse
à 0° C. 12
de surnageant
pendant 15 heures
dialysat (solution extérieure)
est réduit au vide, à 30° C. à 3 ce. La solution reste claire et il n'y a
pas
de précipitation. Simultanément 12 ce. du même surnageant sont gardés
à la même température pendant le même temps. 13 ce. de surnageant
sont chauffés au bain-marie bouillant pendant 5 minutes et centrifugés.
Le surnageant ou Kochsaft est également dialyse pendant 15 heures
contre 15 ce. d'eau distillée. Le dialysat est réduit au vide à 3 ce.
En
étudiant la synthèse de l'acide hippurique à partir de benzoate et du
précurseur en présence des fractions susmentionnées, nous constatons
que le surnageant dialyse perd son activité. Cette dernière peut être
restaurée en ajoutant le dialysat concentré aussi bien du surnageant que
du
Kochsaft
(tableau 5).
contre
80
avons
ce.
«
ce.
d'eau distillée. Le volume du
»
TABLEAU 5
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0.015 M. ; acide
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C
0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de
mitochondries ; S
sur¬
pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. M
nageant gardé pendant 15 heures à 0° C. ; Sd
surnageant dialyse ; Ds
dialysat
Kochsaft dialyse ; DK
du surnageant ; Kd
dialysat du Kochsaft.
=
=
=
=
S
Sd
—
=
Kd
Ds
DK
Benzoate Glycine
—
+
+
—
—
—
—
—
_
_
-;——
+
+
+
—
_
hippurique
0,730
1,59
1,90
3,55
_
+
ac.
0,410
—
"T
+
=
i
I
—
__
_
+
0,300
0,725
1,43
3,48
Activité
0,229
0,202
0,406
0,860
2,04
0.130
0,290
0,540
1.52
23
d) Peptides, précurseurs
Les résultats
de la
susmentionnés
glycine.
nous
ont
laissé
supposer
que
le
pré¬
peptide à poids moléculaire
En
effet
le
tel
en
élevé,
remplaçant la glycine par
glutathion.
que
peu
certains di- ou tripeptides contenant dans leur molécule de la glycine,
nous constatons que la synthèse de l'acide hippurique a lieu, et ceci aussi
bien avec l'homogénat complet qu'avec les mitochondries. Donc les deux
fractions contiennent les peptidases nécessaires à l'hydrolyse des pep¬
tides utilisés. En ayant comme système enzymatique une suspension de
mitochondries, la synthèse à partir de la 1-leucyl-glycyl-glycine, de la
curseur
pourrait
être
un
acide aminé
«
£0
SO
W>
SO
ou
60
FIGURE
Oxydation
de
divers
acides
70
un
80
90 Jfltn-
1
intermédiaires
du
cycle tricarboxylique,
au
moyen
d'une suspension de mitochondries. Suspension de mitochondries 0,33 ce. (1,25 mgr. N) ;
substrats 0,0083 M. ; ATP 0,001 M. ; MgS04 0,0033 M. ; tampon phosphate 0,0066 M.
de
pH 7,4. L'isotonicité
final 3
24
ce.
est
atteinte
Incubation à 38° C.
au
moyen
d'une solution de KCl 0,5 M. Volume
FIGURE
2o
Groupe de cellules hépatiques montrant les granules plasmatiques
(photographie au microscope à contraste de phases).
*#ÉF-* .4P
tji7*
C
>^2
S^-ff-*'
FIGURE
Suspension
2 6
de mitochondries. Fixation à l'acide
Coloration selon Altmann.
osmique.
25
If-
¥
"f
1
3
2
î
4
FIGURE
6
Kfrjf
'
3
Proportionnalité entre la densité optique et la teneur en azote de différentes
suspensions de mitochondries.
•
Suspension de mitochondries préparées à partir d'un foie homogénéisé dans
du KC1 isotonique. Homogénat de foie de 10 %.
+ Suspension de mitochondries préparées à partir d'un homogénat de foie au
KC1 isotonique. Homogénat de foie de 20 %.
Q Suspension de mitochondries prépaiées à partir d'un foie homogénéisé dans
de la mannite isotonique. Homogénat de foie de 20 %.
glycyl-glycyl-leucine ou du glutathion est plus lente qu'à partir de la
glycyl-l-leucine. L'addition du surnageant ou du surnageant dialyse (donc
contenant plus le précurseur), à la suspension de mitochondries,
ne
accélère de beaucoup la synthèse à partir du tripeptide (tableau 6). Mais
comme nous l'avons indiqué 50, il semble que les dipeptidases et tripeptidases
sont
de la cellule
par P.
différemment réparties entre les fractions protéiques solubles
et les mitochondries. Un phénomène analogue a été observé
et J. P. Greenstein 51. La question se pose
synthèse de l'acide hippurique à partir des peptides,
contenant de la glycine en position terminale, pourrait se faire en absence
de l'ATP, par le passage de la glycine d'un groupe acyl à un autre (réac¬
tion analogue à la transphosphorylation). Le tableau 7 montre que tel
n'est pas le cas. La synthèse à partir des peptides en absence d'ATP
est aussi faible qu'à partir de la glycine libre. On peut en conclure que
la glycine est libérée avant d'être incorporée à l'acide hippurique.
de
J. Fodor, V. E. Price
savoir
si
la
e) Analyse chromatographique
du
Kochsaft ».
du
dialysat,
du surnageant
et
«
Nous
tographie
26
essayé d'identifier la nature du précurseur par chromapapier filtre (Consden, Gordon et Martin52, Dent53),
avons
sur
TABLEAU
6
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; di- ou tripeptides 0.015 M. ;
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cyto¬
chrome C 0,0000145 M. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon
phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 60 min. à 38° C. Hc
mitochondries ; S
surnageant ; Sd
surnageant dialyse.
homogénat complet ; M
acide
=
=
=
=
,aM.
Additions
benzoïque
acide benzoïque
acide benzoïque
Hc + acide
Hc +
Hc
M
+
+
acide
M + acide
M + acide
M
+ acide
M + acide
1-leucyl-glycyl-glycine
+ glutathion
+ glycyl-1-leucine
+
benzoïque
benzoïque +
benzoïque +
benzoïque 4benzoïque +
.
....
.
1-Ieucyl-glycyl-glycine
glutathion
glycyl-1-leucine
alanyl-glycine
.
....
+
M +
S
+
S +
benzoïque
benzoïque
acide benzoïque
acide
M + Sd + acide
M
+
Sd + acide
benzoïque
benzoïque
hipp. Activité
-h
+
-•-
1-leucyl-glycyl-glycine
glycyl-1-leucine
.
1-leucyl-glycyl-glycine
TABLEAU
1,00
2,60
2,03
3,15
0,286
0,658
0,605
0,900
0,33
1,10
1,43
3,31
0,140
0,610
0,770
1,400
1,790
3.35
M + S + acide
M
ac.
formé
1,15
3,69
3,26
0,277
0,886
0,73
0,208
0,935
3,27
0,784
7
Acide benzoïque 0,001 M. ;
glycine ou
Suspension de mitochondries 0,5 ce.
dipeptides 0,015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate
de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C.
«M. ATP par
Exp.
Additions
I
glycyl-1-leucine
glycyl-1-leucine
glycyl-1-leucine
glycyl-1-leucine
0,5
1,0
glycyl-l-leucine
glycyl-1-leucine
alanyl-glycine
alanyl-glycine
glycine
1,0
II
essai
3,0
6,0
«M. acide hippurique
formé
0,10
0,20
0,30
2,15
6.0
0,30
1,50
0,40
3,20
6,0
3,35
6,0
1,0
27
12
de surnageant, d'un
ce.
14 heures à 0° C.
réduit
au
70
contre
vide à 3
ce.
1
ce.
ce.
°0,
dialyses pendant
dialysat est
cette solution est ajouté à 3 ce. d'HCl
ébullition pendant 10 heures. L'acide
homogénat
de 20
sont
d'eau distillée. Le volume du
de
% et le tout chauffé à
chlorhydrique est évacué au vide. Le résidu sec est dissout dans 3 ce.
d'eau et filtré. Le volume du filtrat, dont la couleur est jaune, est réduit
à environ 0,5 ce. Nous avons utilisé du papier filtre Whatman
au vide
No 1 et avons développé le chromatogramme pendant 18 heures à tem¬
pérature ordinaire en utilisant comme solvant une solution de phénol
saturée d'eau et une atmosphère contenant de l'ammoniaque.
Avec le filtrat susmentionné la ninhydrine fait apparaître deux
taches distinctes. Les niveaux de ces taches correspondent à l'acide
glutamique et à la glycine témoins sur la piste S (fig. 4).
de
20
•
là
-<
acide
-<
glycine
-4
alanine
FIGURE
glutamique
4
Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant d'un homogénat de foie de
cobaye centrifugé. Le dialysat est hydrolyse pendant 14 heures. Après évaporation de
l'HCl, le résidu est dissout dans 3 ce. d'eau bidistillée et filtrée. De ce filtrat on a
déposé en 2 deux, en 4 quatre gouttes. En S on a déposé une goutte d'une solution
standard de glycine, d'acide glutamique et d'alanine.
Développement à la ninhydrine.
—
13
au
ce.
trifugation.
28
% sont chauffés pendant 5 minutes
protéines coagulées sont séparées par cenest dialyse pendant 15 heures à 0° C. contre
d'un surnageant de 20
bain-marie à 100° C. Les
Le
«
Kochsaft
»
30
ce.
sont
d'eau distillée.
13
également dialyses
ce.
du même surnageant et du même homogénat
30 ce. d eau distillée pendant le même
contre
temps. Le volume des deux dialysats est réduit à sec par évaporation au
vide. Chaque résidu est redissout dans 3 ce. d'eau. De ces solutions 2 ce.
sont transférés dans deux ballons contenant 4 ce. d'HCl de 20 % que
l'on porte à ébullition durant 24 heures. Après distillation de l'HCl au
vide, chaque résidu est redissout dans 0,2 ce. d'eau bidistillée. Nous avons
Kochsaft
opéré de la même manière avec l'hydrolysat du dialysat du
(DK). Après développement à la ninhydrine nous observons des taches
correspondant à l'acide glutamique et à la glycine (fig. 5).
Nous pouvons en déduire que le précurseur du surnageant est iden¬
Kochsaft
et, comme nous l'avons déjà mentionné,
tique à celui du
thermostable. Même une hydrolyse prolongée de 10 à 24 heures ne fait
«
»
«
DK
2
»
DS
S
1
S
2
cvsteine
*•
lit
acide
glutamique
valine
FIGURE
5
Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant et du Kochsaft du même
chromatogramme de l'hjdrolysat du dialysat du
homogénat de foie de cobaye. Ds
En 1 on a déposé une et en 2 deux gouttes de l'hydrolysat.
liquide surnageant.
DK
chromatogramme de l'hydrolysat du dialysat du Kochsaft. En 1 on a déposé
En S des deux chromatogramme^. on a
2 deux gouttes de l'hydrolysat.
et
en
une
déposé une goutte d'une solution standard de valine. d'acide glutamique. de glycine
et de cystéine.
Développement à la ninhydrine
=
=
—
29
apparaître d'autres acides aminés que celui qui a une valeur Rf.
D'après le tableau de Dent 53 nous pouvons avoir à cet endroit
l'ornithine, la valine, la norvaline ou le tryptophane. Il est possible que
le précurseur se trouve être la glutathion, car cette substance est assez
répandue dans les différents organes des mammifères (Awapara 54). Dans
nos conditions d'expérience nous n'avons néanmoins jamais pu prouver
la présence de la cystéine sous forme de cystine.
pas
de 0,77.
Influence de la
f)
concentration de la
glycine.
D'après les travaux de Cohen et McGilvery2H il faut 15 fois plus
glycine que d'acide p-amino-benzoïque pour obtenir en 45 minutes une
synthèse totale. Nous avons montré qu'à partir de benzoate et du pré¬
curseur on pouvait obtenir une quantité considérable d'acide hippurique.
Il est peu probable que la glycine libérée ou formée à partir d'autres
corps se trouve dans une concentration dépassant de beaucoup celle de
l'acide benzoïque. En effet, dans nos conditions d'expérience, c'est-à-dire
de
avec
un
système enzymatique tel
45 minutes
d'incubation
que les
mitochondries,
/«mol.
avec
4
de
nous
obtenons
synthèse de
77 %. Avec 12 jumol. de glycine, donc une concentration trois fois supé¬
rieure à celle de l'acide benzoïque, nous obtenons une synthèse de 98 %
(tableau 8). Il est à noter qu'un tel rendement n'est possible qu'avec une
en
glycine
une
suspension de mitochondries suffisamment active contenant au moins
2 mgr. N par essai. En comparant nos expériences à celles de Cohen
28
et coll.
nous voyons que la conjugaison de la glycine avec l'acide ben¬
zoïque se fait plus rapidement qu'avec l'acide p-amino-benzoïque.
TABLEAU
8
de mitochondries 0,5 ce., 2,07 mgr. N par essai.
Acide benzoïque
acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate
Suspension
0,001 M.
;
de K de
pH 7,5. Volume final
4
ce.
Incubation 45 min. à 38° C.
fM.
Additions
ac.
4
4
4
4
30
fM.
fM..
fM.
fM.
ac.
ac.
ac.
ac.
benzoïque
benzoïque
benzoïque
benzoïque
+
4
+
8
+12
+ 20
fM.
fM.
ftM.
fiM.
glycine
glycine
glycine
glycine
hippurique
0,25
3,08
3,56
3,95
3,98
Rendement
%
76,9
89,5
98,6
99,5
de la
g) Synthèse
glycine
à
partir d'autres acides aminés.
Après ingestion de fortes doses d'acide benzoïque, la quantité de
glycine, éliminée sous forme d'acide hippurique, dépasse de beaucoup
les réserves de glycine (libre ou combinée) disponible dans l'organisme.
11 doit y avoir une synthèse de la glycine à partir d'autres substances.
Borsook et Dubnoff 25, étudiant la formation de l'acide hippurique dans
des coupes de tissus, ont trouvé que certains amino-acides, en présence
de l'acide benzoïque, augmentent la quantité d'acide hippurique formée.
Leuthardt 29 a prouvé, à l'aide de coupes de foie de cobaye, que la glutamine fournit presque autant d'acide hippurique que la glycine. Leuthardt
31
ont montré que, dans les mêmes conditions d'expérience,
et Glasson
la serine
également transformée en glycine. Ce résultat fut confirmé
qui, en utilisant de la serine marquée (d, 1-sérine N15-l-C14),
est
par Shemin
30
fournit la preuve définitive d'une scission de la chaîne carbonée de la
serine entre les positions fi et y. Nous basant sur ces données, nous avons
possibilité d'une synthèse de la glycine à partir d'autres acides
l'homogénat de foie et les mitochondries.
Avec un homogénat de foie de cobaye ou une suspension de mito¬
chondries, il ne nous a pas été possible d'obtenir une synthèse d'acide
hippurique à partir des acides aminés suivants : acide /?-oxyglutamique,
1-leucine, 1-valine, l'asparagine, la bétaïne, l'alanine et la d, 1-sérine. Par
cherché la
aminés dans
à partir de la thréonine ou de la sarcosine, nous obtenons une
quantité considérable d'acide hippurique. Ceci aussi bien avec un homo¬
génat qu'avec une suspension de mitochondries. L'activité de ces deux
contre
acides aminés
de la
ment
saires
glycine
est
presque aussi
grande
que celle de la
partir de la thréonine et de la
dans des suspensions de mitochondries
à
à
la transformation de
ces
localisés dans les mitochondries
deux
TABLEAU
se
La
synthèse
produit égale¬
pures. Les enzymes néces¬
corps
(tableau 9).
glycine.
sarcosine
en
Avec la
glycine se trouvent
glutamine ou l'acide
9
Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ;
MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce.
Incubation 45 min. à 38° C. Hc
mitochondries.
homogénat complet ; M
=
—
/uM.
Additions
benzoïque
benzoïque
acide benzoïque
acide benzoïque
Hc
+
acide
Hc
+
acide
Hc
+
Hc
+
M
+
acide
M
+
acide
M
+
acide
benzoïque
benzoïque
benzoïque
+
-1-
40 mM. thréonine
8
(«M.
thréonine
+ 40 «M. sarcosine
+ 40
+
ac.
hipp.
formé
8
f 40
^M.
/tM.
,«M.
thréonine
thréonine
sarcosine
Activité
0,90
1,50
1,35
1,20
0,31
0,52
0,41
0,42
0,40
2,20
1,74
2,21
0,22
1,22
0,84
1,23
31
glutamique nous obtenons dans l'homogénal une faible formation d'acide
hippurique. En présence d'une suspension de mitochondries les valeurs
il
sont semblables à celles obtenues à partir du précurseur naturel dont
était question plus haut (page 24). Les combinaisons des systèmes enzymatiques : mitochondries + surnageant, mitochondries + surnageant
dialyse ou mitochondries + Kochsaft, ne favorisent pas la formation de
la glycine à partir des deux acides aminés susmentionnés. La prolon¬
gation du temps d'incubation a pour seul effet d'augmenter la synthèse
de l'acide hippurique à partir du benzoate et du précurseur. Nous avons
également varié la concentration du tampon, sans obtenir d'effet. Il est
curieux que la d, 1-sérine soit inactive tandis que la d, 1-phényl-sérine
mito¬
nous donne une faible synthèse en présence d'une suspension de
également, la combinaison des différentes frac¬
prolongation du temps d'incubation n'a aucun effet
(tableau 10). Les résultats obtenus avec la glutamine, l'acide glutamique
chondries. Dans
tions
ce
cas
la
ou
TABLEAU 10
Mêmes
conditions
que
celles indiquées
sous
tableau 9.
«M.
,,,.,.
acide benzoïque
+
Hc + 40
Hc +
Hc
M
et
la
ac.
+
+
benzoïque -f-
ac.
benzoïque
phényl-sérine
ne
.
38°
C.
...
Activité
.
0,33
1,74
0,55
1,10
0,28
0,33
glutamique
1.54
0,46
0,90
0,96
0,45
0.27
phényl-sérine
40/iM. phényl-sérine
1,10
40
40
sont
.
à
1,22
0,20
+
-j-
min.
hipp.
.
acide
ac.
45
forme
glutamique
benzoïque -+- 40 ^M.
/M.
ac.
r
Additions
Hc
Incubation
^M. glutamine
....
ac.
i/M.
pas
réguliers
et
ne
—
0,29
0,24
0,59
peuvent pas
encore
être
capacité
(coupes)
glycine à partir de la d,l-sérine, de la glutamine et de
l'acide glutamique, tandis que ces transformations n'ont pas lieu dans
le tissu homogénéisé. Nous ne pouvons pas expliquer la raison pour
laquelle la scission de la chaîne carbonée ne peut se produire après la
interprétés.
Or
nous
de former de la
32
constatons que
le tissu intact
a
la
destruction du tissu. Il
est
possible
que les conditions de
soient pas optimales parce qu'un facteur
pendant la préparation de l'homogénat, ou
ne
nos
indispensable
que
expériences
été détruit
a
facteur
ce
se
trouve
être trop dilué.
h)
synthèse de l'acide hippurique
Inhibition de la
un
par
facteur hépatique.
Dans le
chapitre concernant la préparation des mitochondries, nous
qu'une substance inhibitrice colorée se trouve dans les
homogénats de foie de cobaye. En présence de cette substance, on obtient
des suspensions de mitochondries légèrement colorées qui ne sont que
avons
peu
mentionné
ou
pas
actives.
Ces observations
ont
nous
laissé
supposer
que
le
corps inhibiteur pouvait provenir de la bile. Nous avons, après neutra¬
lisation, dilué 10 fois la bile du même animal avec un tampon phosphate
de
pH 7,5.
nos
Nous
avons
ajouté de
essais. L'inhibition de la
cette
synthèse
solution
une
quantité
croissante à
de l'acide
hippurique est nette,
animal à l'autre (tableau 11).
mais n'est pas
toujours la même et varie d'un
synthèse dépend beaucoup de la manière dont les mito¬
chondries sont préparées (voir page 16). La quantité du facteur inhi¬
biteur, contenu dans le foie de cobaye, dépend de la nourriture de l'animal
(herbe ou foin plus betteraves). Cette constatation ainsi que la coloration
observée lors de la préparation des mitochondries, nous fait supposer
qu'il s'agit d'un pigment d'origine végétale. Dans des expériences ulté¬
rieures, il s'agira de chercher la nature chimique de cet inhibiteur.
L'activité de la
TABLEAU 11
Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ;
fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ;
cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un
de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C.
en
azote de la solution de bile ajoutée, exprimé en mgr.
acide
Additions
3
benzoate
+
benzoate
+
benzoate
+
benzoate
+
benzoate
+
benzoate
+
N bile
(«M.
acide
glycine 0,015
ATP
tampon
N bile
hippurique
glycine
glycine
glycine
0,007
3.28
0,028
0.70
glycine
glycine
glycine
0,010
0,020
0,030
3,60
3,12
0,0005
M. ;
M. ;
phosphate
=
teneur
formé
3,60
2.57
33
IV.
1.
Il y
Sommaire
synthèse d'acide hippurique à partir de benzoate et de glycine
hépatique homogénéisé du rat et du cobaye. La synthèse
lieu qu'en présence de l'ATP.
a
dans le tissu
n'a
système enzymatique nécessaire à la synthèse de l'acide hippu¬
rique se trouve localisé dans les granules cytoplasmiques (mitochon¬
2.
Le
3.
En
dries)
de la cellule
présence
concentrée
4.
la
7.
8.
glycine
L'analyse
mitochondries
suffisamment
une
obtenu
d'acide
après centrifugation des mitochon¬
un précurseur de
dialysable
et
sans
altération.
chromatographie sur papier a révélé
glycine. Cela nous laisse supposer
qu'un des précurseurs au moins est du glutathion.
La glycine peut en effet être remplacée par certains polypeptides.
Nous avons obtenu une synthèse d'acide hippurique à partir des
peptides suivants : 1-leucyl-glycyl-glycine, glycyl-glycyl-leucine, le
glutathion, la glycyl-1-leucine, et l'alanyl-glycine. En présence d'une
suspension de mitochondries le rendement en acide hippurique est
supérieur à partir des dipeptides. En ajoutant le liquide surnageant
dialyse à la suspension de mitochondries on augmente la synthèse
à partir des tripeptides. Ceci montre que dans la cellule la répar¬
tition des di- et tripeptidases est différente entre les fractions
protéiques solubles et les mitochondries.
La synthèse à partir des peptides n'a lieu qu'en présence de l'ATP.
Dans
nos
précurseur
glutamique
conditions
quelquefois une
plaçant dans la
tamine et la
34
de
synthèse stoechiométrique
benzoate et de glycine.
thermostable
du
d, 1-phényl-sérine
9.
suspension
obtenons
noyaux et des débris cellulaires contient
de l'acide
6.
nous
hippurique à partir de
Le liquide surnageant,
dries, des
5.
hépatique.
d'une
La bile de
par
et
de la
d'expériences
la
transformées
sarcosine, la thréonine
et
la
glycine. Nous obtenons
très faible formation d'acide hippurique en rem¬
synthèse la glycine par l'acide glutamique, la glusont
en
d,l-sérine.
cobaye contient
l'acide hippurique.
un
facteur inhibiteur de la
synthèse
de
DEUXIEME PARTIE
LA
PHOSPHORYLATION
/.
a)
Rôle
physiologique
Il est
connu
que
de la
BIOLOGIQUE
DE
LA
THIAMINE
Généralités
cocarboxylase.
les troubles de l'avitaminose
lement d'un trouble du catabolisme
Bi relèvent essentiel¬
glucidique qui
se
traduit par
une
accumulation d'acide
tissus
nerveux.
pyruvique dans les tissus et en particulier dans les
Ces phénomènes sont devenus plus clairs depuis qu'on a
la thiamine sous la forme de son dérivé phosphorylé, le
thiaminepyrophosphate ou cocarboxylase, est le coenzyme de la décar¬
boxylation de certains acides a-cétoniques, surtout de l'acide pyruvique.
Dans la levure, le produit de la décarboxylation de l'acide pyruvique est
l'aldéhyde acétique. Dans les tissus animaux, la décarboxylation est
couplée avec une oxydation. Mais il est peu probable que la cocarboxylase
fonctionne en même temps comme coferment de la déshydrogénation.
Nous discuterons ce problème plus tard. Un seul exemple de formation
d'un aldéhyde dans un extrait de tissu animal a été constaté (Green1).
La signification de cette constatation reste douteuse (Krebs2). Green
3
ont étudié la spécificité de la carboxylase purifiée de la levure.
et coll.
Ces auteurs ont trouvé que l'acide a-céto-isovalérique est décarboxylé
avec la même vitesse que l'acide pyruvique. Pour l'acide oxalylacétique
la vitesse est d'un tiers, les acides a-céto-isocaproïque et a-cétoglutarique
sont à peine attaqués. L'enzyme ne réagit pas avec les acides acétoacétique, phénylpyruvique et p-oxy-phénylpyruvique.
montré que
b) Phosphorylation
De
nombreuses
active de la vitamine
Ce dernier
a
de la thiamine.
expériences prouvent actuellement
Bi n'est
été isolé pour la
pas la
thiamine,
première
mais
son
que
la
forme
pyrophosphate.
fois par Lohmann
et
Schuster
4
35
à
partir de la
levure.
Puisque
la vitamine Bi
est
pleinement
active dans
l'animal vivant, il est clair que l'organisme dispose d'enzymes permettant
la phosphorylation de la thiamine en son ester pyrophosphorique. La
formation de
ce
En
a
été étudiée par
cocarboxylase
général,
(levure lavée avec
carboxylase privée de son
zymase
la
dernier
la
»
parations il apparaît
une
formée
a
plusieurs
auteurs.
été dosée à l'aide de ]'« aetio-
des solutions tampons alcalines) contenant
coferment. Mais en utilisant de telles pré¬
difficulté
en
ce
sens
que l'excès
cocarboxylase présente.
de thiamine
(découvert
Ochoa) est explicable par le fait que la thiamine inhibe l'hydrolyse
de la cocarboxylase par une phosphatase contenue dans l'« aetiozymase
(Westenbrink et coll. 5). Comme il n'a pas été tenu compte dans les
effet
premières recherches sur la synthèse de la cocarboxylase de cet
d'Ochoa », l'interprétation des résultats en est incertaine.
augmente l'activité de la
Cet effet
par
»
«
La
levure, les bactéries
et
le tissu animal contiennent des
systèmes
phosphoryler la thiamine. Euler et Vestin 6 ont observé que
le pouvoir de décarboxylation, vis-à-vis de l'acide pyruvique, d'une poudre
de levure de bière augmente lorsque cette dernière est incubée en pré¬
sence de thiamine, de phosphate minéral et de l'acide adénosinetriphosphorique (ATP). Goodhart et Sinclair7, Tauber9, Ochoa et Peter s9 ont
étudié le mécanisme de la phosphorylation dans les tissus d'animaux.
Ochoa 10 a trouvé que le foie contient un système phosphorylant actif.
Les interprétations données aux résultats obtenus ont soulevé un
certain nombre d'objections. Différents auteurs ont travaillé avec des
capables
de
concentrations
en
thiamine
assez
considérables.
Dans
ces
conditions,
l'augmentation de la décarboxylation que l'on observe en ajoutant à
Taetiozymase de levure la solution incubée, pourrait être due, comme
nous venons de voir, à l'activation de la cocarboxylase
préformée et non
à la synthèse de cocarboxylase (Lipton et Elvehjem J1), Westenbrink et
coll.5). Ochoa10 a démontré que les extraits exempts de cellules (foie,
muqueuse intestinale, cerveau) n'étaient pas actifs. Par contre les pulpes
d'organes ne réalisent la phosphorylation qu'au cours d'une respiration
active. Weil-Malherbe 12 réussit à extraire d'une poudre acétonique de
levure de bière, par précipitations fractionnées, une protéine active
capable de phosphoryler la thiamine. Cette opération s'effectue en dehors
de tout processus d'oxydation et l'ATP se trouve être le donateur du
pyrophosphate. Nguyen van Thoai et Chevillard is décrivent une mé¬
thode de purification des protéines phosphorylant la thiamine.
Ces
auteurs ont extrait d'un homogénat de foie de chien,
par précipitations
fractionnées
sulfate d'ammonium, une fraction semble-t-il très active
la thiamine. Malheureusement, les conditions
manquent de clarté. Nous reviendrons sur
leurs résultats dans la discussion de ce travail.
au
capable de phosphoryler
d'expérience et de dosage
et
36
c)
cocarboxylase.
de la
dosage
Méthodes de
et enzymatiques, c'est la dernière que nous
dosage simple qui nous permette de déceler
de petites quantités de cocarboxylase. Le dosage se fait indirectement
et se base sur la décarboxylation de l'acide pyruvique en présence de
l'apoferment de la décarboxylase de la levure. La quantité de CO2 dégagé
chimiques
Des méthodes
avons
est
choisie afin d'avoir
mesuré
sieurs
manométriquement.
utilisé, comme apoferment, de l'a levure
(Auhagenu, Westenbrink et coll.0). Par plu¬
lavages d'une poudre de levure de bière, avec des tampons phos¬
La
lavée
un
plupart
en
phates
des
auteurs ont
milieu alcalin
alcalins
ces
l'« effet d'Ochoa
»,
auteurs
éliminent
Westenbrink
paration enzymatique un grand
cocarboxylase préformée montre
la
activée par la thiamine
le
coferment.
Pour
supprimer
3
proposent d'ajouter à la pré¬
excès de thiamine. Dans ces conditions,
et
contenue
coll.
son
activité
maxima
dans les solutions dont
et
on
n'est
veut
plus
doser
12
en se basant sur les données
cocarboxylase. Weil-Malherbe
de Axmacher et Bergstermann 13 a préparé à partir d'une poudre de
levure une fraction protéinique contenant la carboxylase. Pour enlever
le coferment il s'est servi de la même méthode que Warburg et Christian 16
ont utilisée pour scinder la d-aminoacidodésaminase (addition de HC1
dilué en présence de sulfate d'ammonium). Cette préparation était surtout
destinée à étudier le mécanisme de la phosphorylation de la thiamine.
Green et coll. 1? ont extrait de la levure de bière par précipitation au
sulfate d'ammonium une décarboxylase très active. Cette dernière est
la
teneur en
ensuite traitée à deux
reprises
avec
une
solution de sulfate d'ammonium
l'apoferment (« split
enzyme»). Kubowitz et Lûttgens 18 ont également préparé une carbo¬
xylase très active sans donner, cependant, des détails concernant la
préparation.
Pour nos dosages de la cocarboxylase nous avons essentiellement
utilisé la préparation protéinique décrite par Weil-Malherbe 12. Mais
alcaline. De
comme
nous
cette
le
manière,
verrons,
ces
auteurs
obtiennent
les excès d'ATP
et
de thiamine
contenus
dans
essais peuvent fausser nos résultats quelle que soit la méthode de
dosage. La préparation protéinique de Weil-Malherbe contient encore un
nos
enzyme pouvant phosphoryler la thiamine en présence d'ATP. Il nous
fallait donc tout d'abord fixer les conditions permettant de doser la
cocarboxylase formée en présence d'ATP et de thiamine.
37
//.
a)
Matériel
et
Animaux
Ils
ont reçu
:
Partie
conditions
Nous
pendant
avons
expérimentale
d'expérience.
utilisé des
environ 10
jours
rats
une
albinos adultes de 150-200 gr.
nourriture
optimale
contenant
de la viande.
Substrats
:
thiamine, la cocarboxylase, l'acide glutamique ainsi
La
que le pyruvate de Na sont des
selon
des
produits Hoffmann-La Roche.
méthodes
mentionnées
dans
L'ATP
est
la
préparé par
première
partie de ce travail. L'acide adénosine monophosphorique est un produit
de Bischoff, U. S. A. L'acide adénosine diphosphorique a été obtenu à
partir de l'ATP et de myosine. La levure de bière a été mise obligeamment
à notre disposition par la brasserie Hûrlimann à Zurich.
Conditions d'expérience :
La phase gazeuse est de l'air. Après
20 minutes d'incubation à 38° C. la réaction est arrêtée par déprotéinisation à chaud pendant une minute au bain-marie. Après centrifugation
une partie aliquote est prélevée
pour le dosage de la cocarboxylase.
nous
b) Dosage enzymatique
La
et
coll.
notre
préparation
de
de la
cocarboxylase.
l'apoferment
selon la méthode de Westenbrink
5
n'a pas donné des résultats satisfaisants avec la levure mise à
disposition. Il n'a pas été possible d'obtenir une actiozymase
privée de cocarboxylase à partir de chaque préparation
quantité de cocarboxylase présente dans nos pré¬
parations, après le lavage alcalin, s'élevait souvent à 1/4 de la quantité
à doser. La préparation de l'apoferment selon les modalités de Weilsuffisamment
de levure séchée. La
Malherbe
12
donna la méthode la plus sensible. Mais la fraction
nous
protéinique qu'on obtient est capable de phosphoryler la thiamine en
présence d'ATP. Du fait que nos solutions à doser contiennent encore
de l'ATP et de la thiamine, il peut se produire en présence de l'enzyme
de la levure une synthèse de cocarboxylase qui fausse les résultats. En
évitant dans les essais un excès de thiamine il est cependant possible
d'utiliser l'enzyme de Weil-Malherbe sans introduire une erreur notable.
Mais par fractionnement au sulfate d'ammonium, nous avons réussi à
éliminer complètement l'enzyme phosphorylant. Cette préparation ne
forme aucune cocarboxylase même en présence d'un excès considérable
de thiamine
38
et
d'ATP.
1.
Préparation
de la solution
enzymatique.
La levure de bière fraîchement
pressée est lavée pendant 72 heures
pressée à nouveau et séchée en fines couches à tem¬
pérature ordinaire. Une poudre sèche, gardée à 0° C, reste active pen¬
dant plusieurs mois. La préparation de la poudre acétonique de la levure
à l'eau courante,
se
un
fait selon les indications de Weil-Malherbe 12. Gardée au vide dans
dessicateur la poudre reste active pendant plusieurs semaines.
1 gr. de la poudre acétonique est pétri dans un mortier en
ce. d'eau. On refroidit à 0° C. et on ajoute 1 ce. d'acide
présence
acétique
2 N. Le précipité est séparé par centrifugation. A la solution, 15 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 saturation finale) sont ajoutés et le précipité
obtenu éloigné par centrifugation. A nouveau 15 ce. de (NH4) 2SO4 sat.
(1/2 sat. finale) sont ajoutés. Après centrifugation le précipité est dissout
dans 10 ce. de tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. On ajoute 50 ce.
d'eau et 30 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 sat. finale). Après avoir refroidi
la solution à —5° C, 30 ce. de HC1 N/10 (contenant assez de (NH4) 2SO4
pour donner une concentration finale de 1/3 saturation) sont ajoutés
rapidement en agitant la solution. Il se forme un précipité. Ce dernier
est récolté par centrifugation à —5° C. et lavé avec 20 ce. de
(NH4) 2SO4
3/4 sat. (A ce stade la fraction enzymatique peut être gardée comme
suspension dans une solution de (NH4) 2S04 3/4 sat. pendant plusieurs
heures sans perte d'activité.) Le précipité est dissout dans 45 ce. de
tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. Des protéines dénaturées sont
éliminées par centrifugation. Toutes les opérations ainsi que les centrifugations s'effectuent à 0° C. La solution enzymatique est préparée
avant chaque dosage à partir de la poudre acétonique.
de 30
2.
Dosage manométrique.
Les fioles contiennent 1 ce. d'enzyme de levure, 1 ce. de tampon
phosphate (1/20 M.) de pH 6,2, 0,1 ce. d'une solution de Mn++ et
Mg++ N, et une partie aliquote de la solution de cocarboxylase inconnue.
Le volume final
est
de 3
ce.
Pour établir
remplace la solution inconnue
xylase (en général 0,05 y, 0,10
par
y,
des
est
versé de
CO2 dégagée
l'appendice
est
courbe de
référence,
connues
de
on
cocarbo¬
0,20 y). L'appendice contient 0,5
d'une solution de pyruvate 1/5 N. La
température du thermostat est de 27° C.
le pyruvate
quantité de
une
quantités
ce.
phase gazeuse est de l'air. La
Après 20 minutes d'équilibration
dans la fiole. Dès
mesurée
toutes
les
ce moment, la
10 minutes pendant
1 heure. Dans
ces conditions la quantité de CO2 libéré est proportionnelle
quantité de cocarboxylase présente. Nous comparons les valeurs
de CO2 obtenues après 30 minutes. Comme nous l'avons dit plus haut,
notre préparation protéique contient une quantité variable d'un enzyme
catalysant la synthèse de la cocarboxylase en présence de la thiamine
à
la
39
(thiamine + ATP) de la figure 1 montre une
cocarboxylase. La thiamine ainsi que l'ATP seuls
donnent des valeurs identiques au blanc.
Dans nos expériences, la phosphorylation de la thiamine, en pré¬
sence d'ATP et de l'enzyme hépatique, est incomplète. De ce fait il nous
reste après la période d'incubation un excès de thiamine et d'ATP.
Dans ces conditions la quantité de cocarboxylase peut augmenter au
cours de son dosage manométrique. En général l'erreur est négligeable;
mais nous avons toujours ajouté à chaque série de dosage un essai
qui sert à fixer la limite supérieure de l'erreur. Nous ajoutons à la
solution enzymatique les quantités maxima de thiamine et d'ATP
et
de l'ATP. La courbe
telle
de la
synthèse
pouvant être introduites
La
figure
2
montre
avec
la solution inconnue.
courbe de référence. En
une
général
la quan¬
CO2 libérée, après 30 minutes, est une fonction linéaire de la
quantité de cocarboxylase, jusqu'à une concentration d'environ 0,2 y
de cocarboxylase. La solution enzymatique préparée selon la méthode
tité de
que
nous
venons
La
préformée.
ne
de
représente
de décrire
de
valeur
en
ne
contient que des
CO2 dégagé
moyenne que les 3
%
en
traces
présence
de
de
cocarboxylase
l'enzyme seul
de la valeur obtenue pour 0,2 y
cocarboxylase.
Purification
3.
La
solution
Malherbe
12
Vapoferment
de
obtenue
enzymatique
contient,
de
entre autres
la
décarboxylase.
selon
protéines,
une
les
modalités
de
Weil-
transphosphorylase
très
0,2 y Cocurb
0,1
y
Cocarb
0 05 y Cocarb
0,2 y Thiamine
+
10
20
30
40
FIGURE
40
50
1
0,3fiMATP
60 Minutes
0.2
0.1
FIGURE
2
y
Cocarb
active. Dans le paragraphe précédent nous avons décrit une méthode de
préparation d'une solution enzymatique ne contenant qu'une faible
quantité de transphosphorylase. Nous avons néanmoins constaté que
pour pouvoir étudier la synthèse de la eocarboxylase à partir de plus
grandes concentrations (5 à 10 y) de thiamine et (5 à 10 ,uM.) d'ATP,
il était nécessaire, pour des raisons que nous avons indiquées dans le
chapitre susmentionné, d'éliminer complètement cette transphospho¬
rylase. Nous avons encore apporté les modifications suivantes à la mé¬
thode de préparation de l'apoferment.
Le précipité obtenu par acidification à —5° C. en un milieu de
(NH4) 2SO4 de 1/3 de saturation finale est récolté par centrifugation et
lavé avec 20 ce. de (NH4) 2SO4 3/4 sat. On le centrifuge. Au culot on
ajoute, tout en le triturant, 10 ce. d'une solution de NH4OH N/100. Le
résidu protéique ne se dissout que partiellement et le pH de la suspension
se trouve être de 7,0. A cette suspension on ajoute 30 ce. d'un tampon
phosphate 1/20 M. de pH 6,2. Une petite quantité de protéines déna¬
turées sont écartées par centrifugation. Au surnageant on ajoute 30 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Après centrifugation, le
culot est redissout dans 20 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2
et reprécipité à 43 % de saturation finale en (NH() 2SO4.
On centrifuge.
Le culot est redissout dans 15 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2
et la solution est employée comme telle. Cette dernière contient 65 à
80 y de tyrosine par ce.
Le tableau 1 montre quelques caractéristiques de notre solution
enzymatique. Il en ressort que la décarboxylase est très active et que
TABLEAU
1
récipients de Warburg contiennent 1,0 ce. de solution enzymatique de la
(environ 0,5 mgr. de protéines) ; 1,0 ce. d'une solution de tampon phosphate
1/20 M. de pH 6,2 ; 0,1 ce. d'une solution contenant 1 mgr./cm3 de Mg 1 + et de Mn + ;
dans l'appendice 0,5 ce. d'une solution de
une partie aliquote de la solution à doser ;
Les
levure
de Na 1/5 M. Le volume est complété à 3 ce. avec HoO bidistillée.
quantités de substance indiquées dans le tableau se trouvent dans les récipients.
pyruvate
Additions
mm3
CO-2
en
30
Les
min.
1.5
0,05 y eocarboxylase
0,10 y eocarboxylase
97,7
.
158.5
.
10 y thiamine i- 2 mgr. ATP
0,5 y thiamine + 0,05 mgr. ATP
.
4.4
3,2
6.4
1.0
2
mgr.
0,05
ATP
mgr.
ATP
....
....
1.0
2.1
41
la
transphosphorylase
a
été
complètement
éliminée. Même
en
présence
de 10 y de thiamine et de 2 mgr. d'ATP nous n'obtenons pas, ou tout
au plus dans les limites d'erreur de la méthode, de formation de cocar-
plus élevée de 6,4 mm3 de CO2 après 30 et même
représente qu'environ 0,01 y de cocarboxylase. Il est à
remarquer que, contrairement aux résultats de Weil-Malherbe 12, nous
n'obtenons avec l'ATP aucun effet de cocarboxylase, ceci même avec
boxylase.
La valeur la
60 minutes,
ne
les concentrations de 2 mgr. d'ATP utilisées par cet auteur. Nous n'avons
effet qu'en employant un produit obtenu des Schwarz
cet
observé
Laboratories Inc., New-York, préparé à partir de la levure, et non pas
à partir du muscle de lapin comme le nôtre ainsi que celui utilisé par
Weil-Malherbe. Une telle préparation contient encore des traces de
cocarboxylase (environ 8/100
de y par
juM. d'ATP).
L'effet de l'ATP
observé par Weil-Malherbe est probablement un effet secondaire dont
il est difficile de donner une explication. Il nous semble peu probable
qu'il y ait formation, entre l'ATP
de faible activité.
décarboxylase
et
l'enzyme actif, d'une
«
pseudo-
»
4.
Dosage
des
Le
dosage
de l'azote
mitochondries
protéines.
protéique des homogénats, des suspensions de
des surnageants
Pour les fractions contenant
et
été fait selon la méthode de
a
du
(NH4) 2SO4
Kjeldahl.
utilisé
méthode de Folin-Ciocalteu19, basée sur la réaction de coloration
donnée par la tyrosine et le tryptophane. Les extinctions sont lues au
encore
nous avons
la
spectrophotomètre de Beckman. L'activité
boxylase est exprimée par le rapport :
y
de la
synthèse
de la
cocar¬
cocarboxylase formée
par essai.
mgr.
Pour calculer la
N
N
protéique, nous nous sommes basés
indiquant que 0,126 mgr. de
tyro¬
sine
correspondent à 1 mgr. de protéines. Cette valeur est en réalité
trop élevée pour notre enzyme hépatique. La coloration que nous avons
obtenue avec l'enzyme hépatique, équivaut à 7 8,5 % de tyrosine.
N'ayant pu obtenir une teneur constante dans nos préparations, nous
avons adopté le
rapport indiqué par Weil-Malherbe comme base fictive
permettant d'établir des points de comparaison d'une fraction à l'autre.
sur
teneur
en
les données de Weil-Malherbe
12
«
»
-
42
Résultats
///.
a)
Conditions de la
synthèse
et
discussion
dans le tissu
hépatique.
homogénat de foie de rat de 10 % préparé dans
isotonique au moyen de l'appareil de Potter et
Elvehjem 20. Une telle préparation contient un enzyme capable de syn¬
thétiser de la cocarboxylase à partir de la thiamine en présence de l'ATP,
de ions Mg++ et d'un substrat oxydable tel que l'acide glutamique
Nous utilisons
une
un
solution de KCl
(tableau 2). Le substrat oxydable est nécessaire pour maintenir la
resynthèse oxydative de l'ATP, car les extraits bruts contiennent des
enzymes qui hydrolysent l'ATP (l'« apyrase »). Nous utilisons le nom
d'« apyrase
pour désigner un enzyme hydrolisant les liaisons phospha¬
tées labiles de l'ATP. Le nom
adénosinetriphosphatase ou ATP-ase
devrait être réservé à la myosine, seul enzyme connu qui n'enlève qu'un
seul reste phosphoryl de l'ATP. Le tissu homogénéisé contient une
certaine quantité, variant d'un animal à l'autre, de cocarboxylase pré¬
formée. L'activité de l'homogénat, après soustraction de la valeur à
»
«
blanc,
est
de
»
Le milieu d'incubation contient
M. ;
acide
K 0,0066 M.
:
glutamique
de
pH 7,4.
solution de KCl. Volume final 3
ce.
0,5
ce.
2
d'homogénat
Homogénat +
Homogénat +
Homogénat +
ac.
ac.
ac.
ATP 0,001
M. ;
tampon
avec
une
Incubation 20 min. à 38° C.
y cocarboxylase
formée par essai
glutamique + ATP
glutamique + thiamine
glutamique + thiamine +
Localisation de la
de foie ;
M. ;
thiamine 2 y par essai ;
L'isotonicité du milieu est obtenue
0>0066
Additions
b)
»
0,43.
TABLEAU
Mg++ 0,0033
phosphate de
«
.
.
ATP
0,82
0,98
0,80
1,80
Activité
0,349
0,765
synthèse.
centrifugation nous avons séparé les homogénats de foie en
une
:
suspension de granules cytoplasmiques (mitochondries) et le liquide surnageant. La préparation de ces fractions est
décrite dans un travail précédent 21. L'étude de la phosphorylation de
Par
deux fractions
43
la
thiamine
dans
l'une
ou
l'autre
des
fractions
susmentionnées
nous
qu'il faut la somme des systèmes enzymatiques pour obtenir une
synthèse (tableau 3, exp. III). Pour purifier la phosphorylase, nous avons
centrifugé un homogénat de 10 % pendant 30 minutes à 18.000 t. p. m.
(25.000 X g). Toutes les opérations s'effectuent à 0° C. Au liquide
surnageant, qui est tout à fait limpide, nous ajoutons un volume égal
d'acétone. Le précipité est lavé avec de l'acétone et séché au vide. Une
poudre acétonique gardée au froid dans un dessicateur ne perd pas de
son activité pendant deux semaines.
200 mgr. de poudre sèche sont triturés au moyen de l'appareil de
Potter et Elvehjem dans 5 ce. de KC1 isotonique. On centrifuge afin
d'écarter les particules insolubles. Dans un tel extrait, la formation de
la cocarboxylase à partir de la thiamine et de l'ATP a lieu (tableau 3,
exp. V), même en l'absence de mitochondries et du substrat oxydable.
L'extrait contient encore une quantité considérable de cocarboxylase
préformée, exprimée dans le tableau par l'essai « extrait seul ». En
montre
soustrayant
mine
»
nous
cette
valeur de celle obtenue pour l'essai « extrait + thia¬
une activité de 1,18.
obtenons pour l'extrait
Ces expériences montrent que le liquide surnageant, résultant de
centrifugation de l'homogénat complet, nécessite la présence du
système phosphorylant des mitochondries. Ces dernières, par contre, ne
la
TABLEAU
3
Le milieu d'incubation contient :
suspension enzymatique ; ATP 0,001 M. ;
Mg++ 0,0033 M. ; acide glutamique 0,0066 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. L'isotonicité du milieu est obtenue avec une
solution de KO.
Volume final 3
ce.
Incubation 20 min. à 38° C.
y
Additions
Exp.
I
0,49
Mitochondries + thiamine
0.59
II
0,25
Surnageant
III
-r
Mitochondries
thiamine
....
+ surnageant
.
Mitochondries + surnageant + thiamine
IV
44
cocarboxylase
formée par essai
Extrait + mitochondries
0.55
0,89
1,71
Extrait + mitochondries + thiamine
1,00
2,75
Extrait
0,81
2,16
+
thiamine
....
.....
pas directement à la phosphorylation de la
22
il a été prouvé que les granules
série de travaux
participent
thiamine.
Par
cytoplasmiques
sont le siège du cycle des acides tricarboxyliques et de la phosphorylation
oxydative de l'acide adénylique ou de l'acide adénosinediphosphorique.
Dans l'essai
surnageant + thiamine », l'apyrase est très active et la
faible activité obtenue est probablement due à la présence de mitochondries restées en suspension qui suffisent à maintenir une faible
resynthèse de l'ATP. Le fractionnement à l'acétone élimine la plus grande
partie de l'apyrase présente, sans, pour autant, diminuer la teneur en
cocarboxylase préformée. C'est seulement après la séparation de la
transphosphorylase de l'apyrase que la synthèse devient indépendante
du système phosphorylant des mitochondries et du substrat oxydable.
Ces constatations montrent que l'enzyme qui produit la phosphorylation
de la thiamine est une protéine soluble, contenue dans le liquide sur¬
nageant et que l'ATP est nécessaire comme donateur de phosphore.
une
«
c)
Elimination de la
Pour
sommes
cocarboxylase préformée.
séparer la cocarboxylase de
basés
sur
les constatations de
la poudre acétonique, nous nous
16
concernant
Warburg et Christian
séparation du groupe prosthétique de la d-aminoacidodésaminase de
apoferment. En présence de sulfate d'ammonium ayant une action
protectrice, le groupe prosthétique peut être séparé du ferment par
l'acide chlorhydrique dilué.
400 mgr. de poudre acétonique sont suspendus dans 10 ce. de tampon
phosphate 1/25 M. de pH 7,5. On centrifuge après 2 heures d'extraction.
la
son
l'extrait, dont le volume
A
mesure
environ
9,7
ce.,
on
ajoute
10
ce.
de
tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2, 37,5 ce. d'eau froide et 28,5 ce.
de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale en (NH4) 2SO4
1/3). Le mélange
=
ajoute en remuant 28,5 ce. d'une solution
d'HCl 1/10 N 1/3 saturé en (NH4) 2S04. Après centrifugation (—5° C.)
la fraction précipitée est lavée avec 20 ce. d'une solution de (NH4) 2SO4
3/4 sat. Le résidu est dissout dans 7 ce. de tampon phosphate 1/25 M.
de pH 7,5. On élimine par centrifugation les protéines dénaturées, et la
solution est employée comme telle. Nous appelons cette fraction
pré¬
cipité HC1 ».
La phosphorylation de la thiamin»; avec cette fraction enzymatique
est très active. La valeur à blanc est nulle, ce qui signifie que la cocar¬
boxylase préformée a été éliminée (tableau 3, exp. I). Nous avons vu
dans un chapitre précédent que le fractionnement du liquide surnageant
par l'acétone avait pour effet d'éliminer la plus grande partie de l'apyrase.
Cette dernière a été totalement écartée par la seconde précipitation en
milieu acide. De ce fait, l'acide glutamique comme substrat oxydable
servant à la resynthèse de l'ATP peut être supprimé. Nous observons
même une faible inhibition de la synthèse en présence de l'acide gluest
refroidi à —5° C. Puis
on
«
45
tamique (tableau 4,
menté.
perd
%
que 5
de
II). La stabilité de l'enzyme a également aug¬
enzymatique gardée à 0° C. pendant 5 jours ne
activité initiale (tableau 4, exp. III).
exp.
Une solution
son
TABLEAU
milieu
Le
MgT
7.4.
d'incubation
contient
:
4
enzymatique
suspension
;
ATP
0,001
M. ;
thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH
Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Ppté. HC1
fraction enzymatique
+
0,0033 M.
;
=
(préparation
:
voir
chapitre
élimination de
la
cocarboxylase préformée
}'
Additions
Exp.
I
«
cocarboxylase
formée par essai
Ppté. HC1 seul
0,00
1,60
II
Ppté. HC1 + thiamine + 5 [A.M.
Ppté. HC1 + thiamine + 10 /M.
Ppté. HC1 + thiamine -t 40 /<M.
»,
ac.
ac.
ac.
2,16
2,14
1,93
1,86
glutamique
glutamique
glutamique
III
Ppté. HC1 frais + thiamine
Ppté. HC1 après 5 jours + thiamine
0,00
2,34
2,22
.
page
45).
Activité
4,74
5,58
5,53
4.96
4,80
6,00
5,70
IOuMATP
Influence de la concentration
en
ATP
Le milieu contient :
solution enzymatique (ppté. HC1) ;
Mg++ 0,0033 M. ;
thiamine 3 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final
de 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Af>
d) Influence
de lATP
et
des ions
Mg++.
L'activité de la synthèse de la
concentration
en
fonction des ions
ATP
(figure 3).
Mg++ (figure 4).
cocarboxylase est fonction de la
phosphorylation est également
La concentration optimale se trouve
La
0.6
3 0,4
*-0,2
10
20
FIGURE
Influence
30^MMg"
4
de la concentration des ions
Mg+ +
Le milieu d'incubation contient: solution enzymatique (ppté. HC1). ATP 0,001 M.;
thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final
3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
7.5 pH
FIGURE
5
Effet du pH
Le milieu d'incubation
ATP
contient
:
solution
0,001 M. ; Mg++ 0,0033 M. ; thiamine
K 0,0066 M. de pH différents. Volume final 3
2
enzymatique (ppté. HC1 neutralisé) ;
y par essai ; tampon phosphate de
ce.
Incubation 20 min. à 38° C.
47
15
entre
et
20
//M.
de
Mg
encore
peu clair. Le
une action légèrement
transphosphorylation est
indispensable pour toutes les réac¬
30
par essai.
inhibitrice. Le rôle des ions
Mg++
semble être
Mg
/uM.
ont
lors de la
tions nécessitant de l'ATP.
e) Effet
La
pH
du
figure
du milieu
et
du temps d'incubation.
de
à
verre
synthèse
5 montre l'activité de la
milieu d'incubation. Ce dernier
avant et
a
été mesuré
c'est-à-dire
d'expérience,
thiamine, la formation de la cocarboxylase
20 minutes d'incubation.
Ce temps
phosphoryler quantitativement
de la cystéine (60 juM. par essai)
dans le milieu d'incubation n'a
aucun
du
est
optimale
présence de 2 y de
général achevée après
en
du NaCN
ou
(160 /<M.
ou
par
essai)
inhibiteur
sur
l'enzyme.
milieu
contient
solution
:
5
enzymatique
(ppté.
M. ;
Temps d'incubation
en
en
ATP
0,001
M.
;
y
90
1,32
2,20
2,33
3,30
120
5,43
40
60
de la concentration de
;
Cocarboxylase formée
minutes
20
f) Variation
HC1)
phosphate de K de pH 7,4
5 7 de thiamine par essai ; tampon
Volume final 3 ce. Incubation à 38° C.
Mg++ 0,0033
0,0066 M.
en
effet stimulateur
TABLEAU
Le
est
pH
l'électrode
augmente considérablement si l'on
5 y de thiamine (tableau 5). La pré¬
sence
l'activité de
fonction du
moyen de
après l'incubation. L'activité de la synthèse
un pH de 6,8 à 6,9.
Dans nos conditions
veut
en
au
l'enzyme.
phosphorylation de la thiamine en fonction
l'enzyme. La quantité de cocarboxylase formée
augmente jusqu'à ce que la quantité de thiamine présente devienne le
facteur limitant de la réaction. Dans l'expérience représentée par la
courbe supérieure, la phosphorylation complète de la thiamine est
atteinte avec une concentration de 0,210 mgr. N. (dosage selon Folin)
La
figure
6
montre
la
de la concentration de
par essai. La courbe inférieure est obtenue
un
48
peu moins active.
avec une
solution enzymatique
0,2
0.1
0,3
FIGURE
mgN
0.4
6
Concentrations variables de la solution
enzymatique
Le milieu d'incubation contient : quantités variables de la solution enzymatique
(ppté. HCl). ATP 0,001 M. ; MgH + 0,0033 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
La courbe supérieure correspond à une solution enzymatique plus pure (0.21 mgr. N/cc.)
que la courbe inférieure (0,42 mgr. N/cc).
g)
Mécanisme de la
La
synthèse.
phosphorylation enzymatique
la
de
thiamine
F ATP peut s'effectuer de deux manières différentes
1.
Par l'addition successive de deux
par
substance
une
restes
intermédiaire,
le
en
présence
de
:
phosphoryl, en passant
monophosphate de la
thiamine.
ATP + thiamine
ATP + thiamine
en
résumé
>
cocarboxylase
Par addition d'un groupe
ATP + thiamine
(ADP
phate).
=
i
monophosphate + ADP
cocarboxylase + ADP
:
2 ATP + thiamine
2.
thiamine
monophosphate
adénosine
>
+ 2 ADP.
pyrophosphate.
cocarboxylase
diphosphate
;
AMP
+ AMP
=
adénosine
monophos¬
49
L'ADP qui
fonctionner
reste phosphoryl labile, ne peut pas
phosphate. Il a au contraire une action
(tableau 6, exp. II). Il s'agit très probablement
possède
comme
fortement inhibitrice
dune
substitution
encore
un
donateur de
dans
complexe enzymatique
le
(« compétitive inhibition »),
la
car
structure
de
de l'ADP
l'ADP
est très
à
l'ATP
semblable
à celle de l'ATP. Cette inhibition est fonction de la quantité d'ADP
présente. En remplaçant l'ATP par l'ADP, nous n'obtenons qu'une très
faible formation de cocarboxylase et ceci même avec 10 juM. d'ADP qui
contiennent autant de P labile que 5
fiM. d'ATP (tableau 6, exp. III).
également un effet inhibiteur sur
la phosphorylation de la thiamine (tableau 6, exp. IV). L'action inhibi¬
trice de l'AMP est cependant plus faible que celle de l'ADP. Cette cons¬
tatation est en plein accord avec notre hypothèse selon laquelle il s'agirait
d'un remplacement de l'adénosine de l'ATP dans le complexe enzyma¬
tique par les substances inhibitrices. La structure de l'ADP est plus
proche de la structure de l'ATP que celle de l'AMP. Il faut donc s'at¬
tendre à ce que l'ADP possède pour l'enzyme une affinité plus forte
L'AMP
P labile
contenant aucun
ne
a
que l'AMP.
TABLEAU
Le
y de
final 3
5
milieu
contient
solution
:
6
(ppté. HC1)
enzymatique
celles contenues dans le volume final de 3
I
ce.
MgT
+
0,0033
Incubation 20 min. à 38° C.
y
Additions
Exp.
«M. ATP
5
II
5
fiM.
^M.
fiM.
5
5
III
1,50
1,02
ATP
+ 2,5
+
5
ATP
+
10
/M.
/M.
fiM.
ADP
.
ADP
.
ADP
.
2,5 fiM. ADP
5
10
IV
ATP
4
4
4
6
6
^M.
/uM.
fiM.
fiM.
,«M.
cocarboxylase
formée
2,5 /uM. ATP
50
;
M. ;
thiamine par essai, tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume
Les quantités d'ATP, d'ADP et d'AMP indiquées dans le tableau sont
ce.
0,59
0,37
0,27
ADP
0,16
0,16
ADP
0.16
ATP
ATP
+
ATP +
0,5
2
/M.
fiM.
AMP
.
AMP
.
(M.
AMP
ATP
/M.
/M. ATP
+
2
.
2,00
1,83
1,52
2,20
1,72
monophosphate de la thiamine était un produit intermédiaire
cocarboxylase, celui-ci devrait pouvoir remplacer
Si le
dans la formation de la
la thiamine. Le tableau 7
montre
si
que
substituons la thiamine-
nous
monophosphate * à la thiamine, on ne trouve qu'une faible synthèse de
cocarboxylase. Il est donc peu probable que la thiamine-monophosphate
soit l'étape intermédiaire dans la formation de la cocarboxylase. On
devrait s'attendre, dans ce cas, à ce que le monophosphate soit transformé
en cocarboxylase avec la même vitesse que la thiamine. La faible synthèse
que nous avons constatée, peut être due à une hydrolyse partielle de
la thiamine-monophosphate en donnant de la thiamine. Weil-Malherbe u,
dans ses expériences avec l'enzyme de levure, avait trouvé une période
d'induction plus longue, c'est-à-dire une vitesse de synthèse plus faible,
la thiamine-monophosphate à la thiamine. D'autre part,
en substituant
la formation de la cocarboxylase est légèrement inhibée par l'addition
de la thiamine-monophosphate.
TABLEAU
conditions
Mêmes
que
celles
indiquées
7
pour
tableau
le
6.
TMP
=
thiamine-
monophosphate.
Additions
5
5 y
Au
<uM. ATP
TMP + 5 fM. ATP +
thiamine + 5 /M. ATP
cours
de l'ADP
cocarboxylase formée
0,20
0,56
1,52
TMP
y
5 y TMP + 5
5 y
}'
et
de la
selon
....
synthèse,
la
seconde
5 y thiamine
.
il
se
de
.
2.33
.
forme selon la première hypothèse
l'AMP.
Comme
nous
travaillons
en
présence d'un très grand excès d'ATP par rapport à la thiamine, la
quantité d'ADP ou d'AMP formée, par transphosphorylation, est du même
ordre de grandeur que celle formée par hydrolyse spontanée de l'ATP
de l'expérience. Pour cette raison, il n'est pas possible de
cours
au
recherche des produits de
prouver l'une ou l'autre des hypothèses par
dégradation de l'ATP. D'après nos constatations, nous tirons la conclu¬
sion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue par le transport
d'une molécule de pyrophosphate.
*
La
substance
a
été
mise
obligeamment
à
notre
disposition
par
le
professeur
M. Viscontini.
51
CH3
I
CH
C
C
=
-
OH
CH2-CH2 OH
C
H3C-C
-
!
OH
I
OH
I
HO-P-O-P-O-P-O-adénosine
CH2 N
-
II
C
C-NH2
N
O
s
-
O
O
H
I
OH
CH3
C
CH
I
I
Il
II
O
0 + 0
P-O-adénosine
=
I
OH
OH
X
C
C-NH->
N
=
II
Il
I
C-CHo-N
H3C-C
I
CCH0-CH2-O-P-O-P
=
OH
OH
!
S
-
H
Nous
étudié la
avons
phosphorylation
synthétisée
été récemment
dihydrothiamine.
de la
h) Phosphorylation
par Karrer
et
de la
dihydrothiamine, qui
Krishna
23 *
a
:
CH3
C
CH
N
=
C
CH2 OH
CH2
I
H3C
C
C
'I
l
-
N
-
C
-
N
CH2
-
C
NH2
H2
En
prenant
acétonique,
de la
exp.
nous
comme
obtenons
système enzymatique l'extrait de la poudre
une faible synthèse de cocarboxylase à partir
présence d'ATP et de ions Mg++ (tableau 8,
dihydrothiamine en
I). Elle représente environ
le 40
%
même concentration de thiamine. Avec
que
et
«
60
le précipité HCl », nous
%, comparée à celle de
pour la
(tableau 8,
*
P.
52
La
Karrer.
est
exp.
substance
fonction
de
synthèse
obtenue
avec
la
solution enzymatique telle
synthèse variant entre 40
(tableau 8, exp. II). Comme
la cocarboxylase à partir de la dihy¬
concentration de l'enzyme présent
obtenons
une
la thiamine
thiamine, la formation de
drothiamine
de la
une
la
III).
a
été
obligeamment
mise
à
notre
disposition
par
le
professeur
TABLEAU
8
solution enzymatique ; ATP 0,001 M. ; Mg ^ 0,0033 M. ;
2 y de dihydrothiamine ou de thiamine par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M.
de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Le milieu contient
:
y
Additions
Exp.
cocarboxylase
formée
I
Extrait
+
dihydrothiamine
Extrait
+
thiamine
.....
Ppté. HC1 + dihydrothiamine
Ppté. HC1 + dihydrothiamine
Ppté. HC1 + thiamine
II
0,89
1,30
1,88
0,45
.
sans
ATP
0,00
0,95
....
III
0,5
1,0
1,5
1,0
L'étude
aérobies,
de
la
ce.
ce.
ce.
ce.
ppté. HC1 + dihydrothiamine
ppté. HC1 + dihydrothiamine
ppté. HC1 + dihydrothiamine
0,50
0,60
0,78
ppté. HC1 + thiamine
1,14
phosphorylation
.
dans
des
conditions
anaérobies
et
cystéine, montre que la quantité de cocarboxylase
formée est plus forte en présence d'oxygène et en l'absence de cystéine.
Il semble qu'une certaine quantité de dihydrothiamine est toujours oxydée
milieu aqueux (tableau 9). La quantité d'oxygène nécessaire pour
en
avec
et sans
TABLEAU
Le
milieu
Mg'+ 0,0033
phosphate de
contient
:
solution
9
enzymatique
(ppté.
M. ; 2 y de dihydrothiamine par essai ;
K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce.
ATP 0,001
M. ;
HC1) ;
cystéine 0,0032 M. ; tampon
Incubation 20 min. à 38° C.
de Warburg. La dihydrothiamine ainsi que
la cystéine sont placées dans l'appendice. Pour les essais en milieu anaérobie on place
dans le tube central de la fiole du phosphore et l'air est chassé par un courant d'azote.
Les
Le
essais
contenu
anaérobies
sont
de
sont
effectués
dans
l'appendice
est
des
fioles
ajouté
milieu
au
d'incubation
y
Additions
Anaérobie
Aérobie
lorsque les conditions
atteintes.
Dihydrothiamine
Dihydrothiamine
Dihydrothiamine
Dihydrothiamine
cocarboxylase
formée
sans
avec
sans
avec
cystéine
cystéine
0,39
0,40
cystéine
cystéine
0,62
0,42
0,98
53
l'oxydation de cette petite quantité
(pour 1 7 il faut 4.10-8 ce. d'C^). Il
des
pour
éviter
toute
l'enzyme hépatique.
de
d'obtenir
solution
une
continué à fractionner la
précipitations
à
rigoureuses
de la substance.
i) Purification
Afin
est
suffisamment
conditions anaérobies
oxydation
dihydrothiamine est très faible
évidemment impossible d'avoir
de
enzymatique plus pure, nous avons
protéique
précipité HCl
par des
solution de (NH4) 9SO4 saturée
une
solution
successives
avec
«
»
0° C.
A 17 ce. de la solution
on
précipité HCl
ajoute 12,8 ce. de
(NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Ce précipité est inactif et
nous l'éloignons par centrifugation. Au surnageant nous ajoutons 26,9 ce.
de (NH4) 2SO4 sat., ce qui porte la saturation finale à 70 %. Le précipité
est récolté par centrifugation et dissout dans 10 ce. de tampon phosphate
0,004 M. de pH 7,1. Cette solution enzymatique est active et nous l'ap¬
pelons
précipité 43-70 % I ». A 7,5 ce. de cette solution protéique,
nous ajoutons 10 ce. de
(NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 57 %). Le
précipité est éloigné par centrifugation. Au surnageant on ajoute de
nouveau 10 ce. de (NH4) 2SO4 sat.
(saturation finale 73 %). Après cen¬
trifugation le précipité est dissout dans 3 ce. de tampon phosphate
0,004 M. de pH 7,1. Nous appelons cette fraction
précipité 57-73 % II
«
»
«
«
Le tableau 10
tiques. L'activité
montre
moyenne
l'activité
de
».
des différentes
synthèse
du
«
précipité
solutions
57-73
%
enzyma-
II
»
est
de 18 à 23 7 de cocarboxylase par mgr. N. protéique. Cette fraction
enzymatique est la plus pure que nous ayons obtenue jusqu'à maintenant.
Nous
avons
comparée
enrichissement de l'activité
un
à celle de
enzymatique
de 50 à 60 fois
l'homogénat complet.
TABLEAU 10
Le
milieu
d'incubation
contient
solution
:
thiamine 5 y par essai ; tampon
Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C.
Mg++ 0,0033 M.
;
y
Additions
Ppté.
Ppté.
....
Ppté. 43 70 % I seul
Ppté. 43-70 % I + thiamine
-
....
Ppté. 57 73 % II seul
Ppté. 57 73 % II 4 thiamine
-
-
54
cocarboxylase
formée par essai
HCl seul
HCl + thiamine
ATP 0,00166 M. ;
enzymatique ;
phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,1.
.
....
Activité
0,00
2,22
7,8
0,00
2,26
16
0,00
2,86
24
IV.
1.
Sommaire
décrit une méthode permettant de préparer, à partir
poudre sèche de levure de bière, une solution enzymatique
qui contient Fapoferment de la décarboxylase de l'acide pyruvique.
Au moyen de cette solution enzymatique, il est possible, dans des
conditions appropriées, de doser d'une manière indirecte des quan¬
tités variant de 1/100 à 1/5 de y de cocarboxylase.
Nous
avons
d'une
2.
Cette solution
enzymatique est très active et relativement instable.
présence d'un excès de cocarboxylase nous obtenons environ
700 ce. de CO2 par minute par mgr. N. protéique. Cette préparation
enzymatique ne contient plus de transphosphorylase. De ce fait, il
est possible de doser de faibles quantités de cocarboxylase en pré¬
En
3.
sence
de thiamine
Nous
avons
d'ATP.
étudié la
synthèse de la cocarboxylase à partir de la
présence d'ATP, dans l'homogénat de foie de rat.
L'enzyme hépatique provoquant la transphosphorylation est une
protéine soluble, assez stable.
thiamine,
4.
et
Nous
en
développons
une
enzymatique hépatique
lase préformée. C'est
que
5.
La
et
nous
avons
méthode permettant d'obtenir
en
étudié la
active,
ne
contenant
phosphorylation de la thiamine nécessite
Mg++. La phosphorylation de 2 y
de ions
après 20 minutes d'incubation à 38° C,
enzymatique contenant au moins 0,240
optimum se trouve entre 6,8 et 6,9.
6.
L'étude
du mécanisme
discutée. L'ADP
La
ne
une
solution
cocarboxy¬
présence de cette solution enzymatique
synthèse biologique de la cocarboxylase.
très
de la
la
plus
de
présence de l'ATP
de thiamine
est
totale
présence d'une solution
mgr. N. protéique. Le pH
en
phosphorylation
de la
thiamine
est
fonctionne pas comme donateur de phosphate.
par l'ATP, du corps intermédiaire hypothétique,
phosphorylation
thiamine monophosphate, est très faible. L'AMP a un effet
inhibiteur beaucoup plus faible que l'ADP. De nos expériences, nous
tirons la conclusion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue
par le transport d'une molécule de pyrophosphate de l'ATP sur la
la
thiamine.
55
7.
Nous
avons
thiamine
d'ATP
et
boxylase
étudié la
synthétique
de ions Mg~t"
variant
phosphorylation enzymatique de
en
milieu aérobie
+.
Nous
entre
40
et
avons
60
%,
et
obtenu
par
anaérobie
une
la
en
dihydroprésence
synthèse de cocarla synthèse à
rapport à
partir de la thiamine.
8.
L'enzyme hépatique a encore été purifié par fractionnement de la
solution protéique avec une solution de (NH4) 2SO4 sat. La fraction
la plus pure a une activité de synthèse de 24 y de cocarboxylase
par mgr. N. protéique. Nous avons ainsi augmenté de 50 à 60 fois
l'activité enzymatique par rapport à celle de l'homogénat complet.
Physiologisch-chemisches
Institut der
Zurich, Januar 1951.
56
Universitàt,
CURRICULUM VITAE
danoise, je suis né le 6 octobre 1918 à Sœrabaja, en
onze années. En 1930, je suis entré à l'Ecole Privât
Indonésie,
j'ai
à Genève. Faute de bases solides, j'ai dû quitter cette école en 1931 pour
l'Institut G. Rauch à Genève, où je me suis préparé pour les examens
De nationalité
vécu
où
d'entrée
au
Technicum de Genève. J'ai réussi
ces
examens
en
automne
quitter
obligé
majeures
j'ai dû les suivre. Je suis entré alors provisoirement au
Loughborough Collège en Angleterre.
Au printemps 1937, j'ai quitté l'Angleterre pour la Suisse et suis
1934. En
la
1936, des
Suisse,
raisons
ont
mes
parents à
et
entré à l'Ecole Lémania à Lausanne, pour y préparer la maturité fédérale
type C. J'ai passé ces examens en 1940, session de Fribourg. Les semestres
de l'Ecole Polytechnique Fédérale ne commençant qu'en automne, je me
suis fait immatriculer pour le semestre d'été à l'Université de Lausanne,
à la Faculté des Sciences.
En
1940, je
automne
me
suis fait immatriculer à l'E. P. F. à la section
printemps 1945, j'ai obtenu le diplôme d'ingénieur-chimiste
de chimie. Au
de l'E. P. F.
Au
début de
remplacement
l'année
1946, j'ai fait, pendant quelques mois,
professeur
comme
de
scientifiques,
branches
dans
un
un
internat 4e Villars-sur-Ollon.
En
1946, j'ai été engagé
automne
comme
assistant
non
officiel
et
scientifique par M. le Professeur Leuthardt, Directeur de
l'Institut de Chimie physiologique de la Faculté de Médecine de l'Uni¬
collaborateur
versité de Genève. En automne
1947, M. le Professeur Leuthardt ayant
été nommé directeur de l'Institut de Chimie
de
cet
Zurich, je l'y
institut
porté
sur
physiologique
de l'Université
suivi, et, jusqu'au printemps 1951, j'ai travaillé dans
qualité
en
surtout
ai
la
de
collaborateur
recherche
du
scientifique. Mes
métabolisme
de
travaux
l'azote
et
sur
ont
les
vitamines.
De 1948
à cette
thèse,
au
printemps 1951, j'ai eu le privilège de pouvoir travailler
j'ai présentée au printemps 1951 à la section de chimie
que
de l'E. P. F.
A
partir
de
cette
date, j'occupe
un
poste
d'ingénieur dans l'industrie.
57
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PARTIE
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19O. Folin et F. Ciocalteu, J. Biol. Chem. 73, 627 (1927).
20
V.R. Potter et C.A. Elvehjem, J. Biol. Chem. 114, 495 (1936).
11
M. X
12
M.
^
ti
22
A.F. Millier
23
P. Korrer
iViBiscii'
et
S
F. Leuthardt, Helv. Chim. Acta 32, 2349 (1949).
H. Krishna, Helv. Chim. Acta 33, 555 (1950).
vide Diss
et
59
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TABLE DES MATIERES
PREMIERE PARTIE
Synthèse biologique
de l'acide
hippurique
9
Introduction
I.
Généralités
11
a) Les fonctions chimiques des mitochondries du foie
11
b) Rôle de la formation de l'acide
c) Synthèse
de
l'acide
d) Formation de
II.
Partie
la
13
hippurique
14
15
glycine
expérimentale
16
a) Matériel
16
b) Préparation des suspensions enzymatiques
16
c) Incubation
18
.............
d) Extraction de l'acide hippurique
e) Dosage
III.
hippurique
Résultats
de
et
la
.........
.19
discussion
a) Conditions de synthèse. Dépendance de l'ATP
19
b) Localisation de la synthèse
21
c) Effet des fractions dialysées
23
.
e) Analyse chromatographique du dialysat, du surnageant
f)
Influence de la concentration de la
g)
Synthèse de la
glycine
à
partir
Sommaire
et
du «Kochsaft»
26
30
glycine
d'autres acides aminés
h) Inhibition de la synthèse de l'acide hippurique
IV.
18
19
glycine
par
un
....
facteur
hépatique
31
33
34
61
DEUXIEME PARTIE
La
I.
phosphorylation biologique de la thiamine
Généralités
35
a) Rôle physiologique de cocarboxylase
35
b) Phosphorylation de la thiamine
35
c) Méthodes de dosage de la cocarboxylase
37
II. Partie
expérimentale
a) Matériel
et
38
conditions
d'expérience
38
b) Dosage enzymatique de la cocarboxylase
1.
2.
3.
4.
Préparation de la solution enzymatique
Dosage manométrique
Purification de Papoferment de la décarboxylase
Dosage des protéines
III. Résultats
et
discussion
39
....
40
42
43
b) Localisation de la synthèse
43
c) Elimination de la
45
cocarboxylase préformée
d) Influence de l'ATP
et
e) Effet du pH du milieu
des ions Mg++
et
du temps d'incubation
47
48
j) Variation de la concentration de l'enzyme
48
g)
49
Mécanisme
de
la
synthèse
h) Phosphorylation de la
dihydrothiamine
52
i) Purification de l'enzyme hépatique
54
Sommaire
55
Curriculum
vitae
Bibliographie
62
39
43
a) Conditions de la synthèse dans le tissu hépatique
IV.
38
57
58