Master 2 Biotechnologies des Plantes Tropicales module Développement Végétatif Épigénétique: Intégration des signaux environnementaux & réponses aux contraintes Estelle Jaligot CIRAD, UMR DIADE, équipe Biologie du Développement des Palmiers 20 septembre 2011 Génotype Génotype ADN ARN ARN Réseau épigénétique Protéine Phénotype Proteine Phénotype Environnement Environnement ADN Génotype Génotype ADN ARN ARN Réseau épigénétique Protéine Phénotype Protéine Phénotype Environnement Environnement ADN 1. Ce qu’on entend par « méchanismes épigénétiques » (la plupart du temps et jusqu’à preuve du contraire) • • La méthylation de l’ADN La condensation de la chromatine Ce qui fait débat: • Les petits ARNs non codants • Les modifications des ARN messagers: coiffe, épissage alternatif, polyadénylation… 1. Définitions: la méthylation de l’ADN m m m CATGTCGTTCAGAACG m GTACAGCAAGTCTTGC CATGTCGTTCAGAACG AGTCTTGC CATGTC GTACAGCAAGTCTTGC m m m ADN-méthyltransférases m m SAM SAH m m m CATGTCGTTCAGAACG GTACAGCAAGTCTTGC m m • La méthylation varie en quantité et en répartition, pour une séquence (codante ou pas), au cours du développement et d’un tissu à l’autre. • Selon son emplacement dans une séquence, une mC n’a pas la même influence. m 1. Définitions: la chromatine Nucléosome = 2x (H2a+H2b+H3+H4) Hétérochromatine Euchromatine © CSIRO Plant Industry, Canberra, Australie. K9Me K9Me2 K9Me3 K27Me3 H3 H4 H3 H4 K9Ac K4Me2 K4Me3 K36Me2 Hétérochromatine H3 H4 H3 H4 Ac (différentes K) Euchromatine © CSIRO Plant Industry, Canberra, Australie. • AA modifiés: K, S, R (méthylation, phosphorylation, ubiquitinylation, acétylation, SUMOylation…) • Plusieurs marques peuvent coexister sur la même protéine (différents AA), elles ont un effet cumulatif sur l’activation ou la répression des gènes. Miguel et Marum, 2011 L’emboîtement de plusieurs niveaux d’information qui dialoguent entre eux: • Niveau site • Niveau séquence • Niveau région • Niveau domaine chromatinien Notion de paysage épigénétique Zhang et al 2008 1. Ce qu’on entend par « méchanismes épigénétiques » (la plupart du temps et jusqu’à preuve du contraire) • • La méthylation de l’ADN La condensation de la chromatine Ce qui fait débat: • Les petits ARNs non codants • Les modifications des ARN messagers: coiffe, épissage alternatif, polyadénylation… 2. Les grandes familles de phénomènes épigénétiques • La défense du génome • La régulation de l’expression des gènes • L’intégration de signaux environnementaux => Étude de cas: la vernalisation La vernalisation Sung et Amasino, 2004b Vernalisation • Définition : déclenchement (ou accélération) de la floraison d’une plante après son exposition à une période prolongée de températures froides et en jours longs. • Intérêt : la plante ne fleurit que lorsque les conditions climatiques sont devenues favorables (à la pollinisation, au développement des graines) : au printemps. Orge (annuelle) Betterave (bisannuelle) Campanule Thlaspi arvense (annuelle) Burn et al., 1993 Dosage global de la méthylation génomique par HPLC échantillon m m Nucléase P1 Phosphatase alcaline G G T A mC C GA A T mC T T C G G A mC G T A T AG C mC G mC A A T T CATGTCGTTCAGAACG GTACAGCAAGTCTTGC m m m dC désoxynucléosides %m dC = [m dC] / ([dC] + [m dC]) dG mdC dT dA • Avantage: ne nécessite aucune information de séquence • Inconvénient: concluant uniquement à l’échelle du génome Arabidopsis thaliana (annuelle) Finnegan et al., 1998 Arabidopsis thaliana (annuelle) Finnegan et al., 1998 Finnegan et al., 1998 Sheldon et al., 1999 Sheldon et al., 1999 Sheldon et al., 1999 Michaels et Amasino, 2000 or 5-azacytidine or 5-azacytidine Finnegan et al., 2000 Sheldon et al., 2002 Sheldon et al., 2002 Méthylation de l’ADN: utilisation de McrBC Digestion McrBC Rabinowicz et al., 2003 Finnegan et al., 2005 La conversion des cytosines par le bisulfite de sodium • • • Repose sur la conversion différentielle des cytosines en fonction de leur statut de méthylation: C devient U, mC reste C Conséquence: la méthylation devient « lisible » par la Taq-polymérase lors de la PCR, possibilité de dessiner des amorces spécifiques du profil de méthylation Atout majeur: profilage de la méthylation base à base, différencie les deux brins Exploitation des données du bisulfite sequencing • • Risque non négligeable de faux positifs: il est indispensable de confirmer les résultats par une méthode indépendante Extrême variabilité des profils de méthylation en fonction du stade de développement, de l’état physiologique et du tissu (voire de la cellule): nécessité de réaliser des statistiques (répétitions biologiques + répétitions techniques) Bagus Andika et al 2006 Gendall et al., 2001 Les protéines Polycomb (PcG) Agissent sous forme de complexe comme le PRC2. Les gènes codant pour E(Z) et Su(Z)12 forment des familles multigéniques => plusieurs complexes possibles Drosophila melanogaster PRC2-type P55 ESC SU(Z)12 E(Z) Vernalisation Développement gamétophyte et albumen Transitions phase reproductrice FIS 2 MS1 FIE MEA/ CLF MS1 FIE Arabidopsis thaliana MS1 VRN 2 VIN3 FIE CLF/ SWN EMF 2 CLF/ SWN Stage M1 BFP Sophie Adler, 2010 Conformation de la chromatine: la ChIP (Chromatin Immuno Precipitation) lyse Tissus fixés au formaldéhyde G sonication précipitation avec complexes billes / Ac • Avantage: identification fine des modifications de la chromatine • Inconvénient: très dépendant de la qualité des Ac, nombreuses précipitations parallèles à réaliser G G G PCR: amplification gène-cible G purification ADN Massie et Mills, 2008 élution Bastow et al., 2004 Bastow et al., 2004 Sung et Amasino, 2004a Sung et Amasino, 2004b Sheldon et al. (2008): dilution passive des marques de la chromatine suite à extinction VRN2? L’expression de FLC dans les phases tardives de l’embryogenèse est nécessaire pour retarder la floraison de la plante adulte. Henderson et Jacobsen, 2007 Tamada et al., 2009 Levure Arabidopsis Seo et al., 2009 Bond et al. (2009): VIN3 est aussi impliqué dans la réponse au stress hypoxique => la voie de régulation de la floraison est à la croisée de plusieurs voies de régulation liées aux conditions environnementales. Floraison chez les céréales: Pas d’équivalent de FLC et pas toujours de rôle du froid => mécanismes probablement très différents Oliver et al. (2009): chez l’orge des marques de chromatine activatrices (+H3K4me3, -H3K27me3) au niveau de VRN1 sont liées à l’induction de la floraison par la vernalisation. Greenup et al., 2009 Swiezewski et al., 2007 Homology-Dependent Gene Silencing (HDGS) Matzke et Matzke, 2004 ARN antisens COOLAIR Swiezewski et al., 2009 MS1 VRN 2 VIN3 FIE PRC2 (Vernalisation) CLF Heo et Sung (2011): L’ARN non codant long COLDAIR est produit à partir d’un site localisé dans le 1er intron de FLC et interagit physiquement avec la protéine CLF, responsable de la triméthylation de H3K27 dans le PRC2. Arabidopsis hallieri (pérenne) Aikawa et al., 2010 Delker et Quint, 2011 Rapp et Wendel, 2005