Tri par billes magnétiques Technique et exemple du tri des

Journée thématique de l’Association française de cytométrie
Microbilles et cytométrie : de l’analyse cellulaire à l’analyse moléculaire
Institut Curie, Paris, 17 janvier 2003
Tri par billes magnétiques
Technique et exemple du tri des lymphocytes T
régulateurs CD25
+
chez le rat
F. Ghiringhelli
E. Schmitt
U 517 Inserm, Faculté de médecine,
7, boulevard Jeanne d’Arc, 21000 Dijon.
[email protected]
Résumé. La séparation par billes magnétiques est une nouvelle technologie
utilisant les phénomènes paramagnétiques. Cette technique permet la purifica-
tion de types cellulaires, d’organites intracellulaires mais aussi de composants
biologiques tels que les protéines ou les acides nucléiques. De nombreuses
techniques de séparation par billes magnétiques se sont récemment dévelop-
pées. Le but de cette revue est de montrer les différentes techniques employées
avec leurs avantages et leurs inconvénients. Nous allons décrire les techniques
de sélections positives et négatives de cellules. Nous allons montrer que le tri
par billes magnétiques permet aussi d’effectuer des tris multiparamétriques ou
des tris fonctionnels. Ensuite, nous décrirons les technologies nouvelles per-
mettant de trier les cellules transfectées et les macromolécules tels les protéi-
nes, l’ARN et l’ADN.
Mots clés : bille magnétique, séparation immunomagnétique, tri cellulaire
Summary. Magnetic separation is a recent technology using magnetism pro-
perties. This technology is aimed to purify cells, cell organelles and biologi-
cally active compounds such as nucleic acids and proteins. Many magnetic
separation procedures have been developed to isolate cells and molecules. The
purpose of this review is to give an other view of various methods and strate-
gies which can be employed for selection of targets cells and molecules. We
describe techniques used to positive and negative cells selections, we show that
magnetic selection is also aimed to perform multiparameter selection or func-
tional selection. Then, we underline emerging technology used to select trans-
fected cells and macromolecules such as proteins, DNA and RNA.
Key words: magnetic microsphere, immunomagnetic separation, cellular
separation
Depuis longtemps, les phénomènes magnétiques ont été
utilisés pour isoler les substances magnétiques. L’applica-
tion de ces techniques en biologie pour séparer des cellu-
les ou des molécules non magnétiques s’est développée
dans les 20 dernières années grâce à l’apparition de nou-
velles particules magnétiques.
La séparation cellulaire par billes magnétiques a de nom-
breux avantages par rapport aux autres techniques de sépa-
ration. En effet, cette technique permet d’isoler des cellu-
les provenant directement d’échantillons non traités
comme le sang ou la moelle osseuse. Comparée aux autres
techniques de séparation cellulaire, cette technique est sim-
Tirés à part : F. Ghiringhelli
dossier abc
Ann Biol Clin 2004, 62 : 73-8
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ple et rapide. De plus, contrairement au tri par cytométrie
en flux, il n’y a pas d’interférence avec les mouvements
d’ions et la sélection d’une population de cellules viables
en grande quantité est effectuée très rapidement.
Récemment, l’automatisation des techniques de tri cellu-
laire par billes magnétiques a permis la standardisation et
l’obtention en routine d’une méthode de tri de cellules
viables.
Le tri cellulaire phénotypique
Généralement on décrit deux types de séparation magnéti-
que.
La première consiste à séparer des cellules contenant as-
sez de substances magnétiques pour être retenues par
l’aimant. Cela n’est possible que pour deux types cellulai-
res : les érythrocytes, dont l’hémoglobine contient une
forte concentration d’une substance paramagnétique et les
bactéries magnétotactiques contenant de petites particules
magnétiques [1].
La deuxième consiste à marquer avec une particule magné-
tique un ligand, la plupart du temps un anticorps, recon-
naissant une structure cellulaire de surface.
Technique de séparation monoparamétrique
Le principe du tri par billes magnétiques repose sur un
marquage de la sous-population à isoler (ou à éliminer)
par un anticorps spécifique couplé à une bille magnétique.
Après marquage avec cet anticorps spécifique, les cellules
sont introduites dans une colonne qui traverse le champ
magnétique créé par un aimant. Les cellules, qui sont en-
tourées de billes métalliques, sont retenues sur la colonne
par cet aimant, alors que les cellules non marquées sont
éluées et récupérées dans un premier tube à essai. Les
cellules marquées par les billes sont ensuite récupérées par
gravité après avoir retiré l’aimant dans le deuxième tube
(figure 1). Il est ainsi possible d’effectuer une sélection
positive en marquant les cellules d’intérêt, celles-ci étant
alors retenues dans la colonne. L’autre alternative consiste
à effectuer une sélection négative lorsqu’il y a un risque de
modification de la fonction cellulaire par l’anticorps ou
qu’il n’existe pas de marqueur de ce type cellulaire. On
utilise alors une technique de déplétion en marquant toutes
les cellules non désirées, celles-ci étant alors retenues dans
la colonne.
Un exemple d’utilisation courante du tri cellulaire dans le
domaine médical est l’utilisation pour les greffes de moelle
osseuse ou de précurseurs hématopoïétiques du sang péri-
phérique. Les techniques de sélection sont utilisées pour
les autogreffes de sauvetage chez les patients atteints de
cancer et bénéficiant d’une chimiothérapie intensive. La
sélection négative sert alors à éliminer les cellules tumora-
les du greffon. Les techniques de sélection positive sont
utilisées pour les allo- et les autogreffes et servent à la
sélection des progéniteurs hématopoïétiques exprimant la
molécules de surface CD34 [2].
Les techniques de sélections négatives ont trois objectifs :
– éliminer toutes les cellules cibles non désirées de la
suspension cellulaire de départ ;
– récupérer toutes les cellules non marquées dans un état
viable ;
– éliminer toutes les microbilles de la suspension cellu-
laire.
Ces trois objectifs nécessitent d’utiliser un excès de micro-
billes et d’anticorps reconnaissant les cellules à éliminer
puis l’exposition à un champ magnétique intense pour
s’assurer qu’aucune cellule non désirée ou bille reste dans
la suspension cellulaire.
Les techniques de sélections positives ont trois objectifs :
– récupérer toutes les cellules marquées,
– éliminer toutes les cellules non désirées,
– éliminer les microbilles des cellules sélectionnées.
L’élimination des billes peut être obtenue par méthode
physique ou enzymatique. Les billes colloïdales sont spon-
tanément biodégradables.
Il existe deux types de tri cellulaire monoparamétrique.
La première méthode de tri cellulaire par méthode immu-
nomagnétique a été décrite au début des années 1980 par
John Ugelstad and John Kemshead [3]. Ils utilisent des
particules de polystyrène poreux de1à4µmetcontenant
de l’oxyde de fer. Le polymère de surface protège les
cellules de la possible toxicité du fer. Ces particules sont
des éléments superparamagnétiques, c’est-à-dire qu’elles
ne présentent des propriétés magnétiques que lorsqu’elles
sont soumises à un champ magnétique. Pour permettre un
tri cellulaire efficace, ces billes doivent remplir des critè-
res importants [4] :
– elles doivent rester stables et ne pas s’agréger dans le
milieu de sélection ;
– elles ne doivent pas rester magnétiques après avoir été
soumises au champ magnétique ;
– elles ne doivent pas se lier de manière non spécifique
aux cellules ;
– elles doivent permettre une rapide et quasi totale sépara-
tion des cellules ayant fixé les billes ;
– elles doivent être d’une taille qui limite au maximum la
phagocytose.
Ces billes magnétisables sont bloquées par le champ ma-
gnétique et se dispersent librement sans agrégation quand
le champ magnétique est retiré. Cette interaction entre la
bille et la cellule peut alors être responsable d’une dépres-
sion de la membrane plasmique et ainsi de la formation de
pseudopodes.
Le second procédé de tri cellulaire par microbilles magné-
tiques a été développé à l’université de Cologne par Milte-
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nyi [5] et est devenu la technique la plus utilisée. Cette
technique est basée sur l’utilisation de billes colloïdales
constituées de petites particules paramagnétiques (100 nm)
et d’un puissant champ magnétique. Cette technique per-
met l’isolation de 10
8
cellules en 15 minutes. L’enrichis-
sement est de plus de 100 fois et on obtient une déplétion
d’un facteur 1 000.
Ces billes sont un million de fois plus petites que les
cellules eucaryotes et sont à peine visibles en microscopie
électronique. Leur faible taille limite le stress cellulaire.
Ces billes restent en suspension dans le milieu de culture
et leur composition (oxyde de fer et polysaccharide) les
rend rapidement biodégradables. La plupart du temps, les
billes ne modifient pas la fonction ni la viabilité cellulaire,
il n’y a donc pas besoin de les détacher des cellules récu-
pérées par sélection positive.
Ce système permet d’obtenir une pureté cellulaire de plus
de 95 % et de récupérer plus de 90 % des cellules expri-
mant l’antigène.
Les deux types de techniques utilisant soit des billes de
grande taille soit des billes de petite taille ont été utilisées
avec succès mais les microbilles semblent être d’un intérêt
supérieur pour la sélection positive car elles ne déforment
pas la surface des cellules et il n’est pas nécessaire de les
enlever de la surface des cellules triées pour pouvoir les
utiliser. Les macrobilles nécessitent d’être agitées en per-
manence lors de l’incubation avec les cellules pour éviter
leur sédimentation ; au contraire les microbilles diffusent
en suivant les mouvements browniens des fluides et se
distribuent dans la suspension cellulaire sans agitation.
Les macrobilles ont l’avantage de ne pas nécessiter un
champ magnétique intense et donc le matériel de sépara-
tion reste d’un faible coût contrairement au matériel de
séparation pour les microbilles.
Le tri par billes magnétiques permet de purifier une sous-
population cellulaire avec une bonne efficacité, et d’obte-
nir plusieurs centaines de millions de cellules en une di-
zaine de minutes, ce qui est donc beaucoup plus rapide
qu’un tri par cytométrie en flux. En revanche, un unique
critère de tri peut être pris en compte avec cette technique
standard et seuls les marquages de surface sont utilisables.
Technique de séparation multiparamétrique
Par la technique standard de tri par billes magnétiques, il
n’est possible de sélectionner des cellules que par un cri-
tère phénotypique. La technique de séparation mutipara-
métrique [6] permet de pallier ce problème et de sélection-
ner positivement des cellules en fonction de deux critères
phénotypiques. Cette technique est utile lorsqu’une partie
des cellules que l’on veut éliminer expriment l’antigène
utilisé pour la sélection positive. Cette technique est aussi
utile lorsque l’on cherche à sélectionner une population de
cellules très rares.
Cette technique de double sélection positive s’effectue en
deux étapes. Tout d’abord les cellules subissent une pre-
mière sélection positive permettant d’éliminer les cellules
non désirées. Les billes magnétiques sont ensuite déta-
chées de la fraction positive. Et enfin la fraction cellulaire
désirée est récupérée par une deuxième sélection positive
pour obtenir un pool cellulaire très pur.
Cas particulier des cellules transfectées
Lors d’une transfection transitoire de cellules eucaryotes,
seule une faible proportion des cellules sont transfectées.
Pour rechercher un effet biologique de la transfection il est
plus fiable de travailler sur un pool cellulaire purifié. Il est
possible de sélectionner les cellules transfectées par tri
magnétique. Pour cela, on utilise un plasmide vecteur
contenant une séquence codant pour une protéine mem-
branaire (par exemple une molécule CD4 tronquée). Il est
alors nécessaire qu’il y ait entre le gène d’intérêt et le
Marquage des cellules
avec les billes
Passage au travers
de la colonne magnétique
Sélection
de la fraction négative
Sélection de la fraction positive
Figure 1. Schéma du tri cellulaire phénotypique monoparamétri-
que.
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marqueur de sélection une séquence IRES (internal ribo-
somal entry site) permettant alors l’expression des deux
gènes [7].
Le tri cellulaire fonctionnel
Exemple du tri
en fonction de l’expression de cytokines
Les cytokines [8] ont un rôle capital dans l’orientation de
la réponse immunitaire effectrice. Des lymphocytes T ou
des cellules de la lignée monocytaire, tels les cellules den-
dritiques ou les macrophages, ayant le même phénotype
de surface peuvent sécréter des cytokines différentes. Il a
donc été développé des procédés permettant de séparer les
cellules en fonction de leur sécrétion de cytokines. Cette
technique permet alors de récupérer des fractions enri-
chies en cellules sécrétant un type de cytokine. Le tri par
billes magnétiques présente alors un avantage essentiel
par rapport au cytomètre en flux ; en effet cette technique
permet de récupérer des cellules viables pouvant être utili-
sées pour des tests fonctionnels.
Le principe consiste à utiliser un hybride composé de deux
anticorps : l’un se liant à l’antigène panleucocytaire CD45
et l’autre liant la cytokine recherchée. Les cellules sécré-
trices de cytokines sont ensuite récupérées en utilisant des
billes marquées avec un anticorps anti-cytokine. Cette
technique permet de sélectionner des populations de cellu-
les représentant jusqu’à moins de 0,1 % de la totalité des
cellules de départ.
Technique de tri de macromolécules
Système de séparation des protéines
Il a été développé des techniques permettant de sélection-
ner par tri magnétique des protéines, notamment pour des
immunoprécipitations ou des co-immunoprécipitations
[9]. Il est alors utilisé des microbilles magnétiques conju-
guées à une protéine A de 42 kDa – protéine de la mem-
brane des staphylocoques- ou une protéine G de 33 kDa-
– protéine de la membrane des streptocoques. Ces
protéines ont la propriété de se lier au fragment Fc des
IgG. Pour purifier une protéine dans le but d’effectuer une
immunoprécipitation les cellules sont lysées puis les pro-
téines cellulaires sont incubées avec un anticorps spécifi-
que de la protéine recherchée et avec les billes. La solution
est ensuite passée sur une colonne magnétique. La pro-
téine d’intérêt est ensuite éluée de la colonne.
Système de séparation des ARN
Il a été développé des kits de purification de l’ARNm
provenant de cellules ou tissus [10]. Le principe consiste à
lyser les cellules. Ensuite l’ARNm est hybridé avec des
billes magnétiques porteuses d’une sonde constituée d’un
oligo-dT. Celui-ci a la propriété de s’hybrider à la queue
polyA des ARNm. La solution est ensuite passée sur une
colonne magnétique et seuls les ARNm hybridés avec les
billes magnétiques restent fixés sur la colonne. Ensuite
Après sélection
Avant sélection
CD4-FITC
CD25-PE
CD4-FITC
CD25-PE
Figure 2. Cytométrie en flux double couleur avant et après tri
par billes magnétiques des lymphocytes T CD4
+
CD25
+
. Les
lymphocytes spléniques d’un rat porteur de tumeur sont isolés
puis marqués par un anticorps anti-CD25 marqué à la phyco-
érithrine et un anticorps anti-CD4 marqué au FITC. Ces cellules
dans une autre expérience sont marquées avec un anticorps
anti-CD25 marqué à la phycoérithrine. Ces cellules sont ensuite
sélectionnées grâce à des billes anti-IgG1 de souris se fixant sur
le fragment Fc des anti-CD25. La qualité de la sélection positive
est évaluée en cytométrie en flux double couleur en marquant les
cellules avec un anticorps anti-CD4 marqué au FITC.
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l’ARNm est récupéré grâce à un tampon d’élution chauffé
a 65 °C permettant la rupture de la liaison entre les billes
oligo-dT et les ARNm. Ils sont alors élués par gravité.
Exemple d’application : le tri cellulaire
des lymphocytes T régulateurs
chez le rat
Des cellules T spécialisées dans la suppression de la ré-
ponse immunitaire sont essentielles au bon fonctionne-
ment et à la régulation du système immunitaire. Ces cellu-
les sont essentiellement des lymphocytes T CD4
+
exprimant de manière constitutive le récepteur alpha de
l’interleukine 2 (CD25) et sont retrouvées aussi bien chez
l’homme que chez les rongeurs [11]. Ces cellules appelées
lymphocytes T régulateurs sont présentes dans le thymus,
le sang et les organes lymphoïdes et sont capables de
contrôler les lymphocytes T auto-réactifs et de prévenir
l’apparition de maladies auto-immunes. Des études récen-
tes suggèrent que les lymphocytes T régulateurs CD4
+
CD25
+
pourraient jouer un rôle dans le déclenchement de
la réponse immunitaire anti-tumorale et pourraient repré-
senter une barrière expliquant l’inefficacité de l’immuno-
thérapie des cancers. Nous essayons à l’heure actuelle de
caractériser les fonctions de ces cellules immunorégulatri-
ces dans un modèle expérimental de cancer colique chez
le rat.
Dans ce modèle, le ratio de lymphocytes T spléniques
CD4
+
co-exprimant CD25
+
a été déterminé en cytométrie
en flux par double marquage. Chez les rats naïfs le pour-
centage de lymphocytes T CD4
+
CD25
+
estde10,8±2%
des Lc T CD4
+
. Chez les rats porteurs d’une tumeur PROb
établie, ce pourcentage augmente en corrélation avec le
volume tumoral (r = 0,97, n = 20, P < 0,001). Il atteint en-
viron 40 % chez les rats porteurs d’une tumeur de 1 cm
3
.
Nous avons alors voulu rechercher si ces lymphocytes
sont des lymphocytes T mémoires antitumoraux ou si ces
cellules sont des lymphocytes T régulateurs. Il n’existe
pas chez le rat de moyen de différencier phénotypique-
ment les lymphocytes T régulateurs des lymphocytes effec-
teurs. La seule technique disponible est un test fonctionnel
recherchant si les lymphocytes T CD4
+
CD25
+
sont capa-
bles de bloquer une alloréaction. Nous avons alors décidé
de sélectionner les cellules CD4
+
CD25
+
en effectuant un
tri cellulaire sur les lymphocytes spléniques de rats par
billes magnétiques en ciblant l’antigène CD25. Comme il
n’existe pas chez le rat de billes directement marquées
avec un anticorps anti-CD25, on utilise une sélection indi-
recte en incubant les lymphocytes avec des anticorps mo-
noclonaux de type IgG1 de souris anti-CD25 puis on in-
cube les cellules avec des billes magnétiques porteuses
d’un anticorps anti-IgG1 de souris. Cette technique per-
met de sélectionner environ 90 % de cellules de phénotype
CD4
+
CD25
+
(figure 2). Ces cellules ainsi sélectionnées
sont bien des lymphocytes T à fonction régulatrice car
elles sont capables d’inhiber la prolifération de splénocy-
tes lors d’une alloréaction in vitro (figure 3).
Références
1. Safarik I, Safarikova M. Use of magnetic techniques for the isolation
of cells. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999 ; 722 : 33-53.
2. Hardwick RA, Kulcinski D, Mansour V, Ishizawa L, Law P, Gee AP.
Design of large-scale separation systems for positive and negative immu-
nomagnetic selection of cells using superparamagnetic microspheres.
J Hematother 1992 ; 1 : 379-86.
3. Treleaven JG, Gibson FM, Ugelstad J, et al. Removal of neuroblas-
toma cells from bone marrow with monoclonal antibodies conjugated to
magnetic microspheres. Lancet 1984 ; 8368 : 70-3.
4. Kemshead JT, Ugelstad J. Magnetic separation techniques : their appli-
cation to medicine. Mol Cell Biochem 1985 ; 67 : 11-8.
5. Miltenyi S, Muller W, Weichel W, Radbruch A. High gradient magne-
tic cell separation with MACS. Cytometry 1990 ; 11 : 231-8.
0
50
100
150
200
250
300
j3 j6
Jours
splénocyte BDIX + wistar mito
splénocyte BDIX + wistar
mito + CD25 +
Cpm 103
Figure 3. Alloréaction lymphocytaire inhibée par les lymphocytes
T régulateurs sélectionnés par tri magnétique. Les lymphocytes T
CD25
+
sélectionnés par tri par billes magnétiques sont utilisés
dans un test fonctionnel d’alloréaction. Des splénocytes de rats
BDIX mis en présence de splénocytes de rats allogéniques
Wistar prolifèrent après 3 et 6 jours de coculture. L’adjonction à
la coculture de lymphocyte T CD25
+
bloque cette prolifération,
donc les lymphocytes T sélectionnés sont bien des lymphocytes
T régulateurs.
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