Imagerie en lumière blanche - gdr-Miv
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Imagerie en lumière blanche Votre microscope est votre ami! MiFoBio 2016 ‐ Pierre Bon Deux familles de techniques d’imagerie Objet biologique Contraste endogène Illumination Echantillon Détection Contraste de phase, Holographie, Optique non‐linéaire... 4 Deux familles de techniques d’imagerie Objet biologique Contraste endogène Marquage par sondes Illumination Echantillon Excitation Structure marquée Sondes Détection Détection Contraste de phase, Holographie, Optique non‐linéaire... Imagerie confocale, Super‐résolution... 4 5 Deux approches disjointes Contraste endogène Marquage par sondes Diffusion Absorption + ré‐émission Particule Conservation d’information sur la lumière d’excitation Imagerie cohérente Fluorophore Perte d’information sur la lumière d’excitation Imagerie incohérente 11 Spécificité et complémentarité Diffusion Absorption + ré‐émission Imagerie cohérente Imagerie incohérente Imagerie de phase Intensité de fluorescence 180 nm 0 5 µm Information quantitative Spécificité moléculaire difficile 5 µm Quantification difficile Spécificité moléculaire 6 Utiliser un angle d’illumination pour révéler l’échantillon Illumination 0° « Contraste de Hoffman » 30° « Dark field » 70° 5 µm bead Intensity (« eye ») images Microscope objective Illumination not collected Microscope objective Microscope objective La traversée d’un échantillon semi‐transparent c n n densité vg Lumière incidente (onde plane) n1 Lumière après l’échantillon n2 e n2 > n1 7 La traversée d’un échantillon semi‐transparent c n n densité vg Lumière incidente (onde plane) n1 Pas d’absorption Lumière après l’échantillon n2 e n2 > n1 OPD = (n2-n1) x e Ex : Ex : Intensité Phase Image d’intensité : I Image de phase : φ = 2π.OPD/λ 8 9 Principe du DIC 5 µm Image « DIC » Phase 1 Phase 2 ‐ Interférences Intensité Effet « gradient » 10 Principe du contraste de phase de Zernike Phase Intensités Interférences « passe bande fréquentiel » « Zernike Type 1 » Phase Intensité Zernike « Zernike Type 2 » « Zernike Type 3 » Imagerie de phase quantitative Quadriwave lateral shearing interferometry (QWLSI) allows phase and intensity measurements 11 12 How to extract the phase and the intensity Deformations = information on the OPD gradients OPD gradient along x FT‐1 FT Interferogram obtained with a living cell Intensity FT-1 FT-1 OPD gradient along y Phase 161 nm 0 Une imagerie sans marquage très sensible! Cellules CHO vivantes (37°C, CO2 5%) 13 8 Un des résultats majeurs : masse à l’échelle micrométrique Suivi temporel d’une cellule t=0 t=10h t=20h t=25h 20µm 40µm Segmentation automatisée Σ Masse (pg) 600 o Mesure de masse o Non invasif & rapide 400 1er cycle cell. 2em cycle cell. 3em cycle cell. 200 0 10 20 Temps (heures) 30 15 Lien entre masse et phase Indice optique ∝ densité des nuages électroniques1 1,50 Concentration massique nsolution ≈ nsolvant + α . Cm Incrément spécifique ≈ 0.18 µm3/pg pour tout élément! Indice optique 1,47 1,44 1,41 Saccharose Urée Lécithine (DPPC) 1,38 ADN Chlorure de sodium 1,35 0 ·d 250 500 750 Concentration massique g L -1 · Masse 1 : Feynman et al. (The Feynman lectures on physics, 1963) 1000 1250 16 Une autre application : la compensation des drifts en 3D Quantitative Phase dSTORM Pierre Bon Patented Bon et al., Nature Communication, 2015 Examples of drift compensation in super‐resolution Without drift correction 900 nm With 3D drift correction z 0 5µm Human fibroblast, f‐actin labelled with A647/Phalloidin 60x NA=1.45, 3D dSTORM imaging during 4 hours Pierre Bon / Jeanne Linarès 17 18 Evanescence frustrée Objet biologique Evanescence frustrée Champ évanescent ≈ 200 nm Lamelle Réflexion totale interne Intensité Transmission 5 µm Un accès au premiers 200 nm au dessus de la lamelle Cellules HEK vivantes (37°C, CO2 5%) 19
