Escherichia coli

Approches interdisciplinaires du
vieillissement et de la mort dans des
lignages cellulaires
http://www.necker.fr/tamara/
François Taddei
LABORATOIRES IMPLIQUES:
U571 INSERM Génétique Moléculaire Évolutive et Médicale
Institut Jacques-Monod
Institut des Hautes Études Scientifiques
OBJECTIFS
RESULTATS SCIENTIFIQUES
Les progrès techniques rendent, aujourd’hui, possible l'enregistrement
de centaines de divisions cellulaires issues d'une seule cellule.
Permettant ainsi l'observation des variations individuelles dont la plus
extrême est la mort cellulaire.
Nous avons développé une méthodologie expérimentale et un logiciel
qui nous permettent de suivre les variations phénotypiques et leur
héritabilité dans un lignage cellulaire initié par une cellule unique
d'Escherichia coli.
Jusqu'ici le vieillissement avait été classiquement associé à la présence
d'une séparation entre lignée germinale et lignée somatique. Pourtant
dans le cadre de notre travail sur une bactérie à division symétrique, E.
coli., nous avons montré que ni la lignée germinale, ni la présence d'un
stade juvénile ne sont des pré requis pour le vieillissement. Celui-ci
étant défini comme étant
l'accroissement de la mortalité et la
décroissance du nombre de descendants avec l'âge. De plus, ces
résultats obtenus sur l'organisme modèle de la biologie moléculaire ont
permis de décortiquer les mécanismes moléculaires impliqués dans le
vieillissement et la mort cellulaire.
Nous avons pu montrer qu'une partie de ce vieillissement (au moins
30%) chez E. coli peut-être expliqué par la présence de corps
d'inclusion
qui
se
divisent
asymétriquement
et
sont
préférentiellement associés aux « vieux pôles ».
Nous avons également étudié la mortalité en absence de stress
exogène chez les bactéries. Deux mutants présentant un taux de
mortalité plus faible, ont été identifiés par criblage. Le premier agit
sur la résistance aux différents stress et le second sur la motilité.
L'identification de ces deux mutants a montré que la réduction de la
mortalité n'est pas impossible mais est sujette à un coût qui influe sur
le succès compétitif de l'organisme.
Par ailleurs en comparant seize bactériophages infectant les bactéries
Escherichia coli, nous avons montré que le taux de mortalité des virus
est constant avec le temps et négativement corrélé avec leurs taux de
multiplication. Quoique ces virus ne vieillissent pas, ce résultat est en
conformité avec le « trade-off » entre survie et reproduction
observées dans de nombreux organismes présentant un
vieillissement.
DEROULEMENT DU PROJET
Une première étude a mis en évidence le vieillissement dans un
organisme, à division apparemment symétrique et sans phase
juvénile identifiable : les bactéries Escherichia coli. Dans ce modèle
l’âge est défini en fonction du nombre de générations et de
l’héritage des pôles préexistants chez la bactérie « mère », qui sont
aussi appelés « vieux pôles ».Grâce à l'efficacité de la génétique
moléculaire chez E. coli, le criblage systématique nous a déjà permis
d'isoler des mutants présentant plus ou moins de cellules mortes que
le génotype sauvage. L'étude de la distribution de la mortalité dans
les lignages issus de ces mutants nous permettrons de mieux
comprendre les causes moléculaires de la mort cellulaire.
De plus, à l'aide de nouveaux variants de protéines fluorescentes que
nous avons développé au laboratoire, nous avons suivi l'expression
et la localisation sub-cellulaire de protéines susceptibles d'être
impliquées dans la prévention de défauts moléculaires, comme les
protéines agrégées qui s'accumulent lors du vieillissement des
neurones.
Pour étudier l'effet de l'environnement (composition chimique,
température), nous avons couplé le microscope robotisé à un
système (flow-chamber) permettant de faire varier rapidement les
conditions du milieu de croissance et de générer des stress variés:
nutriments, pression osmotique, oxydation, antibiotiques, etc.
(Développer en collaboration avec le laboratoire Microfluidique,
Organisation chimique et Nanotechnologie de l'ENS)
PRINCIPALES PUBLICATIONS
Viruses' Life History: Towards a Mechanistic Basis of a Trade-Off
between Survival and Reproduction among Phages. De Paepe M,
Taddei F. PLoS Biol. 2006 Jun 13;4(7):e193
Asymmetric segregation of protein aggregates is associated with
cellular aging and rejuvenation. Ariel B. Lindner, Dick Madden2, Alice
Demarez, Eric Stewart & Francois Taddei. Submitted to PNAS
Evidence for tradeoff between mortality, motility and reproduction in
Escherichia coli. Fontaine F., Lindner A., Stewart E. and Taddei F.
Submitted to molecular microbilogy
VIEILLISSEMENT BACTERIEN ET
AGREGATION
1
2
FAITS MARQUANTS
Le logiciel « Bacterial Home Vision », utilisé dans le laboratoire, permet
une analyse semi-automatique de films de croissances de bactéries.
Cependant il nécessite un traitement manuel d'environ 10 % des
bactéries, qui n'ont pu être correctement détectées automatiquement;
ce qui représente environ 1 semaine de travail.
Afin d’accélérer cette étape, qui est pour le moment le facteur limitant,
nous collaborons actuellement avec le laboratoire de mathématiques
appliquées de Paris 5 (MAP5) pour améliorer les méthodes d'analyse
d'images. Deux approches sont développées : La première augmentera
la qualité de la segmentation des bactéries, en injectant toutes les
informations contenues dans les images, dans un modèle de maximum
a posteriori. Nous voulons aussi utiliser les informations temporelles
apportées par la forte redondance entre les images. La seconde est de
faciliter le post-traitement manuel grâce à une analyse statistique de la
segmentation obtenue qui permettra de concentrer l'attention des
utilisateurs sur les zones dont la segmentation est incertaine.
L’étude systématique des lignages obtenus, grâce aux nouvelles
méthodes développées par l’équipe, et leurs comparaisons avec ceux
obtenus en simulant sur ordinateur la croissance bactérienne à partir
de mécanismes physiologiques, permettra de tester de manière
quantitative les principales hypothèses sur les mécanismes impliqués
dans le vieillissement cellulaire.
1)Taux de croissance moyen (A) et intensité de fluorescence (B) des
cellules héritant des nouveaux pôles (bleues) et vieux pôles (en
rouge). Dans 90.5% des bactéries héritant du vieux pôle pousse plus
lente que sa « sœur » tandis que dans 74.6% la bactérie héritant du
jeune pôle se développe plus rapidement que sa « mère » Les
ordonnées sont les écarts types des populations (jeune Vs vieux) par
rapport à la moyenne de la génération, données issus de 12 films.
2) Étapes de l’analyse d’images avec le logiciel « Bacterial Home
Vision »,
a) Image de la micro-colonie bactérienne en contraste phase (b)
Image de fluorescence des agrégats marqués par un fusion protéique
avec la YFP (c) Segmentation des bactéries (d) Identification des
bactéries et des agrégats.