M. Rouleau - Grenoble INP
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Les Cellules Souches Matthieu ROULEAU INSERM U898 Université de Nice-Sophia Antipolis - FRANCE Plan de la présentation 1ere partie : Introduction générale Définitions, concepts Propriétés des cellules souches Les différents types de cellules souches 2ieme partie : Focus sur les cellules souches embryonnaires et adultes au travers d’exemples Les cellules hématopoiétiques adultes Les cellules souches épidermiques adultes Les cellules souches embryonnaires Les cellules pluripotentes induites iPS Conclusion / Débat Qu’est-ce qu’une cellule souche? Quelle est sa fonction au sein d’un tissu ou d’un organe ? Une cellule souche va assurer: l’homéostasie à long terme du tissus/organe Maintien tout au long de la vie de l’individu de la fonction du tissu/organe la réparation du tissus en cas de lésion Plasticité des cellules souches Invertébrés: hydre Regénère même sa tête!! Persistence d’une niche de cellules pluripotentes, Cnidaires: méduses, les coraux, les anémones de mer et autres polypes. Coupé, formera autant de vers complets!! plathelminthe: vers plats recrutées en cas de lésion. Plasticité des cellules souches Vertébrés: Cicatrisation (Days 1-2) salamandre régénère tous ses membres (mais aussi œil, queue, portions de cœur) amphibiens nocturnes, de l’ordre des urocèles Dé-differenciation (Days 3-12) Formation du blastème (Days 13-21) Re-differenciation (Days 22-40) Les cellules à proximité de la lésion (surtout fibres musculaires) se dé-différencient pour former un blastème régénératif contenant des progéniteurs mésenchymateux. Plasticité des cellules souches Differenciation Morphallaxis (allaxis= exchange) De-differenciation La régénération d’une partie du corps se fait par une réorganisation cellulaire et structurale avec un nombre restreint de nouvelles cellules (pas de prolifération) Hydre La régénération se fait par recrutement de néoplastes en dehors de l’organe bléssé (forte prolifération) Cellules souches ou Proliferation Differenciation progénitrices Salamandre Tissus des mammifères Epimorphosis Plasticité des cellules souches A quoi est due cette incapacité régénératrice chez les Mammifères à l’âge adulte ? Absence de persistence de cellules pluripotentes ? (Hydre) Limitation du niveau de dé-différenciation ? (Salamandre) Mais conservation d’un certain nombre de caractéristiques typiques des cellules souches Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche possède les caractéristiques uniques de: s’auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée se différencier c’est à dire produire différentes cellules spécialisées (différenciées) Notion de Plasticité Différents niveaux de plasticité Totipotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme y compris le tissu extra-embryonnaire = œuf fécondé Pluripotence : capacité à générer toutes les cellules d’un organisme = les cellules souches embryonnaires (ES) Multipotence : capacité à générer certaines cellules constitutives d’un organe = cellules souches adultes tissulaires Unipotence : capacité à générer un seul type de cellules = progéniteurs unipotents (maturation fonctionnelle d’une cellule) Notion d’Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Division cellulaire symétrique 2 SC Auto-renouvellement symétrique 2 cellules engagées Division cellulaire asymétrique SC Cellule engagée Différenciation symétrique La division d’une cellule souche est asymétrique : les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère Maintien d’un nombre constant de cellules souches (SC) œuf fécondé (jour 1) cellules souches embryonnaires (ES) Pluripotentes stade 8 cellules (3 jours) embryon pré-implantatoire Evans and Kaufman. 1981 Nature Thomson et al. 1998 Science cellules souches fœtales Pluripotentes (?) ou multipotentes Embryon de 6 semaines Les différents types de cellules souches Nouveau-né cellules souches germinales Embryonnaires Pluripotentes cellules souches de sang de cordon Pluripotentes (?) ou multipotentes cellules souches Adultes Multipotentes et unipotentes adulte Ovule fécondé Totipotentes (jour 1) (> 200 types cellulaires) blastocyste (40-100 cellules (jour 4) stade 8 cellules (3 jours) Cellules souches embryonnaires Bouton embryonnaire (ICM = intern cell mass) 1981 Pluripotentes épiderme Neurones Ectoderme coeur Pancréas muscles Thyroïde Lymphocytes,… Poumon Mésoderme Endoderme Potentiel de différenciation des cellules ES cardiomyocytes Cellules gliales Neurones kératinocytes mélanocytes Muscles Cellules de la rétine Hépatocytes Îlots de Langherans spermatogonies adipocytes ovocytes Cellules endothéliales Globules rouges chondrocytes macrophages lymphocytes Cellules souches tissulaires - Auto-renouvellement: - Renouvellement tissulaire: Caractéristiques typiques des cellules souches tissulaires Auto-renouvellement : division cellulaire qui engendre au moins une cellule fille qui conserve le potentiel souche Multipotence : capacité à engendrer des cellules progénitrices de tous les types cellulaires composant le tissus Quiecence in vivo, Caractéristiques clefs pour assurer l’homéostasie/le renouvellement du tissu/réparation tissulaire mais parfois fort taux prolifératif in vitro Notion de holo-, méro- et para-clones (Barrandon & Green PNAS 1985)) Très faible nombre in vivo Absence de marqueur spécifique Cellules difficiles à analyser Notion de « niche » une structure responsable du maitien de la CS dans un état de non différenciation Concept de niches Environnement stable pour les cellules souches Les niches sont des tissus et/ou des matrices extracellulaires qui peuvent indéfiniment héberger des cellules souches et contrôler leur autorenouvellement et leur production cellulaire in vivo. Les “niches” des cellules souches: des environnements ultra-spécialisés Follicule pileux Moelle osseuse Crypte intestinale Shofield (1978): 1) Site anatomiquement défini 2) Maintien des fonctions des CSH 3) Inhibition de la différenciation 4) Contrôle nombre de CSH 5) Capacité de réversion (?) Potentiel médical des cellules souches La thérapie cellulaire réparatrice • Aujourd’hui : lymphome, leucémie. – Transplantation de möelle osseuse, source de cellules souches hématopoiétiques – Quelques essais de transplantation de cell.souches neuronales fœtales (Maladie de Huntington) – Un essai clinique en cours transplantation de précurseurs neuronaux issus de la différenciation in vitro de cellules ES humaines (USA, 2009) • Demain? Parkinson, maladies cardiaques, diabète… Les cellules souches adultes • Renouvellement tissulaire et réparation • Multipotence Les différent types de cellules d’origine hématopoiétique Auto-renouvellement Multipotence 1011 cellules/jours Caractéristiques marquantes Choix possible entre autorenouvellement et differenciation Multipotence Auto-renouvellement Peuvent s’expandre temporairement mais continuent à se différencier Cellules matures différenciées fonctionnelles Unipotence Pas d’auto-renouvellement Test de reconstitution in vivo ⇒ Capacité à régénérer un système hématopoïétique complet à long-terme chez une souris irradiée Irradiation létale 2) 1) Survie (progéniteurs), Prise de greffe (% chimérisme) 2-5 mois 3) Transplantation en serie Seul test des CSH les plus pluripotentes!! Moelle osseuse/CSH Seule 1 sur 10000 cellules de moelle osseuse possède cette capacité de reconstitution à long terme Structure de l’épiderme Les différentes strates de kératinocytes différenciés (épithélium pluristratifié) C’est un tissu qui se renouvelle en permanence Le renouvellement de la peau se fait en 2-3 semaines Comment assurer à la fois le renouvellement et la différenciation ? Homéostasie épidermique : Plutôt division asymétrique Développement embryonnaire précoce Épithelium buccal mb basale Stratification durant la morphogénèse protéines de polarité Follicule pileux SC intégrines, fact. de croissance Homéostasie de l’épiderme adulte Numb 1 Asymetric spindle orientation 2 D’aprè après C Blanpain & E Fuchs Nature Rev Mol Cell Biol, Biol, 2009 Homéostasie cutanée : Modèle de l’EPU (Epidermal proliferative unit) Stratum corneum Auto-renouvellement Granular K1, K10 layer Spinous Cell. souche layer epidermis Basement membrane Dermis TA Stem TA cell cell cell Basal Layer (K5/K14) Mesenchymal connective tissue Dermal Potten C. et al. (1979) BBA MacKenzie IC (1997) JID cells transient amplifying (TA) cells Identifier les cellules souches épidermiques > In vivo : quiescence > LRC (BrdU, 3H-Thy, Hist H2B, …) LCR = labelled retaining cells > In vitro : fort potentiel prolifératif Utilisation clinique >20 ans pour traiter les grands brûlés (Expantion d’un facteur de l’ordre de 1016) Surface : 6bright CD71dim ß1bright MTS-24 (UI cells) Nucléaire : ∆Np63 Blimp1 (GS) Cytoplasmiques : CD34 (bulge) K19, K15, Lgr5 Cellules souches ou progéniteurs ? Différentes localisations des Cellules Souches (CS) épidermiques Jaks, Nature Gen, 2008 Germe folliculaire IIaire (début d’anagène) CS multipotentes Epiderme interfolliculaire (Lgr5+ cells) Nijhof, Development, 2006 Jensen, J Cell Science, 2008 Isthme supérieur CS multipotentes (qq évidences) (MTS24+ cells) Glande sébacée Bulge Progéniteurs (Blimp1+ cells) Ghazizadeh, Embo J, 2001 Horsley, Cell, 2006 CS multipotentes (très nb évidences) Oshima, Cell, 2001 Blanpain, Cell, 2004 …etc Matrice Progéniteurs (TA cells amplification transitoire) Et différents niveaux de « stemness » (potentiel souche). Homéostasie épidermique : destinée des Cellules Souches du bulge pendant la cicatrisation Expérience de tracabilité à long-terme (marquage génétique) Epiderme interfolliculaire (IFE) Migration des cellules marquées dans l’épiderme inter-folliculaire blessé, puis disparition progressive une fois la plaie refermée. Tumbar et al, Science, 2004 Ito et al, Nature Med, 2005 Levy et al, Faseb J, 2007 Home sweet … niche Exemple de la niche épidermique épiderme SCE Progéniteur multipotent Follicule SCE pileux Glande Notch Wnt (ß-catenin/LEF1) c-Myc sébacée Cell. différenciées Gat et al. (1998) Cell Lowell et al. (2000) Curr Biol Les Cellules ES humaines (huES) 1ère publication : 1998 2-3 cellules Projet parental (surnuméraire) Projet de recherche 5 jours oeuf fécondé Cellules embryonnaires issues de FIV in vitro embryon pré-implantatoire (40-100 cellules) Pluripotence des cellules souches embryonnaires Différenciation in vivo intestin os rein neuroectoderm e Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la région qui l'entoure Les Cellules ES humaines (huES) Cellules souches embryonnaires kératinocytes mélanocytes cardiomyocytes Neurones lymphocytes Muscles adipocytes Hépatocytes Îlots de Langherans Modèle cellulaire: Tests pharmacologiques Toxicologie Développement embryonnaire Cellules endothéliales chondrocytes ovocytes spermatogonies Thérapie cellulaire Allogénie Correction génique possible Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie - Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines - Contrôler leur différenciation de manière sélective - Pureté cellulaire: FACS, sélection génique, clones - Contrôler le rejet de tissus - Eviter les tératomes (indiff. cells?) - Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires Différences entre cellules souches adultes et cellules souches embryonnaires Adultes Embryonnaires Différenciation limitée : multipotence au mieux Rares dans les tissus matures Présentes en grand nombre Difficiles à cultiver in vitro Faciles à cultiver in vitro Plus “éthiques” que les cellules souches embryonnaires Différenciation illimitée: pluripotence Les cellules souches pluripotentes induites iPS Reprogrammation Induced pluripotent stem cells Avantages: Cellules différenciées Pas de pb éthique (≠ hES) autologues Problèmes à résoudre pour la thérapie: Utilisation de virus Protocoles de différenciation Utilité et perspectives d’utilisation des cellules pluripotentes Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide). Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I; infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour corriger un phénotype pathologique, …. Délivrance de médicaments - Production massive de protéines recombinantes ou endogènes… Regénération tissulaire contre le viellissement Thérapie des cancers ?
