N°d’Ordre......................./LABIOGENE UNIVERSITE DE OUAGA 1, Pr Joseph KI-ZERBO --------------- LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE (LABIOGENE) SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT) Mémoire Présenté Par : Edwige Tampoubila YELEMKOURE Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université de Ouagadougou SUR LE THEME: Diagnostic moléculaire de l’hépatite B chez les femmes enceintes à terme et transmission verticale du virus, au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou Soutenu le 08 juillet 2015 devant le jury composé de : Président : Pr Yves TRAORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Djénéba OUERMI, Maître Assistant, Université de Ouagadougou Dr Florencia W. DJIGMA, Assistante, Université de Ouagadougou Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaire Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT - École Doctorale Sciences Technologie Université de Ouagadougou – Burkina Faso Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 et Page i DEDICACE Je dédie ce mémoire A mon père et à ma mère Vous avez consenti d'énormes sacrifices pour le succès de mes études grâce à vos prières, à vos bénédictions, et à votre soutien constant et multiforme je vous dédie ce travail en témoignage de ma reconnaissance filiale. A mes frères Eric, Gildas et Sœurs Catherine, Monique, Clarisse vous avez toujours été pour moi d'un soutien inestimable, merci pour vos conseils, soyez honorés pour tous vos efforts. A ma fille Amiratou Myriame. Puisse ce mémoire marquer le début de notre bonheur ! A mon oncle Dr YELEMKOURE Kodio Joseph, et à ma tante madame OUARE Bernadette ce travail est le fruit de vos soutiens moraux et matériels. A Mr TIDIGA Abdou Rachid, en témoignage de ma gratitude et de mon affection. A tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’aboutissement de ce travail. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page ii REMERCIEMENTS Nous exprimons notre profonde gratitude : Au Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire à l’université de Ouagadougou (UFR/SVT), Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin à Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI /Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA/LABIOGENE), Coordonnateur du Master de Biologie et de Génétique Moléculaires Appliquées (BioGeMA), pour avoir accepté de diriger ce Master, pour le choix pertinent de ce thème, pour avoir trouvé le financement de ces travaux et pour son encadrement exceptionnel. Au Pr Yves TRAORE, Professeur titulaire d’immunologie à l’Université de Ouagadougou, pour avoir accepté de présider notre jury malgré vos multiples occupations. Au Dr Djénéba Diane OUERMI, Maître Assistante en Biologie Moléculaire, merci pour la qualité de vos enseignements et d’avoir accepté de juger ce travail. Au Dr DJIGMA Wendkuni Florencia, Assistante en Biologie Moléculaire pour avoir accepté de critiquer ce travail malgré vos multiples occupations. Au Dr ZOHONCON M. Théodora, Mr SOUBEIGA R. Serge Théophile, Dr DIARRA Birama, Mlle COMPAORE T. Rébecca et Mr OUATTARA Abdoul Karim, pour l’encadrement technique au laboratoire et leurs conseils pour l’amélioration de la qualité de ce travail. Aux Docteurs BASSOLE Henri Ismaèl, TAO Issoufou et BAYALA Bagora pour l’amélioration de la qualité de ce travail. Au corps professoral de l’UFR/SVT en général et celui du Master II de BioGeMA en particulier, pour la qualité des enseignements. A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) à travers le programme PACER2 pour le soutien financier du master BioGeMa. A toutes les femmes qui ont bien voulu participer à la réalisation de ce travail. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page iii Résumé Introduction : selon l’OMS l’hépatite virale B est responsable de plus d’un million de décès par an dans le monde, dont la plupart survient dans les pays en développement. Parmi les voies de transmission du virus, la transmission mère-enfant demeure l’une des principales voies de transmission. Malgré l’introduction effective du vaccin de l’hépatite dans le programme vaccinal élargi des enfants, la transmission mère-enfant demeure un problème de santé dans notre pays. L’objectif de cette étude est de contribuer à la réduction de la transmission verticale du virus de l’hépatite B au Burkina Faso. Matériel et Méthode : cette étude a été réalisée au Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO). Elle a concerné 237 femmes enceintes issues de différentes couches socioprofessionnelles venues pour accouchement. Des tests rapides pour la détection des antigènes de surface du virus de l’hépatite B ont été réalisés en utilisant le kit Abon Biopharm (hangzhou; Chine). A la naissance, tous les enfants ont reçu la première dose du vaccin EUVAX contre l’hépatite B. Deux et quatre mois plus tard, les deuxième et troisième doses leurs ont été administrées. Sept mois après accouchement des prélèvements veineux ont été faits chez les mères et leurs enfants. Le Kit ELISA : ‟HBsAb Quantitative EIA”a servi pour le dosage des anticorps IgA, IgM et IgG chez les enfants. Le diagnostic moléculaire de VHB a été réalisé à l’aide du Kit ‟Ribo Virus (HBV Real-TM Qual)” pour l’extraction et le Kit ‟HBV Real-TM Qual ”qui a servi d’amplifier l’ADN des mères positives au VHB et leurs enfants. Résultats et conclusion: sur 237 échantillons, les tests rapides ont révélé 22 échantillons positifs à AgHBs soit une prévalence de 9,28% et la PCR en temps réel a confirmé 21 échantillons positifs. Des 22 femmes positives au VHB, cinq ont transmis l’infection à leurs enfants soit un taux de transmission verticale de 22,73%. Les prévalences les plus élevées ont été constatées chez les femmes élèves/étudiantes (13,73%) suivies des femmes ménagères (10,49%). Le dosage des anticorps anti-VHB chez les enfants non infectés a donné un taux de protection de 98,31% avec une concentration moyenne de 218,07±74,66 mIU/ml. Cette étude nous permet de confirmer que la transmission verticale est bien une réalité dans notre pays et que la vaccination permettrait de réduire considérablement cette transmission du virus Mots clés : VHB, Transmission Verticale, Femmes enceinte, Vaccin, Enfant Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page iv Summary Objective: according to the W.H.O. viral hepatitis B is responsible for over one million deaths per year worldwide, most of which occur in developing countries. Mother to child transmission remains the primary mode of transmission, this occurs primarily during and after child birth. Despite the actual introduction of the hepatitis vaccine at birth in the immunization program for children, mother-child transmission remains a public health problem in our country. The objective of this study is to contribute to the reduction of hepatitis B vertical transmission in Burkina Faso. Methods: This study was conducted at Saint Camille Medical Center (CMSC) of Ouagadougou; it involved 237 pregnant women from different social and professional groups who came to give birth. The kit Abon Biopharm (Hangzhou) was used to determine hepatitis B virus surface antigens. At birth, all children received the first dose of EUVAX vaccine against hepatitis B. Two and four months later, their second and third doses were administered. Seven months after childbirth venous samples were taken for mothers and their children. The ELISA kit: "Quantitative HBsAb EIA" was used for the determination of IgA, IgM and IgG in children. Molecular diagnosis of HBV was performed using kits "Ribo Virus (HBV Real-Qual TM)" (extraction) and "HBV Real-TM Qual" was used for the amplification of DNA from HBV positive mothers and their children. Results: Of the 237 samples, rapid tests revealed 22 positive samples for HBsAg a prevalence of 9.28% and the real-time PCR confirmed 21 positive samples. Of the 22 HBV-positive women, five have transmitted the infection to their children with a rate of 22.73%. The highest prevalence was found among women pupils / students (13.73%) followed by housewives (10.49%). HBV antibody dosage in children gave a protection rate of 98.31% with an average concentration of 218.07 ± 74.66 mIU / ml. This study allows us to confirm that vertical transmission is a reality in our country and that vaccination would greatly reduce the transmission of HIV. Keywords: HBV, vertical transmission, pregnant women, vaccine Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page v TABLE DES MATIERES DEDICACE ................................................................................................................................ ii REMERCIEMENTS ................................................................................................................. iii Résumé ...................................................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................................... v Liste des figures ......................................................................................................................... x Liste des abréviations ................................................................................................................ xi INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1 1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................. 3 1.1. Virus de l’hépatite B .................................................................................................. 3 1.1.1. Historique ......................................................................................................... 3 1.1.2. Les hepadnaviridae ........................................................................................... 3 1.1.3. Morphologie et structure du VHB .................................................................... 4 1.1.4. Le génome du VHB .......................................................................................... 5 1.1.4.1. La polymérase ................................................................................................... 5 1.1.4.3. Les protéines HBc et HBe ................................................................................ 6 1.1.4.4. La protéine X (HBx) ......................................................................................... 7 1.1.5. La réplication .................................................................................................... 7 1.1.5.1. L’entrée virale ................................................................................................... 8 1.1.5.2. Transport des nucléocapsides VHB au noyau .................................................. 9 1.1.5.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc .............................. 9 1.1.5.4. La transcription ............................................................................................... 10 1.1.5.5. La traduction ................................................................................................... 10 1.1.5.6. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale .................................. 11 1.1.6. Modes de transmission du VHB ..................................................................... 11 1.1.6.1. La transmission sexuelle ................................................................................. 11 1.1.6.2. La transmission parentérale ............................................................................ 11 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page vi 1.1.6.3. La transmission mère- enfant (verticale) ........................................................ 12 1.1.6.4. La transmission horizontale ............................................................................ 12 1.1.7. Histoire naturelle de l’infection par VHB ...................................................... 13 1.1.7.1. Tropisme cellulaire ......................................................................................... 13 1.1.7.2. Pathogenèse .................................................................................................... 13 1.1.7.3. Profils sérologiques ........................................................................................ 14 1.1.7.4. Hépatite aiguë ................................................................................................. 15 1.1.7.5. Hépatite chronique .......................................................................................... 15 1.1.8. Epidémiologie du VHB .................................................................................. 16 1.1.9.1. Diagnostic clinique ......................................................................................... 18 1.1.9.2. Recherche des marqueurs sérologiques .......................................................... 18 1.1.9.2.1. Marqueurs directs ........................................................................................... 18 1.1.9.2.2. Marqueurs indirects ........................................................................................ 19 1.1.10. Méthodes d’étude de la variabilité du VHB et diversité du génome du VHB 19 1.1.10.1. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB ................................ 19 1.1.10.2. Diversité génétique du VHB........................................................................... 20 1.1.11. Traitement et prévention ................................................................................. 21 1.1.11.1. Les analogues de nucléosides/nucléotides de la transcriptase inverse ........... 22 1.1.11.2. Les traitements « immuno-modulateurs » ou interférons ............................... 22 1.1.11.3. La vaccinothérapie .......................................................................................... 22 1.1.11.4. Stratégies de vaccination contre l’hépatite B ................................................. 23 2. OBJECTIFS DE L’ETUDE............................................................................ 24 2.1. Objectif général .............................................................................................. 24 2.2. Objectifs spécifiques....................................................................................... 24 3. MATERIEL ET METHODES ....................................................................... 24 3.1. Cadre d’étude .................................................................................................. 24 3.2. Matériel ........................................................................................................... 25 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page vii 3.2.1. Réactifs ........................................................................................................... 25 3.2.2. Appareillage .................................................................................................... 26 3.3. Méthodes ........................................................................................................ 27 3.3.1. Type et période d’étude .................................................................................. 27 3.3.2. Population d’étude .......................................................................................... 27 3.3.3. Critères d’inclusion......................................................................................... 27 3.3.4. Critères de non inclusion ................................................................................ 27 3.3.5. Echantillonnage .............................................................................................. 27 3.3.6. Principe et mode opératoire de l’ELISA en Sandwich ................................... 28 3.3.7. Détection du VHB .......................................................................................... 29 3.3.7.1. PCR en temps réel .......................................................................................... 29 3.3.7.2. Principe de la PCR en temps réel ................................................................... 29 3.3.7.3. Extraction et quantification de l’ADN du VHB ............................................. 30 3.3.7.4. Protocole de la PCR en temps réel ................................................................. 31 3.3.8. Analyses statistiques ....................................................................................... 31 3.3.9. Aspect éthique de la recherche ....................................................................... 31 4. RESULTATS .................................................................................................................... 32 5. DISCUSSION ................................................................................................................... 37 CONCLUSION ........................................................................................................................ 39 RECOMMANDATIONS ......................................................................................................... 40 PERSPECTIVES ...................................................................................................................... 40 REFFERENCES....................................................................................................................... 41 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page viii Liste des tableaux Tableau I: statut socioprofessionnel des femmes enceintes en fonction des moyennes .......... 32 Tableau II : Prévalence du VHB en fonction des classes d'âge des femmes enceintes............ 33 Tableau III: Taux des anticorps anti-HBs des enfants vaccinés ............................................... 35 Tableau IV : Résultats de la PCR et différents marqueurs du VHB dans la transmission mèreenfant ........................................................................................................................................ 36 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page ix Liste des figures Figure 1 : Représentation de la particule virale du VHB selon James A. Perkins (2002) (Source :http://www.infectiologie.org.tn) ; Consulté le 05/01/2015 ........................................ 4 Figure 2 : Organisation du génome du VHB .............................................................................. 5 Figure 3: Schéma simplifié de la réplication du VHB (Lucifora et Zoulim, 2007) ; Source :www.google.com ; Consulté le 03/04/2015 ................................................................. 8 Figure 4 : Schémas montrant l'histoire naturelle du VHB ....................................................... 13 Figure 5: courbes des résultats du diagnostic qualitatif du VHB par PCR en Temps Réel ..... 36 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page x Liste des abréviations AA : Acide Aminé ADN : Acide Désoxyribo-Nucléique ADN RC : Acide Désoxyribo-Nucléique relâché circulaire ADNccc : Acide Désoxyribo-Nucléique covalently closed circular (circulaire fermé de façon covalente) AgHBc : Antigène de la capside du Virus de l’hépatite B AgHBe : Antigène e du Virus de l’hépatite B AgHBs : Antigène de Surface du Virus de l’hépatite B ALAT : Alanine Amino -Transférase Anti-HBc : Anticorps dirigé contre la proteine core du Virus de l’hépatite B Anti-HBe : Anticorps dirigé contre la proteine e du Virus de l’hépatite B Anti-HBs : Anticorps dirigé contre la proteine de surface du Virus de l’hépatite B ARN : Acide Ribo-Nucléique ARNm : Acide Ribo-Nucléique messager ARNpg : Acide Ribo-Nucléique pré-génomique CHC : Carcinome Hépato-Céllulaire Ch HBV : Chimpanzee Hepatitis B Virus (Virus de l’hépatite B du Chimpanzé) CTL : Lymphocyte T Cytotoxique DHBV : Duck Hepatitis B Virus (Virus de l’Hépatite B du Canard) DR1 et DR2 : Direct Repeat HSP90 : Heat Shock Protein 90 GiHBV : Gibbon hepatitis B Virus (Virus de l’hépatite B du Gibbon) GoHBV : Gorilla Hepatitis B Virus (Virus de l’hépatite du Gorille) Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page xi HSP90 : Heat Shock Protein 90 INF : Interféron NLS : Nuclear Localization Signal OMS : Organisation Mondiale de la Santé OuHBV : Orang-outan Hepatitis B Virus RE : Réticulum Endoplasmique TLM : Translocation Motif UV : Ultra Violet VHB : Virus de l’hépatite B VHC : Virus de l’hépatite C VHD : Virus de l’hépatite D VIH : Virus de l’immunodéficience Humaine WHBV : Wuoodchuck Hepatitis B Virus (Virus de l’hépatite B de la marmotte) WMHBV : Wooly Monkey Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du singe laineux) YMDD : Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate PCR : Polymerase Chaine Reaction ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay PVD :Pays en Voie de Développement PEV : Programme Elargi de Vaccination KDa : Kilo Dalton PTME : Prévention de la Transmission Mère-Enfant Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page xii INTRODUCTION Des études de prévalence réalisées au cours de ces trente dernières années en zone tropicale, ont montré que les hépatites constituent un problème majeur de santé publique. Depuis mai 2010 elles sont considérées comme la quatrième priorité de santé publique à l’échelle mondiale par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), après l’infection à VIH/SIDA, le paludisme et la tuberculose. L’OMS estime à près de 30% la part de la population mondiale porteuse de marqueurs sérologiques du virus de l’hépatite B (VHB), dont plus de 240 millions sont porteurs chroniques de l’antigène HBs (AgHBs) avec 600 000 décès par an dans le monde, dont la plupart survient dans les pays en développement (OMS, 2013). En Afrique, l’hépatite B chronique est devenue l’une des premières causes de mortalité par le cancer (OMS, 2002) avec plus de 65 millions de porteurs chroniques (Kramvis et Kew, 2007). Le Burkina Faso est classé par l’OMS parmi les Pays à haute prévalence ( 8 %) du virus de l’hépatite B. Il est à forte endémicité avec une prévalence de 14 ,47% de la population générale qui est porteur de l’antigène HBs; une prédominance de 18 ,58% chez les hommes contre 11,60% chez les femmes (Tao et al., 2014). Parmi les modes de transmission du virus de l’hépatite B, la transmission verticale mère-enfant est un fait bien établi (Buffet, 1985). Les voies de transmission varient selon les zones géographiques. Si, dans les pays développés, la prévalence du portage chronique de l’antigène HBs chez les femmes enceintes est inférieur à 1%, sous nos tropiques cette prévalence est supérieur à 10% (Ghaffar et al, 1989). Les facteurs de risque sont observés différemment, même entre pays de forte endémicité : en Asie du Sud –Est, ou la prévalence de l’antigène HBe (AgHBe) chez les femmes enceintes est très élevée, la transmission de la mère infectée à l’enfant est surtout verticale, alors qu’en Afrique Sub –Saharienne, l’AgHBe est moins prévalent chez les femmes enceintes et l’infection survient plutôt par voie horizontale, pendant et après l’accouchement (OMS, 2002; Ranger et al, 2004). Cette transmission horizontale se fait de façon privilégiée dans le per-partum par micro-transfusion materno-fœtale au cours du travail ou par contact avec le sang maternel et les sécrétions génitales lors de la traversée de la filière (Ilboudo et al, 2002). La transmission antepartum est rare, de l’ordre de 10%. L’âge de survenue de l’infection joue un rôle très important dans le portage : les enfants nés de mères atteintes d’hépatite B active ont des risques élevés d’être infectés tôt dans l’enfance et de devenir des porteurs chroniques (Ranger et Denis, 2004; Hou et al, 2005). Ces dernières années, le Ministère de la Santé burkinabè a adopté des stratégies visant la diminution de la transmission du VHB, telles que le renforcement de la prévention des infections dans les structures de soins et des mesures de Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 1 sécurité transfusionnelle, ainsi que l’intégration de la vaccination anti-VHB au Programme Elargi de Vaccination (PEV). Par contre, la vaccination anti-VHB n’est pas utilisée d’une manière systématique pour la protection des femmes. Par ailleurs, la prévalence du VHB au Burkina Faso chez les femmes a été très peu étudiée. (Pietra et al, 2008). Peu d’études se sont intéressées aux facteurs de risques pour la transmission mère-enfant du VHB et l’efficacité de la réponse immune chez les enfants vaccinés. Ainsi, afin de contribuer à la réduction de la transmission verticale du virus de l’hépatite B au Burkina Faso. L’objectif général de notre étude est le diagnostic moléculaire de l’hépatite B chez les femmes enceintes à terme et le risque de transmission verticale de l’infection à l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou. Il s’est agi plus spécifiquement de déterminer la prévalence de l’hépatite B chez les femmes enceintes à l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou; de confirmer la positivité des mères à l’hépatite B par la PCR ; de déterminer le taux d’anticorps anti-VHB par l’ELISA classique chez les enfants après la vaccination et de déterminer le taux de transmission mère-enfant de l’hépatite B. Pour atteindre ces objectifs, notre travail s’articulera autour des points suivants : une revue bibliographique, les matériels et méthodes utilisés, les résultats suivis de leur discussion et enfin une conclusion suivie des recommandations et perspectives. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 2 1. Revue bibliographique Virus de l’hépatite B 1.1. 1.1.1. Historique L’hépatite virale B est une inflammation du foie consécutive à l’infection par le virus de l’hépatite B et s’accompagne parfois d’ictère (jaunisse). L’origine virale de l’hépatite B fut évoquée pour la première fois en 1947 (Borensztejn, 1948). Blumberg a découvert en 1963 une nouvelle lipoprotéine qu’il désigna sous le nom d’antigène « Australia » ; connu plus tard sous le nom d’antigène de surface de l'hépatite B, ou AgHBs. Il publia un article montrant la relation entre cet antigène et l’hépatite (Blumberg et al, 1967). Dane et ses collaborateurs découvrent en 1970 les particules denses, sphériques de 42 nm de diamètre au microscope électronique : « la particule de Dane ». Ces particules constituaient la forme complète et infectieuse du virus de l’hépatite B (Dane et al, 1970). Blumberg reçut en 1976 le prix Nobel de médecine pour la découverte de cet antigène. Au début des années 1980 le génome du virus a été séquencé et les premiers clonages réussis par Pierre Tiollais, a permis la production en masse des vaccins anti-hépatite B par recombinaison génétique (Tiollais et al, 1981). Le VHB devient le chef de file d’une nouvelle classe de virus, les Hepadnaviridae. 1.1.2. Les hepadnaviridae La famille des hépadnavirus (hep pour le tropisme hépatique, et dna pour la nature du génome) regroupe de petits virus à ADN hépatotropes qui se subdivisent en deux genres les orthohepadnavirus et les Avihepadnavirus. Les orthohepadnavirus infectent seulement les mammifères tels que l’homme et expérimentalement, ils peuvent aussi infecter d’autres primates supérieurs tels que les chimpanzés (Dane et al, 1970). Cette famille comprend également des virus trouvés chez les primates (gorille, chimpanzé, gibbon, orang-outan) et chez le singe laineux (Grethe et al, 2000). Les Avihepadnavirus qui regroupent le HHBV (Heron hepatitis B virus), le SGHV (snow goose hepatitis virus) qui infectent respectivement le héron cendré Ardea cinerea et l'oie Anser caerulescens, le STHBV (Stork Hepatitis B virus) infectant la cigogne et enfin le CHBV (Crane Hepatitis B Virus) qui infecte la grue (Schaefer, 2007). Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 3 1.1.3. Morphologie et structure du VHB C’est un virus enveloppé à capside icosaédrique renferment un ADN partiellement double brin. L’enveloppe extérieure de la particule virale (virion) est composée de lipide et la nucléocapside de forme icosaédrique se compose de protéines. Dans le sérum d'un malade en phase active de synthèse virale, trois types de structures sont observées : des sphères de 20 nm de diamètre, non infectieuses, des tubules de 20 nm de diamètre et de 200 à 700 nm de long qui sont un empilement des sphères, non infectieuses, des « particules de Dane» de 42 nm de diamètre, correspondant aux particules virales complètes et infectieuses (Dane et al, 1970). Les virions VHB (particules de Dane) Les virions infectieux VHB ou particules de Dane sont constitués d’une enveloppe lipidique dans laquelle sont insérées les trois protéines de surface du virus : les petites (S ou S-AgHBs), moyennes (M ou M-AgHBs) et grandes (L ou L-AgHBs) protéines d’enveloppe du VHB. La protéine S est le constituant principal de l’enveloppe des particules et un marqueur important de l’infection par VHB (Gilbert et al, 2005) (Fig.1). Figure 1 : Représentation de la particule virale du VHB selon James A. Perkins (2002) (Source :http://www.infectiologie.org.tn) ; Consulté le 05/01/2015 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 4 1.1.4. Le génome du VHB Avec ses 3 200 paires de bases, c'est le plus petit des virus humains à ADN. Il code seulement pour 4 gènes : le gène C, avec une zone pré-C pour la capside ou core constituée de l'antigène HBc de poids moléculaire 21 kDa ; le gène S, avec une zone pré-S1 et une zone pré-S2 pour l'enveloppe constituée d'antigène HBs; le gène P, pour la polymérase, plus précisément l'ADN polymérase, de 90 kDa et le gène X. Quatre gènes dans un si petit génome, cela implique une organisation particulière, très économe : l'ADN viral est circulaire, à 2 brins sur 50 à 80 % de sa longueur, et surtout, ses 3 cadres de lecture sont mis à contribution, de sorte que les gènes se chevauchent, utilisant au mieux les capacités génétiques réduites de ce virus. Le gène P, le plus long des quatre, correspondant aux trois quarts du génome, chevauche ainsi entièrement le gène S et partiellement les gènes C et X (fig. 2). Figure 2 : Organisation du génome du VHB (source :http://www.infectiologie.org.tn) ; Consulté le 05/01/2015 1.1.4.1. La polymérase Le cadre ouvert de lecture codant pour la protéine P, ou polymérase virale, couvre près de 80% du génome des hépadnavirus. Les particules virales ne contiennent qu’une seule protéine Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 5 P par particule (Locarnini, 2004). La polymérase possède 3 domaines fonctionnels impliqués dans la réplication: - l’extrémité N-terminale ou TP (Terminal Protein) permet la liaison covalente de la protéine avec l’extrémité 5’ du brin (-) d’ADN (Locarnini, 2004). - la région ADN polymérase/transcriptase inverse contient un motif peptidique TyrosineMéthionine-Aspartate-Aspartate (YMDD) important pour l’activité de transcription inverse (Schildgen et al., 2010); - le domaine RNAse H est responsable de la dégradation de l’ARN pré-génomique lors de la synthèse du brin (-) de l’ADN viral (Locarnini, 2004). 1.1.4.2. Les protéines de l’enveloppe L’enveloppe des particules virales contient 3 types de protéines de surface codées à partir d’un même cadre ouvert de lecture possédant 3 codons d’initiation de la traduction. La protéine majoritaire (S) de 226 aa et 24 kDa est constituée exclusivement de la région S, commune aux 3 protéines de surface. Elle assure leur ancrage dans la bicouche lipidique de l’enveloppe virale ou dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elles sont synthétisées. La protéine moyenne (M) de 30 kDa possède 55 aa N-terminaux supplémentaires, correspondant à la région Pré-S2. Enfin, la grande protéine (L) de 39 kDa comporte en plus des régions S et Pré-S2, une région Pré-S1 de 108 aa à son extrémité Nterminale (génotype D). Elles possèdent toutes un site potentiel de N-glycosylation situé au niveau de leur domaine commun (Locarnini, 2004). 1.1.4.3. Les protéines HBc et HBe L’antigène du core (AgHBc) est la protéine structurale majeure de la capside. Elle possède une extrémité C-terminale basique permettant sa liaison à l’ADN viral. De plus, l’initiation de la traduction en 5’ de la séquence pré-C, située en amont du gène C et dans le même cadre de lecture, aboutit à la synthèse d’une protéine pré-C. La présence de cette séquence supplémentaire en position N-terminale de la protéine HBc, correspondant à un peptide signal, dirige la protéine vers le RE. Au cours de ce processus, la protéine perd son extrémité C-terminale basique. Finalement, c’est une protéine de 16 kDa, nommée antigène HBe, que l’on retrouve dans le sérum des malades (Locarnini, 2004). Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 6 1.1.4.4. La protéine X (HBx) C’est une protéine de 154 aa et de 17 kDa découverte en 1985 grâce à l’identification d’anticorps dirigés contre des épitopes de celle-ci (Bouchard et Schneider, 2004). C’est un régulateur multifonctionnel qui module la transcription, la transduction du signal, le cycle cellulaire, les voies de dégradation des protéines, l’apoptose et la stabilité génétique en interagissant directement ou indirectement avec des facteurs cellulaires (Tang et al., 2006). Elle permet d’augmenter l’expression des gènes du VHB ainsi que la réplication virale en agissant comme un coactivateur transcriptionnel des facteurs de transcription cellulaire. Ainsi, son inactivation grâce à des méthodes utilisant des ARNs interférents diminue la transcription et la réplication du VHB. De ce fait, le développement d’antiviraux ciblant la protéine X pourrait en théorie permettre de limiter la réplication virale et de diminuer le développement de CHC associés au VHB (Bouchard et Schneider, 2004; Yang et Cho, 2013) 1.1.5. La réplication Le cycle de vie du virus de l'hépatite B est complexe. L'hépatite B est l'un des rares virus connus en dehors des rétrovirus qui utilise la transcription inverse dans le cadre de son processus de réplication. Le virus parvient à se fixer sur la cellule en se liant à un récepteur situé sur la surface de la cellule et entre par endocytose. L'ADN du génome viral doit être transféré dans le noyau de la cellule hôte par des protéines appelées chaperones moléculaires. Dans le noyau de l’hépatocyte, l’ADN viral se circularise en cccDNA (cccDNA pour covalently closed circular DNA appelé aussi supercoiled DNA), pour ADN surenroulé ou torsadé. Cet ADN surenroulé est une sorte de minichromosome détecté dans le noyau où il sert de matrice pour la transcription d'ARN viraux de différentes tailles : le plus long de ces transcrits, qui contient toute l'information génétique du virus, est un "progénome", tandis que des transcrits plus courts sont les ARN messagers correspondant aux 4 gènes du virus et sont bientôt traduits en protéines virales. Ultérieurement, le progénome ARN est encapsidé par l'antigène HBc avec l'ADN polymérase qui, fonctionnant comme RT, douée également d'une action ARNase H, fabrique, à partir de ce progénome d'ARN, le génome d'ADN définitif et digère le progénome. Cette opération est très particulière aux hepadnavirus et à un virus des plantes, le virus de la mosaïque du chou-fleur. Elle n'est pas identique à la rétro-transcription du VIH car, si l'on observe parfois de l'ADN viral intégré dans l'ADN cellulaire, cette intégration n'est pas indispensable, ni à la réplication du VHB en phase active, ni à son pouvoir cancérigène. Le VHB, contrairement au VIH, ne code pas d'intégrasse. Cependant, il y a une homologie de séquence entre VIH et VHB, dont la polymérase partage le site Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 7 catalytique caractérisé par la séquence Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate (YMDD) (Fig.3). Figure 3: Schéma simplifié de la réplication du VHB (Lucifora et Zoulim, 2007) ; Source :www.google.com ; Consulté le 03/04/2015 Légende 1. Entrée virale 2. Libération du génome dans le noyau et formation de l’ADNccc 3. Transcription du génome viral 4. Réplication du génome viral 5. Assemblage et excrétion 1.1.5.1. L’entrée virale La première étape pour l’infection par le VHB est l’attachement de la particule infectieuse à une structure exposée accessible à la surface des hépatocytes de l’hôte. Ce premier contact est souvent décrit comme réversible, de faible affinité et rapide. L’attachement initial et la reconnaissance du récepteur spécifique contribuent à la spécificité de l’hôte et au tropisme Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 8 cellulaire. Il nécessite cependant le domaine Pré-S1 de la grande protéine (L) de surface. La myristylation de cette protéine serait essentielle à l’infectivité des particules virales (Glebe et Urban, 2007). Grâce à cette interaction, les virions seraient internalisés lentement (jusqu’à 16 heures) dans les hépatocytes par endocytose pH indépendant (Chojnacki et al, 2005). Une autre étude suggère un rôle crucial des motifs de translocation (TLM) dans la voie de l’endocytose (Stoeckl et al, 2006). 1.1.5.2. Transport des nucléocapsides VHB au noyau Les nucléocapsides, relargués dans le cytoplasme des hépatocytes empruntent le réseau de microtubules (MT) pour atteindre le centre organisateur des microtubules ou microtubule organizing center (MOTC) à proximité du noyau et des pores nucléaires. Une fraction des protéines de capsides expose à la surface des nucléocapsides le domaine C-terminal portant le NLS (Séquence de Localisation Nucléaire) (Rabe et al, 2006). Cette séquence NLS interagit avec les importines α (Imp α) pour former un complexe nucléocapside VHB-imp α puis l’importine β (Imp β) lie ce complexe ce qui favoriserait le contact avec le pore nucléaire et entraînerait sa translocation dans le pore nucléaire (Kann et al, 2007). Après dissociation des importines α et β, les nucléocapsides VHB se désassemblent en dimères d’AgHBc à l’intérieur du pore et libèrent le génome viral dans le noyau cellulaire (Rabe et al, 2009). Les protéines de capside diffusent dans le noyau et se réassemblent en capsides vides lorsqu’elles atteignent une concentration critique (Kann et al, 2007). 1.1.5.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc Dans les hépatocytes infectés, l’ADN-RC est immédiatement transformé en une forme circulaire double brin stable et persistante appelé ADNccc par les enzymes cellulaires. L’ADNccc prend la forme d’un minichromosome viral qui sert de matrice pour la transcription des gènes viraux. La conversion de l’ADN-RC en ADNccc résulte de la complétion du brin (+) par la polymérase virale, de la dégradation de l’oligoribonucléotide fixé en 5’ du brin (+) et de la ligation des extrémités du brin (+). La polymérase virale liée au brin (–) de façon covalente est ensuite éliminée tout comme la partie redondante située sur le brin (-). Enfin, le surenroulement nécessaire à la formation finale de l’ADNccc est assuré par les histones et les protéines de la capside (Nassal, 2008). Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 9 1.1.5.4. La transcription La transcription des ARN viraux messagers et de l’ARN pré-génomique est réalisée par l’ARN polymérase II cellulaire à partir de l’ADNccc. Tous les transcrits VHB sont coiffés en 5’ et polyadénylés en 3’ à une position commune. La polyadénylation est dirigée par un signal unique non-canonique situé dans l’ORF préC/C. La transcription des gènes VHB est contrôlée par 4 promoteurs viraux et deux régions « enhancers ». Il a été observé que cette étape de transcription était régulée aussi par des phénomènes épigénétiques tels que le statut d’acétylation des histones H3 et H4 liés à l’ADNccc et par le recrutement des acétyltransférases cellulaires (p300 et CBP), et des désacétylases cellulaires (HDACI) (Levrero et al, 2009) Le promoteur C localisé dans l’ORF X dirige la synthèse des ARNm pré-C et pré-génomique (pg) de 3,5 kb. La polyadénylation des ARNm préC et ARNpg n’a lieu qu’au deuxième passage de la polymérase cellulaire au niveau du signal de polyadénylation (Kay et Zoulim, 2007; Nassal,2008). Par conséquent, l’ARNpg contient l’ensemble de l’information génétique virale, ainsi qu’une région redondante terminale de 120 nt contenant une deuxième copie de la séquence DR1 (Direct repeat 1), le signal d’encapsidation ε en épingle à cheveux, et la queue polyA. L’ARNpg est encapsidé avec la polymérase virale, des kinases cellulaires et des protéines chaperonnes (hsp90, hsp60 et p23) pour permettre le repliement correct de la polymérase virale et son interaction avec les protéines de capside. Le promoteur S1 dirige la synthèse de l’ARNm préS1 de 2,4 kb qui code la protéine d’enveloppe L-AgHBs. Les transcrits sous génomiques de 0,7 kb sont sous le contrôle du promoteur X et permettent la synthèse de la protéine X (Beck et Nassal, 2007). 1.1.5.5. La traduction Tous les transcrits VHB coiffés et polyadénylés recrutent les facteurs eucaryotes d’initiation de la traduction (eIF) indispensables à la liaison des ribosomes aux extrémités 5’ des ARNm VHB. La traduction active de la protéine préC à partir d’un AUG en amont du signal d’encapsidation ε de la région 5’ de l’ARNm préC empêche l’interaction de la polymérase et ε et par conséquent l’encapsidation de l’ARNm préC. Les ARNm sont traduits dans le cytoplasme au niveau du réticulum endoplasmique (RE) en différents produits viraux capables de s’assembler en de nouvelles particules virales. Une partie de l’encapsidation se ferait par réassemblage des dimères d’AgHBc obtenus après la dissolution à l’entrée du noyau. Au sein Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 10 de la capside, la polymérase possède différentes activités enzymatiques pour convertir l’ARNpg en ADN RC (Rabe et al, 2009). 1.1.5.6. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale Les nucléocapsides contenant l’ADN RC peuvent avoir deux devenirs : soit elles interagissent avec les protéines de l’enveloppe insérées dans la membrane du RE, pour conduire à la formation de virions infectieux et à leur sécrétion par exocytose (Watanabe et al, 2007), soit elles vont être redirigées vers le noyau de l’hépatocyte afin de maintenir ou d’amplifier le pool d’ADNccc nucléaire (Niedre et al, 2013). 1.1.6. Modes de transmission du VHB Les modes de transmission sont identiques à ceux du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), mais le virus de l’hépatite B est 50 à 100 fois plus infectieux. Le virus de l’hépatite B peut survivre à l’extérieur du corps pendant au moins 7 jours. Durant ce laps de temps, il reste capable d’occasionner une infection s’il pénètre dans l’organisme d’une personne non protégée par le vaccin. La période d’incubation de cette maladie est de 75 jours en moyenne, mais peut varier de 30 à 180 jours. Le virus peut être détecté 30 à 60 jours après l’infection et persiste sur des durées variables. Les modes de contamination du virus sont : les voies sanguines (transfusion, toxicomanie), les voies sexuelles (homo et hétérosexuelle),la voie Materno-fœtale ou périnatale, les transplantations d'organes. 1.1.6.1. La transmission sexuelle L’hépatite B est une maladie sexuellement transmissible. Le risque de contamination par voie sexuelle peut varier de 30 à 80%. Il augmente avec le nombre de partenaires sexuels, les autres infections sexuellement transmissibles (IST), et le type de rapports notamment les rapports anaux réceptifs. Ce mode de contamination est surtout observé en zone de faible endémie où la contamination survient principalement à l’âge adulte (Liaw et Chu, 2009). 1.1.6.2. La transmission parentérale Ce mode de transmission représente 10 à 30% des infections à l’hépatite B et est due à une virémie importante et élevée. Cependant 25% des infections sont représentés par les toxicomanes, les polytransfusés, les hémodialysés, les tatouages, les piercings et affectent le personnel de santé. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 11 1.1.6.3. La transmission mère- enfant (verticale) Elle est exceptionnelle dans l’utérus, mais le plus souvent au moment de l’accouchement et au post natale. Dans les zones de forte endémicité comme l'Afrique subsaharienne, le virus de l’hépatite B se transmet généralement à la naissance, de la mère à l’enfant, ou dans la petite enfance, faisant de l’infection périnatale le principal mode de transmission. Pour la transmission mère-enfant, une charge virale élevée (> 108 copies/ml), une maternité précoce, un travail long et difficile ; une infection intra-utérine sont autant de facteurs pouvant favoriser la transmission du virus de l’hépatite B (Borgia et Gentile, 2014). 1.1.6.4. La transmission horizontale Un tiers (1/3) des infections est intrafamiliale c'est-à-dire la transmission d’un enfant à un autre. La transmission du VHB d’un enfant à un autre est le cas le plus fréquent. Cette transmission se produit habituellement à domicile, mais aussi dans les crèches et à l’école. Elle résulte le plus souvent du contact de lésions cutanées ou de muqueuses avec du sang ou des sécrétions de plaies. Le virus peut également être transmis par contact avec la salive à la suite de morsures ou autres effractions cutanées et à la suite de la pré-mastication des aliments. En outre, le virus peut être transmis par des objets, comme des serviettes ou des brosses à dents partagées, car il peut survivre au moins sept jours hors de l’organisme et se déposer en forte concentration sur les objets, même en l’absence de sang visible (OMS, 2002). La probabilité qu’une infection par le virus de l’hépatite B devienne chronique dépend de l’âge auquel est contractée cette infection. Ce sont les enfants de moins de 6 ans infectés par le VHB qui ont la plus forte probabilité de devenir porteurs chroniques: 80 à 90% des nourrissons infectés au cours de la première année de vie seront atteints d’une infection chronique; 30 à 50% des enfants infectés entre un et quatre ans seront atteints d’une infection chronique. Chez les adultes: moins de 5% des adultes par ailleurs en bonne santé infectés par le virus de l’hépatite B seront atteints d’une infection chronique: 15 à 25% des adultes ayant contracté une infection chronique pendant l’enfance meurent d’un cancer ou d’une cirrhose du foie liés à l’hépatite B. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 12 1.1.7. Histoire naturelle de l’infection par VHB Figure 4 : Schémas montrant l'histoire naturelle du VHB Source : cours de 1.1.7.1. Consulté le 06/02/2015 Tropisme cellulaire Le VHB est un virus essentiellement hépatotrope. L’hépatocyte est le principal site de réplication pour l’ensemble de la famille des Hepadnaviridae. En effet, l’ADN viral et les antigènes viraux sont retrouvés d’une façon prédominante dans les cellules hépatiques qui contiennent toutes les formes réplicatives de l’ADN viral (Fattovich et al, 2008). 1.1.7.2. Pathogenèse L’infection par le VHB est à l’origine d’atteintes hépatiques aiguës ou chroniques qui peuvent évoluer vers la cirrhose et le CHC. Le virus n’est pas directement cytopathogène, c’est la réponse immune qui induit les lésions hépatiques chez les patients. Au cours de l’infection par le VHB, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisent l’apoptose des hépatocytes infectés et activent en parallèle une série de réactions inflammatoires dues à la production du facteur de nécrose tumoral (TNF), des radicaux libres, ou des protéases. Ces réactions exacerbent la mort hépatocellulaire et aboutissent à l’apparition de foyers d’inflammation nécrotiques dans Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 13 le foie. Les lésions hépatiques s’accompagnent d’une régénération active des hépatocytes. Ces deux processus multiplient par 100 le risque de cancer du foie chez les patients infectés (Ganem et Prince, 2004). 1.1.7.3. Profils sérologiques Le diagnostic d’une hépatite aigue est fondé sur la présence dans le sang de l’AgHBs et des Ac anti-HBc de type IgM dans un contexte cytolytique hépatique. L’AgHBs est le premier marqueur détecté dans le sérum, il apparait pendant la période d’incubation, en moyenne de deux semaines à trois mois après le contact (figure 5). Cette phase d’incubation correspond à la fenêtre immunologique silencieuse dont la durée est estimée à 56 jours et pendant laquelle le VHB est indétectable par les tests sérologiques classiques. Les Ac anti-HBc totaux apparaissent 2 à 4 semaines après l’AgHBs, pendant la phase aigue de la maladie. L’AgHBe apparait peu de temps après l’AgHBs puis disparait rapidement (sa persistance au-delà de trois semaines serait un indicateur de passage à la chronicité) (figure 5). Lors de la phase aigüe de l’hépatite, environ 1013 virions sont produits par jour et la charge virale peut atteindre 1010 copies de génome/ml de sérum. La recherche de ces deux marqueurs de multiplication virale n’est pas utile au cours de l’hépatite aigüe. Figure 5: Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l'infection au VHB (http:t2.gstatic.com/images) Consulté le 28/02/2015 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 14 1.1.7.4. Hépatite aiguë L'hépatite B aiguë, peu fréquente, correspond à une inflammation récente avec une période d'incubation de 1 à 4 mois. Elle se présente sous différentes formes : - une forme asymptomatique ou anictérique dans 70% des cas environ. - une forme symptomatique dans 30% des cas environ. La maladie commence par une altération de l'état général, une légère fièvre, des douleurs, le tout évoquant un état grippal ainsi que des troubles digestifs, une perte d'appétit, des nausées, des vomissements. L'ictère apparaît plus tard permettant d'affirmer le diagnostic. On note parfois un prurit comme dans toutes les formes d'hépatite dont il peut être le premier signe. La maladie dure quelques semaines, puis la plupart des personnes touchées présentent une amélioration progressive. - une forme fulminante: 1 à 2% des cas environ. Les patients présentent des taux de prothrombine <45% et des signes neurologiques d'insuffisance hépatique. Cette forme est létale dans 90% des cas. Chez l'adulte, la guérison survient dans plus de 95% des cas et ils sont immunisés à vie contre la maladie. 1.1.7.5. Hépatite chronique L'infection chronique est définie par la persistance de l'antigène HBs pendant plus de 6 mois après la contamination virale. Elle correspond tout simplement à une inflammation qui dure depuis plus de 6 mois. L’infection chronique par le VHB présente cinq phases distinctes : la phase de tolérance immunitaire, la phase de clairance immunitaire, la phase de portage inactif, l’hépatite B chronique AgHBe négative et la phase AgHBs négative (Hoofnagle et al, 2007). La phase de tolérance immunitaire est caractérisée par la présence de l’AgHBe, par une importante réplication virale (ADN VHB) et des lésions hépatiques minimes (transaminases normales). Cette phase est plus fréquente et plus longue chez les patients infectés pendant la période périnatale ou la première année de vie. Pendant cette phase, la contagiosité est élevée (Fattovich et al., 2008). La phase de clairance immunitaire est définie par la présence de l’AgHBe, la diminution de la réplication virale, l’augmentation de la réponse immunitaire avec augmentation des transaminases et des lésions inflammatoires. Le taux de séroconversion AgHBs-Ac Anti-HBs augmente. Cette phase est plus fréquente chez les patients infectés à l’âge adulte. La durée de Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 15 cette phase ainsi que la sévérité des lésions hépatiques qu’elle engendre sont corrélées avec le risque de progression vers la cirrhose et le CHC (Ikeda et al, 2009; Chan et al, 2011). La phase de portage inactif de l’AgHBs suit la séroconversion AgHBe en Ac Anti-HBe. Elle se caractérise par un taux d’ADN viral très faible ou indétectable, des transaminases normales. L’évolution est bonne avec un très faible risque de cirrhose et de CHC (Fattovich et al, 2008). Evolution vers une cirrhose: La cirrhose représente environ 20 % des évolutions naturelles des hépatites chroniques. Une forte consommation d'alcool, supérieure à 20 grammes par jour pour les femmes et supérieure à 30 grammes par jour pour les hommes, est un facteur de risque important dans le développement d'une cirrhose. Evolution vers l'hépatocarcinome : le virus de l'hépatite B est un puissant carcinogène. Le risque de développer un hépatocarcinome est multiplié par 100 chez les porteurs VHB. Après vaccination contre le VHB, il a été démontré une diminution de la fréquence d'apparition de carcinomes hépatocellulaires. 1.1.8. Epidémiologie du VHB L’hépatite B (VHB) se retrouve partout dans le monde. On estime que plus 2 milliards de personnes ont été infectées par le VHB dans le monde. Parmi elles, près de 240 millions présentent une infection chronique et sont exposées à un risque de maladie grave par cirrhose ou cancer du foie et près de 600 000 décès par an dans le monde (OMS, 2013). L’homme est le seul réservoir du VHB. Une proportion importante (7 à 40%) de sujets HBs Ag-positifs peut également être porteuse de l’antigène e de l’hépatite B (HBe Ag), qui est associé à une forte infectiosité. La plupart des enfants nés de mères HBe Ag-positives vont présenter une infection chronique. L’endémicité de l’hépatite B est illustrée par la prévalence de l’antigène HBs dans la population générale d’une zone géographique donnée et elle montre des variations considérables dans le monde. Les prévalences de l’HBs Ag ≥8% sont typiques des zones de forte endémie, telles que l'Afrique sub-saharienne, l'Asie du Sud-Est et le bassin amazonien. Des prévalences de 2 à 7% se retrouvent dans les zones d’endémie moyenne, que sont l’Europe du Sud et de l’Est, le bassin méditerranéen. Le Moyen-Orient, une partie de l'Amérique Centrale et de l'Amérique du Sud, les prévalences de l’HBs Ag <2% sont typiques des zones de faible endémie telles que l'Amérique du Nord, l'Europe occidentale et du Nord, l’Australie et la Nouvelle Zélande où le taux de porteurs chroniques du VHB est inférieur à Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 16 2% (fig.6). Dans ces régions, le pourcentage de porteurs chroniques peut cependant être plus élevé parmi les populations dites à risques, notamment les toxicomanes, les homosexuels, les sujets à partenaires multiples, les professionnels de la santé (OMS, 2013). L’hépatite B constitue la cinquième cause de cancer le plus fréquent dans le monde (Zhou et al, 2012). Dans les zones de forte endémie, le VHB est très communément transmis de la mère à l’enfant à la naissance, ou d’un enfant à l’autre au cours de la petite enfance. Au Burkina Faso, des études ont montré que les prévalences de l’AgHBs chez les donneurs de sang de premier don en zones rurale et urbaine étaient respectivement de 13,0% et 16,2% à Ouagadougou, 10,9% et 11,5% à Bobo Dioulasso, 17,9% et 19,8% à Fada N’gourma et de 13% et 19% à Koudougou (Nagalo et al, 2011). Figure 6 : Répartition géographique de l'infection au VHB dans le monde (Source : www.google.com) ; Consulté le 03/05/2015 1.1.9. Diagnostic du VHB chez l’homme Il n’est pas possible de distinguer l’hépatite B des hépatites provoquées par d’autres agents viraux sur le plan clinique, aussi, il est indispensable de confirmer le diagnostic en laboratoire. Plusieurs tests sanguins sont disponibles pour diagnostiquer et surveiller les personnes atteintes d’une hépatite B. Ils peuvent aussi servir à différencier les infections aiguës des infections chroniques. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 17 1.1.9.1. Diagnostic clinique L’examen clinique, chez un porteur chronique de l’hépatite B, est normal, si ce n’est l’existence d’une asthénie modérée dans certains cas. Dans le cas d’une hépatite chronique active, certains symptômes peuvent apparaître. Ce sont une petite fièvre, une augmentation du volume du foie et/ou de la rate (hépatomégalie et/ou splénomégalie), des poussées ictériques (symptômes d’allure pseudo-grippale : céphalées, douleurs articulaires et musculaires, mais aussi nausées, diarrhée, urines foncées) et des manifestations extra-hépatiques, dues aux dépôts de complexes immuns (ex : péri artérite noueuse). En cas de cirrhose, des signes cliniques d’insuffisance hépatocellulaire et d’hypertension portale sont constatés. 1.1.9.2. Recherche des marqueurs sérologiques 1.1.9.2.1. Marqueurs directs Antigènes viraux Les antigènes du virus à savoir AgHBc de la capside est indétectable dans le sérum tandis que les AgHBs et AgHBe sont mis en évidence dans le sérum par des techniques immunoenzymatiques chez les sujets porteurs du virus. L'élément essentiel du diagnostic d'une infection par le VHB en cours repose sur la mise en évidence dans le sérum de l'AgHBs. L’AgHBe est recherché dans le bilan d’une hépatite chronique (Bottero et al, 2013). Détection et quantification de l’ADN du VHB L’ADN du VHB peut être détecté et éventuellement quantifié dans le sérum, soit par des techniques d’hybridation au moyen de sondes spécifiques, soit par amplification génique. Les techniques d’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) du génome viral sont les plus sensibles et permettent également après séquençage de révéler des variants ou mutants. La quantification permet de suivre l'évolution de la charge virale. Différentes techniques sont actuellement proposées (Valsamakis, 2007): - L’ADN branché : Quantitex HBV DNA assay (bDNA), Laboratoires Bayer (seuil de détection 3,3x103 copies/mL) ; Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 18 - La PCR : Cobas AmplicorTM HBV MONITOR Test, Roche Diagnostics (2x102 copies/ml) ; - Les PCR en temps réel : Real Time TM HBV PCR Kit, Laboratoires Abbott (4 IU/ml) et Real Time PCR System Cobas TaqMan 48, Roche Diagnostics (35 copies/ml) ; -Kit d’amplification : ‟HBV Real-TM Qual ” (Sacace biotechnologie, ,Como, Italy). 1.1.9.2.2. Marqueurs indirects Les anticorps Le diagnostic sérologique permet la recherche et éventuellement la quantification des anticorps dirigés contre les différents antigènes viraux : anticorps anti-HBs, anticorps antiHBc totaux et de type IgM, anti-HBe (Bottero et al, 2013). 1.1.10. Méthodes d’étude de la variabilité du VHB et diversité du génome du VHB 1.1.10.1. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour différencier les génotypes du VHB, le choix de la technique dépend de l’objectif des études menées. Le Séquençage et l’analyse phylogénétique décrite par Yeh et al, en 2004 compare des séquences obtenues sur le génome entier et dans la région du gène S et montre que les séquences dans la région S permettaient également d’identifier précisément les génotypes de A à H. L’analyse par polymorphisme de restriction (restriction fragment length polymorphism : RFLP) décrite par Wu et al, en 2012 repose sur la différence de taille d’amplicons du gène S après digestion enzymatique. L’utilisation d’amorces spécifiques développée par Naito et al, en 2001 repose sur l’existence d’une divergence intergroupe de la séquence nucléotidique au niveau d’une région conservée des gènes préS1/S. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 19 1.1.10.2. Diversité génétique du VHB Durant la dernière décennie, la classification selon les sérotypes a progressivement été remplacée par celle des génotypes. Cependant, les sérotypes sont corrélés aux génotypes bien qu’ils puissent être trouvés avec plusieurs génotypes. Les études phylogénétiques menées à partir des séquences nucléotidiques de différents génomes viraux ont permis de classer provisoirement le VHB en 10 génotypes allant de A à J (Tatematsu et al, 2009). Les génotypes du VHB sont définis par une divergence d’au moins 8 % de la séquence nucléotidique du génome entier et d’au moins 4,1 % dans le gène S (Norder et al, 2004). Les principaux génotypes ont été divisés en sous génotype à partir d’analyses phylogénétiques et ils sont définis par la divergence comprise entre 4,1 % et 8 % de leur séquence nucléotidique complète (Schaefer, 2007). La distribution géographique et épidémiologique des génotypes du VHB est continuellement recherchée dans différentes parties du monde. A partir des différentes données accumulées, il a été observé que chaque génotype/sous génotype a une distribution géographique spécifique. Ainsi : Le génotype A est ubiquitaire mais prédomine en Europe du Nord-ouest, en Amérique du Nord et en Afrique Centrale. Le génotype A est le seul génotype prédominant en Afrique de l’Est où la prévalence des autres génotypes est inférieure à 5% (Kurbanov et al., 2010). Il a été divisé en 6 sous génotypes allant de 1 à 6. Le sous génotype A1 est prédominant en Afrique, Asie et en Indonésie (Kramvis et Kew, 2007), A2 est prévalent en Europe du Nord Ouest (McMahon, 2009) et A3–A6 sont trouvés en Afrique centrale et en Afrique de l’Ouest (Kramvis et Kew, 2007; Pourkarim et al, 2010). Les génotypes B et C sont principalement trouvés en Asie et dans les îles du pacifique et sont divisés en 8 sous génotypes chacun. B1 et C2 sont prévalent au Japon, en Corée et au Nord de la Chine, C2 est trouvé en Alaska, alors que B2 et C1 sont prévalent au Sud de la Chine, Taiwan et Asie du Sud Est (McMahon, 2009) B3–B5 et B7-B8 comme C3–C8 sont prédominants dans le pacifique, B6 est prévalent en Alaska, au Nord du Canada et au Groenland (Chan et al, 2011; Mulyanto et al, 2009) . Le génotype D subdivisé en 7 sous génotypes est endémique mais très fréquent sur le pourtour du bassin méditerranéen et au Moyen-Orient. Il est le seul génotype prédominant en Asie de l’Ouest. D1 est fortement prévalent en Asie central, dans le pourtour du bassin méditerranéen mais aussi en Inde et en Afrique de l’Est (Banerjee et al, 2006). D2 est prévalent en Europe de l’Est incluant la Russie et la région de la Baltique, D3 est distribué en Russie, au Nord de Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 20 l’Inde, au Pakistan et est fréquemment retrouvé chez les toxicomanes à travers le monde (Tallo et al, 2008). D5 a été caractérisé à l’Est de l’Inde (Chandra et al, 2009). D4 et D6 sont endémiques en Océanie et en Indonésie respectivement (Lusida et al, 2008). D7 a été isolé en Tunisie (Meldal et al, 2009). D8 a été caractérisé au Niger (Chekaraou et al, 2010). Le sous génotype D9, un nouveau recombinant D/C, a été retrouvé en Inde orientale (Ghosh et al, 2013) L’Afrique de l’ouest est le foyer principal du génotype E (Norder et al, 2004). Le génotype F est prédominant en Amérique Latine et Centrale, F1 a été trouvé en Alaska, à Mexico, en Amérique central et a été disséminé au Pérou et en Argentine, alors que F2–F4 sont prévalent en Amérique du Sud (Devesa et al, 2008). Le génotype G a été identifié aux Etats-Unis et en France (Stuyver et al, 2000). C’est le seul génotype qui semble ne pas être associé à un foyer principal. Le génotype H a été décrit chez les Amérindiens en Amérique Centrale et aux USA (Arauz et al, 2002). Un neuvième génotype provisoire I a été identifié en Asie et au Vietnam (Olinger et al, 2008). Récemment le dixième génotype provisoire J a été signalé au Japon (Tatematsu et al, 2009). Cependant, de nombreux génotypes hybrides ont été observés dans certaines régions du monde : A/C au Vietnam, C/D au Tibet, A/D en Afrique ou B/C en Asie. Des recherches supplémentaires sont donc nécessaires afin de déterminer si les échanges entre génotypes sont la conséquence d’une recombinaison génétique directe entre deux souches virales ou si elles sont la conséquence d’une adaptation rapide du VHB à un environnement génétique et immunologique particulier associé à certaines populations humaines (Schaefer, 2007). 1.1.11. Traitement et prévention L'hépatite B aiguë ne se traite pas. Quant à L'hépatite fulminante, elle requiert la transplantation. Le but du traitement de l'hépatite chronique B est la suppression de la réplication virale, l’ADN viral sérique, indétectable, normalisation de la transaminase, la séroconversion HBe, la diminution des troubles hépatiques, si possible avant que le stade de cirrhose ne soit atteint. Des stratégies antivirales ont été élaborées selon trois voies : les analogues de nucléos(t)ides, les immuno-modulateurs et la vaccinothérapie. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 21 1.1.11.1. Les analogues de nucléosides/nucléotides de la transcriptase inverse Le traitement actuel de l’hépatite chronique par des analogues de nucléosides/nucléotides à l’âge adulte réduirait le risque de complication à long terme. Ces analogues de nucléosides et nucléotides appartiennent à 3 classes que sont les L-nucléosides (lamivudine, telbivudine et emtricitabine), les analogues de la déoxyguanosine (entécavir) et les nucléosides acycliques phosphanates (adéfovir et tenofovir). Parmi ces traitements antiviraux, la lamivudine et l’adéfovir (capable d’inhiber la réplication virale chez les patients atteints d’hépatite chronique et d’induire une importante séroconversion de l’AgHBe selon (Hadziyannis et al., 2005) connaissent des taux de résistance qui croissent par année de traitement. L’entécavir n’induit que très peu de résistance, même après 4 ans de traitement et a une activité antivirale plus importante que la lamivudine (Zhang et al,2011; Kumada et al, 2013). Des études cliniques ont montré que la telbivudine a une efficacité antivirale supérieure à la lamivudine et que le ténofovir utilisé aussi chez les patients coinfectés VIH/VHB qui recevaient déjà un traitement par la lamivudine ou l’emtricitabine dans le cadre de leur trithérapie antirétrovirale hautement active (HAART) (Kumada et al, 2013) permet de réduire la multiplication virale présente très peu ou pas de résistance . La telbivudine et le ténofovir sont les deux antiviraux recommandés au dernier trimestre chez les femmes enceintes. 1.1.11.2. Les traitements « immuno-modulateurs » ou interférons Actuellement préféré aux interférons conventionnels, l’interféron-α constitue aujourd’hui la base du traitement de première intention. Il a une activité antivirale et immunomodulatrice en augmentant l’action de certaines cellules du système immunitaire. Il ralentit ou arrête la fibrose, favorise une moindre fréquence de survenue de la cirrhose et peut entraîner une séroconversion de l’AgHBe ( Zhijian et al, 2010; Liang et al, 2011). Une étude récente vient de montrer que l'hétérogénéité dans la région promotrice du gène de l'IL-10 joue un rôle important dans la détermination de la réponse initiale de l'hépatite B chronique à l'IFNthérapie (Wang et al, 2011). 1.1.11.3. La vaccinothérapie L’intérêt de la vaccinothérapie associée à un traitement antiviral est suggéré par certaines études mais son effet reste inconstant. Une meilleure connaissance des réponses T antivirales Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 22 devrait permettre de mieux sélectionner les patients pouvant bénéficier de ces traitements. Les différentes expérimentations visant à induire une rupture de tolérance immunitaire par le biais d'une vaccinothérapie spécifique sont prometteuses et indiquent que cette approche pourrait être efficace (Zhang et al, 2011). 1.1.11.4. Stratégies de vaccination contre l’hépatite B L’objectif principal des stratégies de vaccination contre l’hépatite B est par conséquent de prévenir les infections chroniques par ce virus. Les stratégies de vaccination contre l’hépatite B comprennent : La vaccination systématique des nourrissons : Dans les pays à moyenne ou forte endémicité de l’infection à VHB, la vaccination systématique des nourrissons contre l’hépatite B est prioritaire parce que la plupart des infections chroniques sont contractées pendant la petite enfance. La vaccination systématique des nourrissons est également une priorité élevée dans les pays à faible endémicité car c’est la seule stratégie permettant d’éviter l’infection de toutes les classes d’âge (enfants, adolescents et adultes). La prévention de la transmission périnatale du VHB : afin de prévenir la transmission périnatale du VHB, la première dose de vaccin anti- hépatite B doit être administrée aussitôt que possible après la naissance, de préférence dans les 24 heures qui suivent l’accouchement. La stratégie la plus facile à adopter pour prévenir la transmission périnatale du VHB consiste à administrer une dose du vaccin à tous les nouveau-nés. Une autre stratégie consiste à dépister le HBsAg chez la femme enceinte et à vacciner à la naissance les enfants de femmes infectées par le VHB. Des études menées par Degli en 2011 et Kumar en 2012 ont montré que l’injection de l’immunoglobuline (HBIG) de l’hépatite B (immunoprophylaxie passive) associé à la première dose de vaccin VHB réduisaient le risque de transmission verticale dans les pays à haute prévalence du VHB. La vaccination adulte pour les sujets plus âgés : les groupes cibles de cette vaccination se composent des jeunes adolescents et les personnes exposées à des facteurs de risque. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 23 2. OBJECTIFS DE L’ETUDE 2.1. Objectif général Contribuer à la réduction de la transmission verticale du virus de l’hépatite B au Burkina Faso. 2.2. Objectifs spécifiques Déterminer la prévalence de l’hépatite B chez les femmes enceintes au centre médical saint Camille ; Confirmer la positivité des mères à l’hépatite B par la PCR ; Déterminer le taux d’anticorps anti-VHB par l’ELISA chez les enfants après la vaccination ; Déterminer le taux de transmission mère-enfant de l’hépatite B. 3. MATERIEL ET METHODES Cadre d’étude 3.1. L’étude s’est déroulée à Ouagadougou, la capitale du BURKINA FASO Au laboratoire du l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO) qui est une structure sanitaire de la congrégation des Pères camilliens située dans le district sanitaire de Bogodogo. C’est un site de surveillance épidémiologique qui est également considéré par le ministère de la santé du Burkina Faso comme un centre de référence en matière de santé publique et plus spécifiquement de santé maternelle et infantile. L’HOSCO comprend une maternité, un service de pathologie néonatale, un service de pédiatrie, un service de santé maternelle et infantile (SMI), un dispensaire adulte, un dépôt pharmaceutique, un cabinet dentaire, un service d'imagerie médicale avec tomodensitométrie, des consultations spécialisées et un laboratoire d'analyse (parasitologie, bactériologie, biochimie, hématologie, sérologie, immuno-virologie, biologie moléculaire). Nos prélèvements ont été faits à la maternité pendant la période de l’accouchement et au laboratoire six mois après l’accouchement. Les analyses sérologiques ont été effectuées au laboratoire du HOSCO. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 24 Les échantillons ont été acheminés dans le laboratoire du centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) où les tests ELISA et moléculaires (PCR) ont été réalisés. C’est également un centre de recherche qui a comme objectif principal, de promouvoir le développement de la santé au Burkina Faso et en Afrique par la formation de jeunes médecins, pharmaciens et biologistes. Il possède un plateau technique moderne pour les recherches fondamentales, pharmacologiques, de biologie et génétique moléculaires. 3.2. Matériel 3.2.1. Réactifs Les tests de diagnostic rapide (TDR) pour VHB, VHC et VHC ont été réalisés à l’aide du kit ABON Biopharm, (ABON Biopharm, Hangzhou, Chine) Réactif pour le dosage des anticorps anti HBs - Kit ELISA : ‟HBsAb Quantitative EIA” (ACON Laboratories®, San Diego, USA) Réactifs pour le diagnostic moléculaire de VHB - Kit d’extraction de l’ADN : ‟ Ribo Virus ” (Sacace biotechnologies®, Como, Italy) - Kit d’amplification : ‟ HBV Real-TM Qual ” (Sacace biotechnologie, ,Como, Italy) Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 25 3.2.2. Appareillage Cet appareil ci-dessous a servi pour la lecture des plaques ELISA Figure 7: Spectrophotomètre couplé à un ordinateur (Heidolph Titramax 1000, Germany) L’amplification de l’ADN a été réalisée en utilisant l’appareil suivant : Figure 8: Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7. 3 de" Sacace Biotechnologie" Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 26 3.3. Méthodes 3.3.1. Type et période d’étude Il s’agit d’une étude transversale a visée descriptive qui s’est déroulée en trois périodes : du 09 septembre 2013 au 04 février 2014 pour la première collecte des échantillons à la maternité du HOSCO. du 09 avril 2014 au 04 septembre 2014 pour la deuxième collecte des échantillons au laboratoire d’immunologie du HOSCO. et du 10 septembre au 23 décembre 2014 pour les tests ELISA, PCR et l’analyse des données. 3.3.2. Population d’étude Notre étude a particulièrement porté sur les femmes enceintes à terme qui se sont rendues à l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou pour accouchement durant la période de l’étude. 3.3.3. Critères d’inclusion Toutes les femmes enceintes à terme qui se sont rendues au CMSCO pour accouchement du 09 septembre 2013 au 05 février 2014 et qui ont donné leurs consentement ont été incluses dans cette étude. 3.3.4. Critères de non inclusion Toutes les femmes VIH positif et VHC positif n’ont pas été inclues dans cette étude. 3.3.5. Echantillonnage Notre étude a particulièrement porté sur les femmes enceintes à terme de l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou. Les femmes sont âgées d’au moins 15 ans et d’au plus 50 ans, de toutes professions et catégories sociales confondues. Pour ce faire, nous avons collecté 237 échantillons de sang total de femmes enceintes pour réaliser des tests rapides du VIH, de VHB et du VHC. Après accouchement les enfants ont reçu le vaccin contre l’hépatite B en trois doses: à la naissance, à deux mois et à quatre mois. Six mois après la première vaccination, des prélèvements ont été effectués chez les mères et leurs enfants dans des tubes secs et dans des tubes EDTA. Après centrifugation à 4000 rpm pendant 5min, les sérums et plasma ont été Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 27 collectés dans des tubes Eppendorf préalablement numérotés et conservés à -20°C pour les analyses sérologiques et moléculaires. 3.3.6. Principe et mode opératoire de l’ELISA en Sandwich Principe Cette technique est un dosage immuno enzymatique sur une phase solide dite technique ELISA directe en sandwich. Elle est basée sur la spécificité du complexe antigène-anticorps pour la détection des immunoglobulines IgG, IgM et IgA dans le sérum ou plasma. Les puits de la plaque sont imprégnés d’antigène de surface de l’hépatite B. Les échantillons sont ajoutés dans les puits et incubés. Si les échantillons contiennent les anticorps HBs, ils trouveront les antigènes des puits et simultanément le conjuguer pour former les complexes antigènes-anticorps-conjuguer. Si les échantillons ne contiennent pas d’anticorps, les complexes ne se formeront pas. Après incubation, les puits sont lavés pour éliminer les débris non liés. Le substrat A (peroxyde d’hydrogène) et le substrat B (tetramethylbenzidine) sont ajoutés et incubés pour produire la couleur bleue indiquant la présence d’anticorps dans l’échantillon. La solution d’acide sulfurique (0,5M) est ajoutée dans les puits pour stopper la réaction avec production d’une couleur jaune (la couleur bleue vire au jaune). L’intensité de la couleur correspond à la quantité d’anticorps HBs présent dans l’échantillon et lue au spectrophotomètre à 450/630 nm pendant 30 minutes. Les enfants dont le taux d’anticorps serait ˂ 11 seront dits non immunisés et ceux dont le titre des anticorps serait ˃ 11 seront dits immunisés. La figure 9 nous montre la réalisation de la plaque ELISA. Figure 9 : Réalisation de la plaque ELISA Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 28 Mode opératoire Les réactifs et sérums ont été ramenés à la température ambiante peu avant l’emploi, puis homogénéiser. La solution tampon de lavage a été préparée en diluant 1ml de la solution de lavage concentrée dans 25ml d’eau distillée. Le puits A1 est gardé pour le blanc et sont ajouté dans les puits correspondants respectivement 50 µl du calibrateur (sérum humain à différente concentration d’anticorps dirigés contre l’antigène de surface du virus de l’hépatite B) correspondant. Il a été ajouté 50µl des échantillons dans les puits correspondants, puis 50µl du conjuguer excepté le puits du blanc puis ensuite homogénéisé. Les puits de la plaque ont été couvert avec l’adhésif et incuber à 37°C pendant 30 min. L’adhésif a été ensuite retiré et les puits lavés 5 fois de suite avec 350 µl du tampon de lavage et la plaque égouttée à l’aide d’un papier absorbant. Il a été ajouté respectivement 50µl du Substrat A (peroxyde d’hydrogène) et B (tetramethylbenzidine) dans chaque puits en prenant soin de bien homogenéiser et couvrir avec l’adhésif puis incubé à 37°C pendant 15 min. L’adhésif est ensuite retiré et 50 µl de la solution Stop (acide sulfuric à 0,5M) a été ajoutée dans chaque puits. La plaque ainsi obtenue est lue au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 450/630nm après une période 30min. 3.3.7. Détection du VHB 3.3.7.1. PCR en temps réel L’ADN extrait, la PCR est composée de deux étapes essentielles: l’amplification et la détection de l’ADN. Dans le cas de la PCR en temps réel, l’étape de la détection est faite pendant l’amplification. 3.3.7.2. Principe de la PCR en temps réel Le principe de la PCR en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule reporter fluorescente capable d’émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l’intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR (Tse, 2003 ). Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 29 3.3.7.3. Extraction et quantification de l’ADN du VHB L’extraction a été faite à l’aide du kit ‟Ribo Virus ” de sacace biotechnologies en suivant le protocole fourni par le fabriquant. On a procédé comme suit : après avoir mis 600 µl de la solution de lyse (tampon RAV1) dans des tubes eppendoff préalablement numérotes, 5µl du contrôle interne (HBV Rec IC), 20 µl de protéinase K ont été ajouté dans chaque tube et 150 µl des échantillons dans les tubes appropriés. Il a été ajouté 100 µl du contrôle négatif (Cneg) dans le tube numéroté Cneg puis 90 µl de Cneg et 10 µl du contrôle positif (Cpos) du VHB dans le tube numéroté Cpos. Les tubes ont été vortexés et incubés à 70°C pendant 5min puis centrifugés brièvement. 600 µl de l’éthanol absolu a été ajouté dans les tubes puis vortexés pendant 15s et centrifugés brièvement. Les colonnes Ribo Virus ont été placées dans des tubes collecteurs de 2 ml et 700 µl des échantillons lysés ont été transférés puis Centrifugés pendant 1min à 8000 rpm. Le reste des échantillons lysés a été également transféré dans les colonnes Ribovirus puis centrifugés pendant 1min à 8000 rpm. Les tubes collecteurs contenant le filtrat ont été jetés, les colonnes du Ribovirus ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs et 500 µl de Wash1 (tampon RAW) a été ajouté puis Centrifugés à 8000 rpm pendant 1 min. Les tubes collecteurs contenant le filtrat ont été jetés, les colonnes Ribovirus ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs et 600 µl de Wash 2 (tampon RAV3) a été ajouté puis centrifugés pendant 1min à 8000 rpm. Les tubes collecteurs contenant le filtrat ont été jetés, les colonnes ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs et 200 µl de Wash 3(tampon RAV3) a été ajouté puis centrifugés à 11000 rpm pendant 5min pour enlever complètement l’éthanol. Les colonnes ouvertes ont été incubées à 70°C pendant 1min pour éliminer les traces d’éthanol et les colonnes placées à nouveau dans des tubes eppendoff préalablement numérotés. 50 µl de l’éluant (Rnase-free H2O) a été ajouté et incuber à 70°C pendant 1 à 2 min puis centrifugés à 11000 rpm pendant 1min. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 30 3.3.7.4. Protocole de la PCR en temps réel Préparation des échantillons pour l’amplification Le mélange réactionnel est obtenu par ajout dans le tube PCR-mix-1-TM, 200 µl de PCR-mix-2-TM et 20µl de l’ADN polymérase puis vortexer vigoureusement et centrifuger brièvement. La PCR en temps réel a été réalisé dans un volume réactionnel total de 25 µl composé de 12,5 µl du mélange réactionnel dans chaque tube et/soit 12,5 µl d’ADN extrait du plasma dans les tubes correspondants, soit 12,5 µl de QS3 VHB dans le tube du contrôle positif, soit 12,5 µl de QS3IC dans le tube du contrôle interne et 12,5µl du tampon TE-buffer dans le tube du contrôle négatif. Les tubes ont été fermés et transférés dans le thermocycleur pour l’amplification proprement dite. Programme d’amplification 1- 95°C pendant 15 minutes 2- 95°C pendant 20 secondes 42 Cycles 60°C pendant 1minute 3.3.8. Analyses statistiques Les analyses statistiques ont été réalisées par les logiciels Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17.0 et Epi info version 7.0. Le test du khi carré (2) a été utilisé pour les comparaisons. Toute différence sera considérée comme statistiquement significative pour P<0,05. 3.3.9. Aspect éthique de la recherche Cette étude a reçu l’approbation du comité d’éthique pour la recherche en santé du Burkina Faso. Toutes les femmes ont donné leur consentement libre et éclairé de même que les parents ou tuteurs des enfants pour leur participation à l’étude. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 31 4. RESULTATS 4.1. Caractéristiques socioprofessionnelles des femmes enceintes et prévalence de VHB, VIH et HCV Deux cent quarante un (241) femmes ont accepté librement de participer à notre étude. Parmi elles, quatre (04) ont été exclues parce qu’elles étaient positives soit au VIH, soit à l’hépatite C. Donc, l’étude a concerné 237 femmes enceintes à terme enrôlées à la maternité de l’HOSCO répondant parfaitement aux critères d’inclusions. La majorité d’entre elles était des ménagères, suivies de celles qui travaillent dans le secteur informel, des élèves/étudiantes et des fonctionnaires. La moyenne d’âge des femmes enceintes de l’étude était de 27,53 ± 6,16 ans. Parmi les femmes enceintes de l’étude, 22/237 étaient positives à l’antigène de surface du virus de l’hépatite B, soit une prévalence de 9,28 %. Les femmes enceintes élèves/étudiantes et les ménagères étaient les plus touchées par l’hépatite virale B avec des prévalences respectives de 13,79 % et 10,49% (Tableau I). Tableau I: statut socioprofessionnel des femmes enceintes en fonction des moyennes d'âge et de la prévalence du VHB, du VIH et de VHC. HBV+ Femmes enceintes N Age moyen 1 Ménagères 147 27,74 ± 6,33 15 2 Secteur Informel 52 27,44 ± 4,84 3 Elèves/étudiantes 29 4 Fonctionnaires Total N % VIH + VHC N % N % 10,20 3 2,10 1 1,36 2 3,85 0 0 0 0 23,55 ± 3,68 4 13,79 0 0 0 0 13 35,54 ± 5,69 1 7,69 0 0 0 0 241 27,59 ± 6,16 22 9,13 3 1,24 1 0,41 N : le nombre 1→2 : P=0,757(NS) ; 1→3 : P˂0,001 ; 1→4 : P˂0,001 ; 2→3 : P˂0,001 ; 2→4 : P˂0,001 3→4 : P˂0,001 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 32 Les classes d’âges sensiblement plus touchées par l’hépatite virale B sont celles des femmes enceintes âgées de plus de 29 ans, X ˃ 29 (10,39%) et celles des femmes enceintes adolescentes âgées de moins de 20 ans, X ˂ 20 (9,68%) (Tableau II). La tranche d’âge la moins touchée par l’infection par le VHB est celle comprise entre 20 et 24 ans (8,33%). Nous ne notons pas de différence significative entre la tranche d’âge la plus touchée et la moins touchée (P=0,94). Tableau II : Prévalence du VHB en fonction des classes d'âge des femmes enceintes Ages : ans N Age moyen VHB (% ) X ˂ 20 31 19,19 ± 0,79 9,68 20 – 24 48 22,73 ± 1,14 8,33 25 – 29 81 27,05 ± 1,31 8,64 X ˃ 29 77 34,57 ± 4,63 10,39 Total 237 27,59 ± 6,16 9,28 Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Valeur de P NS Page 33 Résultats du taux d’anticorps anti- VHB par l’ELISA classique chez les enfants 4.2. après la vaccination La figure 10 nous montre les résultats du taux d’anticorps anti-VHB par ELISA direct en sandwich des enfants après la vaccination. L’intensité de la couleur correspond à la quantité d’anticorps présent dans l’échantillon. Figure 10 : Résultat Test ELISA C1 : Blanc B1 et C1 : Calibrateur1 F1 et G1 : Calibrateur3 D1 et E1 : Calibrateur2 H1 et A2 : Calibrateur 4 B2 et C2 : Calibrateur 5 La moyenne de la concentration des AcHBs des 237 enfants était de 218,07 ± 74,66 mIU/ml. Au total 233/237 soit 98,31% des enfants étaient immunisés avec une concentration en AcHBs X ˃11 mIU/ml. Tandis que 4/237 soit 1,69% des enfants avaient une concentration des AcHBs inférieur à 11 mIU/ml donc non immunisés (tableau III). La différence entre le taux d’enfants non immunisés (1,69%) et ceux immunisés (98,31%) était statistiquement significative P˂0,001. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 34 Tableau III: Taux des anticorps anti-HBs des enfants vaccinés Concentration des HBsAb Effectif des enfants Pourcentage % Statut Immunitaire des enfants mIU/Ml X ˂ 11 4 1,69 Non immunisés 11 ˂X ≤100 8 3,37 Immunisés X ˃100 225 94,94 Immunisés Total 237 100 X : concentration Les enfants dont le taux d’anticorps est ˂ 11 sont dits non immunisés et ceux dont le titre des anticorps est ˃ 11 sont dits immunisés. 4.3. Confirmation par PCR des résultats des tests rapides de VHB des mères, du statut VHB des enfants non immunisés et transmission verticale du VHB Sur les 22 femmes enceintes positives à l’HBsAg, 21 femmes ont été confirmées positives à l’hépatite virale B par la PCR (ADN+) et 1 femme était négative à la PCR (ADN-) comme le montre la figure 5. On note donc une concordance de 95,45% (21/22) et une discordance de 4,55% (1/22). Chez ces 21 femmes infectées par l’hépatite virale B, 5 femmes ont transmis l’infection à leurs enfants, soit un taux de transmission verticale de l’hépatite B de 23,81% (5/21). Le tableau IV montre les résultats de la PCR et des marqueurs de VHB chez les mères et la transmission verticale. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 35 Contrôle positif Echantillons Figure 5: courbes des résultats du diagnostic qualitatif du VHB par PCR en Temps Réel Tableau IV : Résultats de la PCR et différents marqueurs du VHB dans la transmission mèreenfant Total Effectif des mères 1 ADN VHB + 4 Mères HBV positif HBsAg HBeAg HBsAb HBeAb HBcAb ADN VHB + Enfants Transmission verticale VHB 1 + + - - + + + - - + + + 4 11 + + - - + + - 0 4 + + - - - + - 0 1 - + - - - - - 0 22 5 La PCR a confirmé 21 femmes positives à l’hépatite B. La prévalence est désormais de 8,86% (21/ 237) pour les femmes enceintes de notre étude. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 36 5. DISCUSSION Notre étude a particulièrement portée sur les femmes enceintes venues pour accouchement à l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou. Les âges des mères étaient représentatifs de ceux de la population générale des femmes enceintes au Burkina Faso mais la taille de l’échantillon ne permet pas de généraliser les conclusions à l’ensemble de la population féminine du Burkina Faso. Cette étude nous a permis d’estimer la prévalence du VHB chez les femmes enceintes à Ouagadougou. Les femmes enceintes inclues dans l’étude étaient âgées d’au moins 15 ans et d’au plus 50 ans avec une moyenne de 27,59 ± 6,16 ans. La prévalence chez les femmes élèves/étudiantes se trouve être très élevée 13,79%, elle est de 10,49% chez les ménagères. La forte prévalence observée chez les élèves/étudiantes pourrait s’expliquer par des comportements à risque, sexuel notamment ceci au regard de leur jeunesse. Chez les ménagères ces résultats s’expliqueraient par le cumul des risques de contact avec le virus par transmission parentérale et sexuelle au cours de la vie adulte dû à un faible niveau d’instruction ou à l’ignorance de la maladie. Le taux de portage de l’AgHBs chez les femmes enceintes (8,86 %) dans notre étude est voisin de celui rapporté par Simporé et al., en 2004 qui était de 9,3% chez les femmes enceintes à Ouagadougou. Ce taux est inférieur à ceux trouvés par Simpore et al, 2006 (9,8 %) et 11,4 % rapportés par Sangare et al, 2009. Cette prévalence est largement en deçà de celle rapportée par Tao et al, en 2014 au sein de la population générale du Burkina qui était de 14,47%. Mais nos résultats confirment la haute endémicité du VHB au Burkina Faso (prévalence supérieure à 8%). Des prévalences chez les femmes enceintes ont été rapportées dans d’autres pays africains ont été rapportées. Au Nord du Benin, Paschale et al., en 2014 ont trouvé des prévalences de 15,5% et au Nigeria Musa et al en 2015 ont rapporté une prévalence de 14,1%. Ces prévalences sont plus élevées que celle rapportée dans notre étude. Aussi des prévalences moins élevées chez les femmes enceintes ont été observées en Cote d’Ivoire et au Nord Mali par Rouet et al, en 2004 et par Mac en 2011 qui étaient de 8%. Ces différences pourraient s’expliquer par la qualité des systèmes sanitaires des pays et des niveaux de vie dans les régions. Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 37 Il n’y a pas de différence significative entre la prévalence du VHB en fonction des classes d’âges des femmes enceintes (Tableau II). L’infection par le VHB semble donc n’être pas liée à l’âge de la femme enceinte. Nos résultats montrent que l’immunisation des enfants dès les premières heures permet de réduire de façon considérable la transmission du VHB. En effet nous avons enregistré un taux d’immunisation de 98,31% contre un taux d’échec de 1,6% seulement, d’où l’efficacité protectrice de la vaccination anti-hépatite B liée à l’induction d’anticorps anti-HBs. Ces résultats confirment que la série des 3 doses de primovaccination induit des concentrations protectrices d’anticorps chez plus de 95% des nourrissons, enfants et jeunes adultes en bonne santé tel que rapporté par Bialek et al., (Bialek et al., 2008). Dans notre étude plusieurs marqueurs ont été utilisés à savoir l’AgHBs, AgHBe, AbHBe, AbHBc, et l’ADN du virus. L’antigène HBe était présent chez 4,54% des mères AgHBs positives. Ce taux est inférieur à ceux rapportés par Nacro (2000) 18,2 %, Ilboudo ( 2002) 11,1% et Sangaré (2009) 31,4% respectivement à Bobo Dioulasso et à Ouagadougou. Il est également inférieur à celui rapporté au Bénin par Paschale et al, en 2014 qui était de 11,4%. Les voies de transmission varient selon les zones géographiques du fait des différences de facteurs de risque qui sont observées, même entre pays de zones de forte endémicité : en Asie du Sud-Est, où la prévalence de l’antigène HBe (AgHBe) chez les femmes enceintes est très élevée, la transmission de la mère infectée à son enfant est surtout verticale, alors qu’en Afrique sub-saharienne, l’AgHBe est moins prévalent chez les femmes enceintes et l’infection survient plutôt par voie horizontale, pendant et après l’accouchement (OMS, 2002 ; Ranger et Denis, 2004). Des 22 mères infectées, 21 ont intégré l’ADN du virus dans leurs génomes et tous les enfants infectés sont issus de mères ayant en commun les marqueurs AgHBs et l’ADN du virus. En plus des deux marqueurs une mère présentait le marqueur de réplication active sans mutation du gène pré-C à savoir l’AgHBe ainsi que le marqueur de contact avec le VHB à savoir l’AcHBc. Aussi ces résultats corroborent ceux trouvé par Maiga et al (1992) qui montrent que la présence de l’antigène HBe est un risque important de contamination du nouveau né avec 90% de chance qu’il soit porteur chronique. Aussi, quatre autres enfants infectés étaient nés de mères qui en plus des deux marqueurs commun possédaient également l’AcHBc et l’AcHBe qui est un marqueur d’arrêt de la Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 38 réplication viral. Pourtant cette transmission prouve que le virus se réplique normalement ; ce qui pourrait traduire la présence du mutant pré-C (qui empêche l’arrêt de la réplication virale) et de l’Agpré-S1 qui est un marqueur très sensible de la réplication. Ainsi, l’ADN du VHB détecté dans le sang veineux de 23,81% (5/21) des enfants six mois après la première vaccination montre qu’il s’agit probablement d’infections acquises in utero. Malgré la forte endémicité du VHB dans les pays africains sub-sahariens, ce mode de transmission n’y a été que très rarement décrit, contrairement à la Chine et à l’Asie du SudEst. La voie transplacentaire est le plus souvent évoquée pour expliquer cette transmission périnatale du VHB. Ce résultat confirme que le nombre de porteuses AgHBe est moindre parmi les personnes infectées. Pour les enfants infectés de mère AcHBc positive une étude menée par Alexander Walz et al., en 2009 a prouvé que la transmission verticale était possible pour une mère positive à l’anticorps AgHBc. Malgré la présence d’anticorps HBe chez les 4 mères, l’ADN du virus a intégré le génome des enfants, cela pourrait s’expliquer par le génotype du VHB qui a infecté la mère. Ces résultats corroborent ceux de Maiga et al, (1992) au Mali qui font remarquer une profonde discordance entre les marqueurs de réplication (AgHBs et ADN viral) et l’AgpréS2 qui a été plus souvent décelé chez les mères AgHBs positives et font penser que dans nos pays la réplication se ferait à ‹bas bruit ›. Aussi dans nos pays l’absence du marqueur de réplication à savoir l’AgHBe n’est pas forcement synonyme d’absence totale de réplication. Enfin, l’étude menée par Pietra sur le personnel du District de Nanoro a montré que les sujets de sexe masculin constituaient un groupe à risque donc susceptible de transmettre le virus à leurs conjointes. Il est donc évident que la lutte contre la transmission verticale du VHB ne saurait se limiter chez les femmes enceintes. CONCLUSION Les hépatites virales en générale dont l’hépatite B en particulier constitue un problème de santé publique pour les pays à haute endémicité tel que le Burkina Faso. Cette étude a permis de déterminer la prévalence du VHB (8,86% ) chez les femmes enceintes à l’HOSCO, de confirmer par PCR la présence du virus chez ces femmes, de déterminer le taux d’anticorps anti-HBs des enfants après la vaccination qui est de 98,31% et la prévalence de la transmission verticale (22,73%) du virus de l’hépatite B. Ces résultats confirment que la transmission mèreenfant est une réalité dans notre pays. Pour ces raisons, il est nécessaire que les chercheurs Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 39 collaborent et que les politiques de santé décident de la mise en place d’une surveillance systématique des femmes enceintes de sorte à réduire la transmission verticale du VHB. RECOMMANDATIONS A l’endroit du Ministère de la santé, les stratégies suivantes pourraient réduire la transmission verticale de l’hépatite B à savoir : - Subventionner les vaccins anti VHB - Intensifier les campagnes d’information, d’éducation et de sensibilisation de la population sur les hépatites en générale et en particulier l’hépatite B ; -Coupler l’injection des immunoglobulines (HBIG) de l’hépatite B à la première dose du vaccin à la naissance A la PTME, il serait important de faire des dépistages systématiques du VHB des femmes enceintes dès les premières consultations prénatales. PERSPECTIVES Au regard des résultats fournis par cette étude nous pourrions envisager les perspectives suivantes: Elargir l’étude à une population représentative des femmes enceintes du Burkina Faso Etudier les différentes mutations qui agissent sur la réplication du VHB Etablir la relation entre la charge virale et la transmission Mémoire Edwige T. YELEMKOURE/2013-2014 Page 40 REFFERENCES ABDOU CHEKARAOU, M., BRICHLER, S., MANSOUR, W., LE GAL, F., GARBA, A., DENY, P. & GORDIEN, E. 2010. A novel hepatitis B virus (HBV) subgenotype D (D8) strain, resulting from recombination between genotypes D and E, is circulating in Niger along with HBV/E strains. J Gen Virol, 91, 1609-20. ALEXANDER WALZ, STEFAN WIRTH, HUCKE, J. & GERNER, A. P. 2009. Vertical transmission of the hepatitis B Virus (HBV) from mothers negative for HBS Surface Antigen and positive for Antibody to HBV Core Antigen. Infectious diseases, 200, 1227-31. ARAUZ-RUIZ, P., NORDER, H., ROBERTSON, B. H. & MAGNIUS, L. O. 2002. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol, 83, 2059-73. BANERJEE, A., KURBANOV, F., DATTA, S., CHANDRA, P. K., TANAKA, Y., MIZOKAMI, M. & CHAKRAVARTY, R. 2006. Phylogenetic relatedness and genetic diversity of hepatitis B virus isolates in Eastern India. J Med Virol, 78, 1164-74. 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