Etude de l`effet de l`oxygène sur la physiologie et le métabolisme de

Université de Carthage
Ecole doctorale des Sciences de l’Ingénieur et
Technologie
Institut National des Sciences Appliquées et de
Laboratoire d’Ecologie et de Technologie Microbienne
(LETMi)
Université de Provence Aix Marseille I
Ecole Doctorale des Sciences de la Vie
et de la Santé
Laboratoire de Microbiologie
Institut de Recherche pour le Développement
(IRD) Marseille
Thèse de Doctorat
Mention Microbiologie, Biotechnologie
Etude de l’Effet de l’Oxygène sur la
Physiologie et le Métabolisme de la
bactérie hyperthermophile
anaérobie Thermotoga maritima
Présentée par
Mlle Raja LAKHAL
Ingénieur en Sciences Appliquées et Technologie filière Bio-Industrie
En vue d’obtenir le grade de docteur de l’Université de Carthage à Tunis et
de l’Université de Provence à Marseille
Soutenance prévue pour le 15 Juillet 2011 à l’Institut National des Sciences Appliquées et de
Technologie devant le Jury composé de
Pr. Abdelatif BOUDABOUS
Pr. Nabil ZOUARI
Dr. Gérard FONTY
Dr. Yannick COMBET-BLANC
Pr. Moka HAMDI
Dr. Bernard OLLIVIER
Président (Tunisie)
Rapporteur (Tunisie)
Rapporteur (France)
Examinateur (France)
Directeur de thèse (Tunisie)
Directeur de thèse (France)
A mes parents Fethi et Beya,
J’espère que vous êtes fiers de moi !
Remerciements
Cette thèse a été réalisée au Laboratoire de Microbiologie et Biotechnologie
des Environnements Chauds à l’Institut de Recherche pour le Développement (IRD)
à Marseille en partenariat avec le Laboratoire d’Ecologie et de Technologie
Microbienne (LETMi) à l’Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie
(INSAT) à Tunis. Je remercie ainsi Monsieur Jean-Luc THOLOZAN, directeur du
laboratoire IRD, de m’avoir accueillie dans ses locaux ; ainsi que Monsieur Samir
BEN AHMED, directeur de l’INSAT, d’avoir accepté mon inscription dans son
établissement.
Je souhaite remercier en premier lieu Monsieur Gérard FONTY et Monsieur
Nabil ZOUARI de m’avoir fait l’honneur d’accepter d’êtres les rapporteurs de ma
thèse et de m’accorder un peu de leur temps précieux pour juger et corriger mon
travail. Qu’ils reçoivent ici l’expression de ma profonde gratitude.
J’adresse un grand remerciement à mon directeur de thèse Monsieur Bernard
OLLIVIER qui était toujours là pour moi. Je lui suis reconnaissante de m’avoir faite
profiter de ses compétences et connaissances scientifiques et je le remercie
également pour sa grande sagesse, son soutien moral et son rire légendaire.
Je remercie mon directeur de thèse le Professeur Moktar HAMDI, également
directeur du laboratoire LETMi à l’INSAT et directeur de l’école doctorale des
Sciences de l’Ingénieur et Technologie, pour son regard sur mon travail ainsi que ses
conseils scientifiques. Je lui suis reconnaissante de m’avoir permis de participer à
des séminaires nationaux et internationaux et de m’épauler pendant mes
communications orales.
Mes vifs remerciements s’adressent à mes encadrants de thèse Messieurs
Yannick COMBET-BLANC et Richard AURIA qui m’ont été d’une aide considérable
dans la conduite des expérimentations tout au long de mes travaux de thèse et dans
la rédaction de mes deux articles ainsi que ma thèse. Je les remercie aussi de
m’avoir offert la possibilité de travailler dans le cadre d’une ANR pendant ma
dernière année de thèse et de me faire profiter de leur savoir faire. Je les remercie
également pour tous les conseils scientifiques, administratifs et autres qu’ils m’ont
donnés autour de nos multiples réunions formelles et informelles. Je ne peux oublier
de les remercier de m’avoir accompagné à mon premier congrès international
« Extremophiles 2010 » aux Azores et de tous les bons moments qu’on a passé làbas. Qu’ils trouvent ici le témoignage de ma grande reconnaissance.
Une mention spéciale à Monsieur Alain DOLLA, directeur du laboratoire
d’interactions et modulateurs de réponses IBSM CNRS Marseille et Madame MarieClaire DURAND, ingénieur du laboratoire, pour m’avoir accueillie à bras ouvert dans
leur laboratoire pour m’initier aux approches de transcriptomique. Merci Alain pour
ton aide précieuse dans la conduite de mes expérimentations, pour ta réactivité dans
la correction de mes articles et mon manuscrit de thèse, pour tes conseils avisés et
enfin pour ta disponibilité et ta gentillesse. Merci Marie-Claire pour nos séances de
bavardages en attendant les résultats de la qRT-PCR et merci pour le chocolat !!
Un grand merci à notre ingénieur d’étude à l’IRD Sylvain DAVIDSON qui m’a
formée à l’utilisation de la plateforme du fermenteur, les appareils de
chromatographie et même les feuilles de calcul Excel. Je le remercie, par ailleurs,
pour sa disponibilité (même vers minuit !!), son aide considérable et sa bonne
humeur qui m’a accompagnée même dans les moments difficiles par lesquels je suis
passée tout au long de ma thèse.
Comment exprimer ma reconnaissance à la personne qui, tout au long de mon
séjour à Marseille, a joué le rôle d’une douce maman, une généreuse sœur, une
sympathique confidente, une agréable voisine et une vraie amie, Madame Corinne
VALETTE, notre responsable qualité du laboratoire IRD et ma collègue de bureau ?
Je n’oublierais jamais les leçons de la vie qu’elle m’a données pendant nos multiples
conversations, les tempos des chansons qu’elle m’a fait découverts, les astuces de
cuisine gourmande qu’elle a généreusement partagées avec moi et surtout son
grand sourire et ses mots doux qui ont guéri mes nombreuses blessures et m’ont
remonté le moral à chaque fois que ma Tunisie me manquait. Du fond du cœur,
merci ma Coco ! Notre amitié restera à jamais précieuse à mes yeux !
Je témoigne ma reconnaissance également à mes amies Dukaniennes,
Docteur Laurence CASALOT et Docteur Gwénola SIMON, chargées de recherche à
l’IRD sans oublier Mademoiselle Isabelle GUEDIN, notre secrétaire de laboratoire. Je
les remercie pour leur générosité et leur disponibilité et pour tous les petits bons
repas conviviaux qu’on a partagés ensemble dans la joie et la bonne humeur. Merci
Laurie pour ton implication dans mon travail de thèse, tes conseils scientifiques mais
aussi pour tes fameux bisous matinaux chaleureux et ton sourire sympathique et j’ai
failli oublier le chocolat !
Toute ma reconnaissance va à Marie-Laure FARDEAU, notre ingénieur de
recherche à l’IRD, pour m’avoir soutenue et épaulée tout au long de ma thèse, pour
m’avoir initiée aux techniques de culture des micro-organismes anaérobies lors de
mon stage de master BioDev et pour m’avoir transmis son savoir faire technique et
scientifique. Grâce à elle, le monde fascinant des micro-organismes anaérobies n’a
plus de secret pour moi (ou presque !!). Je ne manque pas de la remercier pour son
soutien moral et ses encouragements. Merci Marie-Laure pour tout ce que tu as fait
pour moi.
Merci à Manon JOSEPH BARTOLI, notre technicienne de laboratoire, pour sa
bonne humeur et sa sympathie. Un grand merci à Agnès HIRSCHLER, Pierre
CHRISTEN, Jean-Luc CAYOL, Jean LORQUIN, Anne POSTEC, Nathalie PRADEL,
Marc LABAT, Didier ALAZARD, Gaël ERAUSO, Guy FAUQUE, Jean LE MER et
Grégoire GALLES pour avoir supporté mes éclats de rire stridents et mes
bavardages dans les couloirs du laboratoire.
Je ne manquerais pas de remercier les thésards du laboratoire, mes
compagnons de guerre, Oulfat AMIN ALI, Alexia COMTE, Matthieu CRAVERO,
Wajdi BEN HANIA, Abdeljabar HEDI, Zouhaier BENALIGAM et Bruno MAYEUX, qui
ont beaucoup contribué à mon équilibre pendant ces quatre années de thèse. Merci
les amis pour les fous rires qu’on a partagés.
Mes journées à l’IRD n’auraient pas été les mêmes sans mon fidèle ami
Rafael UZARRAGA, avec qui j’ai partagé la plupart de mes fous rires durant ces
quatre ans. C’est quelqu’un qui était toujours présent pour moi et qui a su apaiser ma
colère, réconforter mes craintes, modérer mes angoisses et supporter (par
moments !!) ma mauvaise humeur. Je le remercie également pour sa générosité et je
lui souhaite une bonne chance pour sa soutenance de thèse prévue très
prochainement et aussi un bon retour au Mexique. Je lui adresse mes vœux de
bonheur et que Dieu lui garde sa merveilleuse famille. Espérons qu’on gardera ces
liens d’amitié très forts en dépit des océans qui nous sépareront.
Riadh, Julien et Michel, nos informaticiens, merci de répondre présents dès
que j’appelle au secours, et de domestiquer à chaque fois cette satané de machine
qu’un appelle ordinateur !
Une attention spéciale à ma « nmila » adorée Qods LAHMAR, ma voisine de
palier à la cité universitaire et ma sœurette dévouée. Merci d’avoir embelli mes
années passées loin de ma famille ; merci d’avoir effacé avec ton sourire gracieux, ta
bonté divine et ton énorme générosité tout sentiment de dépaysement ; merci de
m’avoir accepté comme je suis ; merci pour tes conseils de tous genres ; merci
d’avoir essuyé mes larmes dans mes moments de tristesse et de faiblesse ; merci
d’avoir fait de mes peines des purs moments de joie ; merci de m’avoir accompagnée
pratiquement chaque week-end à la rue Saint Ferréol, au cinéma, à la piscine ; merci
d’avoir partagé avec moi tous mes kebab et mes repas galas aux restaurants ; merci
pour toutes les soirées pyjamas sans oublier les bons moments qu’on a passé à Nice
et j’en passe car je ne te remercierais jamais assez !
Je réserve mes derniers chaleureux remerciements à ma famille à Tunis.
Papa, j’espère que tu es fier de ton petit « machmoum », comme tu m’appelles
souvent. Je te dédie cette thèse et ce diplôme à toi qui ne m’as jamais abandonnée,
à toi qui as toujours su comment me remonter les bretelles et m’encourager à aller
vers l’avant, à toi qui, avec ton sourire, panses ma tristesse et sèmes la gaieté dans
tout mon être.
Papa, tu te rappelles quand j’étais petite, contrairement à tous les enfants de mon
âge, je ne rêvais pas d’un métier phare ; médecin, pilote, artiste, et autres, ne veulent
rien dire pour moi ! Cependant, en discutant avec toi, tu as su m’orienter dans mes
choix d’études et de carrière, et je n’oublierais jamais ton conseil : « ma fille, la
recherche biologique est l’avenir de ce monde !». A force d’avoir confiance en toi, j’ai
suivi tes conseils aveuglement et je ne le regrette point, car après dix ans d’études
supérieurs, je trouve ton conseil plus que d’actualité et je suis tout simplement fière
d’avoir un papa visionnaire comme toi ! Merci papa d’avoir guidé mes pas vers la
réussite !
Je me rappelle aussi de toutes les fois, où en rentrant de l’école, du lycée, de la
faculté et même du laboratoire, je te raconterais tout ce que j’ai fait de ma journée. Je
te faisais un compte rendu de mes cours, TD et TP (cela m’aidait à réviser aussi !), je
t’expliquais mes expérimentations et mon raisonnement et je te faisais même part de
mes réunions. Je sentais à chaque fois ton implication et je remarquais que tu
t’intéressais à tout ce que je disais quelques soit le sujet. Je te racontais même les
potins de mes amis et même les blagues que j’ai entendues dans la journée. Grâce à
ta générosité et ta sagesse, tu rigolais, tu me conseillais, tu essayais mes larmes, tu
me donnais une petite tape dans le dos, tu me calmais, etc… Tu as toujours su
quelle réaction adopter pour me faire le maximum de plaisir possible. Merci papa
pour m’avoir laissée m’envoler toute seule dans un pays étranger, loin de toi et de
toute la famille, dans le seul but de réaliser mon rêve ; merci pour ne pas t’être
interposé sur le chemin de mes travaux scientifiques. Les cinq années que j’ai passé
loin de vous tous étaient certainement une énorme épreuve pour toi, mon papa
« poule » ; pourtant tu n’as jamais cessé de m’encourager et de me rappeler toujours
ce que j’étais allée chercher là-bas surtout au moment où je perdais le nord !
J’exprime ma grande affection à ma maman chérie, Beya, celle qui donne sans
compter, sans rien attendre en retour, celle qui fait passer mon confort et mon bienêtre avant les siens, celle qui représente pour moi une maman, une amie, une sœur
et une confidente, celle à qui je réserve une place bien particulière dans mon cœur !
Comment pourrais-je te remercier ma bonne fée ? Par quoi devrais-je commencer ?
Certainement pas le jour où tu m’as donné la vie car sinon je rédigerais un roman !
Merci pour tes bons petits plats copieux (qui ne m’ont d’ailleurs pas facilité le régime
Dukan !), merci pour toutes les provisions que tu me donnes à chaque fois que je
repars à Marseille, merci pour nos conversations passionnantes qu’on partage
souvent en dépit de la distance qui nous sépare, merci pour ta bienveillance et ta
clémence, merci pour la douceur de tes caresses, la bonté de tes paroles et
l’affection de ton sourire. Je te remercie maman d’avoir fait de moi la femme que je
suis maintenant et d’avoir supporté la distance qui nous a séparées durant ces cinq
ans sans jamais te plaindre ! Je ne souhaite qu’une chose dès à présent, c’est d’être
une femme aussi épanouie que tu l’as été toute ta vie et qu’un jour on me
dira : « Qu’est ce que tu ressembles à ta maman, tu es son portrait tout craché » !
Maman, j’espère que tu es fière de moi !
Merci également à mes sœurs Lamia et Nada et mon frère Moktar pour le soutien
qu’ils m’ont gracieusement témoigné et l’affection dont ils ont fait preuve durant ces
années. Merci Lamia et Nada pour tous les fous rires qu’on a partagé et toutes les
bêtises qu’on a pu dire ou faire ensemble ! Durant ces années, j’ai vu dans vos yeux
une lueur de fierté qui scintille quand vous me regardez et j’espère que je suis et je
serais toujours à la hauteur de vos espérances et que la vie ne nous séparera plus
jamais !
Comment pourrais-je ne pas signaler une mention spéciale à ma copine de
toujours, Yosr ? Celle qui a toujours été de bons conseils, celle qui était mon
modérateur émotionnel et celle qui, malgré la distance, a su comment préserver
notre précieuse amitié. Merci Yosr et à nous les petites soirées pyjamas !
Finalement, je termine mes remerciements avec une douce attention pour
Abdesselem, l’homme qui m’a tant aimée et chérie pendant ces cinq dernières
années (même en cachette !). Malgré tous les petits soucis de la vie qu’on a eus,
malgré la rude rupture qu’on a vécue et malgré la distance qui, par moments, a
refroidi notre couple, on est arrivé à surmonter ces épreuves pénibles. Notre
engagement du 30 Avril 2011 en est témoin ! Merci Slouma pour ton amour et surtout
ta patience et reçois ici en retour ma reconnaissance et mes promesses de fidélité !
Pour tous ceux que j’ai oublié de mentionner, un grand MERCI !
Sommaire
INTRODUCTION GENERALE ................................................................................................................ 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ................................................................................................................. 4
I / LES MEMBRES DE L’ORDRE DES THERMOTOGALES .............................................................................. 5
I.1. Description, phylogénie et écologie .......................................................................................... 5
I.2. Métabolisme des Thermotogales.............................................................................................. 7
I.3. T. maritima : phylogénie et métabolisme................................................................................. 7
II / HYDROGENE ET HYDROGENASES ..................................................................................................... 13
II.1. Mécanisme de la production d’hydrogène : la fermentation à haute température ................ 13
II.2. Caractéristiques générales des hydrogénases ..................................................................... 14
II.3. Caractéristique de l’hydrogénase de Thermotoga maritima.................................................. 15
III / STRESS OXYDANT CHEZ LES PROCARYOTES.................................................................................... 18
III.1. Apparition de l’O2 dans l’atmosphère et sensibilité des bactéries anaérobies vis-à-vis de l’O2
...................................................................................................................................................... 18
III.2. Génération des espèces réactives de l’O2 ........................................................................... 19
III.3. Effets toxiques de l’O2 et des ROS sur les cellules bactériennes ........................................ 24
III.3.1. Peroxydation des lipides ............................................................................................... 25
III.3.2. Altération de l’ADN ........................................................................................................ 26
III.3.3. Oxydation des protéines................................................................................................ 27
III.4. Détoxification des espèces réactives d’O2 ........................................................................... 28
III.4.1. Détoxification de l’anion superoxyde............................................................................. 30
III.4.2. Détoxification de l’anion peroxyde................................................................................. 31
IV / EFFET DE L’O2 SUR LES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES ........................................................... 33
IV. 1. Présence et diversité des BSR dans les environnements oxygénés.................................. 33
IV. 2. Toxicité de l’oxygène pour les BSR et mécanismes de protection développés.................. 35
IV.2.1. Adaptation comportementale ........................................................................................ 35
IV.2.1.1. L’agrégation ........................................................................................................... 35
IV.2.1.2. La migration des BSR vers les zones anoxiques .................................................. 36
IV.2.1.3. L’aérotactisme ....................................................................................................... 37
IV.2.2. Mécanismes moléculaires de réduction de l’oxygène .................................................. 38
IV.2.3. Mécanismes d’élimination des ROS chez les BSR ...................................................... 40
IV.2.3.1. Activités superoxyde dismutase et superoxyde réductase des BSR .................... 40
IV.2.3.2. Activités catalases et peroxydases des BSR ........................................................ 43
IV.2.3.3. Synchronisation de toutes les activités enzymatiques cellulaires pour la
détoxification des espèces réactives d’oxygène chez les BSR et chez les micro-organismes
hyperthermophiles anaérobies............................................................................................. 44
V / EFFET DE L’O2 SUR LA BACTERIE THERMOTOGA MARITIMA ET MECANISMES DE DEFENSE .................. 47
VI / METABOLISME DES SUCRES CHEZ LES HYPERTHERMOPHILES .......................................................... 52
VI.1. Glycolyse chez les Archaea ................................................................................................. 54
VI.2. La glycolyse chez les Thermotogales : exemple Thermotoga maritima .............................. 61
VII / METHODOLOGIE DE CULTURE DES BACTERIES HYPERTHERMOPHILES ANAEROBIES ......................... 63
VII.1. Les problèmes de la culture des hyperthermophiles anaérobies........................................ 63
VII.2. Méthodes de culture de routine........................................................................................... 64
VII.3. Culture en fermenteur ......................................................................................................... 64
VII.3.1. Réacteur gas-lift ........................................................................................................... 66
VII.3.2. Réacteur continue avec recyclage des cellules........................................................... 66
VII.3.3. Système de fermenteur à membrane de dialyse ......................................................... 66
MATERIEL ET METHODES ................................................................................................................. 68
I / CULTURE DE T. MARITIMA EN ANAEROBIOSE EN MICROCOSME ........................................................... 69
II/ CULTURE DE T. MARITIMA EN FERMENTEUR ...................................................................................... 70
II.1. Croissance de T. maritima en fermenteur dans des conditions anaérobies ......................... 73
II.2. Culture de T. maritima en anaérobiose suivie de conditions oxydantes variables............... 73
II.3. Mesure de la consommation d’O2 et suivi de la croissance de T. maritima soumise aux
différentes conditions oxydantes .................................................................................................. 76
II.3.1. Stress ponctuel et estimation de la vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima . 76
II.3.2. Croissance de T. maritima soumise à des conditions de stress oxydant long :
« adaptation à l’O2 » ................................................................................................................. 78
III / METHODES ANALYTIQUES .............................................................................................................. 79
III.1. Estimation de la biomasse par turbidimétrie......................................................................... 79
III.2. Dosage des gaz par chromatographie en phase gazeuse................................................... 79
III.3. Dosage du glucose et des métabolites en phase aqueuse par chromatographie liquide
haute performance........................................................................................................................ 79
III.4. Dosage des exopolysaccharides .......................................................................................... 80
III.5. Dosage du peroxyde............................................................................................................. 80
III.6. Dosage des protéines totales ............................................................................................... 81
III.7. Spectroscopie RMN .............................................................................................................. 82
III.7.1. Définition de la spectroscopie RMN .............................................................................. 82
III.7.2. Objectif de la RMN ........................................................................................................ 82
III. 7.3. Principe de la RMN....................................................................................................... 82
IV/ TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : QRT-PCR ..................................................................... 90
IV.1. Préparation des cellules pour l’analyse transcriptomique qRT-PCR ................................... 90
IV.2. Extraction de l’ARN, quantification et contrôle de sa qualité ............................................... 90
IV.3. Synthèse des ADNc par reverse transcriptase .................................................................... 91
IV.4. PCR quantitative en temps réel............................................................................................ 91
RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................................................................ 93
I. CROISSANCE DE T. MARITIMA EN FERMENTEUR DE 2L : OPTIMISATION DU MILIEU DE CULTURE ET
VALIDATION DE LA CULTURE EN FERMENTEUR ....................................................................................... 95
II. VALIDATION DE LA METHODE DE CALCUL DES PRODUCTIVITES DES GAZ ............................................. 98
III. VALIDATION DU PROTOCOLE DU STRESS OXYDANT ........................................................................... 99
IV. EFFET DE L’OXYGENE ET DU POTENTIEL REDOX SUR LE METABOLISME DU GLUCOSE CHEZ THERMOTOGA
MARITIMA ( ARTICLE 1)
....................................................................................................................... 100
IV.1. Introduction......................................................................................................................... 100
IV.2. Article 1 (accepté dans International Journal of Microbiology Volume 2010, Article ID
896510, 10 pages doi:10.1155/2010/896510)............................................................................ 100
IV.3. Conclusions de l’article 1.................................................................................................... 111
V. ESTIMATION DE LA VITESSE DE CONSOMMATION DE L’O2 PAR T. MARITIMA ET MISE EN EVIDENCE DES
MECANISMES ENZYMATIQUES IMPLIQUES DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDANT ( ARTICLE 2) ........ 112
V.1. Introduction.......................................................................................................................... 112
V.2. Article 2 (accepté dans Archieves of Microbiology DOI 10.1007/s00203-011-0687-8) ...... 113
V.3. Conclusion de l’article 2 ...................................................................................................... 124
VI. ETUDE DU METABOLISME DE T. MARITIMA LORS D’UNE LONGUE EXPOSITION A L’OXYGENE (ENVIRON 20
HEURES) (MANUSCRIT EN PREPARATION POUR APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY)............. 125
VI.1. Introduction......................................................................................................................... 125
VI.2. Résultats............................................................................................................................. 125
VI.2.1. Effet de l’O2 sur le métabolisme et la croissance de T. maritima cultivées en présence
d’oxygène sur une période de 20h. ........................................................................................ 125
VI.2.2. Réponse transcriptomique de T. maritima lors d’une exposition longue à l’oxygène (20
h)............................................................................................................................................. 131
VI.3. Discussion .......................................................................................................................... 134
VII. LA GLYCOLYSE CHEZ T. MARITIMA LORS D’UNE EXPOSITION LONGUE A L’O2 ................................. 139
VII.1. Analyse des produits finaux de la glycolyse par spectroscopie RMN ex vivo .................. 139
VII.2. Analyse de l’expression des enzymes clefs impliquées dans les voies de glycolyse ED et
EM par une étude transcriptomique............................................................................................ 140
VII.3. Discussion ......................................................................................................................... 143
CONCLUSION GENERALE ............................................................................................................... 152
PERSPECTIVES ................................................................................................................................. 158
ANNEXES ........................................................................................................................................... 161
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................. 164
RESUME ............................................................................................................................................. 193
Liste des figures
Figure 1 : Arbre phylogénique représentant les trois domaines du vivant d’après Woese
modifié............................................................................................................................ 6
Figure 2: Arbre phylogénétique des Thermotogales basé sur l’analyse des séquences de gènes
codant l’ARNr 16S ......................................................................................................... 8
Figure 3 : Cellules de Thermotoga maritima observées au microscope électronique ............. 12
Figure 4 : Vue d’ensemble de la structure et de la cavité du site catalytique de l’hydrogénase
TmHydE de Thermotoga maritima. ............................................................................ 17
Figure 5 : Dismutation spontanée de l’ion superoxyde............................................................ 20
Figure 6 : Cascade de réactions de réduction de la molécule d’O2 en H2O par addition d’un
seul électron à la fois. ................................................................................................... 20
Figure 7 : Génération des différentes espèces réactives d’oxygène par des réactions de
transfert d’énergie ou une séquence de réduction univalente à partir de la molécule du
dioxygéne. .................................................................................................................... 21
Figure 8 : La génération des radicaux hydroxyles par la réaction de Haber-Weiss................. 21
Figure 9 : Formation des ions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène par des réactions
enzymatiques. ............................................................................................................... 22
Figure 10 : Différents systèmes de défenses antioxydants et leurs cibles................................ 23
Figure 11 : Comparaison des différentes voies de glycolyses proposées pour les microorganismes hyperthermophiles (Bacteria et Archaea). ................................................ 53
Figure 12 : Les voies possibles de fermentation du maltose et de la cellobiose en acétate,
alanine, H2 et CO2 chez Pyrococcus furiosus............................................................... 58
Figure 13 : Voie de conversion du glucose en pyruvate chez l’archaea aérobie
hyperthermophile Sulfolobus solfataricus et S. acidocaldarius et chez l’archaea
thermophile modérée Thermoplasma acidophilum via la voie ED non phosphorylée 60
Figure 14 : Voie de fermentation du glucose en acétate, CO2 et H2 chez la bactérie
hyperthermophile Thermotoga maritima via la voie EM classique ............................. 62
Figure 15 : Photo de la plateforme de fermentation pour la culture de Thermotoga maritima.
...................................................................................................................................... 72
Figure 16 : Méthode dynamique inspirée de la méthode de Bandyopadhyay et al. (1967) pour
la mesure de la vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima .............................. 77
Figure 17 : Appareillage spectroscopie RMN.......................................................................... 85
Figure 18 : Représentation schématique du motif de marquage attendu des produits de
fermentation réalisée avec C1 et C3 glucose dans le cas où la fermentation se fera
selon la voie Embden-Meyerhof (EM) ou Entner-Doudoroff (ED). ............................ 87
Figure 19 : Prélèvements pour analyse RMN des produits de la glycolyse par des cellules de
T. maritima cultivées en anaérobiose (a) et en conditions de stress oxydant long (b) en
présence de glucose marqué en C1 et C3. .................................................................... 89
Figure 20 : Effet de la concentration en extrait de levure (EL) sur la croissance de T. maritima
cultivée en anoxie en présence et en absence de réducteurs chimiques (cystéine +
Na2S)............................................................................................................................. 97
Figure 21 : Comparaison de la cinétique de croissance, de l’évolution du potentiel redox et de
la concentration en O2 dissous dans le milieu de T. maritima cultivée en anaérobiose et
en conditions de stress oxydant long (20h) ................................................................ 127
Figure 22 : Comparaison de l’évolution des métabolites dans la phase aqueuse et dans la
phase gazeuse lorsque T. maritima est cultivée en anaérobiose et en conditions de
stress oxydant long (20h)........................................................................................... 128
Figure 23 : Variation du taux d’expression des gènes induits par les conditions de stress
oxydant long. .............................................................................................................. 133
Figure 24 : Comparaison des flux de carbone chez T. maritima lors de sa croissance en
anaérobiose (graphe à gauche) et en conditions de stress oxydant long (20h) (graphe à
droite). ........................................................................................................................ 138
Figure 25 : Voies métaboliques suivies par T. maritima en présence et en absence d’oxygène
.................................................................................................................................... 138
Figure 26 : Représentation schématique du niveau d’expression de différents gènes codant des
enzymes impliquées dans la glycolyse chez T. maritima en fonction du temps de
culture dans les conditions de stress oxydant long..................................................... 141
Figure 27 : Réaction de synthèse du pyruvate à partir du glucose ......................................... 142
Figure 28 : Réaction de synthèse du 3-phosphoglycérate à partir de du 1,3-diphosphoglycérate
.................................................................................................................................... 143
Figure 29 : spectre carbone des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur
en présence de glucose marqué en C1 (13C1)............................................................. 146
Figure 30 : spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur
en présence de glucose marqué en C1 (13C1)............................................................. 147
Figure 31 : zoom du spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en
fermenteur en présence de glucose marqué en C1 (13C1) .......................................... 148
Figure 32: spectre carbone des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur
en présence de glucose marqué en C3 (13C3)............................................................. 149
Figure 33 : spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur
en présence de glucose marqué en C3 (13C3)............................................................. 150
Figure 34 : zoom du spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en
fermenteur en présence de glucose marqué en C3 (13C3) .......................................... 151
Liste des Tableaux
Tableau 1 : Propriétés physiologiques de certaines espèces des Thermotogales ..................... 10
Tableau 2 : Récapitulatif des conditions opératoires de la fermentation de T. maritima en
anaérobiose suivi de conditions oxydantes variables. .................................................. 75
Tableau 3 : Gamma étalon pour le dosage du H2O2 à l’aide de PeroXOquant TM Quantitative
Peroxide Assay Kits ..................................................................................................... 81
Tableau 4 : Estimation de la consommation abiotique et biologique de l’O2 pendant la culture
en conditions de stress oxydant long. ......................................................................... 126
Tableau 5 : Paramètres métaboliques relatifs à la fermentation du glucose par T. maritima
cultivée en fermenteur en anaérobiose et en conditions de stress oxydant long. ....... 129
Tableau 6: Comparaison du métabolisme oxydatif de T. maritima en conditions de stress long
(20h) avec les réactions classique d’oxydation complète et de la fermentation du
glucose ........................................................................................................................ 136
Introduction générale
INTRODUCTION GENERALE
1
Introduction générale
L’apparition de la vie sur terre date d’environ 3.8 millions d’années. Selon le consensus
actuel, différents phénomènes occasionnels ont conduit à l’échauffement des océans ainsi que
de l’atmosphère terrestre à des températures avoisinant les 100°C. Par conséquent, les
organismes hyperthermophiles étaient probablement les seuls habitants de la terre à cette
époque. Ainsi, la vie primitive se serait diversifiée à proximité des biotopes hydrothermaux ;
ces formes de vie hyperthermophiles étaient dotées de matériel biochimique original mais
dépourvues d’appareils photosynthétiques. C’est ainsi que ces organismes pouvaient survivre
dans une atmosphère chaude, anoxique et réduite, riche en CO2 et H2S. La création d’appareil
photosynthétique capable de scinder la molécule d’eau en oxygène, protons et électrons était
l’innovation cruciale de l’évolution de la vie sur terre. Elle a permis l’accumulation
progressive de l’oxygène dans l’atmosphère et le développement de nouvelles formes de vie
aérobies dotées d’un nouveau métabolisme respiratoire nettement plus énergétique. Face à
cette explosion de biodiversité, les micro-organismes primitifs anaérobies devraient assurer
leur survie dans une atmosphère toxique où l’oxygène représente un véritable poison et sont
dans l’obligation de s’adapter à ces conditions oxydantes.
Les micro-organismes anaérobies hyperthermophiles tels que Thermotoga maritima
représentent, à cet effet, un très bon modèle pour l’étude de l’adaptation des anaérobies à une
atmosphère s’enrichissant progressivement en oxygène.
En effet, les espèces du genre Thermotoga sont des bactéries hyperthermophiles,
fermentaires, anaérobies qui appartiennent à une des branches bactériennes les plus basses de
l’arbre phylogénétique dans le domaine des Bacteria (Woese, 1987; Huber and Stetter, 1992;
Darimont and Sterner, 1994; Nelson et al., 1999; Huber and Hannig, 2006) et peuvent,
notamment en ce qui concerne T. maritima, être considérées comme ancestrales d’un point de
vue évolutif. Ces bactéries ont été isolées de nombreux écosystèmes chauds tels que les
sources hydrothermales, les réservoirs pétroliers et les environnements marins peu profonds à
profonds (Huber and Stetter, 1992; Jeanthon et al., 1995; Fardeau et al., 1997) caractérisés par
des gradients physicochimiques importants (pH, température, oxygène, etc…) (Von Damm,
1990; Jorgensen et al., 1992; Wenzhöfer et al., 2000). Ainsi, malgré leur caractère anaérobie,
ces espèces appartenant à l’ordre des Thermotogales sont abondantes dans les environnements
chauds terrestres ou marins anoxiques mais aussi partiellement oxygénées (Huber et al., 1986;
Rusch and Amend, 2004; Rusch et al., 2005). De ce fait, il a été supposé que ces
microorganismes, étaient dotés des mécanismes biochimiques leur permettant de « tolérer »
dans une certaine mesure, la présence d’oxygène dans leur environnement (Yang and Ma,
2
Introduction générale
2005, , 2007; Le Fourn et al., 2008). L’ensemble des caractères phénotypiques avérés ou
supposés fait donc de Thermotoga maritima un bon modèle pour l’étude des réponses
physiologiques des anaérobies mises en présence d’oxygène.
Peu d’études ont été réalisées sur l’aptitude des Thermotoga spp. et des
hyperthermophiles anaérobies en général à tolérer de faibles pressions partielles d’oxygène
(Van Ooteghem et al., 2004; Eriksen et al., 2008; Le Fourn et al., 2008). Certains travaux ont
montré que T. neapolitana était capable de croître en présence de pression partielle d’oxygène
variant entre 1% à 6% (v/v) dans la phase gazeuse des milieux de cultures (Eriksen et al.,
2008). Récemment, Le Fourn et al. ont montré que T. maritima peut également se développer
dans un milieu de culture dont la phase gazeuse contenait 0.5% O2 (v/v) (Le Fourn et al.,
2008). Ces auteurs ont montré, par une étude de protéomique, qu’en présence d’oxygène, T.
maritima
surproduisait
une
flavoprotéine
homologue
à
la
rubrédoxine
oxygène
oxydoréductase isolée chez les espèces de Desulfovibrio (Le Fourn et al., 2008). Par ailleurs,
ces auteurs montraient également que l’oxygène induisait chez cette bactérie la synthèse d’un
grand nombre de protéines impliquées dans la détoxication des espèces réactives de
l’oxygène, la synthèse et/ou la réparation des ponts fer soufre des protéines à hèmes, les voies
de biosynthèse des acides aminés soufrés (cystéines et méthionine) et des exopolysaccharides.
En préliminaire à ce travail de thèse, une méthodologie spécifique de culture de T.
maritima a été validée afin de simuler des conditions physicochimiques oxydantes telles que
celles que T. maritima peut rencontrer au sein de son biotope. Ce dispositif expérimental, a
permis entre autre de réaliser des cultures comprenant des périodes alternant présence et
absence d’oxygène. Un fermenteur de 2L a été utilisé à cet effet pour étudier la croissance et
le métabolisme du glucose chez T. maritima soumis à des stress oxydants de durées variables
(expositions courtes ou prolongées à l’oxygène). Dans le cadre de ces travaux de thèse, nous
avons donc étudié les réponses métaboliques et transcriptomiques de T. maritima cultivée
dans différentes conditions de stress oxydant.
Ces études ont été réalisées au LMBEC de l’IRD à Marseille disposant des moyens de
la plateforme BIOPROCEDES pour les cultures automatisées et instrumentées conduites à
haute température en contrôlant notamment les gaz dissous comme l’oxygène.
D’autre part, la réponse cellulaire de T. maritima au stress a été étudiée par des
approches de transcriptomique et de suivi des métabolites marqués au carbone 13. Ces études
ont été réalisées en collaboration avec Alain Dolla et Françoise Guerlesquin du laboratoire
d’interactions et modulateurs de réponses IBSM CNRS Marseille.
3
Etude Bibliographique
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
4
Etude Bibliographique
I / Les membres de l’ordre des Thermotogales
I.1. Description, phylogénie et écologie
L’ordre des Thermotogales comprend des bactéries anaérobies strictes, thermophiles à
hyperthermophiles, ayant une croissance optimale à un pH proche de la neutralité et à une
température oscillant entre 60 °C et 80 °C. Cet ordre comprend neuf genres : Thermotoga
(Huber et al., 1986; Huber and Stetter, 2001a), Fervidobacterium (Patel et al., 1985; Huber et
al., 1990; Huber and Stetter, 2001b), Thermosipho (Huber et al., 1989; Ravot et al., 1996a;
Huber and Stetter, 2001b), Geotoga, Petrotoga (Davey et al., 1993; Lien et al., 1998;
l'Haridon et al., 2002; Miranda-Tello et al., 2004; Miranda-Tello et al., 2007), Marinitoga
(Wery et al., 2001), Thermococcoides (Feng et al., 2009), Kosmotoga (DiPippo et al., 2009) et
Oceanotoga (Jayasinghearachchi and Lal, 2010) (voir les arbres phylogénétiques figures 1 et
2). Ces bactéries sont de forme bacillaire, non sporulante, et sont toutes entourées par une
double enveloppe ample aux extrémités appelée « Toga ». Elles peuvent mesurer de 1 à 50
µm de longueur et de 0.4 à 1 µm de diamètre. Elles sont souvent seules ou en paires, mais
peuvent également se présenter sous la forme de filaments. Tous les membres de l’ordre des
Thermotogales ont une réaction Gram négatif, cependant, ils sont dépourvus d’acide diaminopimelique, molécule typique des bactéries à Gram négatif (Huber and Hannig, 2006). Ils
peuvent être immobiles ou mobiles grâce à la présence de flagelles (Huber and Stetter, 1998;
Huber and Stetter, 2001b). De nombreuses espèces de cet ordre tolèrent une large gamme de
salinité, ce qui reflète leur surprenante aptitude à s’adapter à de nombreux biotopes naturels
légèrement à modérément salés (Huber and Stetter, 1998). On retrouve notamment les
Thermotogales dans les sources hydrothermales continentales, ou les environnements marins
chauds et profonds ainsi que les réservoirs pétroliers présentant des salinités différentes
(Grassia et al., 1996).
Les représentants de l’ordre des Thermotogales représente avec ceux des Aquificales,
les organismes ayant la température optimale de croissance la plus élevée (de 65°C à 90°C)
dans le domaine des Bacteria (Conners et al., 2006) (tableau 1). Le positionnement
phylogénétique des Thermotogales a été le sujet de nombreux débats à cause des transferts
latéraux de gènes qui ont existé entre ces dernières et d’autres bactéries ou archées cohabitant
avec elles dans les environnements chauds (Nelson et al., 1999; Zhaxybayeva et al., 2009).
5
Etude Bibliographique
Figure 1 : Arbre phylogénique représentant les trois domaines du vivant d’après Woese modifié
(Stetter, 2006).
6
Etude Bibliographique
Les membres de l’ordre des Thermotogales possèdent une grande variété d’enzymes
thermophiles hydrolytiques pouvant être exploitées dans des applications industrielles
(Niehaus et al., 1999) ou bien d’ingénierie génétique tel que les fermentations (Jiang et al.,
2006). En effet, ces enzymes se caractérisent par leur grande thermostabilité et présentent des
températures de dénaturation souvent supérieures à la température optimale de croissance des
bactéries (supérieure à 80°C).
I.2. Métabolisme des Thermotogales
Les Thermotogales sont des micro-organismes organotrophes qui fermentent les
carbohydrates ainsi que les composés organiques complexes contenus l’extrait de levure ou
les peptones. Ces derniers composés stimulent la croissance de ces bactéries. A titre
d’exemple, T. lettingae est capable de métaboliser le méthanol, seulement en présence
d’extrait de levure (Balk et al., 2002). A partir du glucose, les Thermotogales produisent
majoritairement du L(+) lactate, de l’acétate, du dioxyde de carbone et l’hydrogène et selon
les espèces de l’éthanol et/ou de la L-alanine. Certaines espèces forment en plus des traces
d’acide isovalérique, d’acide isobutyrique, d’α-aminobutyrate, d’hydroxy-phénylacétate et de
phénylacétate, le plus souvent à partir de l’extrait de levure. La production de la L-alanine à
partir des sucres par les Thermotogales est un caractère qu’elles ont en commun avec les
archées de l’ordre des Thermococcales. De ce fait, la production de L-alanine à partir des
sucres pourrait être
considérée comme un métabolisme ancestral (Ravot et al., 1996b)
prévenant de l’accumulation, dans le milieu de culture, de deux produits toxiques que sont
l’hydrogène et l’ammonium.
L’accumulation d’hydrogène est inhibitrice pour la croissance des Thermotogales
(Huber et al., 1986). Cette inhibition peut être levée par l’addition dans le milieu de
thiosulfate ou de soufre élémentaire utilisés comme accepteurs finaux d’électrons (Ravot et
al., 1995). Dans ce cas, du sulfure est formé (Huber et al., 1986; Huber and Stetter, 1992).
I.3. T. maritima : phylogénie et métabolisme
En ce qui concerne plus particulièrement Thermotoga maritima (MSB 8) (DSM 3109),
notre modèle d’étude, c’est une bactérie anaérobie stricte hyperthermophile, qui a été isolée
de sédiments marins profonds en Italie (Vulcano) et au Portugal (Açores) (Huber et al., 1986).
T. maritima est extrêmement sensible à l’oxygène, mais malgré son caractère anaérobie strict,
cette dernière possède des enzymes non sensibles à l’oxygène (Huber and Hannig, 2006).
7
Etude Bibliographique
Figure 2: Arbre phylogénétique des Thermotogales basé sur l’analyse des séquences de
gènes codant l’ARNr 16S
(Huber and Hannig, 2006; Jayasinghearachchi and Lal, 2010).
8
Etude Bibliographique
Ainsi, elle tolère l’oxygène à de faibles pressions partielles, ce qui lui permet d’avoir
une large distribution dans les environnements chauds et profonds marins soumis à des
conditions oxygénées.
En se fondant sur les analyses de comparaison de séquences des gènes codant pour
l’ARNr 16S, il a été démontré en 1987 que T. maritima appartenait à une des branches
bactériennes les plus ancestrales étant donné sa position très basse dans l’arbre
phylogénétique (Huber et al., 1986; Woese, 1987). Ce résultat a été confirmé par la suite par
l’analyse phylogénétique de nombreux autres gènes codant l’ARNr 23S, par exemple,
l’élongation du facteur Tu et G, la sous unité β des enzymes ATPases, les ferredoxines, et le
gène fus (Bachleitner et al., 1989; Schleifer and Ludwig, 1989; Tiboni et al., 1991; Ludwig et
al., 1993; Blamey et al., 1994; Darimont and Sterner, 1994) et aussi grâce à l’analyse de son
génome (Fitz-Gibbon and House, 1999). Il existe cependant deux autres hypothèses, en terme
d’évolution, qui suggèrent que (i) la séquence bactérienne de la large sous unité de l’ARN
polymérase de T. maritima est positionnée à proximité des chloroplastes ou que (ii) l’ADN
polymérase de T. maritima est proche de Clostridium acetobutylicum, phylum des Firmicutes
(Palm et al., 1993).
T. maritima possède un pourcentage GC de son ADN de l’ordre de 46 mol%. Les
cellules sont mobiles grâce à un flagelle unique subpolaire (figure 3).
T. maritima, pousse dans une gamme de températures comprises entre 55°C et 90°C
avec une température optimale de croissance à 80°C, un pH optimal de 6.5 environ (pH de
croissance entre 5.5 et 9), et une salinité optimale de 2.7% (salinité de croissance entre 0.25 et
3.75%) (Huber et al., 1986).
Le génome de T. maritima a été séquencé en 1999. Il consiste en un seul chromosome
circulaire de taille 1,86 Mb (G+C : 46%) formé de 1877 régions codantes ; 54% de ces
régions codent pour des fonctions bien déterminées, alors que 46% sont inconnus de nos jours
(Nelson et al., 1999).
T. maritima est caractérisée par un métabolisme fermentaire. En effet, elle est capable
de fermenter les carbohydrates en lactate, acétate, CO2 et H2 (Huber et al., 1986)
principalement via la voie de Embden-Meyerhof (Schröder et al., 1994) et rarement via la
voie Entner-Doudoroff (Schröder et al., 1994; Selig et al., 1997). T. maritima métabolise de
nombreuses molécules simples et complexes de carbohydrates tels que le glucose, le sucrose,
l’amidon, la cellulose et le xylane (Huber et al., 1986). L’impressionnante capacité
métabolique de cette bactérie à dégrader les carbohydrates se retrouve dans son génome où il
9
Etude Bibliographique
Tableau 1 : Propriétés physiologiques de certaines espèces des Thermotogales
(Huber and Hannig, 2006).
10
Etude Bibliographique
a été démontré qu’au moins 7% de ses gènes étaient impliqués dans l’utilisation de ces
composés (Nelson et al., 1999).
Récemment, Vargas et al (1998) ont montré que T. maritima était capable d’oxyder l’H2
en présence de Fe (III) comme accepteur d’électrons (Vargas et al., 1998). Cependant dans
ces conditions, aucune croissance n’est obtenue (Huber and Stetter, 2001b). En revanche, la
présence de soufre élémentaire ou de thiosulfate comme accepteurs d’électrons, favorise la
croissance bactérienne des cellules de T. maritima (Huber et al., 1986; Ravot et al., 1995).
Cette dernière est en effet capable de réduire les composés soufrés (thiosulfate ou soufre
élémentaire) pour produire H2S. Dans ces conditions, l’H2, inhibiteur de la croissance
cellulaire de T. maritima est éliminé.
11
Etude Bibliographique
Figure 3 : Cellules de Thermotoga maritima observées au microscope électronique
à gauche : cellule flagellée (barre = 1 µm), à droite : coupe ultra fine d’une cellule de T.
maritima avec son enveloppe « toga » aux extrémités (barre = 1 µm)(Huber and Hannig,
2006)
12
Etude Bibliographique
II / Hydrogène et hydrogénases
II.1. Mécanisme de la production d’hydrogène : la fermentation à haute
température
L’hydrogène est une source d’énergie propre ayant un grand potentiel énergétique, non
polluante et peut être produit à partir de matières premières renouvelables (Johnston et al.,
2005). L’hydrogène est obtenu par pyrolyse, électrolyse ou par des bioprocédés utilisant les
micro-organismes. La production d’H2 biologique par fermentation ou par photosynthèse est
très attractive de part ses avantages environnementaux (dépollution des déchets), sa faible
demande en énergie et son coût réduit (Levin, 2004). Elle peut être réalisée à partir de
nombreux déchets industriels et ménagers contenant des carbohydrates qui peuvent de ce fait
être recyclés (Hallenbeck and Benemann, 2002).
La fermentation en condition de haute température s’avère très prometteuse dans la
mesure où la solubilité de la matière organique et les cinétiques de réaction sont améliorées.
Par ailleurs, dans le cadre de procédés industriels, le risque de contamination par d’autres
micro-organismes est réduit (Nguyen et al., 2008).
C’est ainsi que certains thermophiles à hyperthermophiles de l’ordre des Thermotogales
ont été choisis comme candidats potentiels pour la bioconversion industrielle des déchets en
H2 (Jannasch et al., 1988). Ils sont capables de produire des quantités importantes d’H2
(Belkin et al., 1986). Des rendements de 4 moles H2 par mole de glucose consommé
correspondant au taux de production théorique maximum (Schröder et al., 1994) ont été
rapportés chez Thermotoga maritima MSB8, DSM 3109. Ce taux maximum est atteint grâce
au caractère quasi homoacétogène de T. maritima. Cependant, bien que la production d’H2,
par les membres des Thermotogales, a longtemps été considérée comme un processus
strictement anaérobie, de récentes études ont montré que cette production pouvait s’établir à
de faibles pressions partielles d’oxygène (Van Ooteghem et al., 2004; Van Ooteghem, 2005;
Yang and Ma, 2005).
Par exemple, en ce qui concerne T. neapolitana, une bactérie phylogénétiquement
proche de T. maritima, Van Ooteghem et al. (2002) ont montré que sa production
d’hydrogène, n’est pas affectée par des concentrations en oxygène de l’ordre de 6-12% (v/v
dans la phase gazeuse) (Van Ooteghem et al., 2002). Dans ces conditions, 25 à 30% d’H2
(v/v dans la phase gazeuse) sont produits dans la phase gaz d’un fermenteur. Quelques années
plus tard, ce résultat a été corroboré par Eriksen et al. (2008) qui a testé la productivité de l’H2
13
Etude Bibliographique
par cette même bactérie en condition de microaérophilie (Eriksen et al., 2008). Cette capacité
à produire de l’H2 en condition de microaérophilie est due aux caractéristiques
physicochimiques des hydrogénases de cette bactérie. Bien que les hydrogénases productrices
d’H2 sont souvent inhibées par l’O2, Kaslin et al. (1998) ont néanmoins décrit une
hydrogénase insensible à l’O2 chez T. neapolitana, ce qui expliquerait l’aptitude de cette
souche à produire de l’H2 malgré la présence d’O2 (Käslin et al., 1998).
Ainsi, la production d’H2 revêt un intérêt particulier chez T. maritima, notre modèle
d’étude au cours de ce travail. Il s’agit donc de s’intéresser aux hydrogénases en général et à
celles de T. maritima en particulier. Cet aspect est développé ci-dessous.
II.2. Caractéristiques générales des hydrogénases
L’hydrogénase, en catalysant l’oxydation réversible de l’H2, permet aux microorganismes d’utiliser l’H2 comme source d’énergie ou d’évacuer l’excès des équivalents
réducteurs (Vignais et al., 2001) en le produisant. En ce qui concerne son activité oxydante,
elle est dépendante de son cofacteur (ion métallique présent au niveau de son site catalytique)
(Hartmann et al., 1996; Thauer et al., 1996). Les hydrogénases qui catalysent l’oxydation d’
H2 sont dites « consommatrices » ou « uptake » hydrogénases. Les hydrogénases capables,
soit d’oxyder H2 soit de le produire sont dites « réversibles » (Wu and Mandrand, 1993).
Les « uptake » hydrogénases sont présentes chez les bactéries anaérobies strictes,
anaérobies facultatives ou aérobies. L’oxydation de H2 est couplée à la réduction d’un
accepteur final d’électrons tel que l’oxygène, le nitrate, le sulfate, le dioxyde de carbone et le
fumarate. Cette respiration permet la production d’énergie. De telles hydrogénases sont dans
la plupart des cas appelées hydrogénases NiFe en raison de la présence d’un groupement Fe-S
et un ion de nickel au sein de leur site catalytique (Albracht, 1994).
Les hydrogénases « réversibles » qui catalysent la production d’hydrogène, sont
présentes quant à elles dans les bactéries anaérobies strictes ou facultatives et dans les microorganismes photosynthétiques. Lors de la fermentation d’acides tels que le pyruvate, la
réduction de protons permet d’éliminer l’excès de pouvoir réducteur et de maintenir un pH
cellulaire constant (Rodrigue, 1997). Ce groupe d’hydrogénases ne contient généralement que
le groupement Fe-S dans les sites catalytiques de l’enzyme et sont appelées hydrogénases à
fer (Adams, 1990). Verhagen et al. ont purifié des hydrogénases à fer de micro-organismes
tels que Clostridium pasteurianum et Desulfovibrio desulfuricans (Verhagen et al., 1999).
14
Etude Bibliographique
Cependant, il existe une hydrogénase particulière qui n’appartient à aucune classe
d’hydrogénases précédemment décrites. Celle-ci a été isolée à partir d’une bactérie
méthanogène et ne renferme aucun groupement métallique au niveau de son site catalytique
(Hartmann et al., 1996; Thauer et al., 1996).
II.3. Caractéristique de l’hydrogénase de Thermotoga maritima
L’hydrogénase de T. maritima est une hydrogénase à fer (Juszczak et al., 1991)
contenant deux groupements [2Fe-2S] et deux groupements [4Fe-4S] par sous unité. Cette
hydrogénase est formée de deux sous unités de même poids moléculaire (70 kDa environ sous
unité α et β) et d’une troisième sous unité un peu plus petite (19 kDa environ sous unité γ) :
c’est une enzyme hétéro trimère, une structure nettement plus complexe des hydrogénases à
fer des micro-organismes mésophiles (figure 4) (Verhagen et al., 1999). La sous unité α
présente une longueur de 645 acides aminés et elle représente la plus grande hydrogénase à
fer connue à ce jour. Les deux sous unités β et γ stabilisent la sous unité catalytique α.
Cependant, la présence de nombreux centres Fe-S dans la sous unité β suggère que ce n’est
pas sa fonction primaire. Il semblerait que la sous unité β serait plutôt capable d’oxyder un
donneur d’électrons spécifique et de transférer par la suite ces électrons jusqu’à la sous unité
catalytique α. Toutefois des analyses réalisées in vitro montrent que, ni le NADH ni la
ferrédoxine réduite, générés pendant la fermentation des sucres (Schönheit and Schäfer,
1995), ne sont utilisés comme donneurs d’électrons à l’holoenzyme pour la production d’H2.
T. maritima peut aussi évacuer son pouvoir réducteur en excès sur l’hydrogène en présence de
soufre élémentaire ou de thiosulfate, sous forme de H2S (Ravot et al., 1995) ; ces réactions
semblent ne pas impliquer l’hydrogénase (Verhagen et al., 1999). En se fondant sur les
analyses de séquences de ces sous unités, il a été proposé que la sous unité β renferme une
flavoprotéine à Fe-S capable d’utiliser le NADH comme donneur d’électrons; la sous unité γ,
qui renferme les centres [2Fe], possède une fonction réductrice et transfère les électrons de
l’unité β à l’unité α, qui elle, comprend le site catalytique (Tosatto et al., 2008).
L’activité spécifique de consommation d’H2 de cette enzyme varie entre 45 et 70 U.mg1
, celle de production d’H2 varie entre 9 et 15 U.mg-1. Par comparaison avec les activités
spécifiques des hydrogénases I de C. Pasteurianum ou des hydrogénases des espèces de
Desulfovibrio, l’activité spécifique de l’hydrogénase de T. maritima est considérablement plus
faible. Pour cela, la comparaison du turnover de cette enzyme paraît plus judicieuse. En effet,
le turnover de l’hydrogénase de T. maritima varie entre 120 et 190 s-1 pour la consommation
15
Etude Bibliographique
et 24 à 40 s-1 pour la production. Ces valeurs sont comparables à celles reportées
précédemment chez C. Pasteurianum, M. entierelsdenii et T. entier vaginalis (Van Dijk et al.,
1979; Payne et al., 1993). Des études comparatives ont montré une très grande similitude
entre la sous unité α de l’hydrogénase de T. maritima et les autres hydrogénases à fer ; ceci
suggère que cette classe d’enzyme est extrêmement conservée dans les branches basses du
domaine bactérien.
16
Etude Bibliographique
Figure 4 : Vue d’ensemble de la structure et de la cavité du site catalytique de l’hydrogénase TmHydE de Thermotoga maritima.
A et B sont deux vues orthogonales de la structure cristallographique de la TmHydE. Le support β constituant la barrière est représenté
en rouge; ses hélices correspondantes sont représentées en bleues. Les trois hélices additionnelles N-terminales sont représentées en rose,
le support C terminal additionnel en vert et la boucle lid putative en violet. Les images sont générées en utilisant MolScript (Kraulis,
1991) et Raster3D (Merritt and Bacon, 1997).
17
Etude Bibliographique
III / Stress oxydant chez les procaryotes
III.1. Apparition de l’O2 dans l’atmosphère et sensibilité des bactéries
anaérobies vis-à-vis de l’O2
La photosynthèse constitue le processus dominant ayant conduit à l’enrichissement de
l’atmosphère et des océans en oxygène, élément essential pour la survie des formes de vie
aérobies. L’appareil photosynthétique capable de photolyser la molécule d’eau en oxygène,
protons et électrons, a donc constitué une importante étape de l’évolution de la vie sur terre.
L’oxygène est apparu dans l’atmosphère terrestre il y a environ 2-2,5 milliards d’années grâce
en particulier à l’activité des bactéries photosynthétiques. Cette apparition sous forme de
traces a obligé dans un premier temps les micro-organismes strictement anaérobies à s’adapter
à une atmosphère de plus en plus oxydante. Il est fort probable que ces premiers organismes
aient mis en place des mécanismes de défense vis-à-vis de l’effet toxique de l’O2 et de ses
produits dérivés (Fridovich, 1978; Gille and Sigler, 1995). On sait aujourd’hui que plusieurs
bactéries anaérobies tolèrent une courte période d’oxygénation et retrouvent leur croissance
dès la restitution des conditions d’anaérobiose (Rocha et al., 1996; Karnholz et al., 2002). La
consommation de l’O2 par les bactéries anaérobies a fait l’objet d’un long débat jusqu’à ce
jour. Certains chercheurs vont même jusqu’à penser que quelques bactéries anaérobies
effectuent une vraie respiration en présence de faibles pressions partielles d’O2 (Cypionka,
2000) ; ou bien que la consommation de l’O2 est complètement futile à cause de l’autooxydation de la déshydrogénase flavine (Oparin, 1964). Cependant, il existe également des
micro-organismes anaérobies dont on connaît la grande sensibilité vis à vis de l’O2
(Fridovich, 1998). L’aérotolérance varie donc beaucoup d’une espèce anaérobie à une autre.
En effet, une minute d’exposition à une concentration de l’ordre du nano molaire d’O2 peut
être létale à certaines archées méthanogènes alors que d’autres bactéries sulfato-réductrices du
genre de Desulfovibrio restent viables après une diffusion accidentelle de l’O2 dans leur
habitat pendant un jour ou plus. Dans ce cas, l’O2 est un élément bactériostatique et non
bactéricide.
Les facteurs responsables de l’aérotolérance chez les bactéries anaérobies sont les
suivants : l’expression des enzymes impliquées dans la défense contre l’oxygène tels que la
catalase et la superoxyde dismutase (enzymes intervenant pour décomposer les espèces
réactives d’oxygène, intermédiaires générés au cours de la réduction de l’oxygène)
(Brioukhanov et al., 2002; Brioukhanov and Netrusov, 2004), la présence de composés
18
Etude Bibliographique
cellulaires insensibles à l’effet toxique de l’O2, l’aérotactisme, l’expression des
chémorécepteurs transmembranaires, l’aptitude des réducteurs cellulaires à piéger l’O2 et
enfin, le taux et les mécanismes de consommation de ce dernier par les systèmes
enzymatiques propres à la cellule (Morris, 1976). Tous ces systèmes de défense assurent la
viabilité des micro-organismes anaérobies stricts dans des conditions d’aérobiose transitoires
ou en présence des produits de la réaction de réduction incomplète de l’O2 dans leur
environnement (Brioukhanov and Netrusov, 2007).
Pour résumer, on peut définir chez les anaérobies celles qui sont sensibles à l’O2, celles
dites aérotolérantes qui peuvent supporter la présence d’O2 à faible pression partielle et
finalement celles dites microaérophiles qui comme certaines bactéries sulfato-réductrices
peuvent consommer l’O2 à faible pression partielle d’O2.
La différence de sensibilité des bactéries, notamment celles anaérobies, vis-à-vis de l’O2
est aussi observée vis-à-vis des espèces réactives de l’oxygène. Les réactions chimiques et
cellulaires conduisant à la formation de ces composées toxiques pour la cellule sont discutées
dans le paragraphe suivant.
III.2. Génération des espèces réactives de l’O2
On qualifie le « stress oxydant » comme l’état décrivant un déséquilibre dans la cellule
entre production et consommation des espèces réactives d’O2 (ERO). Une augmentation
incontrôlée de la concentration basale de ces antioxydants conduit à des réactions en chaînes
réalisées par l’intermédiaire des radicaux libres pouvant attaquer les protéines (Stadtman and
Levine, 2000), les lipides (Rubbo et al., 1994), les polysaccharides (Kaur and Halliwell, 1994)
ainsi que l’ADN (Richter et al., 1988; LeDoux et al., 1999).
Les espèces réactives d’oxygène désignent une variété de molécules et de radicaux
libres dérivant de l’oxygène moléculaire. Ce dernier, dans son état fondamental, présente une
structure bi radicalaire formée de deux électrons non appariées sur sa dernière couche. Etant
donné que ces deux électrons présentent le même spin, l’oxygène ne peut réagir qu’avec un
seul électron à la fois, ce qui diminue considérablement sa réactivité avec les espèces non
radicalaires (Fridovich, 1998). Par contre, lorsque l’un des deux électrons de l’oxygène est
excité et change de spin, il se forme une espèce appelée oxygène singulet. Cette molécule
devient un oxydant puissant étant donné que ses deux électrons, de spins opposés, peuvent
réagir instantanément avec d’autres paires d’électrons appartenant à un autre atome ou une
autre molécule (Turrens, 2003).
19
Etude Bibliographique
La majorité des espèces réactives de l'oxygène présentent un caractère radicalaire. Un
radical libre, est une entité chimique possédant un ou plusieurs électrons non appariés sur sa
couche externe. La présence d'un électron célibataire confère à ces molécules, la plupart du
temps, une grande instabilité ce qui signifie qu'elles ont la possibilité de réagir avec de
nombreux composés dans des processus le plus souvent non spécifiques, et que leur durée de
vie en solution est très courte.
La réaction de réduction de l’oxygène par addition d’un seul électron à la fois, produit
des intermédiaires hautement instables : l’anion superoxyde (O2_•), issu de l’ajout d’un seul
électron à la molécule d’oxygène (réduction monoélectronique du dioxygène), est le
précurseur de la plupart des ERO et est le médiateur des chaînes de réactions d’oxydation. La
dismutation de O2_• (spontanément ou à travers la réaction enzymatique catalysée par la
superoxyde dismutase) conduit à la formation du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un composé
pouvant être réduit totalement en eau ou partiellement en radical hydroxyle (OH•), l’un des
plus puissant oxydant présent dans la nature (Turrens, 2003) (figure 5).
5
-1
-1
(k = 3×10 M .s à pH 7.4, 25 °C)
Figure 5 : Dismutation spontanée de l’ion superoxyde
(Halliwell, 1990).
La formation de OH• est catalysée par des métaux de transition réduits. Ces derniers
peuvent être réduit par l’anion superoxyde O2_• ; ce qui conduit inévitablement à la
propagation de ces réactions d’oxydation en cascades (Liochev and Fridovich, 1999) (figure 6
et 7).
Figure 6 : Cascade de réactions de réduction de la molécule d’O2 en H2O par addition
d’un seul électron à la fois.
20
Etude Bibliographique
Figure 7 : Génération des différentes espèces réactives d’oxygène par des réactions de
transfert d’énergie ou une séquence de réduction univalente à partir de la molécule du
dioxygéne.
Contrairement à la molécule d’O2, l'ion superoxyde est diamagnétique. L'ion
superoxyde, est naturellement produit dans toutes les cellules des êtres vivants respirant le
dioxygène, en particulier dans les mitochondries des cellules eucaryotes. In vivo, l’anion
superoxyde est produit par des processus enzymatiques ou non enzymatiques. Les enzymes
peuvent être soit des NADPH oxydases (Babior, 2000; Babior et al., 2002; Vignais, 2002),
soit des oxygénases cytochrome P450 dépendantes (Coon et al., 1992). La formation non
enzymatique de O2
_•
survient lorsqu’un seul électron est transféré directement sur l’oxygène
à l’aide de coenzymes réduits ou de coenzymes de groupes prosthétique (tels que les flavines
ou les groupements Fe-S). Ce composé est toxique et sa toxicité a principalement pour origine
la réaction de Haber-Weiss (figure 8). En effet le superoxyde peut réagir avec le peroxyde
d'hydrogène, pour donner le radical hydroxyle hautement réactif, qui peut être à l'origine de
l'oxydation des constituants cellulaires. Cette réaction est catalysée par des ions de certains
métaux de transition, tels que le fer ou le cuivre.
Figure 8 : La génération des radicaux hydroxyles par la réaction de Haber-Weiss.
Un deuxième exemple, le peroxyde d'hydrogène (H2O2) est produit par les microorganismes et est ensuite décomposé par les peroxydases afin de produire de
l'hypothiocyanite.
La molécule de peroxyde d’hydrogène est l’intermédiaire le plus stable du processus de
réduction de l’oxygène. Elle est aussi formée pendant la réaction de dismutation des radicaux
21
Etude Bibliographique
superoxyde et l’oxydation d’une grande variété de composés cellulaires réduits tels que les
flavoprotéines et les protéines à fer (Fridovich, 1978; Storz and Imlay, 1999). Le peroxyde
d’hydrogène est capable de réagir avec les ions ferreux et d’autres métaux de transition pour
former d’autres molécules oxydantes plus toxiques et très réactives comme les radicaux
hydroxyles (réaction Fenton figure 8), les radicaux alkoxyles et les complexes fer-oxygène
(Halliwell and Gutteridge, 1984; Liochev and Fridovich, 1994).
La réaction de dismutation spontanée du superoxyde donne lieu à la formation du
peroxyde d’hydrogène et de l’oxygène singulet (Fridovich, 1978). Aussi, le radical
superoxyde ainsi que le peroxyde d’hydrogène peuvent être formés au cours de la réaction
d’auto oxydation des enzymes dehydrogénases, des cytochromes, des catéchols, des thiols,
des flavines et des oxydases causée par l’irradiation UV (Farr and Kogoma, 1991) (figure 9).
Figure 9 : Formation des ions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène par des
réactions enzymatiques.
Les ERO peuvent ainsi être générées soit par réduction enzymatique de l’O2, soit par
une auto oxydation, en présence d’oxygène, de certaines protéines réduites tels que les
cytochromes ou les flavoprotéines (Cypionka, 2000). De plus, l’auto oxydation chimique du
sulfure d’hydrogène, un métabolite produit par les bactéries sulfato-réductrices anaérobies
strictes, par exemple, résulte en la formation de ces espèces réactives (Cypionka et al., 1985).
Les micro-organismes possèdent un certain nombre de moyens de défenses contre les
ERO. Ils mettent en jeu des enzymes comme les superoxydes dismutases, les catalases, la
glutathion peroxydase et la glutathion réductase. Lorsque ce système devient inéfficace pour
la détoxication des ERO présentes dans la cellule, l'organisme est dans une situation de stress
oxydant.
D'autres antioxydants (espèces chimiques empêchant les réactions d'oxydation
dommageables causées par les ROS) sont des petites molécules telles que les vitamines E et
C, les caroténoïdes, certains polyphénols, et des huiles essentielles (figure 10).
22
Etude Bibliographique
Figure 10 : Différents systèmes de défenses antioxydants et leurs cibles
(en bleu les systèmes enzymatiques).
23
Etude Bibliographique
III.3. Effets toxiques de l’O2 et des ROS sur les cellules bactériennes
Les produits de la réduction incomplète de l’O2 tels que le radical superoxyde (O2- ), le
peroxyde d’hydrogène (H2O2), le radical hydroxyle (OH ) et même l’O2 sont toxiques et
endommagent les macromolécules cellulaires. Les ERO sont des espèces chimiques à très
forte réactivité vis-à-vis des composants cellulaires. Ces réactions altèrent les propriétés
intrinsèques des membranes (tels que la fluidité), le transport des ions, la perte des activités de
certaines enzymes, la dénaturation des protéines, l’inhibition de la synthèse protéique, et
l’altération de l’ADN, ce qui conduit à la mort cellulaire (Halliwell and Gutteridge, 1990).
Certaines des conséquences des radicaux libres in vivo sont très bien connues de nos jours, et
elles impliquent l’altération de la cohésion de la molécule d’ADN (Brawn and Fridovich,
1981), la modification des acides nucléiques (Moody and Hassan, 1982), l’oxydation des
protéines (Stadtman, 1990; Pacifici et al., 1993) et la peroxydation des lipides (Halliwell and
Gutteridge, 1990). Cette dernière réaction génère des produits tel que le malondialdehyde ou
les aldéhydes insaturés qui se lient à la molécule d’ADN et engendre des lésions et des
mutations (Chaudhary et al., 1994; Douki and Ames, 1994). De plus, l’ADN polymérase
(Feig and Loeb, 1993; Taguchi and Ohashi, 1998) et les enzymes réparatrices de l’ADN
(Wiseman and Halliwell, 1996) sont aussi la cible des attaques par les ERO, ce qui provoque
une altération de la fidélité de réplication de l’ADN et une réduction de l’efficacité de la
réparation des lésions. On assiste alors, à une cascade de réactions qui endommage la totalité
de la cellule.
Le superoxyde, le radical le plus répandu, altère tous les composants cellulaires en plus
des structures subcellulaires et des macromolécules (Farr and Kogoma, 1991). De plus le
superoxyde est caractérisé par sa capacité de diffusion considérable et sa grande sélectivité de
réaction vis-à-vis des protéines intracellulaires, une sélectivité nettement supérieure à celle du
H2O2 ou le radical hydroxyle (Fridovich, 1999). Par exemple, le superoxyde est responsable
de la rupture des ponts peptidiques, de la dépolymérisation des acides nucléiques, de
l’oxydation des groupes sulfhydriles et du groupe des enzymes à centre [4Fe-4S] (avec le
relarguage concomitant d’ions fer) et finalement de l’oxydation des membranes lipidiques,
des polysaccharides et des acides gras poly insaturés (Storz et al., 1990; Imlay, 2003).
L’implication du H2O2 dans la réaction de Fenton (figure 8) le rend plus toxique pour la
cellule. Dans le cas où la réaction Fenton implique des molécules d’ADN ou des membranes
bactériennes associées à des ions fer, la cellule est détruite. Par ailleurs, des peroxydes
organiques peuvent se formés dans la cellule et initier des chaînes de réactions d’oxydation
24
Etude Bibliographique
des lipides conduisant à la détérioration de l’ADN et des membranes cellulaires (Halliwell
and Gutteridge, 1984; Liochev and Fridovich, 1994; Keyer and Imlay, 1996). Bien que les
espèces réactives d’O2 causent, dans la majorité des cas, des dommages cellulaires, l’O2 luimême est aussi responsable (i) de la désactivation irréversible de certaines protéines
périplasmiques critiques tels que les hydrogénases à fer réduit (Cammack et al., 1994; Vincent
et al., 2005) et les lactate déshydrogénases (Stams and Hansen, 1982) et (ii) de la modification
des paramètres physicochimiques de l’environnement tels que le potentiel redox et le pH.
Dans le cas des bactéries aérobies, le stress oxydant est une conséquence inévitable de
la respiration aérobie. La réduction de l’O2 en H2O est une réaction qui nécessite quatre
électrons et génère des molécules intermédiaires telles que le superoxyde (O2 -), le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (OH ).
Il est à noter que lors de la croissance de bactéries anaérobies, les ERO sont également
formés même en conditions anoxiques (Poole, 1994; Valentine et al., 1998; Lumppio et al.,
2001). Les bactéries anaérobies ont donc également besoin des enzymes « du stress
oxydant » pour se prémunir de l’accumulation et pour décomposer les molécules des ERO
(Storz et al., 1990). Le stress oxydant chez les micro-organismes est induit par la présence,
dans la cellule, du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène à des concentrations
intracellulaires relativement faibles de l’ordre du nano molaire et du micro molaire
respectivement (Imlay, 2003; Kurtz, 2004).
III.3.1. Peroxydation des lipides
Les lipides sont facilement oxydés par l’oxygène et ses espèces réactives. Lorsque les
membranes cellulaires sont endommagées, le transport des nutriments ainsi que la circulation
des protons et par voie de conséquence la synthèse d’ATP sont perturbés (Farr et al., 1988).
Quand ces dommages se poursuivent dans le temps, la cellule lyse (Demple, 1991).
Les radicaux libres d’O2 catalysent l’oxydation des lipides. La présence d’une double
liaison adjacente à un groupement méthyle fragilise la liaison méthyle C-H des acides gras
polyinsaturés et par la suite l’hydrogène devient très facile à « arracher » (Bandyopadhyay et
al., 1999). La peroxydation des lipides est initiée par le radical hydroxyle (OH ), alkoxyle
(RO ) et peroxyle (ROO ) (Turrens and Boveris, 1980). Ceci entraîne une perturbation du
processus étant donné que le radical peroxyle est en même temps un initiateur et un produit de
la réaction de peroxydation des lipides. Les radicaux peroxy lipidiques générés, vont inter
réagir avec les autres molécules lipidiques, protéiques ainsi que les acides nucléiques et le
25
Etude Bibliographique
transfert d’électrons se propage jusqu’à l’oxydation des différents substrats. Les membranes
cellulaires formées de nombreux acides gras insaturés, sont hautement sensibles à ces attaques
d’oxydation, ce qui entraîne des modifications de leurs fluidités, perméabilités et fonctions
métaboliques (Bandyopadhyay et al., 1999).
III.3.2. Altération de l’ADN
Les ERO sont également responsables de l’altération de l’ADN, ce qui inclut la
mutation des paires de base, leur réarrangement, la délétion ou l’insertion de quelques bases,
ou encore l’amplification de certaines régions (Wiseman and Halliwell, 1996). Les différents
radicaux libres affectent l’ADN différemment. Par exemple, l’anion superoxyde et le
peroxyde d’hydrogène ne réagissent pas avec les bases azotées de l’ADN, le radical
hydroxyle attaque toutes les bases de l’ADN et génère une multitude de produits (Halliwell
and Aruoma, 1991). L’oxygène singulet quand a lui attaque spécifiquement la guanine (van
den Akker et al., 1994).
Ces radicaux ciblent l’ADN à cause de la localisation cellulaire des ions Fe2+ au niveau
des ponts phosphodiester des acides nucléiques ; ainsi le mécanisme de défense contre la
toxicité de ces composés implique une minimisation de leur production et une élimination
rapide des radicaux dont la production est inévitable.
Les ERO endommagent l’ADN nucléaire et mitochondriale. Les altérations incluent la
modification des bases azotées, l’oxydation des désoxyriboses, la rupture de la structure et des
liaisons ADN-protéines. Parmi les différents ERO, OH génère des produits variés à partir des
bases de l’ADN ; par exemple la réaction de C-8 hydroxylation de la guanine a pour produits :
le
8-oxo-7,8
dehydro-2’-deoxyguanosine;
le
2,6-diamino-4-hydroxy-5-
formamimodipyrimidine, le 8-OH-adenine, le 2-OH-adenine, le thymine glycol, le cytosine
glycol, etc... (Wiseman and Halliwell, 1996). Les ERO peuvent aussi provoquer la mutation
de l’ADN en modifiant d’une manière sélective les sites G : C entraînant ainsi la formation
des cellules cancéreuses (Weitzman et al., 1994).
Chez Clostridium acetobutylicum et Desulfovibrio gigas, on a montré une inhibition par
l’O2 de la croissance cellulaire et de la synthèse de l’ADN (conséquence de l’inactivation de
la ribonucléotide réductase) (O'Brien and Morris, 1971; Fareleira et al., 2003). O’Brien et
Morris (1971) proposent que l’O2 réagit avec les systèmes d’oxydation des NAD(P)H des
espèces de Clostridium et engendrent l’oxydation des donneurs d’électrons, tel que la
molécule de NAD(P)H, requise dans le métabolisme cellulaire central ; ce qui conduit à
26
Etude Bibliographique
l’altération des systèmes assurant le maintien de la balance du redox interne au sein des
cellules (O'Brien and Morris, 1971; Morris, 1976). Le stress oxydant endommage aussi
l’ADN d’autres souches anaérobies strictes tel que Prevotella melaninogenica par
l’intermédiaire des molécules d’O2 et de H2O2 (Takeuchi et al., 1999).
III.3.3. Oxydation des protéines
Les effets de l’oxygène sur les protéines incluent l’oxydation des aminoacides (tels que
la cystéine ou la méthionine) ainsi que des changements dans les centres actifs des
métalloenzymes (Davies and Lin, 1988) pouvant même jusqu’à entraîner une rupture des
chaînes polypeptidiques et la formation d’agrégats protéiques (Stadtman and Levine, 2003).
L’ion superoxyde détruit les ponts Fe-S provoquant ainsi la perte de l’activité enzymatique
(Flint et al., 1993). De plus, l’ion de fer libéré dans le cytosol catalyse l’oxydation de l’ADN
par l’intermédiaire du peroxyde (Keyer and Imlay, 1996). Le peroxyde d’hydrogène oxyde,
quant à lui, les enzymes à groupements thiols et cause leur désactivation. Il réagit également
avec les ions Fe2+ pour produire des radicaux hydroxyles, qui sont de puissants oxydants
capables d’oxyder la plupart des biomolécules (Dolla et al., 2006).
Chez les eucaryotes lors du transit d’électrons au sein de la membrane cytoplasmique de
la mitochondrie, il se forme des radicaux libres qui stimulent la dégradation des protéines.
L’oxydation des protéines peut aussi être provoquée par le processus métabolique destiné à
dégrader les protéines endommagées pour promouvoir la synthèse de nouvelles protéines. Le
concept de la « spécificité du site » a été bien étudié (Halliwell and Gutteridge, 1986;
Stadtman, 1986; Fisher and Stadtman, 1992). En effet, les ions métalliques catalytiques (tels
que le fer ou le cuivre) devraient, normalement, être liés à la molécule cible (protéines, ADN
ou membrane cellulaire) ; malheureusement, le radical hydroxyle (OH ) va se lier
préférentiellement à la molécule cible à la place de l’ion catalytique. Par conséquent, les
tentatives du système de défense pour éliminer le radical hydroxyle toxique des sites
catalytiques sont vouées à l’échec étant donné que ce dernier est confiné dans un
microenvironnement difficile d’accès. Il est à noter que les acides aminées tryptophane,
phénylalanine et tyrosine ne constituent pas des sites majeurs de l’attaque par ces systèmes
d’oxydation des « sites spécifiques », cependant, l’arginine, la lysine, l’histidine, la cystéine et
la proline sont particulièrement sensibles à ces oxydations et par conséquent, il se forme des
dérivés carbonyles (Levine, 1983; Amici et al., 1989).
27
Etude Bibliographique
Les superoxyde dismutases à Cu2+ ou à Zn2+, génèrent le radical hydroxyle quand elles
sont exposées au peroxyde d’hydrogène. Le radical est véhiculé jusqu’au site catalytique ce
qui altère le groupement histidine adjacent et provoque la perte de l’ion Cu2+ de l’enzyme
(Yim et al., 1990; Sato et al., 1992). Les autres exemples sont nombreux et concernent
l’estérase acétylcholine (Shinar et al., 1983), la phosphoglucomutase (Deshpande and Joshi,
1985) la carbamyl phosphate synthétase (Alonso et al., 1992), l’alkyle phosphatase (Mordente
et al., 1987) et la glucose-6-phosphatedehydrogénase (Szweda and Stadtman, 1992).
Chez certaines bactéries sulfato-réductrices (BSR), l’O2 présente un effet létal dans la
mesure où de nombreuses enzymes clefs impliquées dans les voies métaboliques de
l’oxydation des substrats sont hautement sensibles à l’O2 (Stams and Hansen, 1982; Hensgens
et al., 1993). Certaines espèces de Desulfovibrio développent des cellules atypiques de forme
allongée, lorsque celles-ci sont cultivées en présence d’oxygène, ce qui suggère que certaines
enzymes requises pour la division cellulaire sont inhibées (Sass et al., 1998).
III.4. Détoxification des espèces réactives d’O2
Les antioxydants peuvent être définis comme des substances qui, présentes à faible
concentration par rapport au substrat oxydable, est capable de ralentir ou d’inhiber
l’oxydation de ce substrat (Halliwell and Gutteridge, 1988). Cette définition fonctionnelle
s’applique à un grand nombre de substances, comprenant des enzymes aux propriétés
catalytiques spécifiques, mais aussi à de petites molécules hydro- ou liposolubles comme par
exemple le glutathion, la ß-carotène (provitamines A), l'acide ascorbique (vitamine C), le
tocophérol (vitamine E), les polyphénols et le lycopène. Cette grande variété des propriétés
physico-chimiques de ces molécules autorise leurs présences dans tous les compartiments de
l’organisme, qu’ils soient intracellulaires, membranaires ou extracellulaires Indépendamment
de leur localisation, les antioxydants peuvent agir à deux niveaux : en prévenant la formation
de radicaux libres oxygénés (antioxydants primaires) ou en épurant les radicaux libres
oxygénés (antioxydants secondaires). En complément de cette double ligne de défense,
l’organisme est en outre capable de réparer ou d’éliminer les molécules endommagées par
l’attaque radicalaire.
La première ligne de défense contre les effets toxiques de l’O2 et ses dérivés chez les
micro-organismes est constituée des enzymes superoxyde dismutase, catalase et peroxydase.
Les antioxydants tel que l’α tocophérole appartiennent à la seconde ligne de défense,
minimisant ainsi les dégâts causés par le radical OH formé à l’intérieur de la cellule en dépit
28
Etude Bibliographique
de l’élimination enzymatique des ions O2- et H2O2 (Fridovich, 1978). Ainsi, toutes les
bactéries anaérobies et/ou anaérobies facultatives possèdent un système de défense contre l’O2
très complexe comprenant des systèmes enzymatiques et d’autres non enzymatiques destinés
à l’élimination des dérivés toxiques de l’O2. Dans certains cas, les micro-organismes
surexpriment également des enzymes impliquées dans la synthèse de l’ADN (exonucléase III
et endonucléase IV chez E coli) ou des enzymes clés des voies métaboliques (Storz et al.,
1990). Ces mécanismes impliquant les systèmes de défense intracellulaires et ceux de la
réparation fonctionnent en coopération. Ceci est une preuve que l’expression des gènes codant
certains composés cellulaires impliqués dans la défense contre le stress oxydant est contrôlée
par un mécanisme de régulation générale (Storz et al., 1990).
Dans le cas des bactéries aérobies, de nombreuses études ont été effectuées pour
comprendre les sources du stress oxydant, les mécanismes de destruction cellulaire provoqués
par l’O2 et ses dérivés toxiques ainsi que les systèmes de défense mis en place par les
bactéries (Imlay, 2003). Ainsi, puisque les types de radicaux produits ainsi que leurs lieux de
production et de propagation sont variés, la riposte antiradicalaire est polymorphe, à la fois
préventive et curative (Halliwell, 1994).
D’autres études ont montré que le fer et le cuivre sous forme libre, étant
particulièrement promoteurs de dommages radicalaires, ces métaux sont physiologiquement
séquestrés et transportés grâce à des protéines comme la ferritine, la transférine, la
céruloplasmine, etc…. Ces protéines agissent donc indirectement comme des antioxydants
primaires. La superoxyde dismutase est une enzyme convertissant le superoxyde en
hydrogène peroxyde. Ce dernier est secondairement soit dismuté en oxygène et eau grâce à la
catalase soit transformé en eau lors d’une réaction couplée à l’oxydation du glutathion,
catalysée par la glutathion peroxydase. Le glutathion oxydé est non toxique et peut en outre
être réduit par le NADPH grâce à l’enzyme glutathion réductase. La glutathion peroxydase
ainsi que les différentes isoformes de superoxyde dismutase sont des métallœnzymes
comprenant soit du sélénium (glutathion peroxydase) soit du manganèse (superoxyde
dismutase mitochondriale) soit du cuivre et du zinc (superoxyde dismutase cytosolique). C’est
donc indirectement que ces métaux possèdent une activité antioxydante, alors qu’il convient
de rappeler que le cuivre, sous forme libre, est directement pro-oxydant. Les « scavengers »
(ou les antioxydants) liposolubles, comme l’alpha-tocophérol (vitamine E), l’ubiquinol (forme
réduite du coenzyme Q), sont concentrés dans les membranes cellulaires où ils sont
particulièrement efficaces pour limiter la peroxydation lipidique. Leur effet protecteur est
29
Etude Bibliographique
principalement lié à leur capacité à céder un de leurs électrons pour arrêter la propagation
radicalaire tout en étant capable soit de céder un second électron lors d’une réaction
d’oxydation conventionnelle soit de se régénérer par le remplacement de l’électron manquant.
Dans les milieux hydrosolubles, de nombreuses molécules semblent avoir un pouvoir
antioxydant. C’est notamment le cas de la vitamine C, de l’acide urique, de l’albumine et de la
bilirubine. Même si les mécanismes de défense mis en jeu sont différents, le dispositif mis en
place permet d’assurer une protection anti-radicalaire sur l’ensemble de l’espace cellulaire.
Tous les acteurs de cette lutte sont non seulement complémentaires mais ils agissent aussi en
synergie. On oppose parfois la protection enzymatique, capable de métaboliser un grand
nombre de radicaux libres, à la protection des « scavengers » qui seraient systématiquement
consommés pour chaque molécule radicalaire détruite. Par ailleur, dans une certaine mesure,
les « scavengers » peuvent êtres recyclés. Par exemple, le radical vitamine E peut être réduit
par la vitamine C, elle-même secondairement réduite par un processus enzymatique.
III.4.1. Détoxification de l’anion superoxyde
Le système de défense contre l’anion superoxyde impliquant l’enzyme superoxyde
dismutase (SOD), catalyse la réduction de deux ions superoxyde en peroxyde d’hydrogène.
Ces catalyseurs incroyablement efficaces sont très abondants chez les cellules aérobies et sont
capables de maintenir le taux de O2 - dans la cellule à des niveaux très bas de l’ordre de 10-10
moles.L-1 (Imlay and Fridovich, 1991). La SOD est la principale enzyme qui protège les
molécules cibles des attaques de O2 - (Liochev and Fridovich, 1997). Par ailleurs, l’activité
des SOD dépend de l’ion métallique (Cu et Zn, Mn, Fe ou même Ni) spécifique aux sites
catalytiques. Les SOD peuvent alors être cytosoliques, liées à des structures subcellulaires ou
bien secrétées à l’extérieur de la cellule (Fridovich, 1998).
Les CuZn SOD sont des enzymes qu’on trouve dans le périplasme des bactéries à Gram
négatif. Elles possèdent un ion Cu et un ion Zn au niveau de leur site catalytique. Le cuivre
subit des changements de valence pendant le cycle catalytique, alors que le zinc pourrait jouer
essentiellement un rôle dans le maintien de la structure (Fridovich, 1998). Les enzymes Mn
SOD peuvent être dimériques ou tétramériques. Elles sont aussi actives que les CuZn SOD,
mais ne présentent aucun lien de parenté avec ces dernières. Elles possèdent un ion Mn2+ dans
chaque sous unité et leur structure a été déterminée par cristallographie aux rayons X (Wagner
et al., 1993). La Mn SOD de E coli est dimérique, non produite en condition d’anaérobiose,
mais induite en présence d’oxygène ou de composés générant le radical superoxyde
30
Etude Bibliographique
intracellulaire (Hassan and Fridovich, 1979). Lorsque E coli passe brusquement d’un
environnement anoxique à aéré, la Fe SOD la protège contre les effets de l’O2. Bien que la Fe
SOD soit spécifique de l’ion métallique qu’elle contient, elle présente des analogies de
séquence avec la Mn SOD (Fridovich, 1998). Certaines SOD isolées chez Bacteroides fragilis
(Gregory and Dapper, 1983) et Propionibacterium shermanii (Meier et al., 1982) sont actives
soit avec un ion Fe2+ soit avec un ion Mn2+ dans leur site catalytique. Ces enzymes sont
appelées cambialistiques. Le site catalytique de ces enzymes présente de l’affinité avec l’ion
Fe, lorsque la cellule est cultivée en anaérobiose et avec l’ion Mn en conditions aérobie. Ceci
constitue une forme d’adaptation aux conditions oxydantes étant donné qu’en présence d’O2,
le Fe2+ s’auto oxyde en Fe3+, un ion beaucoup moins soluble et donc beaucoup moins
disponible. Par contre l’ion Mn2+ reste soluble même en présence d’O2.
Concernant les SOD à Ni, une Ni SOD homotétramérique de poids moléculaire totale de
52 kDa a récemment été décrite chez Streptomyces griseus (Youn et al., 1996).
III.4.2. Détoxification de l’anion peroxyde
Les catalases, enzymes capables de dismuter deux molécules de H2O2 en une molécule
d’O2 et deux molécules de H2O, et les peroxydases, enzymes capables d’utiliser divers
réducteurs pour réduire le H2O2 en H2O, sont les principales enzymes qui décomposent le
H2O2. Certaines peroxydases réduisent également les alkyl peroxydes en alcools
correspondants (Fridovich, 1998). Les catalases et les peroxydases constituent une famille
diversifiée d’enzymes. La plupart d’entre elles sont des enzymes à hème ferrique et leur
action implique l’oxydation divalente de l’hème en un radical Fe(IV) par le H2O2, suivie par
une réduction divalente par le H2O2 également dans le cas des catalases ou deux réductions
successives univalentes par des substrats organiques dans le cas des peroxydases (Dolphin et
al., 1971).
Chez E. coli, on a isolé deux catalases nommées hydroperoxydases (HP) I et II
(Claiborne and Fridovich, 1979; Claiborne et al., 1979). HP-I est une catalase peu commune
puisqu’elle possède les deux activités catalase et peroxydase et est capable d’utiliser une
gamme très large de substrats réducteurs donneurs d’électrons, tels que le dianisidine. La HPII, en revanche, possède l’activité catalase seule. HP-I et HP-II ont des localisations
différentes dans la cellule ; HP-I est dans le périplasme et est associée à la membrane
cytoplasmique ; alors que HP-II présente une localisation cytosolique (Heimberger and
Eisenstark, 1988). L’importance des catalases est illustrée par le comportement
31
Etude Bibliographique
de Lactobacillus plantarum qui est incapable de synthétiser l’hème. En effet, lorsque l’hème
est disponible dans le milieu, ce micro-organisme synthétise la catalase et y incorpore l’hème
disponible dans le milieu de culture. En revanche en absence d’hème, la bactérie synthétise
une autre catalase à manganèse, appelée pseudo catalase (Kono and Fridovich, 1983).
Lorsque E coli est exposée à de faibles concentrations de H2O2 (de l’ordre du micro
molaire), elle anticipe l’effet de plus fortes concentrations de H2O2 et déploie, pour se
protéger, des mécanismes de défense contre des doses de l’ordre du milli molaire de cet agent
toxique (Demple and Halbrook, 1983). L’induction de l’activité catalase (Richter and
Loewen, 1981) est en partie corrélée au mécanisme de résistance cellulaire mis en place. La
réponse vis-à-vis du H2O2 chez E. coli et Salmonella typhimurium est spectaculaire au niveau
biochimique et est accompagnée par l’induction de la synthèse de polypeptides de 30 à 40
acides aminés (Walkup and Kogoma, 1989). Seulement quelques unes de ces protéines ont été
identifiées et annotées. Ce qui illustre que de nombreuses enzymes antioxydants sont co
régulées.
32
Etude Bibliographique
IV / Effet de l’O2 sur les bactéries sulfato-réductrices
De nos jours, les bactéries sulfato-réductrices (BSR) sont des micro-organismes
capables de réduire le plus grand nombre d’accepteurs d’électrons différents (Cypionka,
2000). En plus des composés inorganiques soufrés (sulfate, thiosulfate, sulfite et soufre
élémentaire) et du fumarate (Miller and Wakerley, 1966), ces bactéries peuvent utiliser selon
les espèces de nombreux autres composés inorganiques comme accepteurs d’électrons (le
nitrate, le nitrite (Widdel and Pfennig, 1982), le CO2 (Klemps et al., 1985), le Fe (III)
(Coleman et al., 1993; Lovley et al., 1993) et même l’uranium VI et le chromate (Lovley and
Phillips, 1994). Cela montre la grande diversité du métabolisme énergétique de ces BSR. Les
BSR n’ont pas pour habitat exclusif les environnements anoxiques. Des études ont montré
leur existence dans des environnements où elles peuvent être exposées plus ou moins
longtemps à l’oxygène. Aujourd’hui, on parle d’une capacité de respiration aérobie chez les
BSR et en particulier chez les espèces de Desulfovibrio qui leur permet de tolérer la présence
d’oxygène dans les environnements qu’elles habitent (Cypionka, 2000). Néanmoins, aucune
croissance n’a été observée chez des BSR cultivées en présence d’oxygène. Pour toutes ces
raisons, il était important d’étudier plus précisément l’effet de l’O2 sur ce groupe de bactéries
anaérobies dans le but d’élucider les mécanismes cellulaires ayant permis à ces dernières et,
éventuellement aux autres formes de vie qui leur ont succédé, de s’adapter à un atmosphère
qui s’est progressivement enrichi en oxygène au cours des temps géologiques.
IV. 1. Présence et diversité des BSR dans les environnements oxygénés
Plusieurs études ont montré la présence des BSR, malgré leur caractère anaérobie, dans
des environnements oxygénés ou bien dans des zones où l’oxygène est présent
périodiquement. Dans des systèmes stratifiés tels que les sédiments, le plus grand nombre de
BSR existe juste à l’interface oxygène/environnements anoxiques (Sass et al., 1997). La
majorité des BSR isolées des sites oxygénés appartiennent au genre Desulfovibrio et
Desulfomicrobium (Sass et al., 1997; Sass et al., 1998) ; le genre Desulfotomaculum est
présent principalement sous forme de spores (Sass et al., 1996). Des BSR filamenteuses du
genre Desulfonema ont également été isolées (Fukui et al., 1999). Des espèces de
Desulfococcus et Desulfosarcina sont également dominantes dans des sédiments de marécage
salé et dans la rhizosphère (Rooney-Varga et al., 1997).
33
Etude Bibliographique
Il a été démontré que les populations de BSR présentes dans les environnements
oxygénés se sont adaptées à l’oxygène (Sass et al., 1996, , 1997). En effet, les analyses ont
montré que les BSR isolées de tels environnements sont différents d’un point de vue
taxonomique de ceux des couches profondes anoxiques. Ce résultat confirme les travaux de
Risatti et al. (1994) qui ont montré, à travers l’utilisation des techniques de biologie
moléculaire, qu’au niveau d’un sédiment, la profondeur des différentes couches est un facteur
phylogénétique discriminant des populations bactériennes présentes (Risatti et al., 1994). Cela
dit, les BSR sembleraient migrer vers les environnements oxygénés où la disponibilité en
substrats est plus importante. Ainsi, en 1991, Canfield et Des Marais ont observé, dans des
sédiments, pendant la nuit des taux de sulfato-réduction similaires à ceux obtenus pendant la
journée, quand le sol est saturé en oxygène (Canfield and Des Marais, 1991).
De nombreuses études ont, par ailleurs, montré que des cultures pures de certaines BSR,
exposées à l’oxygène, peuvent survivre des heures voire même des jours (Cypionka et al.,
1985; Sass et al., 1996). Certaines BSR sont donc relativement aérotolérantes et survivent
après des courtes périodes d’exposition à l’air (Hardy and Hamilton, 1981; Cypionka et al.,
1985; Wall et al., 1990). D’autres, comme par exemple certaines espèces du genre
Desulfovibrio, restent viables après une période considérable (plusieurs jours) d’exposition à
l’O2 et reprennent leur croissance lorsque l’anaérobiose est restaurée (Cypionka, 2000). Par
exemple, la croissance de D. gigas dans un milieu contenant du lactate et du sulfate est
inhibée en présence de 5 µM d’O2 alors que la division cellulaire reprend aussitôt que
l’anaérobiose est restaurée même si la période d’oxygénation a duré 24h.
Certaines BSR sont capables de rester viables en présence de concentrations d’O2
avoisinant la saturation (21% d’oxygène dans la phase gazeuse) (Canfield and Des Marais,
1991). Cypionka a identifié des souches dont la sensibilité vis-à-vis de l’O2 diffère
sensiblement. Par exemple les représentants des genre Desulfobacter et Desulfobacterium
habitent les couches de sédiments profonds, alors que Desulfococcus et Desulfovibrio
prédominent dans les zones bien aérées où la concentration d’O2 peut atteindre 1 mM
(Krekeler et al., 1997). Dans ces zones aérées les espèces des genres Desulfococcus et
Desulfovibrio entrent en compétition avec les bactéries aérobies hétérotrophes pour les
substrats organiques (Jonkers et al., 2005). Ces résultats démontrent que les espèces de
Desulfovibrio présentent des mécanismes d’adaptation et de défense vis-à-vis de l’O2, qui
jouent un rôle important dans la physiologie de ces bactéries.
34
Etude Bibliographique
IV. 2. Toxicité de l’oxygène pour les BSR et mécanismes de protection
développés
IV.2.1. Adaptation comportementale
Les BSR possèdent des propriétés physiologiques intrinsèques qui leur permettent donc
de se protéger des conditions aérobies. Certaines forment des agglomérats cellulaires
(Krekeler et al., 1997), d’autres, comme les représentants du genre Desulfovibrio, répondent à
l’augmentation de la pression partielles d’O2 dans leur milieu par l’aérotactisme négatif
(Krekeler et al., 1997; Cypionka, 2000). D’autres encore respirent l’O2 pour détoxiquer leur
milieu et restaurer l’anaérobiose (Cypionka, 2000). Les cellules de D. gigas accumulent le
glycogène en condition anoxique et l’utilise comme source de carbone et d’énergie dans des
conditions de stress oxydant (Fareleira et al., 2003). Les réponses comportementales des BSR
vis-à-vis de l’oxygène sont alors classées en trois types : agrégation, migration vers les zones
anoxiques et aérotactisme.
IV.2.1.1. L’agrégation
Les BSR tendent à former des agrégats lorsqu’elles sont exposées à l’oxygène en
culture homogène agitée (Krekeler et al., 1997). Les agrégats apparaissent alors, comme une
réaction de défense vis-à-vis de l’oxygène. Ceux-ci peuvent être formés exclusivement de
cellules bactériennes ou bien en mélange avec d’autres composés tels que les sulfates de fer.
Par ailleurs, des études ont montré que les BSR formant des agrégats survivent mieux à
l’exposition de l’oxygène que les cellules isolées (Fukui and Takii, 1996). En effet, les BSR
occupent la partie intérieure de l’agrégat où est maintenue l’anoxie.
L’agrégation des cellules dépend de la disponibilité des donneurs d’électrons. En effet,
les cellules se concentrent dans des environnements plus ou moins riches en source d’énergie
pour pouvoir réduire l’oxygène en métabolisant les substrats disponibles. Les bactéries
peuplant les environnements aérés sont, ainsi, capables de réduire la concentration de
l’oxygène présent ; contrairement aux bactéries anaérobies strictes incapables de réduire la
concentration environnante de l’oxygène. Desulfovibrio desulfuricans CSN, par exemple, se
caractérise par une mobilité différente selon qu’il soit présent dans des environnements aérés
ou anoxiques (Eschemann et al., 1999). En effet, quand les cellules sont en agrégats, elles font
des mouvements circulaires de diamètre de 20 µm environ, alors que dans un environnement
anoxique, elles adoptent une trajectoire rectiligne voir même légèrement courbée.
35
Etude Bibliographique
Contrairement aux mouvements aléatoires, les trajectoires circulaires ne permettent pas aux
bactéries de fuir les zones oxygénées.
La formation d’agrégats bactériens peut constituer un des mécanismes adoptés par
certaines BSR pour survivre à des expositions périodiques à l’O2 dans leur habitat naturel. Au
niveau des sédiments de cyanobactéries du lac « Solar » par exemple, les BSR forment des
amas bactériens autour de quelques filaments des cyanobactéries Microcoleus chthonoplastes
(Sigalevich et al., 2000). La formation d’agrégats cellulaire de D. oxyclinae en culture pure a
aussi été reportée par ces auteurs. En effet, l’agrégation est d’autant plus rapide que l’O2 est
introduit d’une manière continue dans le milieu (environ 5%) alors qu’elle est ralentie lorsque
l’O2 est introduit ponctuellement (sous forme d’un pulse) (Sigalevich et al., 2000). Par contre,
quand D. oxyclinae est co-cultivée avec la bactérie hétérotrophe aérobie facultative
Marinobacter sp. en présence d’O2, un consortium bactérien stable est formé et aucune
agrégation n’a été observée. Dans ces conditions, la sulfato-réduction persiste sous des
conditions d’oxygénation de 0% à 20% d’O2 dans la phase gazeuse. Considérant que ces deux
bactéries ont été isolées du même habitat naturel, à savoir les sédiments aérés caractérisés par
des concentrations d’O2 très variables, on conclut que l’agrégation couplé à la co-culture
permet aux BSR de faire face à ces expositions périodiques d’O2 et de se protéger de ses
effets néfastes (Sigalevich and Cohen, 2000).
Certaines BSR, et plus particulièrement D. oxyclinae (Krekeler et al., 1998), sont
capables de croître et de respirer même lorsqu’ils sont exposés à l’O2 (les périodes varient de
quelques heures à quelques jours). Les cellules forment des agglomérats autour des bulles
d’air et utilisent l’hydrogène, ou le lactate comme des donneurs d’électrons, alors que l’O2
leur sert d’accepteur d’électrons ; et c’est ainsi que ce dernier est efficacement éliminé du
milieu (Dilling and Cypionka, 1990; Marschall et al., 1993).
IV.2.1.2. La migration des BSR vers les zones anoxiques
La migration des BSR vers les couches de sol les moins oxygénées est principalement
due aux changements des conditions du cycle circadien. Par exemple, les tapis cellulaires
formés par les cyanobactéries représentent un modèle intéressant pour l’étude de la stratégie
comportementale des BSR vis-à-vis de l’O2. En effet, le nombre des cellules dans la couche
supérieure du sédiment du lac Solar Lake (Sinai, Egypte) varie tout au long de la journée
selon la concentration de l’O2 disponible. Krekeler et al. (1997) ont montré que pendant la
journée, lorsque les couches superficielles sont saturées en O2, le nombre des cellules de BSR
est vingt fois inférieur à celui obtenu pendant la nuit en absence d’O2 (Krekeler et al., 1997).
36
Etude Bibliographique
La souche Desulfovibrio D22 isolée à partir des couches supérieures de ces sédiments pendant
la journée, ne montre aucun mouvement de migration, contrairement à la souche N13, qui a
été isolée la nuit et qui migre en fonction de la concentration d’O2 (Krekeler et al., 1998). Ces
réactions comportementales de migration ont aussi été obtenues avec des souches pures de
Desulfovibrio cultivées en milieu liquide (Johnson et al., 1997; Krekeler et al., 1998;
Eschemann et al., 1999). Johnson et al. (1997) ont montré que D. vulgaris Hildenborough
cultivé en présence d’un gradient d’O2, forme un foyer cellulaire à une concentration d’O2
autour de 0.02%-0.04% (Johnson et al., 1997). D. desulfuricans forme aussi une bande
circulaire autour des bulles d’air. La position de ces bandes, en terme de concentration d’O2,
dépend de la biomasse bactérienne et varie de 50 µM d’O2 pour une biomasse élevée (autour
de 10 unités à 600 nm), à 30 µM d’O2 pour des densités bactériennes moins élevées (3 unités
à 600 nm) (Eschemann et al., 1999). Le fait que les bandes cellulaires se sont formées à une
certaine distance des bulles d’air montre clairement que d’une part, une concentration élevée
d’O2 agit comme un produit répulsif et que les cellules peuvent effectuer un mouvement
aérotactique négatif. D’autre part, l’agrégation cellulaire suggère que les cellules de D.
desulfuricans sont aussi capables d’aérotactisme positif. Cependant, Eschemann et al. (1999)
ont montré que dans les zones aérées des sédiments du Solar Lake, D. desulfuricans se
déplace selon un mouvement circulaire : lorsque cette bactérie pénètre dans la bande
cellulaire, le mouvement circulaire la propulse au niveau des zones oxygénées (Eschemann et
al., 1999). D. vulgaris, par contre, ne présente pas un mouvement circulaire, suggérant que les
BSR ont développé des stratégies variées pour palier à l’effet toxique de l’O2 (Johnson et al.,
1997).
IV.2.1.3. L’aérotactisme
L’aérotactisme négatif chez les BSR ne les conduit pas nécessairement vers les sites
anaérobies comme attendu pour des bactéries anaérobies. En effet, les BSR se concentrent au
niveau de la limite de la couche aérée où la saturation de l’air est inférieure ou égale à 20%
(Eschemann et al., 1999). Chez les BSR, l’aérotactisme n’est donc pas simplement une
aérophobie mais elle comprend des réponses positives et négatives vis-à-vis de l’oxygène.
La migration des cellules de Desulfovibrio résulte d’un mécanisme élaboré de la
perception de l’O2. Certaines études ont montré que D. vulgaris Hildenborough possède un
chémorécepteur (DcrA) qui est sensible à la présence d’O2 ou à la valeur du potentiel redox
de son milieu environnant (Dolla et al., 1992; Fu et al., 1994). Un récepteur homologue à
DcrA a aussi été identifié dans le génome de la souche D. desulfuricans G20. La structure de
37
Etude Bibliographique
ce chémorécepteur est similaire à celle d’une protéine chémotactique à groupement méthyle
(MCPs) avec un domaine N terminale périplasmique qui contient un hème de type c, jouant le
rôle de senseur, et un domaine C terminale cytoplasmique jouant le rôle de domaine de
signalisation (Deckers and Voordouw, 1994). Le degré de méthylation du domaine de
signalisation est influencé par l’état d’oxydation de l’hème (Fu et al., 1994). Ce signal de
transduction permet aux cellules de produire une réponse consistant à fuir les environnements
oxygénés. La délétion du gène codant pour le DcrA, n’a pas d’effet sur le phénotype
« aérotactique » selon les travaux de Fu et Voordouw (1997) (Fu and Voordouw, 1997). Les
auteurs ont également démontré l’existence d’une quinzaine d’autres chémorécepteurs chez
D. vulgaris, et l’agrégation des cellules constituent une réponse contrôlée par une multitude
de gènes appartenant à la famille dcr (Deckers and Voordouw, 1994).
IV.2.2. Mécanismes moléculaires de réduction de l’oxygène
La capacité à réduire l’O2 est très répandue chez les BSR. Dannenberg et al. (1992) ont
montré que certaines de ces souches réduisent l’O2 en présence d’au moins un donneur
d’électrons (Dannenberg et al., 1992). Selon la souche de BSR, le lactate, le formate, le
pyruvate, l’éthanol, l’acétate, le propionate, le butyrate, l’hydrogène et même le sulfite et le
thiosulfate servent de donneurs d’électrons pour la réduction de l’O2. Les souches de
Desulfovibrio présentent généralement des vitesses de réduction de l’O2 comparables à celles
des bactéries aérobies de l’ordre de 670 nmoles O2 min-1mg protéines totales-1. Ces taux
diminuent souvent lorsque la concentration d’O2 environnant augmente ou bien suite à des
expositions répétées à l’O2 (Dannenberg et al., 1992; Krekeler et al., 1998; Sass et al., 2002).
Le taux de réduction d’O2 le plus élevé a été observé chez Desulfovibrio termidis qui est
équivalent à 1570 nmoles O2 min-1mg protéines totales-1, un taux supérieur même à celui de la
plupart des bactéries aérobies (Kuhnigk et al., 1996). Dilling et Cypionka (1990) ont montré
que la réduction de l’O2 par D. desulfuricans CSN en présence d’hydrogène ou de donneurs
d’électrons organiques conduit à la synthèse d’ATP (Dilling and Cypionka, 1990). De même,
les souches Desulfovibrio desulfuricans et Desulfobulbus propionicus couplent la formation
d’ATP à l’oxydation du sulfite en utilisant l’O2 comme un accepteur d’électron (Dannenberg
et al., 1992). Cependant, malgré cette réduction couplée à la production d’énergie, il n’a
jamais montré, jusqu’à présent, que les BSR étaient capables, en cultures pures, de croître en
présence d’oxygène.
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Etude Bibliographique
La capacité à réduire l’O2 directement en H2O2 avec en parallèle la régénération du
NAD+ et la formation de l’ATP a été démontré chez D. gigas, D. vulgaris et D. desulfuricans
(Gomes et al., 1997; Cypionka, 2000). D. Desulfuricans est capable de « switcher »
instantanément son métabolisme de la sulfato-réduction à la réduction de l’O2 ou du nitrate
pour répondre à des changements qui surviennent dans son environnement (Brune et al.,
2000).
Chez D. gigas, l’O2 est réduit dans le cytosol. Ce processus implique une ETC unique
qui comprend trois protéines : une NADH rubrédoxine oxydoréductase, une rubrédoxine et
une rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO) qui est la dernière oxydase (Chen et al.,
1993b; Cypionka, 2000; Frazão et al., 2000). Les rubrédoxines sont des petites protéines
cytoplasmiques contenant un seul atome de fer coordonné à quatre atomes cysteinyl sulfure
(Moura et al., 1979; Adman et al., 1991; Lamosa et al., 2001). Ces protéines jouent le rôle de
transporteurs d’électrons entre la NADH rubrédoxine oxygène oxydoréductase (Chen et al.,
1993a) et la rubrédoxine oxygène oxydoréductase (Chen et al., 1993b; Frazão et al., 2000). La
NADH rubrédoxine oxygène oxydoréductase est une protéine dimérique qui renferme dans sa
structure à la fois le FMN et le FAD et est capable de réduire la rubrédoxine du NADH. Cette
enzyme réduit d’une manière incomplète l’O2 en H2O2 (Chen et al., 1993a). L’enzyme
rubrédoxine, achemine les électrons à d’autres partenaires redox à savoir la rubrédoxine
oxygène oxydoréductase (ROO). Cette dernière est une protéine homodimérique dont la sous
unité fait 43 kDa. Chaque monomère est composé d’un domaine β lactamase et d’une autre
flavorédoxine. Le premier contient un centre à deux atomes de fer où l’O2 est réduit en H2O.
Le second renferme un cofacteur FMN qui joue le rôle d’un pont intermédiaire dans le
processus de transfert d’électrons entre la rubrédoxine et le centre di-ferrique de la ROO
(Frazão et al., 2000). Ce processus de réduction de l’O2 est cytoplasmique et semble être
conservé chez les espèces de Desulfovibrio.
Un autre mécanisme périplasmique a aussi été décrit chez ce genre bactérien. En effet,
la chaîne respiratoire chez les représentants du genre Desulfovibrio renferme une oxydase
terminale associée à la membrane, une cytochrome bd et une cytochrome c oxydase. La
réduction périplasmique de l’O2 fait intervenir également une hydrogénase et un cytochrome c
(Cypionka, 2000; Baumgarten et al., 2001; Lemos et al., 2001). Les gènes codant pour la
cytochrome oxydase c (Cox) ont été identifié dans le génome de D. vulgaris Miyazaki
(Kitamura et al., 1995) et l’oxygène réductase terminale bd (Cbd) a été purifiée à partie de la
membrane de D. gigas (Lemos et al., 2001).
39
Etude Bibliographique
Baumgarten et al. (2001) ont montré que des cellules de D. vulgaris Marburg, cultivées
en présence de 30µM d’O2 au maximum, réduisent l’O2 en H2O en présence d’hydrogène
comme un donneur d’électrons avec un taux maximale avoisinant les 222 nmoles d’O2 min1
mg protéines totales-1 (Baumgarten et al., 2001). Cette réaction de réduction implique
essentiellement les hydrogénases et les cytochromes. En plus de leur fonction fondamentale
dans le métabolisme énergétique de Desulfovibrio (Malki et al., 1997; Pohorelic et al., 2002),
les Fe hydrogénases et les cytochromes sont impliquées dans la réponse au stress oxydant
engendré soit par l’O2 soit par des potentiels redox élevés. Ces deux protéines peuvent être
soit directement impliquées dans le processus d’élimination de l’O2 par réduction en H2O, soit
impliquées dans un mécanisme conduisant à l’abaissement du potentiel redox du milieu pour
assurer des conditions optimales de croissance.
IV.2.3. Mécanismes d’élimination des ROS chez les BSR
Les BSR ne meurent pas suite à un simple contact avec l’oxygène mais leur croissance
est inhibée (Postgate, 1979). Il a été démontré que l’O2, à des faibles concentrations, exerce
un effet toxique sur ces bactéries pour les raisons suivantes (1) l’O2 est réduit en espèces
réactives hautement toxiques pour les composants cellulaires, (2) l’O2 entre en compétition
avec le sulfate en tant qu’accepteurs d’électrons (Pianzzola et al., 1996) et bloque ainsi la
réduction dissimilatrice du sulfate.
IV.2.3.1. Activités superoxyde dismutase et superoxyde réductase des BSR
Chez les espèces de Desulfovibrio, deux enzymes capables d’éliminer l’anion
superoxyde ont été caractérisées, la superoxyde dismutase (SOD) et la superoxyde réductase
(SOR).
La superoxyde dismutase élimine les ions superoxyde par dismutation du peroxyde
d’hydrogène et de l’O2 moléculaire. La première SOD a été découverte en 1969 par McCord
et Fridovich (McCord and Fridovich, 1969) et il a été établi depuis que tous les microorganismes vivants en présence d’O2 possèdent au moins un des quatre types possibles de la
SOD qui différent par le type de l’ion métallique présent dans leur sites actifs (Dolla et al.,
2006). La présence de la SOD chez les bactéries anaérobies n’a été démontrée qu’en 1977
grâce au travail de Hatchikian et Henry réalisé chez le genre Desulfovibrio (Hatchikian and
Henry, 1977). Plus récemment, une superoxyde dismutase à fer a été purifiée et caractérisée
chez D. gigas (Dos Santos et al., 2000). C’est une enzyme homodimèrique dont la sous unité
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Etude Bibliographique
fait 22 kDa et dont l’activité spécifique est 1900 U.mg-1. La SOD est exprimée d’une manière
constitutive chez D. gigas pendant la croissance anaérobie (Dos Santos et al., 2000) et aucune
différence significative de l’activité de cette enzyme
n’est observée entre des cellules
soumises à un stress oxydant (des concentrations d’O2 variables allant jusqu’à 120 µM) et des
cellules cultivées en anaérobiose (Fareleira et al., 2003). De plus, le temps d’exposition à l’O2
n’a aucun effet sur le taux d’activité de cette enzyme (Fareleira et al., 2003). Dans ce même
registre, la concentration de la SOD ne varie pas chez D. vulgaris Hildenborough quand celuici est soumis à un stress oxydant (Fournier et al., 2006). Ces résultats montrent que le gène de
la SOD est exprimé d’une manière constitutive chez les espèces de Desulfovibrio. Des
expériences de délétion du gène de la SOD chez D. vulgaris Hildenborough conduites par
Fournier et al. en 2003, montrent que la souche devient plus sensible au superoxyde produit à
l’extérieur de la cellule. Toutefois, l’exposition de cette souche à l’air ambiant n’induit pas de
changements significatifs de sensibilité (Fournier et al., 2003). L’espace périplasmique des
espèces de Desulfovibrio contient ainsi une grande quantité d’enzymes à potentiel redox bas
pouvant générer des anions superoxyde en présence d’O2. Si l’ion superoxyde n’est pas
éliminé, il induit des dommages cellulaires comme l’oxydation et la déstabilisation des ponts
Fe-S de nombreuses enzymes les rendant ainsi inactives (Flint et al., 1993). En effet, le
périplasme de Desulfovibrio contient des enzymes sensibles au superoxyde telles que les
hydrogénases ou les formates déshydrogénases impliquées dans le métabolisme énergétique
de la cellule (Heidelberg et al., 2004; ElAntak et al., 2005). Il a été montré que lorsque les
cellules sont exposées à l’O2 pendant une courte période, l’activité enzymatique de
l’hydrogénase périplasmique à fer chez la souche sauvage de D. vulgaris Hildenborough est
plus importante que celle enregistrée chez le mutant sod (Fournier et al., 2004). On conclut
par ailleurs, que la SOD périplasmique joue un rôle de protection des enzymes sensibles aux
dommages induits par le superoxyde toxique.
L’élimination de d’anion superoxyde a longtemps été expliquée comme étant le résultat
de la réaction de dismutation réalisée par la SOD. Ce n’est qu’en 2000 que Lombard et al. ont
montré que la desulfoferrédoxine de Desulfoarculus baarsii se caractérisant par une activité
superoxyde réductase est capable de protéger des cellules de E. coli dépourvues du gène sod
contre la toxicité des anions superoxyde contenus dans leur milieu (Lombard et al., 2000).
Cette protéine a été purifiée des souches de Desulfovibrio desulfuricans ATCC27774 et D.
vulgaris Hildenborough (Moura et al., 1990; Tavares et al., 1994) et la caractérisation de sa
structure tridimensionnelle a été réalisée en 1997 par Coelho et al (Coelho et al., 1997). C’est
un monomère de 14 kDa qui renferme deux centres à fer mononucléaires non hémiques
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Etude Bibliographique
séparés, chacun se situant sur une chaîne polypeptidique. Le centre I est un centre ferrique
avec une coordination tétrahédrale déformée, le centre II est un site ferreux avec une structure
pyramidale carrée unique incluant un résidu cystéine et quatre résidus histidine comme
ligands. Les expériences de cinétique et de spectroscopie ont identifiées le centre II comme la
source de résidu de fer nécessaire à l’activité de la superoxyde réductase (Lombard et al.,
2001; Emerson et al., 2002; Mathé et al., 2002).
Une autre enzyme présentant une activité superoxyde réductase, appelée neelarédoxine
et contenant un site métallique et identique au centre II de la desulfoferrodoxine a été purifiée
de D. gigas (Silva et al., 2001). Il est à noter également que le génome de l’archée
Archaeglobus fulgidus contient également les gènes codant la desulfoferrodoxine (AF0833) et
la neelarédoxine (AF0344) (Klenk et al., 1997). Ces deux dernières ont pour donneurs
d’électrons, les rubrédoxines, petites protéines contenant un résidu de fer. Chez D. vulgaris
Hildenborough et D. desulfuricans G20, les enzymes desulfoferrodoxine (SOR), rubrédoxine
et rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO) sont sous le contrôle d’un même opéron qui
est DVU3183-DVU3184-DVU3185 et Dde3193-Dde3194-Dde3195 respectivement. On note
par ailleurs l’absence de la séquence N signal terminale suggérant une localisation
cytoplasmique de ces protéines. Cette organisation des gènes démontre que la SOR et la ROO
collaborent ensemble pour la réduction et la détoxification de l’oxygène au niveau du
cytoplasme à travers une voie commune impliquant la rubrédoxine comme donneurs
d’électrons.
L’implication des enzymes SOR dans le processus de défense vis-à-vis de l’oxygène a
été démontrée par Voordouw et Voordouw en 1998 qui ont délété le gène codant pour la
desulfoferrodoxine chez D. vulgaris Hildenborough pour créer une souche mutante sor
(Voordouw and Voordouw, 1998). Cette délétion n’affecte pas la croissance sous des
conditions anaérobies mais a causé un accroissement de la sensibilité de cette souche à une
exposition à l’oxygène. De plus, la souche mutante sor est beaucoup plus sensible à l’ion
superoxyde que la souche mutante sod qui elle-même est plus sensible au superoxyde que la
souche sauvage (Lumppio et al., 2001; Fournier et al., 2003). La comparaison de la sensibilité
des mutants sod et sor aux différentes conditions de stress oxydants montre que, chez D.
vulgaris Hildenborough, la SOR est l’enzyme clé de la défense vis-à-vis de l’oxygène.
L’enzyme SOD, comme cela a été indiqué plus haut, est impliquée dans l’élimination du
superoxyde périplasmique pour protéger les enzymes sensibles à cet ion. Les enzymes SOR et
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Etude Bibliographique
SOD sont alors deux composés complémentaires du système de défense contre le superoxyde
existant dans les deux compartiments cellulaires des bactéries anaérobies (Dolla et al., 2006).
IV.2.3.2. Activités catalases et peroxydases des BSR
Comme pour le processus de détoxication de l’anion superoxyde, deux réactions
enzymatiques impliquées dans l’élimination du peroxyde d’hydrogène ont été décrites chez
Desulfovibrio.
La première réaction est catalysée par l’enzyme catalase, enzyme présente chez toutes
les bactéries aérobies et aussi chez certaines bactéries anaérobies. L’activité catalase a été
détectée pour la première fois chez Desulfovibrio par Hatchikian et al. en 1977 (Hatchikian
and Henry, 1977). L’enzyme catalase de D. gigas est composée de trois sous unités de 61 kDa
chacune et contient seulement un groupe hèminique par molécule, ce qui est caractéristique de
cette enzyme et qui explique d’ailleurs sa faible activité spécifique (Dos Santos et al., 2000).
L’activité catalase semble ne pas être présente chez toutes les espèces de Desulfovibrio. En
effet, D. vulgaris et D. gigas montrent une activité positive de la catalase alors que chez D.
salexigens et D. desulfuricans ne possèdent pas cette activité (Dos Santos et al., 2000).
Le gène codant la catalase chez D. vulgaris Miyazaki a été cloné. La protéine est un
tétramère dont chacun des monomères a une taille de 60 kDa et possède un groupe hèminique
(Kitamura et al., 2001). Les analyses génomiques révèlent la présence d’un gène codant pour
la catalase chez D. vulgaris Hildenborough (DVUA0091), Desulfotalea psychrophila
(DP3003) et Archaeoglobus fulgidus (AF2233), alors que les données préliminaires portant
sur D. desulfuricans G20 ne permettent pas la détection du gène de la catalase. Dans le cas de
D. vulgaris Hildenborough, le gène est localisé dans le plasmide contenant le gène nif dont
l’expression est perdue lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu contenant de l’azote
sous forme d’ammonium (Fournier et al., 2003). Les études effectuées chez la souche D.
gigas montrent que l’activité catalase augmente lorsque les cellules sont exposées à des
concentrations d’oxygène croissantes allant jusqu’à 120 µM. De plus, l’allongement du temps
d’exposition a pour effet d’augmenter l’activité catalase (Fareleira et al., 2003).
La seconde réaction qui élimine le peroxyde d’hydrogène est catalysée par l’enzyme
peroxydase dépendante du NAD(P)H. Les enzymes rubrérythrine et nigérythrine, possédant
une activité NADH peroxydase in vitro, ont été isolées chez D. vulgaris Hildenborough
(Pierik et al., 1993; Coulter et al., 1999). La rubrérythrine est une protéine à fer,
cytoplasmique, homodimérique et contenant un groupement hème. Elle renferme également
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Etude Bibliographique
un site di-ferrique carboxylé et un site [Fe(Scyc)4] mononucléaire contenu dans une sous unité
protéique de 23 kDa (DeMare et al., 1996). L’enzyme nigérythrine est une grande protéine
cytoplasmique homodimérique contenant le même type de site ferrique que la rubrérythrine
(Iyer et al., 2005). La délétion du gène codant pour la rubrérythrine chez D. vulgaris
Hildenborough n’altère pas la sensibilité de la souche aux différentes conditions de stress
oxydants (Fournier et al., 2003). Cependant, le manque d’un important phénotype stressé chez
le mutant prouve l’existence dans le génome d’un gène codant la nigérythrine et d’un autre
gène codant une seconde nigérythrine homologue à la rubreryhthrine capable de compenser
l’effet de la délétion (Heidelberg et al., 2004).
Des études de protéomiques différentielles ainsi que celles de la PCR quantitative en
temps réel montrent que lorsque D. vulgaris Hildenborough est exposé à l’oxygène pendant
plus d’une heure, la bactérie surexprime les deux protéines possédant l’activité thiolperoxydase à savoir DVU1228 et DVU0814 (Fournier et al., 2006). En effet, D. vulgaris
soumise à un fort stress oxydant réduit la quantité des espèces réactives d’oxygène et des
rubrérythrines (Fournier et al., 2003; Fournier et al., 2006). Les enzymes thiol-peroxydase
représentent alors, d’autres systèmes de détoxification qui viennent s’ajouter aux autres
systèmes décrits précédemment pour protéger la cellule bactérienne contre le stress oxydant.
D. vulgaris contient, en outre, une superoxyde réductase (SOR) cytoplasmique et une
Fe-hydrogénase périplasmique dont la synthèse est induite soit par l’aérobiose soit par une
augmentation du potentiel redox du milieu. Ces enzymes constituent un système alternatif de
protection contre l’O2 toxique (Fournier et al., 2004). Le rôle de la Fe-hydrogénase, une
enzyme clef de la sulfato-réduction, dans la défense contre l’O2 et ses espèces réactives
consiste en la réduction directe de l’O2 en H2O2 (un processus faisant intervenir les
cytochromes) et aussi en la baisse du potentiel redox du milieu grâce à la présence
concomitante de ces hydrogénases et des diverses ETCs (Fournier et al., 2004).
IV.2.3.3. Synchronisation de toutes les activités enzymatiques cellulaires pour la
détoxification des espèces réactives d’oxygène chez les BSR et chez les micro-organismes
hyperthermophiles anaérobies
La majorité des enzymes impliquées dans la détoxication des espèces réductives d’O2
chez D. gigas sont la SOR cytoplasmique et la rubrérythrine (Rbr) qui est pourvue d’une
activité H2O2 réductase dépendante du NADH, mais aussi la Fe SOD périplasmique, la
catalase et la nigérythrine (Fournier et al., 2003). Ce système de défense, grâce à l’action
combinée de la SOR et la Rbr, réduit le superoxyde et le peroxyde d’hydrogène en eau sans la
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Etude Bibliographique
formation d’O2, composé toujours critique pour les micro-organismes anaérobies stricts
(Jenney et al., 1999). La SOR joue un rôle primordial dans la stratégie de défense des cellules
de D. vulgaris vis-à-vis de l’O2 en condition d’aérobiose, lorsque le radical superoxyde est
formé dans le cytoplasme (Fournier et al., 2003). Toutefois, la Fe SOD de D. vulgaris
présente une activité maximale sous des conditions de microaérobiose (environ 1%
d’oxygène) où quelques protéines périplasmiques tels que les hydrogénases et les nitrates
réductases sont partiellement réduites et fonctionnent comme des sources de radicaux
superoxydes (Fournier et al., 2003).
En plus des enzymes classiques SOD et catalase, qui ne sont pas présentes chez toutes
les BSR, les cellules contiennent des protéines à fer dépourvues d’hèmes tels que la
rubrédoxine désulfoferrodoxine, la neelarédoxine et la rubrérythrine qui sont impliquées dans
la défense contre le stress oxydant. Chez les bactéries anaérobies strictes, ces protéines
constituent la meilleure défense « antioxydant » parce que contrairement à la SOD et à la
catalase, elles n’engendrent pas la libération de l’O2 (Postgate, 1979; Voordouw and
Voordouw, 1998; Silva et al., 1999; Lumppio et al., 2001).
Jusqu’à nos jours, peu d’études ont été réalisés concernant l’étude du stress oxydant
chez les micro-organismes hyperthermophiles anaérobies. Récemment, Strand et al. (2010)
ont montré que, sous des conditions de stress oxydant, l’archée anaérobie hyperthermophile
Pyrococcus furiosus sur-exprime des enzymes impliquées spécifiquement : dans le piégeage
du fer et du sulfite, dans la réparation de l’ADN, ainsi que dans la régénération du NADPH.
De plus, cet organisme met en place un système de protection contre le peroxyde qui implique
les enzymes oxydo-réductase de type superoxyde réductase, rubrérythrine et alkyl
hydroperoxyde réductases (Strand et al., 2010). De plus, deux NADH oxydases, désignées
NOX1 et NOX2, ont été isolées chez Pyrococcus furiosus. Ces enzymes sont impliquées dans
la protection de cette archée anaérobie contre l’O2 à des hautes températures (Ward et al.,
2001).
La réponse aux stress oxydant a également été étudiée chez l’archée hyperthermophile
anaérobie Pyrococcus horikoshii à l’aide de la technique d’électrophorèse sur gel 2D. En
présence d’air, ce micro-organisme sur-exprime le gène codant pour l’alkyl hydroperoxyde
réductase, une enzyme qui catalyse la réduction du peroxyde d’hydrogène en présence de
dithiothreitol comme donneur d’électrons. Le système peroxyrédoxine joue donc, un rôle
important dans l’élimination du peroxyde chez l’archée P. horikoshii (Kawakami et al., 2004).
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Etude Bibliographique
Archaeoglobus fulgidus est une archée hyperthermophile anaérobie sulfato-réductrice
(Stetter, 1988). Les études de ses mécanismes de détoxification de l’O2 ont montré que
l’enzyme neelarédoxine (Nlr) est le principal acteur de l’élimination de l’ion superoxyde. En
effet, la neelarédoxine présente une réactivité bifonctionnelle vis-à-vis du superoxyde dans la
mesure où elle est capable de le réduire ou de le dismuter via une voie dépendante du
NAD(P)H. Par ailleurs, les extraits cellulaires d’A. fulgidus sont pourvus d’une activité
catalase et d’une activité NAD(P)H/oxygène oxydoréductase (Abreu et al., 2000). D’autres
études ont montré que le génome d’A. fulgidus contient des gènes codant pour trois NADH
oxydases (noxA-1, noxB-1 and noxC) impliquées dans la protection de ce micro-organisme
contre le stress oxydant (Kengen et al., 2003).
Très peu d’études se sont intéressées à l’étude de l’effet de l’oxygène sur les bactéries
hyperthermophiles anaérobies et on reporte dans le paragraphe suivant les études qui ont été
réalisé chez une bactérie particulière Thermotoga maritima.
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Etude Bibliographique
V / Effet de l’O2 sur la bactérie Thermotoga maritima et mécanismes
de défense
Au cours de cette étude, notre intérêt s’est porté plus particulièrement sur l’étude de
l’effet de l’O2 sur la physiologie et la croissance de la bactérie anaérobie hyperthermophile
Thermotoga maritima pour les raisons suivantes.
Tout d’abord, T. maritima se positionne dans une branche très basse de l’arbre
phylogénétique (Huber and Stetter, 1992; Huber and Hannig, 2006) et l’hypothèse de son
caractère ancestral a souvent été émise. Ensuite, T. maritima est l’une des espèces du domaine
des Bacteria les plus hyperthermophiles, capable de croître à des températures allant jusqu’à
90°C (Huber et al., 1986), température à laquelle l’O2 moléculaire est peu soluble. Enfin, T.
maritima bien que décrite comme anaérobie stricte (Huber et al., 1986), s’est montrée capable
de tolérer de faibles pressions partielles d’O2 au même titre que les BSR lors de sa croissance
(Le Fourn et al., 2008). Elle occupe des environnements extrêmes soumis à diverses phases
d’oxygénation, notamment dans le milieu marin. T. maritima a donc été choisie comme
modèle d’étude, dans le but d’élucider les mécanismes cellulaires ayant permis à cette
dernière de s’adapter à la présence d’O2. Ces travaux s’inscrivent dans une problématique
visant à rechercher les mécanismes de défense ancestraux contre les effets toxiques de
l’oxygène mis en place chez les procaryotes anaérobies au cours de l’évolution.
T. maritima tolère une pression partielle d’O2 environ égale à 0.5 % vol/vol dans la
phase gaz d’un flacon de culture correspondant à une concentration d’O2 dissous dans le
milieu équivalente à 2.6µM (Le Fourn et al., 2008). Cependant, chez T. maritima, la nature du
système cellulaire permettant cette tolérance vis-à-vis de l’O2 n’a pas été encore totalement
élucidée. A partir des quelques travaux réalisés sur T. maritima, il ressort que parmi les
enzymes telles que la superoxyde dismutase (Dos Santos et al., 2000), la superoxyde
réductase (Jenney et al., 1999), la peroxydase et la catalase (Dos Santos et al., 2000), la
NADH oxydase apparaît comme une enzyme importante impliquée dans la consommation de
l’O2 grâce à son étonnante capacité à réduire ce dernier (Yang and Ma, 2007).
Une NADH oxydase conduisant à la formation d’H2O2 a été isolée, purifiée et
caractérisée chez Thermotoga hypogea, une bactérie isolée d’eaux de gisements pétroliers
proche phylogénétiquement de T. maritima. Ses propriétés catalytiques sont similaires à celles
des autres NADH oxydase isolées des micro-organismes hyperthermophiles (Yang and Ma,
2005). En effet, c’est une protéine homodimérique dont chacune des sous-unités à une taille
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Etude Bibliographique
de 50 kDa et contient un FAD (flavine adénine dinucléotide). Des études ont pu montrer que
des extraits cellulaires de T. maritima possèdent une activité NADH oxydase six fois
supérieure à celle de T. hypogea laissant supposer que la NADH oxydase de T. maritima est
plus active et permet une meilleure élimination de l’O2 pouvant être présent accidentellement
dans la niche écologique de ces micro-organismes. Cette NADH oxydase de T. maritima est
active même dans des cellules cultivées en absence d’O2. Son activité reste de l’ordre de 1
U.mg-1 de biomasse même dans des conditions d’anaérobiose poussées. Elle augmente
légèrement quand l’O2 est introduit dans le milieu de culture.
La NADH oxydase de T. maritima est formée de 2 sous unités de poids moléculaire 54
et 46 kDa. Cette structure hétérodimérique la rend différente des NADH oxydases typiques
précédemment caractérisées (Ward et al., 2001), mais similaire à quelques autres enzymes
NADH oxydases (Reinards et al., 1981). Cette NADH oxydase, contient un cofacteur FAD, et
est très active mais sensible à l’O2 (Yang and Ma, 2007). La NADH oxydase de T. maritima a
été purifiée en condition d’anaérobiose stricte. Son activité décroît cependant quand elle est
exposée à l’air. Le taux d’inactivation de cette enzyme est fortement dépendant de la
concentration d’O2. Les auteurs ont observé une perte de 50% d’activité au bout de 20
minutes et 40 minutes en présence de 20% (v/v) et 1% (v/v) d’O2 respectivement pour
l’enzyme purifiée. L’enzyme contenue dans la cellule est cependant plus résistante à l’O2.
Pysz et al. (2004) étudiant la réponse de T. maritima, cultivée dans des conditions de
stress oxydant, ont observé une sous expression inattendue des gènes codant la synthèse de la
rubrérythrine (TM0657, 3.7 fois), la superoxyde réductase (SOR, TM0658, 3.4 fois), la
rubrédoxine (TM0659, 3.1 fois) et le gène aphC codant l’alkylhydroperoxyde réductase
(TM0807, 6 fois) (Pysz et al., 2004). Toutes ces protéines présentent une forte homologie avec
celles des souches de Pyrococcus furiosus et Pyrococcus horikoshii (57% à 67% environ
d’homologie (Blake et al., 1991; Jenney et al., 1999; Clay et al., 2003; Kashima and Ishikawa,
2003)). Les enzymes de Pyrococcus furiosus et Pyrococcus horikoshii homologues à celles de
T. maritima ont été largement étudiées. La rubrédoxine et la SOR sont impliquées dans le
processus de détoxication de l’O2 en H2O2 qui est une réaction dépendante du NADPH
(Jenney et al., 1999), alors que la AphC homologue chez P. horikoshii (présentant une
similarité de 69% c'est-à-dire 214 acides aminés identiques à l’opéron TM0807 de T.
maritima) participe dans la voie de réduction du H2O2 en alcool (Kashima and Ishikawa,
2003).
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Etude Bibliographique
D’autres gènes étudiés par Pysz et al. (2004) ont été surexprimés dans les conditions de
stress oxydant. En effet, le gène aphC (TM0780) codant pour une protéine putative
thiorédoxine peroxydase / bactérioférritine (Bcp) a été surexprimée d’un facteur 2.6 dans un
biofilm de T. maritima formé en présence d’O2 (Jeong et al., 2000; Pysz et al., 2004). Le gène
TM0386 qui contient une combinaison unique entre un domaine d’une Bcp thiorédoxine
peroxydase et un domaine d’une nitroréductase, a également été surexprimé d’un facteur 3.
Des gènes impliqués dans le processus de réparation et de la recombinaison de l’ADN ont
aussi été surexprimés (Sms/RadA (TM0199) et endonucléases (TM0664 et TM1545)).
De nombreuses explications possibles ont été avancées pour la sous expression
surprenante du gène codant pour la SOR. En effet, une baisse dans l’expression de ce gène a
été observée chez des cellules de T. maritima en phase stationnaire (travaux non publiés de
Johnson et Kelly), ce qui reflète une similarité entre la phase stationnaire de croissance et la
formation de biofilm cellulaire suite à une exposition à l’O2. Une autre explication
impliquerait le fait que les cellules piégées dans une matrice cellulaire seraient moins
exposées à l’O2 mais aussi au H2O2 résultant de la détoxication de l’O2, cela se traduit par une
sous expression de ces gènes.
Des études récentes se sont intéressées à la culture de T. maritima en présence d’O2 (Le
Fourn et al., 2008). Ces auteurs ont cultivé T. maritima dans trois conditions différentes : en
anaérobiose dans un milieu réduit avec 0.25 mM Na2S, en anaérobiose dans un milieu non
réduit (exempt de Na2S) et en présence d’O2 (0.25% O2 v/v dans la phase gaz). La technique
d’électrophorèse gel 2D a montré une abondance significative des protéines neelarédoxine
(TM0658) et rubrérythrine (TM0657) dans les conditions oxydantes. Les gènes codant pour
ces protéines appartiennent à la même unité multicistronique codant également pour la
rubrédoxine (TM0659). L’abondance de la protéine neelarédoxine est corrélée avec la
surexpression de son gène en présence d’O2 comme le révèle la technique RT PCR
quantitative. Cette enzyme est impliquée dans la réaction de réduction de l’ion superoxyde en
peroxyde l’hydrogène (Auchere et al., 2003; Rodrigues et al., 2007a) et elle a aussi été
identifiée chez de nombreuses bactéries et archées sensibles à l’O2. La seconde enzyme, la
rubreryhthrine, est responsable de l’élimination du peroxyde d’hydrogène. De nombreuses
rubrérythrines isolées de sources variées présentent une activité efficace NAD(P)H
peroxydase et rubrédoxine peroxydase in vitro (Coulter et al., 1999; Weinberg et al., 2004)
leur permettant de réduire le peroxyde d’hydrogène en eau. Ces résultats suggèrent que T.
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Etude Bibliographique
maritima est exposée aux ROS lorsqu’elle est cultivée en anaérobiose en milieu non réduit ou
en présence d’O2 dans la phase gaz de son milieu de culture (Le Fourn et al., 2008).
En présence d’O2, T. maritima surexprime un gène (TM1368) très intéressant qui lui
permet de réparer les dommages causés par les ROS sur la molécule d’ADN (Le Fourn et al.,
2008). Le gène TM1368 code pour une protéine SufC impliquée dans le système
d’assemblage et de réparation des ponts fer-soufre. Ce gène fait partie d’un cluster qui
comprend les gènes les plus conservés de l’opéron suf qu’on retrouve également chez les
archaea et aussi chez les eucaryotes (Le Fourn et al., 2008). Ce système est responsable de la
synthèse des ponts Fe-S ou de la réparation des ponts Fe-S instables en présence d’O2 et ceci
dans certaines conditions bien définies telles que croissance limitée par le fer ou croissance en
conditions oxydantes qui provoquent un trouble du métabolisme du fer ou du soufre (Loiseau
et al., 2003; Nachin et al., 2003). Le système Suf apparaît donc comme un des mécanismes de
réparation des dommages causés par l’O2 et ses ROS sur les protéines de T. maritima.
T. maritima est par ailleurs capable de réduire l’O2. En effet, Le Fourn et al. (2008) ont
identifié une flavoprotéine, appartenant à la classe A des protéines flavodiférriques (Saraiva et
al., 2004; Le Fourn et al., 2008), qui est plus abondante en condition oxydante qu’en
anaérobiose. La séquence de cette protéine présente 11% d’identité et 27% de similarité avec
une rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO) de Desulfovibrio gigas, une enzyme capable
de réduire l’O2 en H2O (Chen et al., 1993b). L’étude de la structure tridimensionnelle de cette
protéine (TM0755) montre qu’elle est homologue à celle de D. gigas et qu’elle est formée de
deux domaines : un domaine β lactamase qui contient un centre di-ferrique et un domaine
flavodoxine lié à un groupement FMN (Frazão et al., 2000). Le gène de cette protéine est très
surexprimé en condition oxydante par rapport à des conditions de croissance anaérobie, ce qui
tend à montrer son implication dans le mécanisme de protection de T. maritima vis-à-vis de
l’O2. Des constructions génétiques (Le Fourn et al., 2008) du gène TM0755 ont révélé que ce
dernier est inclus dans une unité multicistronique renfermant cinq autres gènes codant pour
une α-glucosidase (TM0752), une ubiquinone/menaquinone biosynthesis méthyltransférase
(TM0753), une oxydoréductase (TM0754), une galactosyl transférase (TM0756), et
finalement une glucosyl transférase (TM0757). Dans cette même unité multicistronique, il
existe en plus le gène TM0754 codant une protéine présentant une homologie significative
avec une NAD(H) oxydoréductase de Pyrococcus furiosus et environ 56% d’identité de
séquence avec une NAD(P)H rubrédoxine oxydoréductase de Thermococcus kodakaraensis.
Chez D. gigas, il a été démontré par Frazao et al. (2000) que la ROO est l’enzyme oxygène
50
Etude Bibliographique
réductase terminale qui se situe à la fin d’une chaîne de transfert d’électrons entre la NADH
oxydoréductase et la rubrédoxine (Frazão et al., 2000). Par analogie, on peut imaginer que la
NADH oxydoréductase de T. maritima codée par le gène TM0754 et l’oxygène réductase
codée par TM0755 agissent ensemble pour réduire l’O2 et que la rubrédoxine codée par le
gène TM0659 véhicule les électrons entre les deux enzymes précédentes (Le Fourn et al.,
2008).
L’α-glucosidase (TM0752), la galactosyl transférase (TM0756), et finalement la
glucosyl transférase (TM0757), surexprimés en présence d’O2, semblent être impliquées dans
la synthèse des exopolysaccharides requis pour la formation d’un biofilm protecteur en
conditions de stress oxydant (Pysz et al., 2004; Le Fourn et al., 2008), ce qui réduirait
l’exposition des cellules à l’O2 environnant en piégeant ces dernières dans une matrice
cellulaire.
51
Etude Bibliographique
VI / Métabolisme des sucres chez les hyperthermophiles
Le métabolisme des sucres a été étudié chez les micro-organismes hyperthermophiles
du domaine des Bacteria et des Archaea grâce notamment à (i) l’identification des produits de
fermentation de glucose par HPLC et
13
C-NMR (Kengen et al., 1994), à celle des
intermédiaires de la dégradation du glucose à l’aide du marquage du glucose au 14C (Selig et
al., 1997), (ii) la mesure de l’activité enzymatique dans les extraits cellulaires (Schäfer and
Schönheit, 1992), (iii) la caractérisation des enzymes purifiées (Kengen et al., 1995) et enfin
(iv) les analyses moléculaires des gènes codant les enzymes glycolytiques (Ronimus and
Morgan, 2003). Ces études ont mis en évidence l’existence de plusieurs voies métaboliques de
transformation du glucose en pyruvate.
La voie Embden-Meyerhof (EM), appelée également glycolyse, est la voie utilisée
communément par la plupart des micro-organismes appartenant à tous les domaines du vivant
confondus. Cependant, un certain nombre de micro-organismes ont recours à des voies
alternatives telles que la voie Entner-Doudoroff (ED). De plus, d’autres organismes sont
capables d’emprunter la voie des pentoses phosphates (PP) connue aussi sous le nom de la
voie des hexoses monophosphates (figure 11) (Melendez-Hevia et al., 1997).
52
Etude Bibliographique
Figure 11 : Comparaison des différentes voies de glycolyses proposées pour les microorganismes hyperthermophiles (Bacteria et Archaea).
Voie Embden-Meyerhof (EM), voie Entner-Doudoroff (ED). Sulfolobus: voie ED non
phosphorylée (non P ED) à 100%; Thermoproteus: voie EM modifiée (85%)
simultanément avec la voie ED non phosphorylée (15%); Desulfurococcus: voie EM
modifiée (100%); Pyrococcus et Thermococcus: voie EM modifiée (100%); Thermotoga:
voie EM conventionnelle (85%) simultanément avec la voie ED phosphorylée
conventionnelle (15%) [Pyr:FdOR pyruvate:ferredoxin oxydoréductase, Ac-P acetylphosphate, TCA cysle de l’acide tricarboxylique, PTA phosphotransacetylase
(phosphate acetyltransférase), AK acétate kinase]
53
Etude Bibliographique
VI.1. Glycolyse chez les Archaea
La dégradation des sucres a été étudiée en premier lieu chez les Archaea
hyperthermophiles (Verhees et al., 2003).
Deux modes de conversion des sucres ont été décrits chez ces dernières :
(1) les archaea anaérobies strictes appartenant aux genres Pyrococcus, Thermococcus et
Desulfurococcus fermentent les sucres essentiellement en acétate, hydrogène et CO2. Ces
archaea fermentaires produisent l’acétate et le CO2 via une acétyl-CoA synthétase spécifique
des archaea.
(2) les archaea anaérobies soufre dépendantes telles que Thermoproteus tenax et les
espèces aérobies du genre Sulfolobus, oxydent totalement les sucres en CO2 en présence de
soufre élémentaire et d’oxygène, respectivement (Selig et al., 1997). Ainsi, S. solfataricus
comme les autres archaea ayant la capacité de respirer l’oxygène, oxydent complètement
l’acétyl-CoA en CO2 via le cycle de l’acide citrique combiné à l’oxydation couplée du
NAD(P)H et de la ferrodoxine (Blamey and Adams, 1993). En se fondant sur l’analyse du
génome de S. solfataricus, il a été proposé que la ferrodoxine est le principal transporteur
physiologique d’électrons chez Sulfolobus et chez les archaea en général (She et al., 2001).
La transformation du glucose en pyruvate est réalisée de deux façons différentes: la voie
EM chez l’hyperthermophile anaérobie archéen Pyrococcus furiosus et la voie ED chez
l’hyperthermophile aérobie archéen Sulfolobus solfataricus (Selig et al., 1997).
Il est à noter que la différence fondamentale entre les deux voies EM et ED est que la
dernière se distingue par la formation à la fois du NADPH et du NADH au lieu de deux
molécules de NADH pour la voie EM. De plus, la phosphorylation du substrat donne lieu à la
libération d’une seule molécule d’ATP par molécule de glucose dégradé, dans la voie ED
(Melendez-Hevia et al., 1997).
En se fondant sur les résultats des expériences menées avec le marquage au
13
C de la
molécule de glucose, une autre différence a été notée qui concerne les enzymes clefs agissant
sur le glucose : (1) dégradation du glucose à l’aide d’une hexokinase ADP-dépendante et une
6-phospho-fructokinase ADP dépendante pour former le fructose-1,6-biphosphate (FBP)
comme intermédiaire réactionnel (voie EM); (2) dégradation du glucose en fructose-1phosphate (F-1-P) grâce à la présence dans la cellule d’une glucose isomérase et d’une
ketohexokinase (voie ED) et ceci chez toutes les archées hyperthermophiles (Schäfer et al.,
1994).
54
Etude Bibliographique
Les voies de fermentation des sucres établies chez les archaea hyperthermophiles
montrent des différences très significatives par rapport aux voies conventionnelles (Selig et
al., 1997). Les modifications de la voie EM impliquent l’intervention de différentes hexose
kinases et des enzymes glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) oxydases.
La kinase ADP-dépendante concerne la glucokinase ADP-dépendante et la
phosphofructokinase ADP-dépendante présentes chez P. furiosus, Thermococcus litoralis et
Thermococcus celer (Kengen et al., 1994; Kengen et al., 1995; Selig et al., 1997). Une des
explications données à la présence des kinases ADP-dépendantes est que l’ADP est plus
thermostable que l’ATP spécialement en présence des cations bivalents (Siebers and Hensel,
1993). La seconde enzyme importante est la glycéraldhéyde-3-phosphate oxydase, une
nouvelle protéine ferredoxine dépendante contenant du tungstène (Mukund and Adams, 1995)
et qui a été découverte chez P. furiosus, Thermococcus litoralis (figure 12) et Desulfococcus
amylolytic (Selig et al., 1997). Cette enzyme originale catalyse une nouvelle conversion qui
est l’étape qui assure la production du 3-phospho-glycérate et de la ferrodoxine réduite à
partir de la glycéraldéhyde-3-phosphate. Il est donc évident que l’absence de la
phosphorylation du substrat par l’enzyme glycéraldehyde-3-phosphate oxydoréductase a une
importante conséquence bioénergétique pour ces archaea fermentaires (Kengen et al., 1996).
Cette modification de la voie EM reflète un mécanisme d’adaptation à des hautes
températures parce que les nucléotides de type pyridine sont nettement moins thermostables
que les ferrodoxines (Daniel and Danson, 1995).
Chez P. furiosus, cette glycéraldéyde-3-phosphate ferredoxine oxydoréductase
(GAP :FdOR) a été détectée et elle est caractérisée par une forte activité (Mukund and
Adams, 1995). Cette enzyme a été proposée pour remplacer le couple GAP-DH (NADP+
dépendante) et la phosphoglycérate kinase (Mukund and Adams, 1995). Ces deux dernières
enzymes sont présentes chez P. furiosus, souche capable de croître sur maltose où elles
présentent une faible activité (figure 12). Cependant, chez les souches de P. furiosus capable
de se multiplier sur pyruvate, ces enzymes présentent une très forte activité catalytique. Ces
résultats suggèrent que ces enzymes sont pourvues d’une fonction gluconéogénétique qui
consiste à synthétiser le glucose à partir de précurseurs non-glucidiques (Schäfer and
Schönheit, 1993).
La voie ED caractérisant les archaea est également modifiée de deux sortes : les
archaea halophiles utilisent une variante de la voie ED dans laquelle le 2-keto-3deoxygluconate (KDG) est phosphorylé en un KDPG sous l’action d’une KDG kinase ;
55
Etude Bibliographique
Thermoproteus, Thermoplasma et Sulfolobus spp. (Figure 13), quand à eux, utilisent une voie
de type ED dans laquelle aucun hexose intermédiaire n’est phosphorylé. En revanche, la
réaction d’activation via la phosphorylation survient tardivement dans les étapes de synthèse
du KDG (archaea halophiles) ou bien du glycérate (Sulfolobus et Thermoplasma) (Verhees et
al., 2003).
P. furiosus renferme des enzymes spécifiques de la voie ED non phosphorylée (Schäfer
and Schönheit, 1992). En revanche, la fonction de ces dernières n’a pas encore été élucidée.
En effet, chez P. furiosus, Schafer et Schonheit (1992) ont identifié la majorité des enzymes
impliquées dans la voie ED nonphosphorylée, mais les spectres RMN obtenus, suite aux
expérimentations du marquage du glucose avec le
13
C, indiquent que cette voie est utilisée
seulement dans certaines conditions de croissance et en plus à un faible pourcentage comme
dans le cas de l’archaea T. tenax (Schäfer and Schönheit, 1992).
En se fondant sur la détection des intermédiaires réactionnels et l’activité des enzymes
(De Rosa et al., 1984; Bartels, 1989), une version nonphosphorylée de cette voie a été
proposée chez l’archaea hyperthermophile aérobie Sulfolobus acidocaldarius. Cette dernière
fait intervenir la réaction d’oxydation du glucose en glycérate qui passe par la synthèse
d’intermédiaires nonphosphorylés, réaction catalysée par la glucose déshydrogénase
[NAD(P)+], la gluconate déhydratase, la KDG aldolase et la glycéraldéhyde déshydrogénase
(NADP+). Une kinase spécifique phosphoryle le glycérate en 2-phosphoglycérate qui est par
la suite converti en pyruvate via une énolase et une pyruvate kinase. Le bilan d’ATP produit
par cette voie nonphosphorylée est égale à zéro (1 mole consommée par la réaction catalysée
par la phosphoglycérate kinase et 1 mole générée par la réaction de pyruvate kinase) (Selig et
al., 1997). Cette voie ED nonphosphorylée a aussi été identifiée chez l’archaea aérobie
modérément thermophile Thermoplasma acidophila (Budgen and Danson, 1986; Danson,
1988) (figure 13).
L’étape
finale
de
la
fermentation
des
sucres
par
les
micro-organismes
hyperthermophiles est la conversion de l’acétyl-CoA en acétate, étape qui libère de l’ATP.
Lors de cette étape cruciale, les archaea hyperthermophiles sont aussi uniques car elles
possèdent une seule enzyme acétyl-CoA synthase ADP-dépendante. Chez P. furiosus, deux
enzymes à activité acétyl-CoA synthase ont été isolées et sont probablement impliquées dans
cette dernière étape de la dégradation du glucose (Glasemacher et al., 1997). Enfin, plusieurs
micro-organismes hyperthermophiles ont la capacité de convertir le pyruvate en alanine, une
56
Etude Bibliographique
voie dont la finalité est d’évacuer du pouvoir réducteur afin de maintenir l’équilibre redox de
la cellule.
57
Etude Bibliographique
Figure 12 : Les voies possibles de fermentation du maltose et de la cellobiose en acétate,
alanine, H2 et CO2 chez Pyrococcus furiosus
Fd (ferrodoxine), (1) α-glucosidase, (2) β-glucosidase, (3) glucose ferredoxine
oxydoréductase, (4) gluconate dehydratase, (5) 2-keto-3-deoxygluconate aldolase, (6)
glycéraldéhyde :ferredoxine oxydoréductase, (7) glycérate kinase, (8) énolase, (9)
pyruvate kinase, (10) pyruvate ferredoxine oxydoréductase, (11) acétyl-CoA synthétase,
(12) hydrogénase, (13) glutamate dehydrogénase, (14) alanine aminotransférase, (15)
glucose isomérase, (16) ketohexokinase, (17) fructose-1-phosphate aldolase, (18)
hexokinase ADP dépendante, (19) glucose-6-phosphate aldolase, (20) fructose-6phosphate kinase ADP dépendante, (21) fructose-1,6-bisphosphate aldolase, (22)
triosephosphate isomérase, (23) glycéraldéhyde 3-phosphate dehydrogénase, (24)
phosphoglycérate kinase, (25) phosphoglycérate mutase.
58
Etude Bibliographique
La formation de l’alanine par P. furious à partir de la fermentation du glucose (figure
12), dépend de la pression partielle de l’H2 dans le milieu et de la concentration des ions
NH4+.En effet, sous une atmosphère de H2/CO2, le ratio alanine/acétate est de l’ordre de
0.8 alors qu’en présence de soufre ou en coculture avec Methanococcus jannaschii, le ratio
diminue à 0.07 (Kengen and Stams, 1994).
P. furious est capable d’utiliser trois différentes voies pour évacuer les électrons générés
pendant la pyroglycolyse : (i) réduction du soufre en H2S (si le soufre est présent dans le
milieu), (ii) réduction des protons via l’hydrogénase, (iii) amination du pyruvate en L-alanine
(Kengen and Stams, 1994).
Chez Desulfurococcus amylolyticus les études (Selig et al., 1997) ont montré la
présence d’une hexokinase ATP dépendante, d’une 6-phosphofructokinase ATP dépendante
et d’une GAP :FdOR comme acteurs dominants dans la réaction d’oxydation du GAP en 3phosphoglycérate. La présence d’une enzyme 6-phosphofructokinase ATP dépendante dans
l’archaea hyperthermophile Desulfurococcus est très intéressante dans la mesure où elle n’a
jamais été précédemment décrite chez aucune archaea capable de métaboliser les sucres. De
plus, elle a été considérée jusqu’à ce jour comme une spécification des bactéries et des
organismes eucaryotes (Danson, 1988; Kandler, 1993; Schönheit and Schäfer, 1995). Une
exception à cette règle a été décrite par Yu et al. (1994) chez une archaea méthanogène
lithotrophe Methanococcus marispaludis capable d’utiliser d’une 6-phosphofructokinase ATP
dépendante pour la dégradation du glycogène (Yu et al., 1994).
La dégradation des sucres chez Archaeoglobus fulgidus est un cas d’espèce. En effet,
cette archaea sulfato-réductrice est capable d’utiliser l’amidon et le glucose (Stetter, 1988).
Cependant, l’analyse génomique homologue récente de cette archaea révèle l’absence de
toutes les enzymes clefs de la dégradation de l’amidon ou même du glucose (Klenk et al.,
1997). Ceci signifie que cette archæa contient de nouveaux gènes codant les enzymes
d’hydrolyse de l’amidon.
Thermoproteus tenax fermente aussi le glucose via cette voie non phosphorylée mais ce
micro-organisme utilise simultanément une voie EM modifiée.
59
Etude Bibliographique
Figure 13 : Voie de conversion du glucose en pyruvate chez l’archaea aérobie
hyperthermophile Sulfolobus solfataricus et S. acidocaldarius et chez l’archaea
thermophile modérée Thermoplasma acidophilum via la voie ED non phosphorylée
(1) glucose dehydrogenase [NAD(P)+], (2) gluconate dehydratase, (3) 2-keto-3-deoxygluconate aldolase, (4) glycéraldéhyde dehydrogenase (NAD+), (5) glycérate kinase, (6)
enolase, (7) pyruvate kinase.
60
Etude Bibliographique
VI.2. La glycolyse chez les Thermotogales : exemple Thermotoga maritima
La voie Embden-Meyerhof (EM) et la voie Entner-Doudoroff (ED) existent aussi chez
les Bacteria. Chez certaines espèces, les deux voies EM et ED sont présentes comme c’est le
cas chez l’hyperthermophile Thermotoga maritima. En l’occurrence, la proportion
d’utilisation de ces deux voies est approximativement égale à 85% EM et 15% ED (Selig et
al., 1997) chez T. maritima cultivée en présence de glucose comme source d’énergie
La voie EM classique de dégradation du glucose est très bien conservée chez les
Thermotoga. En effet, les dix enzymes qui catalysent l’oxydation du glucose en pyruvate sont
présentes. La glycolyse commence avec une phosphorylation du glucose, suivie d’une
isomérisation du glucose en fructose-6-phosphate et d’une seconde phosphorylation. Le
fructose1,6-bisphosphate formé subit une réaction de clivage pour générer un aldole. Le
glycéraldhéyde 3-phosphate (GAP) est ensuite activé pour être finalement converti en
pyruvate (Melendez-Hevia et al., 1997) (figure 14). Les travaux de Huber et al. (1986) ont
montré que Thermotoga maritima fermente le sucre en acétate, CO2 et H2 (Huber et al., 1986).
Les activités enzymatiques décelées ainsi que le rendement énergétique de la croissance
confirment que le glucose est dégradé en pyruvate via la voie conventionnelle EM (Schröder
et al., 1994; Schönheit and Schäfer, 1995) (figure 14).
T. maritima peut aussi dégrader le glucose via la voie ED classique phosphorylée
(Conway, 1992). Ainsi cette voie ED classique de transformation du glucose en pyruvate
compte neuf enzymes et commence par la phosphorylation soit du glucose soit de son dérivé
oxydé le gluconate. Le 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate (KDPG) généré est converti par
une réaction de clivage d’une aldole pour former le GAP et par la suite le pyruvate. Le triose
phosphate est ensuite activé par un phosphate inorganique (Pi) et est transformé en pyruvate
par les mêmes enzymes glycolytiques intervenant dans la voie EM.
61
Etude Bibliographique
Figure 14 : Voie de fermentation du glucose en acétate, CO2 et H2 chez la bactérie
hyperthermophile Thermotoga maritima via la voie EM classique
(1) hexokinase ATP dépendante, (2) glucose-6-phosphate isomérase, (3) 6phosphofructokinase ATP dépendante, (4) fructose-1,6-bisphosphate aldolase, (5) triose
phosphate isomérase, (6) glycéraldéhyde-3-phosphate déhydrogénase, (7)
phosphoglycérate kinase, (8) phosphoglycérate mutase, (9) énolase, (10) pyruvate kinase,
(11) pyruvate :ferredoxine oxydoréductase, (12) phosphate acétyltransférase, (13)
acétate kinase, (14) NADH :ferredoxine oxydoréductase, (15) hydrogénase).
62
Etude Bibliographique
VII / Méthodologie de culture des bactéries hyperthermophiles
anaérobies
VII.1. Les problèmes de la culture des hyperthermophiles anaérobies
Les micro-organismes hyperthermophiles appartiennent essentiellement au domaine des
Archaea et, dans une moindre mesure à celui des Bacteria. Récemment, des microorganismes ayant des températures optimales de croissance dépassant 100°C ont été décrits
(Stetter et al., 1986). Les hyperthermophiles ont été isolés de nombreux habitats naturels
chauds à travers le monde : sources hydrothermales chaudes, sédiments marins profonds,
environnements
pétroliers,
sources
thermales
terrestres,
solfatares,
environnements
anthropiques, sources hydrothermales volcaniques, etc... (Holst et al., 1997). Les
microbiologistes ont attaché de l’importance à ces hyperthermophiles pour des raisons
phylogénétiques (positionnement bas dans l’arbre phylogénétique), en raison de leur diversité
métabolique, et finalement de la stabilité biologique de leurs protéines pouvant prétendre à
des applications biotechnologiques (Holst et al., 1997). Cependant, la culture des
hyperthermophiles de ces micro-organismes pose des problèmes liés essentiellement à leur
culture à grande échelle, dans la mesure où les bioprocédés doivent être conduits à haute
température (entre 80 et 90°C environ). Par ailleurs, l’étude des potentialités
biotechnologiques de ces micro-organismes présente une limitation majeure liée à la faible
quantité de biomasse générée par ces derniers, notamment en condition anaérobie. Au
laboratoire, des problèmes pratiques sont rencontrés tels que leur culture en milieu solide,
l’évaporation des milieux de culture en flacons agités, notamment pour les aérobies. De plus,
à haute température, les sucres (substrats énergétiques) peuvent se décomposer de manière
abiotique ou s’associer à des composés aminés comme dans la réaction de Maillard (Mauron,
1981). Les produits de ces réactions affectent le métabolisme des hyperthermophiles.
Les problèmes liés à la culture des hyperthermophiles sont, en partie, dus à une faible
solubilité des gaz à haute température. De plus, la plupart de ces extrêmophiles ont des taux et
des vitesses de croissance faibles. Ils sont également caractérisés par une grande susceptibilité
vis-à-vis de certains substrats énergétiques et par des inhibitions de croissance par certains
produits du métabolisme, notamment l’hydrogène. Il en résulte des problèmes de
productivités qui empêchent d’obtenir des densités cellulaires conséquentes (Holst et al.,
1997).
63
Etude Bibliographique
VII.2. Méthodes de culture de routine
Les bactéries hyperthermophiles anaérobies sont habituellement cultivées dans les tubes
Hungate ou les flacons de pénicilline scellés selon la technique mise au point par Hungate et
développée par Miller (Hungate, 1969). Cette technique de culture est opérationnelle pour les
milieux liquide et solides. Childers et al. (1992) ont cultivé Thermotoga neapolitana dans des
tubes hungate en milieu solide (Childers et al., 1992). A cet effet, ils ont utilisé la gelrite, un
agent solidifiant plus adapté que l’agar pour la culture des hyperthermophiles (Lin and Casida
Jr, 1984; Grogan, 1989) et ont obtenu de meilleurs résultats en combinant gelrite (0.7%) et
agar (3%). La préparation de milieu solide pour ces hyperthermophiles a notamment été
nettement améliorée par l’abaissement de la concentration des cations divalents, ions
indispensable à la solidification de la gelrite (Childers et al., 1992). Ainsi, ces auteurs ont
développé une méthode de culture de T. neapolitana sur milieu solide. Ils ont démontré en
particulier que les jarres en polycarbonate maintiennent parfaitement l’anaérobiose lors de
longues périodes d’incubation.
Van Ooteghem et al. ont utilisé en 2004 les microplaques pour la culture de T.
neapolitana en anaérobiose et sous des conditions microaérophiles (Van Ooteghem et al.,
2004). Grâce au système Bioblog, ces auteurs ont réussi à déterminer les différentes sources
d’énergie utilisées par T. neapolitana sous des atmosphères
gazeuses contrôlées (Van
Ooteghem et al., 2004).
Récemment Uzarraga et al. ont validé un système de culture pour les hyperthermophiles
en jarre (Uzarraga et al., 2010). Ce système expérimental est constitué d’une jarre de 5 L dans
laquelle sont disposées 7 microplaques de polypropylène de 24 puits pouvant résister à des
températures allant jusqu’à 120°C. Toutes les manipulations sont automatisées. La jarre est
connectée à un anoxomate qui permet de formuler une atmosphère de composition gazeuse
définie. Ce système a été testé avec succès pour la culture d’Aquifex aeolicus.
VII.3. Culture en fermenteur
Le facteur clef de l’étude des micro-organismes hyperthermophiles est le
développement des stratégies de culture qui permettent l’exploration de la diversité de leur
métabolisme ainsi que l’optimisation de leur croissance. Pour cela, il faut produire des
bactéries en quantités suffisantes pour entamer des études plus poussées et spécifiques et
détourner ainsi le problème récurrent de la faible productivité de biomasse caractéristique des
bactéries extrêmophiles (Godfroy et al., 2006). La culture de certains de ces micro-organismes
64
Etude Bibliographique
anaérobies hyperthermophiles réduisant le soufre élémentaire en H2S ou l’oxydant en acide
sulfurique a notamment été entreprise à l’aide de fermenteurs en céramique de très grande
capacité (Kelly and Deming, 1988). La culture des espèces hyperthermophiles à large échelle
a aussi été réalisée dans un fermenteur en métal émaillé ayant une capacité de 300 litres
(Stetter et al., 1983; Blöchl et al., 1997; Huber et al., 2000). Une grande diversité de systèmes
de culture a également été mise au point pour la culture de bactéries hyperthermophiles
acidophiles en particulier (Schiraldi et al., 1999; Worthington et al., 2003) et certaines
méthanogènes (Mukhopadhyay et al., 1999).
La culture de micro-organismes à des températures dépassant les 110°C, dans un milieu
pouvant contenir de fortes concentrations en sel et capable de produire activement du H2S,
représente donc un challenge aux techniques conventionnelles de fermentation employées à ce
jour (Godfroy et al., 2006). Le modèle d’étude choisi pour l’exploration de la physiologie et
du métabolisme des hyperthermophiles hétérotrophes chez les archées est Pyrococcus
furiosus, une bactérie anaérobie stricte appartenant à la famille des Thermococcales pouvant
croître à des températures comprises entre 70 et 103°C. Elle a été isolée d’un sédiment marin
chaud à Vulcano en Italie et est capable d’utiliser les peptides comme source de carbone et
d’énergie. Ses produits du métabolisme sont essentiellement le CO2 et l’H2. En présence de
soufre, la croissance de cette archée est améliorée grâce notamment à l’absence de production
d’hydrogène lors de la sulfo-réduction (Fiala and Stetter, 1986). Etant donné que de
nombreuses bactéries anaérobies hyperthermophiles, comme P. furiosus, produisent du
sulfure d’hydrogène, une attention particulière a été apportée à la conception des fermenteurs
pour cultiver ce type de micro-organismes. En effet, la solubilité du H2S dans le milieu de
culture engendre des problèmes d’inhibition de la croissance bactérienne, et des lyses
bactériennes (Fiala and Stetter, 1986; Godfroy et al., 2000), sans compter les problèmes de
précipitation ou de corrosion des matériaux selon les installations utilisées (Godfroy et al.,
2006). Tous ces effets néfastes ont pu être évités grâce à l’utilisation d’un flux d’azote, par
exemple, pour lessiver et éliminer H2S dans des cultures réalisées en flacons ou dans des
fermenteurs en verre conventionnels (Brown and Kelly, 1989). Ces auteurs ont développé un
réacteur de 2L en verre dont la cuve est cylindrique et présente un fond arrondi. Le chauffage
est assuré par une couverture chauffante. L’azote qui alimente en continue le fermenteur sert à
éliminer l’H2S produit. En sortie, le gaz passe à travers une solution de NaOH pour être
éliminé. Finalement, le réacteur continue développé par Brown et Kelly (1989) a par la suite
été utilisé pour les cultures de P. furiosus, T. littoralis et T. maritima (Rinker and Kelly, 1996,
, 2000).
65
Etude Bibliographique
VII.3.1. Réacteur gas-lift
Les fermenteurs en verre de type gas-lift offrent la possibilité de cultiver une large
gamme de bactéries hyperthermophiles sous des conditions anaérobies et à des températures
dépassant les 98°C. Un bioréacteur continu a été développé pour la production de quantité
importante de biomasse de P. furiosus par Raven et al. en 1992. Le fermenteur en verre de
type gas-lift a permis la culture de cette archée en absence de soufre élémentaire tout en
augmentant les transferts de masses et évitant les problèmes de corrosion. L’utilisation d’un
fort flux d’azote (0.5 v.v-1.min-1) a assuré l’élimination de l’H2 inhibiteur de la croissance
pour atteindre des productivités de biomasse équivalente à 1.5 g poids sec.h-1.L-1 à un taux de
dilution de 0.4h-1 ainsi qu’une meilleure qualité de cellules. Par ailleurs, le fort flux d’azote
rend le processus de culture plus sécurisant et plus économique vu qu’il devient possible
d’utiliser des matériaux à prix bas (Raven et al., 1992). La fermentation en mode continu a
également été utilisée pour la culture d’autres procaryotes hyperthermophiles tels que
Pyrococcus woesei, Pyrobaculum islandicus, Thermococcus litoralis et Hydrogenobacter
thermophilus. En plus de la forte productivité de biomasse obtenue grâce à ce bioréacteur, la
culture en mode continue permet d’étudier précisément la physiologie de ces
hyperthermophiles.
VII.3.2. Réacteur continue avec recyclage des cellules
Dans le but d’éviter les problèmes de culture liés à l’inhibition par le substrat et les
produits de métabolisme surtout lorsque la densité cellulaire devient très élevée, la
méthodologie de la culture en continue avec recyclage des cellules a été développée (Holst et
al., 1997). Ce mode de fermentation permet l’élimination du surnageant de la culture, la
rétention de la biomasse active ainsi que son recyclage dans le fermenteur et surtout
l’alimentation continue des cellules par de faibles concentrations non inhibitrices de substrat
neuf et frais (Mattiasson and Holst, 1991). Ce système a été utilisé avec succès pour la culture
de certains micro-organismes thermophiles tels que Bacillus stearothermophilus (San Martin
et al., 1994) et Clostridium thermosulfurogenes (Nipkow et al., 1989).
VII.3.3. Système de fermenteur à membrane de dialyse
Un fermenteur conventionnel agité cultivant P. furiosus a aussi été décrit par Krahe et
al. (1996). Ce système de fermentation a pu généré une quantité importante de biomasse et les
auteurs ont démontré qu’une vitesse d’agitation supérieure à 1800 rpm porte préjudice à la
66
Etude Bibliographique
croissance bactérienne (Krahe et al., 1996). Ils ont utilisé un bioréacteur à membrane formé de
deux compartiments (Holst et al., 1997). L’utilisation d’une membrane de dialyse est très
avantageuse dans les réacteurs cultivant les micro-organismes et ceci pour deux raisons ; (1)
la membrane de dialyse est efficace pour l’élimination en continue des produits toxiques du
métabolisme bactérien, (2) le substrat, parfois inhibiteur, peut être additionné d’une manière
continue via la membrane (Holst et al., 1997). De cette manière, des concentrations
importantes de biomasse peuvent être atteintes (Märkl et al., 1993; Ogbonna and Märkl,
1993). Ce système intégré est aussi très flexible dans la mesure où plusieurs types de
membranes peuvent être utilisés et il a été utilisé pour la culture de P. furiosus comme
modèle. En effet, les résultats montrent une amélioration de la productivité de la biomasse qui
est passée de 0.03 g.L-1 en microcosme à 0.3 g.L-1 en fermenteur. Ce progrès résulte de
l’amélioration du transfert entre les phases gazeuses et liquide due à l’agitation du milieu et
témoigne de l’efficacité de l’élimination des métabolites toxiques pour l’augmentation de la
productivité de la biomasse d’un facteur 10 (Holst et al., 1997).
Finalement, on peut conclure que bien que beaucoup de travail reste à fournir pour
perfectionner les techniques de culture des hyperthermophiles, il existe néanmoins de
nombreux exemples de procédés qui rendent possible la culture des bactéries
hyperthermophiles avec des productivités cellulaires conséquentes. Grâce à la mise en place
de ces systèmes de culture en fermenteur, il nous a été finalement permis d’approfondir notre
compréhension de la physiologie des bactéries extrêmophiles et d’envisager désormais de
nouvelles applications industrielles les concernant.
67
Matériel et Méthodes
MATERIEL ET METHODES
68
Matériel et Méthodes
I / Culture de T. maritima en anaérobiose en microcosme
Les milieux de culture sont préparés selon les techniques mises au point par Hungate
(1969) et développées par Macy (1972) (Hungate, 1969; Macy et al., 1972).
T. maritima a été cultivée dans un milieu minéral contenant du NH4Cl (1g.L-1), KH2PO4
(0.3 g.L-1), K2HPO4 (0.3 g.L-1), KCl (0.1 g.L-1), CaCl2 (0.1 g.L-1), NaCl (25 g.L-1) et les oligo
éléments de Balch (10 mL.L-1) (Balch et al., 1979). Le pH est régulé à 7 à l’aide d’une
solution de KOH (10M). Le milieu est porté à ébullition pour chasser l’oxygène puis refroidi
sous un flux d’azote. Il est ensuite distribué dans des flacons de type pénicilline ou des tubes
Hungate hermétiquement fermés sous une atmosphère de N2/CO2 (80/20). Les flacons ou
tubes contenant respectivement 35 ml ou 5 ml de milieu sont ensuite autoclavés 30 minutes à
121°C. Le tampon NaHCO3 (2 g.L-1), le MgCl2 (3 g.L-1), le glucose (20 mM) et l’extrait de
levure (1 g.L-1) sont ajoutés au milieu stérile, par l’intermédiaire de seringues stériles au
préalablement purgées avec de l’azote. Les flacons servant à inoculer le fermenteur sont
remplis avec 35 ml de milieu de culture. Après stérilisation du milieu, on ajoute 0.7 mL de
NaHCO3 (10%), 0.7 mL de MgCl2 (150 g.L-1), 0.7 mL de glucose (1M) et 2.5 mL d’inoculum
bactérien. Les solutions stocks de NaHCO3, de MgCl2, de glucose et d’extrait de levure de
concentrations respectives 100 g.L-1, 150 g.L-1, 180 g.L-1 et 50 g.L-1 sont préalablement
stérilisées par autoclavage (30 min, 121°C) ou par filtration dans le cas des composés
thermosensibles tel que le glucose (Miller and Wolin, 1974). En fonction des conditions
expérimentales à tester (anaérobiose ou en présence d’O2), des réducteurs (Na2S (0.4 g.L-1) et
cystéine HCl (0.5 g.L-1) sont apportés aux milieux avant stérilisation. Ces derniers sont
inoculés à 10% et les cultures sont incubées à 80°C pendant 30h dans une étuve sans
agitation.
69
Matériel et Méthodes
II/ Culture de T. maritima en fermenteur
Le dispositif expérimental utilisé est un fermenteur de 2 L représenté à la figure 15. Le
chauffage du fermenteur est assuré par une circulation d'huile dans une double enveloppe.
L’huile est chauffée à 80°C à l’aide d’un bain thermostaté (Julabo F25, France). Une sonde de
température disposée dans un doigt de gant en verre plonge dans le fermenteur. Cette sonde
est connectée au bain thermostaté pour assurer la mesure et la régulation de la température
(80°C). Le milieu de culture est agité à l’aide de trois hélices superposées. Le fermenteur est
équipé de quatre sondes pour le suivi en ligne des paramètres tels que la température, le
potentiel redox, l’O2 dissous et le pH. Les sondes sont reliées à des transmetteurs permettant
l’affichage des valeurs mesurées. Ces derniers sont reliés à un logiciel permettant la saisie des
données (BatchPro, Decobeq Automatismes). Des débitmètres massiques connectés au
logiciel d’acquisition de données assurent la régulation des flux d’azote pur, d’O2 pur ou d’air
en entrée du fermenteur. Afin de minimiser l'évaporation à 80 °C du milieu de culture, le flux
gazeux en sortie du fermenteur est refroidi dans un condenseur au sein duquel circule de l’eau
régulée à 4°C (Julabo F25-MP, Germany). Un joint hydraulique monté en série permet de
maintenir une pression atmosphérique constante dans le fermenteur. Un capteur CO2 (Vaisala
GMT 221, Finlande) disposé après le condenseur permet de suivre en continu la production de
CO2. Le pH du milieu est régulé à 7 grâce à une solution stérile et anaérobie de NaOH (1M).
Le poids du fermenteur et de la solution de soude sont également suivis en ligne grâce à deux
balances.
Avant stérilisation, la cuve cylindrique du fermenteur est remplie avec le milieu minéral
(composition annexe tableau 1). Les entrées servant à introduire les sondes du potentiel redox,
du pH et de l’O2 dissous sont bouchés (l’une d’entre elles est cependant laissée ouverte pour
éviter la surpression lors de l’étape de stérilisation) et les tuyaux servant à l’inoculation du
fermenteur et à l’échantillonnage sont également obstrués. Le fermenteur contenant le milieu
minéral est autoclavé 20 minutes à 121°C. Le flacon contenant la solution de soude est
stérilisé à part. Il est relié à un flacon vide de 500 ml qui fait office de tampon de
dépressurisation. Les sondes de mesure du pH (Mettler Toledo InPro 3253, Switzerland) et du
potentiel redox (Mettler Toledo InPro 3253, Switzerland) au préalablement calibrées à 80°C
dans leurs solutions standards sont introduites stérilement dans le milieu. La sonde d’oxygène
dissous, pO2 (Mettler Toledo InPro 6800, Switzerland) est calibrée dans un milieu minéral
maintenu à 80°C à l’aide d’un flux d’air continu. Vingt et un pourcent d’oxygène (% O2 dans
l’air) représentent 100% de saturation. A l’équilibre, dans une eau à 80 °C et contenant 25
70
Matériel et Méthodes
g.L-1 de NaCl (concentration en sel du milieu de culture), la concentration en O2 dissous est
de 90 µM O2.
Pour l’établissement des conditions anaérobies au début de chaque expérience, un flux
de 20 mL.min-1 de N2 pur est envoyé pendant environ 12 heures dans le fermenteur régulé à
80°C. L’anoxie au sein du fermenteur est vérifiée à l’aide de la sonde d’O2 dissous qui doit
indiquer une valeur de 0 ± 0.5 %. Une fois les conditions anoxiques sont établies, le MgCl2,
l’extrait de levure et le glucose sont additionnées stérilement et de manière anoxique dans le
milieu juste avant l'inoculation. Le MgCl2 est rajouté dans le milieu après stérilisation pour
éviter la réaction de précipitation des sels ; l’extrait de levure et le glucose, étant des
composés thermolabiles sont également ajoutés juste avant le démarrage de la fermentation
pour éviter leur éventuelle dégradation sous l’effet de la haute température (80°C) maintenue
pendant 12h (période pour assurer l’anoxie du milieu dans le fermenteur). Ainsi 5 mL de
solution MgCl2 (900 g.L-1), 5 mL d’extrait de levure (30%) et 10 mL de glucose (3M) sont
ajoutés au milieu de culture. L’inoculum prévu pour ensemencer le fermenteur représente un
volume de 160 mL. Il est préparé dans des flacons pénicilline et est introduit dans le
fermenteur stérilement et en anaérobiose à partir d’un port.
Un logiciel BatchPro (Decobecq Automatismes) nous permet de contrôler en
permanence certains paramètres de la fermentation (pH, Température, agitation, débits de N2,
etc...). La maîtrise des conditions physico-chimiques lors de la croissance bactérienne permet
une bonne traçabilité du matériel biologique et servira par la suite à des études de
transcriptomique. Pour tous les essais de fermentation, la température et la vitesse d’agitation
sont régulés à 80°C±0.5°C et 150±5 rpm, respectivement. Le pH est régulé à 7.0±0.1 à l’aide
d’une solution de NaOH 1M. A la fin de la fermentation, le milieu est acidifié à un pH de 1.52.0 à l’aide d’une solution concentré de H2SO4 pour déterminer la quantité de CO2 dissous
dans le milieu.
Pendant la fermentation, des prélèvements du milieu liquide sont réalisés pour mesurer
la biomasse par turbidimétrie et doser le glucose et les métabolites par HPLC. La
concentration des composés gazeux (H2 et O2) est mesurée à la sortie du fermenteur par
chromatographie gazeuse (prélèvements à l’aide de seringues gaz).
71
Matériel et Méthodes
4
7
5
8
6
1
2
3
Figure 15 : Photo de la plateforme de fermentation pour la culture de Thermotoga maritima.
(1) cuve de fermentation de 2L, (2) bain thermostaté réfrigérant à 4°C, (3) bain thermostaté à 80°C, (4) transmetteurs pour la mesure en
ligne du potentiel redox, pH, O2 dissous, et température, (5) capteur CO2, (6) NaOH à 1M stérile et anaérobie pour la régulation du pH,
(7) contrôleurs de débit massique de gaz, (8) logiciel BatchPro.
72
Matériel et Méthodes
II.1. Croissance de T. maritima en fermenteur dans des conditions anaérobies
Pour la culture en conditions anoxiques de T.maritima en fermenteur, l’agitation est
fixée à 150 rpm avec un flux d'azote de 3 mL.min-1 pendant toute la durée de la fermentation.
Ce flux de N2 constitue un flux de référence (le N2 n’étant ni consommé ni produit pendant la
fermentation) qui permet d’estimer en sortie du fermenteur les débits de CO2 et d’H2 lors de la
croissance (voir les modèles mathématiques décrits dans l’article 1). Dans ce qui suit, ces
conditions opératoires pour toutes les cultures anaérobies en fermenteur seront utilisées.
II.2. Culture de T. maritima en anaérobiose suivie de conditions oxydantes
variables
De nombreuses études ont montré la grande capacité de T. maritima à coloniser divers
biotopes exposés périodiquement à l’oxygène (Rusch et al., 2005). La disponibilité de l’O2
dans ces habitats pour cette bactérie peut être très variable (Von Damm, 1990; Jorgensen et
al., 1992; Rogers and Amend, 2006). Ainsi, nous nous proposons d’étudier la physiologie de
T. maritima sous différentes conditions oxydantes qu’elle retrouve in situ (systèmes
hydrothermaux marins plus ou moins profonds). Pour cela, différents débits d’air contenant de
l’O2 sont administrés pendant des durées de temps variables à l’aide de débitmètres
massiques. A l’aide de notre dispositif de culture (fermenteur), nous sommes capables de
générer ces différentes conditions de stress oxydant en modifiant notamment les débits d’air,
la composition gazeuse et le temps d’exposition. De plus, la plateforme de fermentation est
parfaitement adaptée à la culture des micro-organismes hyperthermophiles anaérobies, grâce à
un contrôle rigoureux de tous les paramètres de fermentation (T°C, pH, potentiel redox, O2
dissous, etc...).
Au cours de ces expériences, T. maritima est cultivée en anaérobiose dans un milieu ne
contenant pas les réducteurs de potentiel d’oxydo-réduction classiques (Na2S ou cystéine
HCl) afin d’éviter une consommation d’O2 trop importante via des réactions abiotiques.
(Voir composition milieu annexe tableau 2).
La fermentation comprend trois phases : une première phase anaérobie, une deuxième
phase oxydante et enfin une troisième phase anaérobie.
La première phase de culture bactérienne a été réalisée sur une période d’environ 10 à
14h (même conditions opératoires que celles décrites dans le paragraphe précédant II.1.).
Cette première phase anoxique favorable à la croissance des cellules de T. maritima permet
73
Matériel et Méthodes
d’obtenir une population cellulaire suffisamment dense pour pouvoir la soumettre au stress
oxydant. Pendant la deuxième phase, les cellules sont donc soumises à des épisodes oxydants
plus ou moins conséquents. Ces épisodes consistent en : 4 pulses d’oxygène de durée courte,
suivis d’un pulse d’O2 de durée longue, et enfin 4 autres pulses d’O2 de durée courte (Tableau
2). Ces conditions opératoires simulent les phases oxiques que la bactérie rencontre
accidentellement dans son habitat naturel. Ainsi, pour les 4 premiers pulses d’O2 de durée
courte, un flux total de 100 mL.min-1 d’un mélange gazeux N2 :O2 est introduit dans le
fermenteur de la manière suivante i) O2:N2 4:96 v/v pendant 24.4 min (la concentration
d’oxygène dissous (OD) dans le milieu atteint 13.4 µM), ii) O2:N2 2:98 v/v pendant 6 min
(OD atteint 6.3 µM), iii) O2:N2 9:91 v/v pendant 3.7 min (OD atteint 36.1 µM) et finalement
iv) O2:N2 1.5:98.5 v/v pendant 2 min (OD atteint 2.9 µM). Le pulse d’oxygène de durée
longue (14 heures) a été réalisé avec un flux total de 4 mL.min-1 et un pourcentage O2:N2 de
0.2:3.8 v/v (OD atteint 2.4 µM juste à la fin de la phase oxydante, avant l’arrêt du stress). Il
est suivi de 4 pulses courts d’O2 différents (débit total de 100 mL.min-1): i) O2:N2 5:95 v/v
durant 4.4 min (OD atteint 16.0 µM), ii) O2:N2 8:92 v/v durant 5.6 min (OD atteint 68.7 µM),
iii) O2:N2 2:98 v/v durant 3.2 min (OD atteint 8.5 µM) et enfin iv) O2:N2 1:99 v/v durant 6.1
min (OD atteint 4.2 µM) (voir tableau 2).
Il est important de préciser qu‘après chaque introduction d’O2 dans le fermenteur, et que
lorsque la concentration d’O2 dissous a atteint sa valeur d’équilibre dans la phase liquide, le
débit gazeux (N2 et O2) ainsi que l’agitation sont alors arrêtés. On observe ainsi une
diminution de l’O2 dissous dans le milieu jusqu’à une valeur proche de 0 %. De plus, avant
toute nouvelle introduction d’O2, pour bien séparer les épisodes d’oxygénation et restaurer
l’anaérobiose, la phase gazeuse du fermenteur est balayée par un flux d’azote de 100mL.min-1
pendant 5 minutes. Il faut savoir que pendant tous ces pulses d’O2 de courtes durées, la
vitesse d’agitation est fixée à 500 rpm afin de d’accroître le transfert d’O2 entre la phase gaz
et la phase liquide et augmenter ainsi la disponibilité de l’O2 lors de la croissance de T.
maritima. Par contre, pendant le pulse d’O2 de longue durée, l’agitation est maintenue
constante à 150 rpm dans le but de favoriser la diffusion lente et progressive de l’O2 vers les
cellules. La dernière phase anaérobie est réalisée de la même façon précédemment décrite (N2
de 3 mL.min-1 et agitation de 150 rpm) pour restaurer les conditions d’anaérobiose dans le
milieu.
74
Matériel et Méthodes
Tableau 2 : Récapitulatif des conditions opératoires de la fermentation de T. maritima en anaérobiose suivi de conditions oxydantes
variables.
Phase II
Phase I
Périodes
Phase III
4 premiers pulses O2
Pulse O2 long
4 derniers pulses O2
13.5h-15h
21h-37h
42.5h-44h
0h-13.5h
-1
Débit total (mL.min )
3
100
100
100
100
4
100
100
100
44h-114h
10
3
0
-1
3
96
98
91
98.5
3
95
92
98
99
3
-1
0
4
2
9
1.5
0
5
8
2
1
0
Débit air (mL.min )
-1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
O2 dissous (µM)
0
13.4
6.3
36.1
2.9
-
16
68.7
8.5
4.2
0
Agitation (rpm)
150
500
500
500
500
150
500
500
500
50
150
Débit N2 (mL.min )
Débit O2 (mL.min )
0
75
Matériel et Méthodes
II.3. Mesure de la consommation d’O2 et suivi de la croissance de T. maritima
soumise aux différentes conditions oxydantes
II.3.1. Stress ponctuel et estimation de la vitesse de consommation de l’O2 par
T. maritima
Un protocole expérimental inspiré des travaux de Bandyopadhyay et. (1967) a été mis
au point pour mesurer la vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima (Bandyopadhyay et
al., 1967). En premier lieu, T. maritima est cultivée en condition anaérobie (voir II.1) jusqu'à
l’obtention d’une biomasse équivalente à 0.2 unité de DO à 600 nm (ce qui correspond à une
phase où T. maritima se trouve en phase exponentielle de croissance). C’est à ce moment
qu’un pulse d’oxygène est appliqué. Ainsi, un mélange O2 / N2 est introduit dans le
fermenteur avec un débit total de 100 mL.min-1 (6 mL.min-1 d’O2 pur et 94 mL.min-1 de N2).
Le milieu est agité à 500 rpm pour favoriser le transfert d’O2 vers les cellules bactériennes. La
concentration d’O2 dissous augmente dans le milieu de 0 µM à 25 µM (figure 16). A l’aide de
la sonde du potentiel redox, on peut également suivre la variation de ce paramètre durant le
pulse d’O2. Une fois l’équilibre atteint (après 30 minutes environ d’oxygénation), le flux d’O2
entrant ainsi que l’agitation sont interrompus. L’O2 dissous dans le fermenteur diminue
progressivement jusqu’à atteindre une concentration de 0 µM. Un flux de N2 de 100mL.min-1
est alors appliqué pendant 5 minutes dans le but de chasser tout l’O2 résiduel du fermenteur.
L’anaérobiose est ensuite restaurée comme précédemment décrit. Tout au long du pulse d’O2,
des échantillons de 50 ml ont été prélevés à différents instants (T1, T2, T3 et T4 figure 19)
afin de réaliser des études transcriptomiques (recherche des mécanismes biochimiques mis en
place par T. maritima pour lutter contre l’effet toxique de l’O2) et des dosages par RMN
(analyse fine du métabolisme carboné chez T. maritima). Les échantillons ont été prélevés à
l’aide d’une pompe péristaltique commandée par le logiciel BatchPro (Decobecq
Automatismes). Ils sont récupérés dans des flacons pénicilline anaérobies et stériles, puis
placés dans de la glace pour être analysés.
Pour estimer la vitesse de consommation de l’O2 par les cellules de T. maritima, nous
avons appliqué une méthode dynamique inspirée des travaux de Bandyopadhyay et al (1967).
Elle consiste à se baser sur la diminution de l’oxygène dissous dans le fermenteur en fonction
du temps comme indiqué sur la figure 16. Cette mesure de la pente est réalisée sur la portion
de courbe linéaire ou aucun effet de limitation en O2 est observé (Bandyopadhyay et al.,
1967).
76
Matériel et Méthodes
40
200
30
Arrêt de l'aération
0
-100
10
-200
-300
0
-400
T1
10.0
10.5
T2 T3
11.0
O2 dissous (%)
20
Potentiel redox (mV)
O2 dissous (µM)
100
Phase d'équilibre
30
Consommation d'O2
20
10
T4
-500
12.5 13.0
Temps (h)
0
0
5
10
Temps (min)
15
Figure 16 : Méthode dynamique inspirée de la méthode de Bandyopadhyay et al. (1967) pour la mesure de la vitesse de consommation de
l’O2 par T. maritima
(Bandyopadhyay et al., 1967) : Représentation schématique d’un pulse d’oxygène : la figure de gauche montre la variation de l’O2
dissous (
) et du potentiel redox ( ) en fonction du temps pendant l’épisode oxydant. Le graphe de droite montre un zoom de la pente
descendante de la courbe de variation de l’O2 dissous (-) en fonction du temps, dont l’estimation nous permet de calculer la vitesse de
consommation de l’O2 par T. maritima.
77
Matériel et Méthodes
II.3.2. Croissance de T. maritima soumise à des conditions de stress oxydant
long : « adaptation à l’O2 »
T. maritima est cultivée en fermenteur dans un milieu non réduit et en anaérobiose
comme précédemment décrit (3 mL.min-1 N2 et une agitation de 150 rpm). Après 10-12h de
culture, on obtient une biomasse équivalente à 0.18-0.2 unité DO à 600 nm correspondant à
des cellules en phase exponentielle de croissance. On applique alors un stress oxydant d’une
longue durée (20h d’oxygénation environ) par l’introduction dans le milieu d’un flux d’air de
1 mL.min-1 et un flux d’azote de 2 mL.min-1 (le flux total est de 3 mL.min-1). L’agitation est
augmentée à 500 rpm. Le retour à l’anaérobiose est réalisé en arrêtant le flux d’air et en
rétablissant le flux d’azote à 3 mL.min-1 tout en réduisant l’agitation à 150 rpm. Durant ce
stress oxydant long, des échantillons sont prélevés à différents instants T0, T1, T2, T3 et T4
(voir figure 19) pour également réaliser les analyses trancsriptomiques et les spectres RMN.
78
Matériel et Méthodes
III / Méthodes analytiques
III.1. Estimation de la biomasse par turbidimétrie
La croissance est suivie par turbidimétrie grâce à la mesure de la densité optique DO à
600 nm. Une unité de DO correspond à 0.339 g.L-1 de poids cellulaire sec. Pour minimiser
l’effet de la présence de précipités minéraux dans le milieu de culture de T. maritima sur la
mesure de la turbidimétrie, nous avons ajouté 100 µL d’acide acétique 150 mM à pH 4 à 900
µL d’échantillon. En effet, à pH neutre, la formation de précipité de sels dans le milieu de
culture présentant une salinité de 25 g.L-1 est inévitable.
III.2. Dosage des gaz par chromatographie en phase gazeuse
Pendant la croissance, la composition de la phase gazeuse du fermenteur a été effectuée
par la mesure des différents gaz (CO2, H2, O2 et N2) à l'aide de la chromatographie en phase
gazeuse. Un échantillon de 1 mL de gaz est prélevé périodiquement pour analyse. Le
chromatographe est un TCD-GC (Shimadzu 8A) équipé d’une colonne concentrique CTR1
(Alltech). Il est connecté à un ordinateur permettant d’analyser les données grâce au logiciel
Winilab III software (Perichrom). La température du four est de 35°C, celles de l’injecteur et
du détecteur sont de 100°C. Le gaz vecteur est l’argon et son débit est fixé à 60 mL.min-1. Le
courant du pont de Weasthone est de 60 mA. La calibration est réalisée à l’aide d’un mélange
gazeux de composition préalablement définie dans le but d’établir la gamme étalon.
III.3. Dosage du glucose et des métabolites en phase aqueuse par
chromatographie liquide haute performance
Le dosage du glucose et des produits du métabolisme fermentaire en phase liquide
(acétate, lactate, etc...) est réalisé en chromatographie liquide haute performance. Un
échantillon de 1 mL est centrifugé 5 minutes à 14,5 rpm. 20 µL de surnageant passent à
travers d’une colonne Animex HPX-87H maintenue à 35°C. L'échantillon est élué avec une
solution de H2SO4 (0.75 mM) avec un débit de 0.5 mL min-1. Un réfractomètre différentiel
(Shimadzu RID 6 A, Japon) permet de quantifier les différents produits dont l'analyse est
réalisée avec le logiciel Winilab III.
79
Matériel et Méthodes
III.4. Dosage des exopolysaccharides
Les exopolysaccharides (EPS) sont dosés selon la méthode colorimétrique de Dubois et
al. (1956) basée sur le phénol et l'acide sulfurique (DuBois et al., 1956). La méthode de
précipitation des EPS à l’éthanol, décrite précédemment par Rinker et Kelly (2000) a
également été testée pour doser les EPS (Rinker and Kelly, 2000). Un volume de 300 ml a été
prélevé du fermenteur pendant la croissance anaérobie de T. maritima. Les EPS ont été
précipités à l’éthanol 95% (600 ml) ajouté goutte à goutte sous une faible agitation. Après une
nuit d’incubation à 4°C, la solution a été filtrée et le précipité lavé à l’eau distillé est séché à
80°C pendant 24h. La poudre séchée est pesée pour déterminer la concentration des EPS.
Dans le but de doser les sucres simples composant cette poudre blanche, on solubilise cette
dernière dans le milieu de culture et on hydrolyse avec de l’acide sulfurique 6N (250µL
milieu de culture + 10 mg de poudre + 50 %µL H2SO4 concentré), on incube à 100°C pendant
2h, 6h et 24h. A la sortie de l’étuve, on laisse refroidir et on neutralise avec une solution de
soude. L’échantillon passe ensuite à l’HLPC pour déterminer la concentration et la nature des
sucres simples composant les EPS.
III.5. Dosage du peroxyde
Le dosage du peroxyde repose sur la méthode colorimétrique de l’oxydation du fer
ferrique en présence du xylénol orange (Jiang et al., 1992). Le kit utilisé est commercialisé
sous le nom de PeroXOquant TM Quantitative Peroxide Assay Kits. En effet, concernant le kit
compatible avec les solutions aqueuses, le peroxyde donne un radical peroxyle en présence de
sorbitol ; ce radical catalyse l’oxydation du fer ferrique (Fe2+) en fer ferreux (Fe3+). Ce
dernier, se complexe avec le colorant xylénol orange dans un milieu acide pour générer un
complexe xylénol Fe3+ de couleur violette capable d’absorber à la longueur d’onde λ = 560
nm. Le kit comprend une solution A et une solution B. On prépare le réactif réactionnel en
mélangeant un volume de A avec 100 volumes de B, et on ajoute 1 ml de ce réactif à 100 µL
d’échantillon. On laisse incuber 20 minutes à température ambiante et on lit l’absorbance à
560 nm.
Une gamme étalon est préparée à partir d’une solution de H2O2 à 30% (p/v). On prépare
une solution H2O2 à 10 mM en diluant 1 ml de la solution à 30% dans 880 ml d’eau. On dilue
la solution à 10 mM 200 fois pour obtenir une solution à 50 µM. Le kit est tellement sensible
qu’il détecte de très faibles concentrations de peroxyde ; au-delà de 1 mM on n’est plus dans
80
Matériel et Méthodes
la zone de linéarité et les résultats ne sont plus exploitables. C’est pour cela que l’on réalise la
gamme étalon comme décrit dans le tableau 3.
Tableau 3 : Gamma étalon pour le dosage du H2O2 à l’aide de PeroXOquant TM
Quantitative Peroxide Assay Kits
Blanc 1 2 3 4 5 6 7
Volume de la solution H2O2 à 50 µM 0
5
Volume d’eau
95 90 85 80 50 20 0
100
10 15 20 50 80 100
Incuber 20 minutes à température ambiante
Lire DO à 560 nm
III.6. Dosage des protéines totales
Les protéines totales de T. maritima ont été dosées par la technique dosage de Bradford
(Bradford, 1976). La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, basé sur le
changement d'absorbance qui se manifeste par la modification de la couleur du réactif bleu de
Coomassie après complexation avec les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et
phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans les protéines.
La forme anionique (liée) du colorant est bleue, et possède un spectre d'absorption
maximal estimé historiquement à 595 nm. Les formes cationiques (libres) du colorant sont
rouges et vertes, absorbant à 465-470 nm. Le changement d'absorbance est proportionnel à la
quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.
Contrairement aux autres méthodes de mesure des protéines, la méthode de Bradford est
moins sensible aux interférences par divers agents présents dans les échantillons de protéine.
Elle est toutefois affectée par les détergents, modifiée par le pH, et donne un résultat positif
également aux polyphénols hydrosolubles de haut poids moléculaire (tanins). La méthode de
Bradford est linéaire sur un intervalle étroit, typiquement de 2 µg.mL-1 à 120 µg.mL-1, ce qui
rend nécessaire des dilutions préliminaires de l'échantillon tissulaire avant analyse.
Des échantillons cellulaires de T. maritima, cultivée en anaérobiose en milieu non réduit
en flacon pénicilline, ont été prélevés à différents moments de la croissance cellulaire.
Après lecture de la DO à 600 nm pour estimer la biomasse, les échantillons ont été
centrifugés et les culots sont resuspendus dans 100 µL-1 d’eau osmosée puis congelés
jusqu’au moment de l’analyse à -20°C. Dans le but de lyser les cellules et de libérer les
protéines totales intracellulaires, on réalise un choc thermique pour rompre l’intégrité de la
81
Matériel et Méthodes
membrane. Ainsi, à la sortie des -20°C, on place les culots dans de l’eau bouillante à +100°C
pendant 10 minutes. Une observation d’un échantillon au microscope confirme la présence de
cellules lysées.
Le dosage des protéines a été réalisé à l’aide du kit Quick Start Bradford Protein Assay
de BIO-RAD. La solution de sérum albumine bovine (BSA) sert à établir la gamme étalon
allant de 125 µg.mL-1 à 2000 µg.mL-1. A 20 µL-1 d’échantillon, on rajoute 1 ml du réactif de
Bradford (1X dye reagent) et on incube à température ambiante pendant 5 minutes.
L’absorbance est mesurée par la suite à 595 nm. Tous les essais ont été réalisés en duplicata.
III.7. Spectroscopie RMN
III.7.1. Définition de la spectroscopie RMN
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique spectroscopique
permettant d'identifier la structure de composés (liquide ou solide), de caractériser leur
enchaînement atomique, et d'obtenir des informations sur l'environnement magnétique (nature
des voisins proches) des noyaux. Cette méthode d'analyse, puissante et très performante, est
utilisée aussi bien en analyse structurale qu'en analyse quantitative. Le phénomène de RMN
correspond à une absorption sélective d'énergie par des noyaux possédant un moment
magnétique, placés dans un champ magnétique et irradiés par une onde électromagnétique.
III.7.2. Objectif de la RMN
La RMN sert à la détermination structurale de composés moléculaires chimiques. Elle
précise la formule développée et la stéréochimie des molécules. Elle revêt une importance
particulière en chimie organique, en biochimie et en chimie macromoléculaire (polymères,
gels, matériaux).
III. 7.3. Principe de la RMN
Tous les noyaux atomiques possèdent une charge en rotation, identifiée sous le nom de
spin nucléaire (ils sont assimilables à des petits aimants et de ce fait peuvent présenter un
moment magnétique nucléaire). Certains noyaux ne sont pas observables en RMN car ils n'ont
pas de propriétés magnétiques.
Sous l'action d'un champ magnétique externe uniforme, le noyau atomique (son moment
magnétique nucléaire) peut prendre différentes orientations. A ces différentes orientations,
82
Matériel et Méthodes
correspondent différents niveaux d'énergie : l'un de basse énergie, si le moment magnétique
est parallèle et de même sens que le champ extérieur, l'autre d'énergie plus élevée, si le sens
est contraire. La différence d'énergie ∆E entre ces deux états est proportionnelle au champ
extérieur. La transition du niveau bas au niveau haut peut avoir lieu par absorption d'une
radiation de fréquence n telle que ∆E = hν.
Lorsque la transition a lieu, on dit qu'il y a résonance du noyau.
Dans la plupart des spectroscopies, l'obtention d'un spectre (c'est-à-dire d'une intensité
en fonction d'une fréquence) se fait par exploration successive des différentes fréquences. La
durée de l'enregistrement est limitée par la vitesse de balayage de ce spectre, compte tenu des
artefacts que cela peut engendrer.
Dans le cas de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), l'enregistrement de spectres
peut se faire:
soit dans le domaine de fréquences (RMN onde continue),
soit dans le domaine des temps (RMN impulsionnelle par transformée de Fourier).
En onde continue, seule une partie des spins à la fréquence courante d'excitation ne
contribue à un instant donné au signal. En RMN impulsionnelle, l'ensemble des spins est
excité en même temps par une impulsion radiofréquence courte donc non sélective; après
celle-ci, le récepteur est ouvert et le signal de précession libre (FID) est mesuré et digitalisé.
Comme il contient les contributions d'un grand nombre de noyaux, son interprétation directe
n'est pas possible. En utilisant la transformée de Fourier, on calcule un spectre en fréquence
formellement analogue au spectre obtenu classiquement par enregistrement onde continue.
L'acquisition d'un spectre ne demande qu'une à deux secondes et en répétant
l'expérience
fois, on augmente le rapport Signal/Bruit d'un facteur
.
En analyse, la transformation de Fourier est un analogue de la théorie des séries de
Fourier pour les fonctions non périodiques, et permet de leur associer un spectre en
fréquences. On cherche ensuite à obtenir l'expression de la fonction comme « somme infinie »
des fonctions trigonométriques de toutes fréquences qui forment son spectre. Une telle
sommation se présentera donc sous forme d'intégrale. L'analyse non standard permet de la
présenter sous forme d'une série et justifie le point de vue intuitif. Séries et transformation de
Fourier constituent les deux outils de base de l'analyse harmonique.
Pour éviter des problèmes d'unités, on définit une grandeur sans unité, elle aussi appelée
: déplacement chimique d .d s'exprime en ppm (parties par million = fréquence noyau /
83
Matériel et Méthodes
fréquence spectroscopie RMN). La fréquence est en Hertz, mais pour simplifier, on ramène
l’échelle des fréquences en ppm. La figure 17 représente le principe de fonctionnement et
l’appareillage de la spectroscopie RMN.
84
Matériel et Méthodes
Figure 17 : Appareillage spectroscopie RMN
85
Matériel et Méthodes
III.7.4. Analyse des voies de la glycolyse chez T. maritima par spectroscopie RMN
Dans le but de déterminer les voies métaboliques empruntées par T. maritima lors de la
glycolyse en anaérobiose et en présence d’O2, nous avons réalisé des fermentations en
présence de glucose marqué au carbone
expériences du marquage du glucose au
13
C en deux positions à savoir C1 et C3. Les
13
C visent à analyser les produits finaux de
fermentation, notamment dans les différentes conditions oxydantes imposées à T. maritima
lors de sa croissance. Ces produits sont l’acétate, le lactate et la L-alanine. Ainsi, si la
glycolyse suit la voie EM (voir figure 18), le marquage
13
C1 glucose, se positionnera sur les
groupes méthyles de l’acétate et/ou du L-alanine et/ou du lactate, alors que le marquage issu
du
13
C3 glucose se situera sur le groupement carboxyle du L-alanine et/ou du lactate.
Inversement, lorsque le glucose est fermenté suivant la voie type ED (voir figure 18), une
fermentation conduite avec un 13C1 glucose résultera en un marquage du groupe carboxyle du
L-alanine et/ou du lactate, tandis que le 13C3 glucose viendrait se placer sur les groupements
méthyles de tous les produits du catabolisme du glucose (figure 18).
Cette méthode de marquage permet également la détection de la contribution de la voie
des pentoses phosphates étant donné qu’elle conduit au marquage du groupement carboxyle
de l’acétate et du carbone C2 du lactate ou du L-alanine dérivés du
13
C3 glucose. Le
13
marquage issu du C1 glucose, quant à lui, sera présent sur le CO2 ou les bicarbonates.
Des expériences ont été réalisées en conditions de stress oxydant long et des essais
contrôles ont été effectués en anaérobiose. La confrontation des résultats obtenus lors de ces
deux expériences, nos permettra de déterminer la voie métabolique empruntée
préférentiellement par T. maritima, Embden-Meyerhof (EM) ou Entner-Doudoroff (ED), dans
les différentes conditions de croissance (anaérobiose ou stress oxydant) testées. Sur la figure
19, sont indiqués les moments où les prélèvements ont été effectués.
86
Matériel et Méthodes
Figure 18 : Représentation schématique du motif de marquage attendu des produits de
fermentation réalisée avec C1 et C3 glucose dans le cas où la fermentation se fera selon
la voie Embden-Meyerhof (EM) ou Entner-Doudoroff (ED).
Le devenir du marquage de l’atome carbone en C1 ( ) et celui de C3 ( ) est indiqué
sur la figure. Le marquage des produits alanine et lactate est similaire à celui du
pyruvate (Selig et al., 1997).
87
Matériel et Méthodes
Pour chaque prélèvement, on récupère 50 ml d’échantillon à l’aide d’une pompe
péristaltique reliée au fermenteur (Watson Marlow 505U). L’échantillon est directement
prélevé dans un flacon de pénicilline stérile et anoxique. L’échantillon est ensuite centrifugé à
9000 rpm pendant 20 minutes (Eppendorf 5804 R) et le surnagent est filtré stérilement à l’aide
d’un filtre stérile 0.2 µm (Filtropur S 0.2 PAT SARSTEDT). Le culot est resuspendu dans 10
ml de milieu neuf additionné de 20% de glycérol liquide. Culots et surnageants sont enfin
stockés à -80°C pour être analysés ultérieurement à l’aide de la technique RMN.
Le motif de marquage du carbone au
déterminé à l’aide de spectres RMN
13
C des produits terminaux de la glycolyse a été
13
C et 1H réalisés sur les surnageants décongelés en
suivant la méthodologie rapportée par Schafer et al. (1994b) (Schäfer et al., 1994). Les
spectres
13
C-RMN sont obtenus à partir d’un spectromètre 600 MHz équipé d’un signal
refroidit en 13C.
Pour les spectres 1H, la largeur spectrale est de 16 ppm (32 K), le temps d’exposition
est d’une minute et le nombre de scans est de 16.
Pour les spectres 13C, la largeur spectrale est de 250 ppm (130 K), le temps
d’exposition est de 8 minutes et le nombre de scans est de 126.
88
Matériel et Méthodes
200
T2
a
0
15
-100
-200
5
-300
0
T3
T1
-5
9
10
T4
11
12
Temps (h)
13
T4
100
0
T3
5
-100
T2
-200
0
T5
-400
-5
0
10
-300
-400
T1
-500
14
b
potentiel redox (mV)
20
10
200
100
potentiel redox (mV)
O2 dissous (%)
25
10
O2 dissous (%)
30
20 30 40
-500
50 60 70
Temps (h)
Figure 19 : Prélèvements pour analyse RMN des produits de la glycolyse par des cellules de T. maritima cultivées en anaérobiose (a) et en
conditions de stress oxydant long (b) en présence de glucose marqué en C1 et C3.
( ) O2 dissous, ( ) potentiel redox
89
Matériel et Méthodes
IV/ Techniques de biologie moléculaire : qRT-PCR
IV.1. Préparation des cellules pour l’analyse transcriptomique qRT-PCR
100 ml d’échantillon sont prélevés du fermenteur dans un flacon pénicilline anaérobie et
stérile placé dans de la glace à l’aide d’une pompe péristaltique (Watson Marlow 505U).
Après refroidissement de 10 minutes dans la glace, l’échantillon est transvasé dans deux tubes
Falcon, puis centrifugé 20 minutes à 7000 rpm à 4°C. Le culot est resuspendu dans 10 ml de
tampon Tris-HCl 0,1 M/ NaCl 0,15 M (pH 7,6) préalablement dégazé sous un flux d’azote
pendant 20 minutes, stérilisé 20 minutes à 120°C et refroidi à 4°C. Après centrifugation
pendant 20 minutes à 4°C à 7000 rpm, le culot est resuspendu dans 1 ml du même tampon et
transféré dans un tube Eppendorf stérile. Après centrifugation 5 minutes à 13000 rpm, le culot
est lavé dans 100 µL de tampon 10 mM Tris-HCl (pH 8) RNase-free. Cette dernière opération
de lavage est répétée quatre fois au total et le culot est finalement resuspendu dans 200 µL de
tampon 10 mM Tris-HCl – 1 mM EDTA (pH 8) RNase –free. Les tubes sont enfin congelés
dans l’azote liquide puis stockés à -80°C pour l’extraction ultérieure de l’ARN. Les
échantillons de culture sont récupérés avant, pendant et après le stress oxydant ponctuel (pulse
O2) et le stress oxydant long ainsi que pendant la culture en anaérobiose (condition de
référence).
IV.2. Extraction de l’ARN, quantification et contrôle de sa qualité
Pour l’extraction de l’ARN, on utilise le kit « High pure RNA isolation Kit » de Roche.
A un échantillon de 100 µL de cellules décongelées on ajoute 4 µL de lysozyme (50
mg.mL-1 dans DEPC-H2O) et on incube 10 minutes à 37°C. On ajoute 400 µL de tampon de
lyse, on homogénéise et on transvase le tout dans le réservoir supérieur de la colonne Roche ;
puis on centrifuge 15 secondes à 8000g. On ajoute 100 µL du mix DNase et on incube 60
minutes à température ambiante. On procède ensuite aux opérations de lavage et d’élution
selon la procédure déterminée par le fabriquant et on refait les mêmes opérations de
traitement à la DNase et de lavage. L’ARN est ensuite précipité avec 20 µL d’acétate de
sodium (DEPC 1/10) dans 500 µL d’éthanol 100% RNase-free (2.5 vol) pendant 30 minutes
au moins à -80°C.
Le culot d’ARN est récupéré après centrifugation de 30 minutes à 10000 rpm à 4°C et
est lavé avec de l’éthanol 70% RNase-free froid.
90
Matériel et Méthodes
L’ARN est enfin resuspendu dans 22 µL de DEPC H2O et est incubé 10 min à 65°C.
La qualité de l’ARN est déterminée grâce à une électrophorèse sur gel d’agarose à 1%
pour visualiser les bandes des ARN 16S et 23S. L’ARN est ensuite quantifié par une méthode
spectrophotométrique utilisant le Nanodrop (Thermoscientific) avec 1U DO à 260 nm
correspond à 40 µg.mL-1 de RNA. Une PCR de contrôle est réalisée pour confirmer une
absence de contamination par de l’ADN génomique.
IV.3. Synthèse des ADNc par reverse transcriptase
A 10 µg d’ARN on ajoute 3 µg d’oligonucléotides hexamèriques (Invitrogen) qu’on
incube 3 minutes à 70°C et qu’on place par la suite 1 minute dans la glace. On prépare le mix
de PCR composé de 1µL de dNTP 10 mM, 6µL de tampon 5X Tris-HCl pH 8.3, 40mM KCl,
6 mM MgCl2, 3 µL de DTT 0.1M et 3.5 µL de DEPC H2O et on incube le tout 5 minutes à
25°C. Après addition de 300 unités de l’enzyme Superscript II reverse transcriptase
(Invitrogen), le mix est incubé 5 minutes à 25°C, puis 1h à 42°C et enfin 15 minutes à 70°C.
Les cDNA sont ensuite purifiés par filtration sur les colonnes Microcon YM-30 (Millipore) et
repris dans un volume total d’eau pure de 100 µL pour être utilisés ultérieurement pour les
réactions de qRT-PCR.
IV.4. PCR quantitative en temps réel
La technologie de PCR quantitative en temps réel repose sur la détection et la
quantification d’un reporter fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la
quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR (Poitras and Houde, 2002).
L’amplification est réalisée de façon constante à un taux exponentiel à l’aide d’une ADN
polymérase thermostable. La détection quantitative des amplicons se fait grâce à des agents
qui se lient à l’ADN double brin tel que le SYBR Green I qui est un agent intercalant
(Morrison et al., 1998) dont l’émission fluorescente augmente lorsqu’il est lié à l’ADN double
brin. La quantification des transcrits est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour
chacun des cycles par un système de lecture de fluorescence intégré à l’appareil de PCR. La
variation du taux d’expression des gènes étudiés se fait par rapport à la quantité des transcrits
du gène codant pour l’unité 16S ribosomale étant donné que le taux de ce gène est considéré
comme invariable quelques soit les conditions de culture.
Les séquences des couples d’amorces spécifiques aux gènes étudiés sont reportées dans
le tableau 1 de l’article 2.
91
Matériel et Méthodes
Dans chaque capillaire, on introduit 5 µL de cDNA (dilué 10 fois), 5 µL de mélange
réactionnel Master mix (5X) (enzyme Fast Start Taq DNA polymérase, dNTP, MgCl2 et
SYBR Green I agent intercalant et fluorescent (kit Roche Diagnostic)) et 0.5 µM de chaque
oligonucléotides spécifiques au gène recherché. La réaction de PCR comporte 4 phases :
1/ Une phase d’activation de l’enzyme (8 minutes à 95°C),
2/ Une phase de PCR qui compte 45 cycles (dénaturation 95°C, 15 secondes ;
hydridation 57°C, 15 secondes ; élongation 72°C, 20 secondes)
3/ Une phase de fusion 65°C, 6 minutes
4/ Une phase de refroidissement 1 minute, 40°C.
La réaction de qRT-PCR est réalisée dans un thermocycler (Roche) et les données sont
traitées par le logiciel Roche molecular Biochemicals light cycler software version 3.5 qui se
base sur la valeur des crossing point des différents gènes par rapport au gène de référence 16S
pour déterminer le niveau d’expression des gènes testés dans diverses conditions. Le taux des
différents transcrits est calculé à l’aide du logiciel REST (Relative expression Software Tool)
(Pfaffl et al., 2002) ; ce dernier calcule l’expression relative de chaque gène par rapport à son
taux initial dans les conditions de référence.
L’étude de la physiologie et du métabolisme de la bactérie Thermotoga maritima en
anaérobiose et dans différentes conditions oxydantes a été réalisée à l’aide du dispositif
expérimental précédemment décrit (fermenteur de 2L). Les analyses analytiques,
métaboliques et transcriptomiques couplées à la méthodologie de culture adaptée à la culture
des micro-organismes hyperthermophiles, nous ont également permis d’approfondir cette
étude discutée dans la partie résultats ci-dessous.
92
Résultats et Discussion
RESULTATS ET DISCUSSION
93
Résultats et Discussion
Au cours de ce travail, nous nous proposons d’étudier l’effet de l’oxygène sur la
physiologie de la bactérie hyperthermophile anaérobie stricte : Thermotoga maritima. A cet
effet, nous avons cultivé cette bactérie dans un fermenteur de 2L afin d’assurer le suivi et le
contrôle des paramètres physicochimiques de fermentation tels que la température, le pH, le
potentiel redox, l’O2 dissous, le CO2 produit, les débits des gaz N2 et O2, etc… Un des enjeux
technologiques de ce travail est de contrôler et de maîtriser la concentration de l’O2 dissous,
dans un milieu de culture, à une température de 80°C, sachant la solubilité des gaz diminue
significativement avec l’augmentation de la température. L’extrapolation de la culture de T.
maritima du microcosme vers le fermenteur nécessite des étapes préliminaires d’optimisation
et de validation du protocole expérimental qui sont :
1/ L’obtention de la croissance de T. maritima en fermenteur de 2L.
2/ L’élaboration d’un modèle mathématique pour l’estimation de la productivité des gaz
par la bactérie et validation du modèle.
3/ La maîtrise du protocole du stress oxydant à appliquer à haute température pour une
bactérie anaérobie stricte sensible à l’oxygène.
94
Résultats et Discussion
I. Croissance de T. maritima en fermenteur de 2L : optimisation du
milieu de culture et validation de la culture en fermenteur
Thermotoga maritima est un micro-organisme anaérobie strict (Huber et al., 1986),
nécessitant pour croître la présence dans son milieu de culture (Huber and Hannig, 2006) de
composés chimiques (exemple : sulfure, cystéine) assurant la réduction du potentiel redox du
milieu de culture. Cependant, afin d’étudier l’effet de l’O2 sur cette bactérie, il a fallu au
préalable diminuer, dans la mesure du possible, les concentrations de ces réducteurs du milieu
de culture. Ces composés ont en effet le pouvoir de réduire et donc de consommer
chimiquement l’oxygène. Pour les mêmes raisons, nous avons également cherché à diminuer
la concentration en extrait de levure (EL) du milieu de culture sachant car ce dernier contient
également des éléments réducteurs comme la cystéine par exemple. Dans le cadre de notre
travail, les cellules de T. maritima ont toujours été cultivées en condition fermentaire en
utilisant le glucose comme source d’énergie.
La première série d’expériences a donc consisté à minimiser la concentration d’extrait
de levure (EL) pour que celle-ci ait le moins d’impact possible sur l’O2 apporté au milieu de
culture. Nous avons donc fait varier la concentration de l’EL lors de cultures conduites (i) en
anoxie et en conditions réduites (en présence de cystéine (0.5 g.L-1) et Na2S (0.4 g.L-1) et (ii)
en conditions d’anoxie non réduites (absence de cystéine et Na2S). Les essais ont été réalisés
pour une gamme de concentration en EL allant de 0 à 1 g.L-1 (0, 0.1, 0.5 et 1 g.L-1). Les
résultats obtenus sont résumés dans la figure 1. Ils montrent que plus on augmente la
concentration d’EL, meilleure est la croissance. En effet la biomasse maximale obtenue en
absence de réducteurs est égale à 0.30 et 0.15 unité DO respectivement en présence de 1 g.L-1
d’EL et 0.5 g.L-1 d’EL soulignant ainsi l’importance de l’EL pour obtenir des quantités
cellulaires conséquentes de T. maritima dans le cadre de notre étude (figure 20). Par ailleurs,
les résultats concernant la croissance réalisée avec un milieu de culture contenant 0.5 g.L-1
d’EL et une solution de vitamines de Balch (Balch et al., 1979), ont montré que la présence de
vitamines n’améliorait pas la croissance de T. maritima (résultats non présentés).
A l’issue de ce travail d’optimisation, un milieu de culture a été défini pour obtenir un
maximum de biomasse avec un minimum de conséquences sur la teneur en O2 dissous dans le
milieu de culture afin de pouvoir réellement tester l’effet de l’oxygène sur la croissance et le
catabolisme du glucose chez T. maritima. Le milieu anaérobie que nous avons sélectionné
95
Résultats et Discussion
pour la suite des expériences a été préparé en l’absence d’agents réducteurs et en présence de
1g.L-1 d’extrait de levure (voir annexe tableau 2).
Pour tester l’efficacité de notre outil méthodologique de culture, le fermenteur de 2L,
nous avons donc cultivé T. maritima en condition fermentaire, dans le milieu précité. Les
résultats obtenus sur les plans de la croissance et du profil des produits de fermentation
(discutés plus en détail dans l’article 1) étaient très proches de ceux obtenus en microcosme.
Ces résultats validaient de ce fait l’efficacité de la méthodologie de culture en fermenteur en
particulier pour ce qui est de la maîtrise de l’anoxie en l’absence de réducteurs chimiques
dans des volumes de culture importants.
96
Résultats et Discussion
0.40
Biomasse (DO à 600 nm)
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
10
20
30
40
50
60
70
Temps (h)
Figure 20 : Effet de la concentration en extrait de levure (EL) sur la croissance de T.
maritima cultivée en anoxie en présence et en absence de réducteurs chimiques (cystéine
+ Na2S)
présence de réducteurs + 1 g.L-1 EL, présence de réducteurs + 0.5 g.L-1 EL,
présence de réducteurs + 0.1 g.L-1 EL, sans réducteurs + 1 g.L-1 EL,  sans
réducteurs + 0.5 g.L-1 EL, ∆ sans réducteurs + 0.1 g.L-1 EL
97
Résultats et Discussion
II. Validation de la méthode de calcul des productivités des gaz
T. maritima a été cultivée dans un fermenteur de 2L, où tous les paramètres de
fermentation (température, O2 dissous, CO2 produit, pH, potentiel redox, débits des gaz N2 et
O2) sont rigoureusement contrôlés. A la différence du microcosme qui constitue un dispositif
de culture totalement fermé, le fermenteur de par sa conception ne permet pas une pression
supérieure à 2 bars pour des raisons de résistance des matériaux. En conséquence lors de
fermentations, les gaz doivent nécessairement s’échapper afin que la pression interne du
fermenteur demeure proche de la pression atmosphérique. Par ailleurs, afin d’estimer
quantitativement les productions des divers gaz, il est nécessaire de connaître les flux de
chacun des composés constituant la phase gazeuse du fermenteur. Dans ce but, un flux
constant d’azote utilisé comme référence balaye le milieu pendant toute la durée de la culture.
Ainsi, en suivant l’évolution de la composition du gaz par CPG (mélange H2, CO2 et N2 pour
les fermentations utilisant T. maritima) à la sortie du bioréacteur et connaissant précisément le
débit d’azote entrant dans le bioréacteur il est possible d’en déduire par le calcul (voir détails
des calculs dans l’article 1) les débits des gaz produits au cours de la fermentation. Pour
l’ensemble des cultures en fermenteur présentées dans ce manuscrit, nous avons utilisé un
flux de référence pour l’N2 de 3 mL.min-1 pour les raisons suivantes:
1/ Eviter l’accumulation de l’hydrogène (composé inhibiteur de la croissance produit
lors de la fermentation) dans la phase gazeuse du fermenteur.
2/ Permettre de réaliser, avec une bonne précision, un mélange gazeux binaire
azote:oxygène permettant une introduction contrôlée de l’oxygène dans le bioréacteur.
98
Résultats et Discussion
III. Validation du protocole du stress oxydant
L’étude de l’effet de l’oxygène sur la physiologie de T. maritima nécessite
préalablement de pouvoir contrôler très précisément la concentration de l’O2 dissous dans la
culture de T. maritima. La contrainte expérimentale concerne la disponibilité de l’O2 dans le
milieu de culture chauffé à 80°C (température optimale de croissance de T. maritima) étant
donné que la solubilité des gaz diminue (d’une manière non proportionnelle) lorsque la
température augmente (loi d’Henry). Le challenge est, donc, de maîtriser une faible
concentration d’O2 dissous dans un milieu où la température est égale à 80°C.
Pour cela, le fermenteur est équipé d’une sonde O2 dissous spécifique qui mesure avec
précision la concentration de ce paramètre à 80°C. Il a été établi, suite à la calibration de la
sonde dans l’eau à une salinité de 25 g.L-1 et chauffée à 80°C, que 100% de saturation en O2
correspond à une concentration en O2 dissous égale à 3 mg.L-1, soit 93.4 µM O2. Le
fermenteur est aussi alimenté par des débits massiques reliés au logiciel Decobeq (BatchPro,
Decobeq Automatismes qui délivrent une composition gazeuse dictée par la consigne de
l’opérateur.
Suite aux différents essais d’optimisation, il a été convenu de toujours introduire l’O2
dans le fermenteur lors de la phase exponentielle de croissance de T. maritima alors que la
biomasse obtenue est conséquente (densité optique (DO) aux alentours 0.18).
99
Résultats et Discussion
IV. Effet de l’oxygène et du potentiel redox sur le métabolisme du
glucose chez Thermotoga maritima (article 1)
IV.1. Introduction
T. maritima est une bactérie hyperthermophile anaérobie qui occupe de nombreux
biotopes strictement anoxiques comme les puits pétroliers ou d’autres biotopes soumis à des
périodes d’oxygénation plus ou moins importantes comme les sédiments marins chauds. Dans
son biotope naturel marin, elle est donc soumise à une alternance d’épisodes anaérobies et
aérobies qui a très certainement permis à T. maritima de développer des mécanismes de
résistance vis à vis de l’O2. Ce sont précisément ces mécanismes peu connus chez les
hyperthermophiles anaérobies que nous nous sommes proposés d’étudier en fermenteur
notamment.
Le fermenteur que nous avons utilisé nous a permis grâce à un capteur d’O2 dissous très
sensible et des vannes régulant les entrées d’air et d’O2 pur dans le milieu (voir validation des
procédés ci-dessus), de simuler des conditions d’oxygénation que T. maritima pouvait
retrouver in vivo. Ces expérimentations nous ont permis de ce fait d’étudier au plus près le
métabolisme et la physiologie de T. maritima soumise à ces différentes périodes oxydantes.
Dans un premier temps (article 1), nous avons insisté sur l’impact de l’O2 sur le métabolisme
de T.maritima, sur sa capacité à consommer l’oxygène et à réduire le potentiel
d’oxydoréduction du milieu de culture.
IV.2. Article 1 (accepté dans International Journal of
Microbiology Volume
2010, Article ID 896510, 10 pages doi:10.1155/2010/896510)
Résumé
Des cultures de Thermotoga maritima ont été conduites à 80°C dans un bioréacteur dans
le but de simuler les conditions oxydantes variables qui caractérise habituellement son habitat
naturel. Dans les conditions de croissance anaérobie, T. maritima réduit le potentiel redox de
son milieu à des valeurs de −480 mV. Cette capacité réductrice est corrélée à son
métabolisme. Des additions successives d’O2 dans le milieu de T. maritima ont conduit à une
baisse importante du taux de consommation du glucose. De plus, un shift métabolique vers la
production de lactate a été noté en conditions oxydantes. Cependant, malgré ta toxicité de
l’O2, T. maritima est capable de le consommer pendant 12h d’exposition.
100
Résultats et Discussion
101
Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
110
Résultats et Discussion
IV.3. Conclusions de l’article 1
En ce qui concerne l’O2, nous avons pu démontrer qu’il exerce un effet toxique sur la
croissance de la bactérie T. maritima. En effet, on a pu mettre en évidence que le taux de
consommation du glucose a été réduit pendant la phase oxydante, ce qui ralentit le
métabolisme de la bactérie sans toutefois l’arrêter. T. maritima est ainsi dotée d’une forte
capacité à résister à l’effet toxique de l’O2.
Pendant la phase oxydante, la mesure de l’O2 dissous, montre très clairement que T.
maritima est capable de consommer l’O2. En effet, ces données suggèrent que la culture
bactérienne (milieu de culture + cellules) a consommé tout l’O2 introduit pendant la période
oxydante, ce qui correspond à environ à 139 ml d’O2.
La culture de T. maritima en fermenteur a permis également de mettre en évidence
l’importance du potentiel redox du milieu sur la croissance de cette bactérie. En effet, la
croissance de T. maritima est meilleure si celle-ci est cultivée dans un milieu de culture réduit
(ajout de cystéine et/ou de Na2S). En revanche, ces travaux ont permis de montrer que T.
maritima était capable, lorsque la souche était cultivée dans un milieu faiblement réducteur
(présence seulement de 1g.L-1 d’extrait de levure), d’abaisser le potentiel redox du milieu de
culture jusqu’à -485 mV, valeur de potentiel propice à la croissance en particulier des
methanoarchaea, connues pour être très sensible à l’oxygène. Des comportements similaires
ont d’ailleurs été relatés par exemple chez ces dernières (Patrick Jr and Reddy, 1978;
Zehnder, 1978; Oremland, 1988). On peut supposer qu’une partie non négligeable de
l’énergie disponible lors de la fermentation des sucres sert vraisemblablement à réduire le
potentiel redox du milieu permettant ainsi à T. maritima de se développer. Cette demande en
énergie devient trop importante dans des phases d’oxydation aigues pour permettre à
T.maritima de croître, aboutissant dans les conditions les plus défavorables à la lyse cellulaire.
A l’issue de ce premier article, nous avons donc mis en évidence la capacité de T.
maritima à consommer l’oxygène. Par la suite, nous avons entrepris des expériences pour
mesurer précisément la vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima tout en essayant de
comprendre les mécanismes enzymatiques qui lui permettent de tolérer ce gaz.
111
Résultats et Discussion
V. Estimation de la vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima
et mise en évidence des mécanismes enzymatiques impliqués dans
la résistance au stress oxydant (article 2)
V.1. Introduction
Quelques travaux antérieurs ont rapporté l’effet de l’O2 chez les bactéries anaérobies et
plus particulièrement chez les bactéries sulfato-réductrices (Cypionka et al., 1985; Sass et al.,
1996, , 1997; Cypionka, 2000). Ces micro-organismes, largement rencontrés dans des
biotopes anoxiques, ont été également isolés dans des biotopes oxygénés malgré leur
caractère strictement anaérobie (Sass et al., 1996, , 1997; Dolla et al., 2006). Il a d’ailleurs été
démontré que ces bactéries peuvent survivre dans une certaine mesure, à une exposition à l’O2
et voire même le consommer. Leur stratégie de défense vis-à-vis de la toxicité de l’O2 et de
ses espèces réactives repose sur des mécanismes de nature comportementale tels que
l’aérotactisme ou l’agrégation cellulaire et/ou sur des mécanismes enzymatiques catalysant la
réduction de l’O2 et éliminant les espèces réactives de l’oxygène (OH., O2- etc…). Les
enzymes qui sont le plus souvent impliquées au sein de ces mécanismes enzymatiques sont :
la superoxyde réductase, la catalase, la peroxydase etc... (McCord and Fridovich, 1969;
Hatchikian and Henry, 1977; Fridovich, 1998). Cependant, contrairement aux bactéries
sulfato-réductrices, il existe peu d’études sur la réponse des hyperthermophiles anaérobies tels
que les membres de l’ordre des Thermotogales au stress oxydant.
Les études réalisées récemment par Le Fourn et al. (2008) montrent que la stratégie de
défense de T. maritima contre le stress oxydant implique (i) la réduction de l’O2 moléculaire
par l’enzyme FprA (TM0755), homologue à la rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO)
isolée chez les espèces de Desulfovibrio, (ii) une élimination des espèces réactives d’O2 à
l’aide
d’enzymes
spécifiques
et
finalement
(iii)
la
synthèse
d’une
matrice
d’exopolysaccharides qui piège et protège les cellules de l’O2 environnant (Le Fourn et al.,
2008). Ces études indiquent que bien que la présence d’oxygène inhibe la croissance de T.
maritima, ce micro-organisme est néanmoins capable de consommer l’oxygène.
En ce qui nous concerne, nous avons réalisé des expériences au cours desquelles nous
avons introduit lors de la croissance de T. maritima une quantité d’oxygène définie dans le
temps. Ces expériences nous ont permis de quantifier la vitesse de consommation de
l’oxygène par T. maritima. Par ailleurs, des études transcriptomiques ont été conduites afin
de déterminer la réponse cellulaire de T. maritima à la présence d’oxygène. Lors de ces
112
Résultats et Discussion
études, nous nous sommes restreints à la recherche de transcrits dont on sait qu’ils sont sensés
intervenir chez T. maritima lors de la réponse de cette bactérie au stress oxydant.
V.2. Article 2 (accepté dans Archieves of Microbiology DOI 10.1007/s00203-0110687-8)
Résumé
Un
bioréacteur
adapté
spécifiquement
à
la
culture
des
micro-organismes
hyperthermophiles sous des conditions rigoureusement contrôlées de température, pH,
potentiel redox et O2 dissous, a été utilisé dans cette étude. Sous une température de 80°C et
un pH de 7, on a démontré que Thermotoga maritima survit et continue à de diviser même
après une exposition de 30 minutes à 23µM d’O2 dissous. Sous ces conditions d’oxygénation,
on a calculé une vitesse de consommation d’O2 par T. maritima égale à 73.6 µmoles O2 min-1
g proteins-1 lorsque la concentration d’O2 dissous est entre 5 et 22 µM. Les études
transcriptomiques révèlent que pendant le pulse d’O2, T. maritima exprime des gènes codant
des enzymes impliquées dans la consommation de l’O2 et la détoxication des espèces
réactives d’O2 tel que les peroxydes. Les expressions de l’alkyl hydroperoxyde réductase
(ahp), la thiol peroxydase thioredoxin-dépendente (Bcp 2), la neelarédoxine (Nlr) et la
rubrérythrine (Rbr) ont été activées pendant le stress oxydant. L’enzyme oxygène réductase
FprA, homologue à la rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO) trouvée chez des espèces
de Desulfovibrio, est proposée comme un système de consommation d’O2 chez T. maritima.
De plus, l’expression du gène frpA est fortement dépendante de la valeur du potentiel redox
du milieu.
113
Résultats et Discussion
114
Résultats et Discussion
115
Résultats et Discussion
116
Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
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Résultats et Discussion
122
Résultats et Discussion
123
Résultats et Discussion
V.3. Conclusion de l’article 2
Au cours de cette étude, nous avons démontré qu’une exposition courte à l’O2 (30
minutes de 25µM d’O2 dissous) dans le milieu de culture de T. maritima ralentit sa croissance
et son métabolisme. La détermination des bilans carbonés pour chacune des expériences
conduites montrent que cette exposition n’affecte pas le bilan carboné partir du glucose
(l’acétate, le lactate et le CO2 représentent environ 80% du carbone provenant de la
fermentation du glucose). A l’inverse, dans l’article 1, nous avons démontré que des additions
répétées d’O2 lors de la croissance de T. maritima sur glucose perturbent clairement son
métabolisme.
La vitesse de consommation de l’O2 par T. maritima a été estimée à 3.36 µM O2 min-1
correspondant à une vitesse spécifique de 73.6 µmoles O2 min-1 mg proteines-1 durant la phase
exponentielle de croissance.
Les analyses transcriptomiques que nous avons conduites montrent que lorsque T.
maritima est momentanément exposée à l’O2, elle doit faire face non seulement à la présence
d’O2, mais également à celle du peroxyde et du superoxyde, produits hautement toxiques pour
les métabolismes microbiens. Ainsi dans nos conditions expérimentales, la détoxication du
peroxyde chez T. maritima est assurée principalement par les enzymes alkyl hydroperoxyde
réductase (peroxydase) et thiorédoxine peroxydase dépendante du thiol. De plus, T. maritima
est capable de consommer l’O2 grâce à un système enzymatique qui implique également
l’oxygène réductase FprA. Cette enzyme intervient notamment lorsque la concentration d’O2
dissous est faible. Les systèmes de défense vis à vis de l’O2 et de ses produits dérivés que
nous avons mis en évidence chez T. maritima nous permettent de conclure que cette bactérie
possède un potentiel enzymatique lui permettant de faire face à la présence momentanée de
l’O2 dans le milieu de culture étudié et vraisemblablement dans son habitat naturel (sources
hydrothermales marines). La suite de notre travail consistera à étudier la réponse de T.
maritima à de plus longues expositions à l’oxygène.
124
Résultats et Discussion
VI. Etude du métabolisme de T. maritima lors d’une longue
exposition
à l’oxygène
(environ
20
heures) (manuscrit en
préparation pour Applied and Enviromental Microbiology)
VI.1. Introduction
Les résultats précédents nous ont permis de confirmer sans ambiguïté que T. maritima
était capable de survivre, à une courte exposition à l’oxygène (30 minutes), et de consommer
ce gaz lors de la fermentation du glucose. De plus, notre dispositif expérimental nous a permis
de mesurer avec précision la vitesse de consommation de l’oxygène par cette bactérie. Malgré
tout, nous ne disposons que de peu d’informations sur le métabolisme des sucres chez T.
maritima en conditions oxydantes. Nous savons cependant (articles 1 et 2) que lors d’une
courte exposition à l’oxygène (30 min), la production d’acide lactique à partir du glucose était
stimulée au détriment de celles de l’acétate et de l’hydrogène. Il restait donc intéressant de
savoir si des modifications du métabolisme du glucose étaient tout autres lors d’une longue
exposition à l’O2 (environ pendant une vingtaine d’heures). Afin d’établir un bilan fiable du
catabolisme du glucose chez T. maritima cultivée en présence d’oxygène, il a été nécessaire
de concevoir un protocole expérimental spécifique consistant à exposer, à une concentration
en oxygène non létale, des cellules de T. maritima. Indépendamment des aspects strictement
métaboliques, nous nous sommes attachés au cours de ce travail à suivre l’évolution de
l’expression d’un certain nombre de gènes (approche transcriptomique) connus pour être
impliqués dans la réponse cellulaire au stress oxydant.
VI.2. Résultats
VI.2.1. Effet de l’O2 sur le métabolisme et la croissance de T. maritima cultivées
en présence d’oxygène sur une période de 20h.
La phase anaérobie de croissance (phase I) qui dure une dizaine heures, est réalisée en
maintenant la culture sous un flux d’azote constant de 3 mL.min-1, comme précédemment
décrit en conditions anoxiques (article 1). A l’issue de cette phase anoxique de croissance, la
phase de stress long à l’oxygène qui dure environ 20 heures, est réalisée en changeant
l’alimentation gazeuse du réacteur avec un mélange azote-oxygène (O2:N2 33:66 v:v) dont le
flux total est gardé constant et régulé à 3 mL.min-1 (voir matériel et méthodes).
125
Résultats et Discussion
Durant les 14 premières heures de la phase oxydante, le potentiel redox augmente
progressivement de -485 mV et se stabilise à -150 mV (figure 21). Durant cette période, tout
l’O2 introduit dans le bioréacteur est consommé. Après 14 heures d’introduction continue de
l’oxygène, l’efficacité de la culture à consommer l’oxygène tend à diminuer et l’oxygène finit
par s’accumuler dans le milieu de culture (jusqu’à 7 µM) et dans la phase gazeuse du
bioréacteur (jusqu’à 4%) (figure 21). De même, le potentiel redox, qui s’était stabilisé à -150
mV après les 14 première heures de la phase oxydante, finit aussi par augmenter vers un
second palier autour de -20 mV (figure 21) à la fin de la phase oxydante. Ces observations
montrent que la capacité de détoxication de l’O2 par T. maritima présente des limites dans la
mesure où une longue exposition à l’O2 conduit finalement à un arrêt de la croissance de cette
bactérie. Malgré tout, nous pouvons constater, grâce à un bilan entre l’entrée et la sortie du
bioréacteur réalisé sur l’oxygène, que durant ces 20 heures, 2,29 mM d’oxygène avaient été
utilisées (tableaux 4 et 5) par T. maritima.
Tableau 4 : Estimation de la consommation abiotique et biologique de l’O2 pendant la
culture en conditions de stress oxydant long.
Batch
O2 total consommé O2 abiotique consommé
O2 consommé par T.
20 h
(mmoles L-1)*
(mmoles L-1)*
maritima (mmoles L-1)*
3.51
1.22
2.29
d’exposition à O2
126
Résultats et Discussion
Figure 21 : Comparaison de la cinétique de croissance, de l’évolution du potentiel redox
et de la concentration en O2 dissous dans le milieu de T. maritima cultivée en
anaérobiose et en conditions de stress oxydant long (20h)
( ) Biomasse, ( ) potentiel redox et (-) O2 dissous. N.B. T1, T2, T3, T4 et T5
correspondent aux temps d’échantillonnage pour l’analyse transcriptomique.
127
Résultats et Discussion
Figure 22 : Comparaison de l’évolution des métabolites dans la phase aqueuse et dans la
phase gazeuse lorsque T. maritima est cultivée en anaérobiose et en conditions de stress
oxydant long (20h)
( ) Glucose, ( ) acétate, (∆) lactate, ( ) H2 et (
) CO2.
128
Résultats et Discussion
Tableau 5 : Paramètres métaboliques relatifs à la fermentation du glucose par T. maritima cultivée en fermenteur en anaérobiose et en
conditions de stress oxydant long.
Batch
Glu
Acétate total
Acétate oxydatif
Lactate
(mM)
(mM)
(mM)
(mM)
Lac/acét
CO2
CO2
H2
totale
oxydatif
(mM)
(mM)
(mM)
H2/CO2
H2/acét
O2
Bilan C
O/R
(mM) *
Anaérobiose
9.98
12.61
-
2.95
0.28
12.6
-
20.89 1.94
1.66
0
81.99
1
Stress oxydant
3.68
2.80
2.53
3
1.07
2.71
2.47
0.49
0.18
2.29
95.36
1.67
* Calcul de la quantité d’O2 consommée.
129
0.18
Résultats et Discussion
Nos résultats démontrent que dès le début de l’introduction de l’oxygène dans le
bioréacteur, la vitesse de croissance de T. maritima est très rapidement ralentie. En effet,
durant la première moitié de la phase oxydante (de 11h à 24h), la biomasse n’augmente que
légèrement de 0,2 à 0,25 unité DO, puis diminue vers 0.15 unité durant la seconde moitié de
la phase oxydante (figure 21). De plus il apparaît clairement qu’en présence d’oxygène les
vitesses de consommation du glucose et de production d’hydrogène sont significativement
ralenties (figure 22). La comparaison des vitesses de consommation du glucose (0.29 contre
0.54 mM h-1 pendant les phases stationnaires en présence et absence d’oxygène,
respectivement) montre que, dans nos conditions expérimentales, l’oxygène a pour effet de
réduire significativement la consommation de glucose par un facteur environ de deux (figure
22, tableau 5).
Sur le plan du catabolisme, les produits du métabolisme du glucose ainsi que les valeurs
du recouvrement carboné, en présence et en absence d’oxygène sont relativement
équivalentes (Tableau 5). En présence ou en absence d’oxygène, l’acétate, le lactate et le CO2,
demeurent toujours les principaux produits de la fermentation du glucose par T. maritima
(Tableau 5). Par ailleurs, en présence d’oxygène, nous pouvons observer que le catabolisme
du glucose est déplacé vers la production de lactate au détriment de la synthèse d’acétate
comme il l’a été observé lors d’une exposition courte à l’O2 (article 2). En effet, le rapport
molaire lactate/acétate augmente significativement de 0.23 en anoxie à 1.07 en présence
d’oxygène. On observe alors une diminution de la production d’acétate, ainsi que celles
d’hydrogène et de CO2 (figure 22, tableau 5). On remarque également que ce soit en présence
ou en absence d’oxygène, le nombre de moles d’acétate produit est toujours proche du
nombre de moles de CO2 produit (ratios molaires acétate/CO2 proches de 1). En revanche, le
nombre de moles d’hydrogène produit proportionnellement au CO2 produit est
significativement plus faible en présence d’oxygène (ratios molaires H2/CO2 égale
respectivement à 0.18 et 1.66 en présence et absence d’oxygène) (tableau 5).
Ainsi, en tenant compte du rapport O/R qui est de 1,0 en anaérobiose et de 1,67 en
présence d’O2, nous pouvons conclure que T. maritima est capable de réaliser un métabolisme
oxydatif lorsque l’O2 est présent, ce qui n’avait jamais été démontré jusqu’à présent.
130
Résultats et Discussion
VI.2.2. Réponse transcriptomique de T. maritima lors d’une exposition longue à
l’oxygène (20 h)
L’exploitation des résultats du métabolisme du glucose en présence et en absence d’O2
montre une étonnante capacité de T. maritima à faire face à la présence de l’O2 dans son
milieu malgré une longue exposition à ce gaz dont on sait qu’il est toxique pour les anaérobies
en général. Par ailleurs, les données de l’article 2 nous ont permis de mettre en évidence les
systèmes enzymatiques mis en place par T. maritima pour lutter contre le stress oxydant lors
d’une courte exposition à l’O2. L’action spécifique, d’une part, de la rubrédoxine oxygène
réductase (fprA) et d’autre part l’élimination des espèces réactives d’O2 par l’alkyl
hydroperoxyde réductase (ahp), les BCP peroxyrédoxines (bcp1 et bcp2), la neelarédoxine
(nlr) et la rubrédoxine (rbr) ont été identifiées lors de la réponse au stress oxydant (exposition
courte) chez T. maritima. Nous avons donc étudié
l’activation ou la répression de
l’expression des même transcrits testés précédemment à savoir fpr ; nlr ;TM0665; ahp; bcp1;
bcp2; hyd et TM1432 lors de l’exposition de T. maritima à une exposition longue à l’O2.
Ainsi, les résultats de la qRT PCR montrent une activation importante de l’expression
des gènes codant pour les enzymes alkyl hydroperoxyde réductase (ahp TM0807),
neelarédoxine (TM0658) et BCP/NADH dehydrogenase (bcp2 TM0386) intervenant dans
l’élimination des espèces réactives d’O2. Ces enzymes constituent la première ligne de
défense contre les effets toxiques de l’O2.
On note par ailleurs une répression significative de l’expression des gènes codant pour
la rubrédoxine oxygène oxydoréductase (ROO) (TM0755), une enzyme impliquée dans la
consommation biologique de l’O2 mises en évidence par LeFourn et al. (2008) chez T.
maritima (Le Fourn et al., 2008). Finalement, la répression du gène hyd codant la seule
hydrogénase présente dans T. maritima est très marqué également au temps T3 et T4 ; ce qui
est corrélée à l’arrêt de production d’H2 révélée par les analyses des produits du catabolisme
du glucose du paragraphe précédent.
En plus des transcrits testés précédemment dans le cadre de l’article 2, nous avons
également étudié l’évolution du gène TM0665 qui code pour l’enzyme cystéine synthase.
Cette enzyme a été isolée chez de nombreux micro-organismes comme Staphylococcus
aureus. Elle intervient dans biosynthèse et le renouvellement du pool cellulaire de la cystéine
(Noji et al., 1994; Lithgow et al., 2004; Le Fourn et al., 2008).
131
Résultats et Discussion
Les travaux antérieurs de Le Fourn et al. (2008) ont montré que la cystéine synthase
(TM0665) a été détectée chez T. maritima dans toutes les conditions de culture (anaérobiose
et en présence d’O2) (Le Fourn et al., 2008). Cependant, les études protéomiques réalisées par
électrophorèse bidimensionnel sur gel 2D couplées à la qRT-PCR ont montré que toutes les
isoformes de la cystéine synthase sont plus abondantes en conditions oxydantes qu’en
conditions anaérobies (Le Fourn et al., 2008). Ainsi, en contribuant à la biosynthèse de la
cystéine, cette enzyme est capable de fournir un pool thiol à toute la cellule, lui permettant de
se défendre contre les conditions oxydantes et de réparer par la suite les lésions oxydatives
des protéines. Cependant, nos résultats montrent une répression de l’expression de cette
enzyme qui devient de plus en plus forte au fur et à mesure que la période du stress oxydant
augmente. Cette répression en condition de stress oxydant long peut être expliquée par le fait
que la présence prolongée d’O2 dans le milieu réprime le système de régulation de
l’expression de la cystéine synthase. L’expression de cette enzyme peut être fortement
affectée par une concentration seuil d’O2, qu’on a largement dépassé dans notre cas d’étude.
132
Résultats et Discussion
T2
T4
T3
T5
Log2 (ratio des taux des transcrits)
8
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
fprA
; nlr
;TM0665
; ahp
; bcp1
; bcp2
; hyd
; TM1432
Figure 23 : Variation du taux d’expression des gènes induits par les conditions de stress oxydant long.
Les histogrammes correspondent au ratio d’expression des gènes à T2, T3 et T4 par rapport à leur taux d’expression à T1.
133
Résultats et Discussion
VI.3. Discussion
Les études transcriptomiques réalisées dans le but d’élucider les mécanismes
enzymatiques mis en place par T. maritima pour se défendre contre la présence prolongée de
l’O2 (20h) ont montré que cette bactérie lutte contre les effets toxiques de l’O2 et de ses
espèces réactives de la même manière quelque soit le temps d’exposition à l’O2. En effet,
l’évolution des transcrits testés est similaire dans les deux conditions de stress oxydant
étudiées (stress court de 30 minutes (article 2) et stress long 20h (figure 23)).
Par ailleurs, au cours de ce travail il a été montré que le métabolisme de T. maritima
pendant la phase oxydante de 20h est « mixte ». En effet, une faible partie de glucose (environ
27%) est fermentée selon la voie fermentaire classique conduisant à la production d’acétate,
de CO2 et de l’H2. Ce métabolisme anaérobie est probablement dû à la présence de cellules de
T. maritima qui sont restées confinées dans des micros zones anoxiques dans le fermenteur ou
piégées dans un biofilm. Des études antérieures ont montré que T. maritima est, en effet,
capable de former un biofilm lorsqu’elle est cultivée dans des conditions de stress oxydant
(Rinker, 1998; Rinker and Kelly, 2000; Pysz et al., 2004; Johnson et al., 2005; Conners et al.,
2006; Le Fourn et al., 2008). Alors que le bilan des produits de fermentation montre que 27%
seulement du glucose fermenté est converti en acides organiques avec production d’H2, 73%
du glucose est converti en acides organiques mais sans production d’hydrogène. L’absence de
production d’H2 laisse à penser que des équivalents réducteurs, produits lors du catabolisme
du glucose, pourraient venir réduire l’O2 en H2O (figures 22 et 24). On peut alors émettre
l’hypothèse que lorsque T. maritima est cultivée en présence d’O2 pendant une période de
20h, elle présente un métabolisme oxydatif.
Les résultats de l’étude transcriptomique ont clairement montré que l’arrêt de la
production d’H2 est corrélé à une répression de l’expression du gène codant pour l’unique
hydrogénase décrite chez T. maritima (Verhagen et al., 1999). Des études antérieures ont
montré que les hydrogénases sont des enzymes sensibles à l’O2 (Vincent et al., 2005). Ainsi,
le métabolisme de l’hydrogène chez T. maritima est inhibé en présence d’O2. Ce résultat
contredit les travaux réalisés par van Ooteghem et al. (2004), qui ont montré que la
production d’H2 est stimulée par les conditions de microaérophilie chez T. neapolitana (Van
Ooteghem et al., 2004).
Par ailleurs, en considérant la quantité effective d’oxygène consommé par T. martima
(tableau 5), il apparaît clairement qu’en présence d’oxygène le catabolisme du glucose est
dévié vers la production de lactate (52% du glucose consommé contre 20% en anoxie) et que
134
Résultats et Discussion
la fraction restante (48% du glucose consommé) est oxydée en acétate et CO2 avec utilisation
de
l’oxygène
comme
accepteur
d’électrons.
135
La
comparaison
des
bilans
de
Résultats et Discussion
Tableau 6: Comparaison du métabolisme oxydatif de T. maritima en conditions de stress long (20h) avec les réactions classique
d’oxydation complète et de la fermentation du glucose
Réaction métabolique
Cas théorique d’une
oxydation complète
biologique du glucose
C6H12O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
Rapport
O/R*
Nombre
d’oxydation moyen
du carbone des
métabolites**
3
+4
Accepteur
d’électrons
6O2 + 12 e
6H2O
-
mole ATP/mole
glucose***
38
Il s’agit d’une oxydation complète du glucose par l’oxygène
Cas d’une fermentation
classique anaérobie
conduite par T. maritima
3
C6H12O6 + /2 H2O
3
/2CH3COOH+ /2CO2+ 3H2+
½C 3H6O3
3
1
+
-
6H + 6 e
3H2
+1
3.44
Il s’agit d’une fermentation classique du glucose en conditions anaérobie
Cas d’une culture de T.
maritima en condition de
stress oxydant long (20h)
3
C6H12O6 + O2
/4CH3COOH +
3
5
3
/4CO2 + /4C3H6O3 + /4H2O
1.67
+0.5
3
3
-
/4O2 + /2 e
3
/4H2O
2.45
Il s’agit d’une oxydation partielle du glucose puisque 1<O/R = 1.67<3
le métabolisme de T. maritima en conditions de stress oxydant long (20h) est un métabolisme semi-oxydatif
* O/R = (nombre de mole d’oxygène × 2e-) / (nombre de mole H × 1e-)
** Nombre d’oxydation moyen du carbone = Na – Nm (avec Na : nombre d’électrons de valence de l’atome d’après le tableau périodique ;
Nm : nombre d’électrons entourant l’atome dans la molécule).
*** 2 moles ATP / 1mole d’acétate produit ; 1 mole d’ATP /1 mole de lactate produit.
136
Résultats et Discussion
fermentation effectués en présence et absence d’oxygène montre qu’en anoxie le carbone des
produits de fermentation est paradoxalement plus oxydé qu’en présence d’oxygène (niveau
d’oxydation moyen du carbone est de +1 et +0.5 en absence et présence d’oxygène
respectivement). En absence d’oxygène les électrons de l’oxydation du carbone sont
représentés par l’hydrogène résultant de la réduction des H+ issus du catabolisme. En
revanche, en présence d’oxygène les électrons émanant de l’oxydation du carbone vont
réduire l’oxygène en eau. Par ailleurs, le rapport O/R obtenu en conditions de stress oxydant
de 20h (1.67) est inférieur à celui spécifique à une oxydation complète du glucose (3). Dans
ce cas, le bilan catabolique peut être considéré comme partiellement oxydatif. Sur le plan
énergétique, l’effet de l’oxygène qui devie le catabolisme du glucose vers le lactate a pour
conséquence une réduction du rendement énergétique (2.45 et 3.44 mole ATP/mole glucose
en présence et absence d’oxygène respectivement). La question qui se pose est de savoir si ce
métabolisme semi oxydatif libère suffisamment d’énergie pour assurer la croissance des
cellules de T. maritima ; ou bien si l’énergie libérée à partir de l’oxydation incomplète du
glucose, est utilisable par T. maritima pour se multiplier comme dans le cas des bactéries
sulfato-réductrices (Krekeler et al., 1997; Krekeler et al., 1998; Cypionka, 2000; Jonkers et
al., 2005)?
Par la suite, nous proposons les schémas, dans les figures 24 et 25, du flux de carbone
chez cette bactérie cultivée en anaérobiose ou en présence d’O2 qui met clairement en
évidence (i) un shift métabolique vers la synthèse de lactate et (ii) l’oxydation partielle d’une
partie du glucose en acétate, CO2 et eau en présence d’oxygène.
Finalement, nous avons pu démontrer pour la première fois au cours de cette expérience
que l’oxygène pouvait jouer le rôle d’accepteur final d’électrons chez T. maritima au même
titre que le thiosulfate ou le soufre élémentaire, dont on sait qu’ils peuvent être également
réduits par cette bactérie. Cependant, à la différence de l’O2, la réduction des accepteurs
d’électrons soufrés chez T. maritima est couplée à l’élimination de l’H2 libéré lors de son
activité catabolique ce qui permet une meilleure croissance bactérienne. Ce type de
métabolisme semi oxydatif est habituellement trouvé chez les bactéries mésophiles acétique
tels que certaines espèces de Gluconobacter (De Ley and Kersters, 1964; Dismukes et al.,
2001), et il est décrit ici pour la première fois chez une bactérie anaérobie hyperthermophile
(T. maritima).
137
Résultats et Discussion
CO2
16%
CO2
27%
Acétate
32%
Acétate
54%
Lactate
19%
Lactate
52%
Figure 24 : Comparaison des flux de carbone chez T. maritima lors de sa croissance en
anaérobiose (graphe à gauche) et en conditions de stress oxydant long (20h) (graphe à
droite).
Voies métaboliques de T. maritima
en anaérobiose
Voies métaboliques de T. maritima
en conditions de stress oxydant long (20h)
1 Glucose
1 Glucose
2 Pyruvate
2 Pyruvate
O2**
4 H2
Lactate
2 AcétylCoA
Lactate
23%*
2 AcétylCoA
H2O
52%*
2 Acétate
2CO2
2CO2
2 Acétate
23%*
54%*
16%*
32%*
Figure 25 : Voies métaboliques suivies par T. maritima en présence et en absence
d’oxygène
** : O2 ajouté dans le milieu de culture et réduit par la cellule bactérienne
138
Résultats et Discussion
VII. La Glycolyse chez T. maritima lors d’une exposition longue à
l’O2
Dans le but approfondir l’étude du métabolisme de T. maritima en présence d’oxygène,
nous nous sommes intéressés aux différentes voies de la glycolyse que pouvait emprunter T.
maritima (Embden-Meyerhof (EM) ou Entner-Doudoroff (ED)) en anaérobiose (Selig et al.,
1997). En 1998, de Vos et al. ont proposé l’hypothèse suivante : les micro-organismes
hyperthermophiles fermentaires utilisent préférentiellement la voie EM alors que la voie ED
est propre aux micro-organismes hyperthermophiles aérobies (De Vos et al., 1998). Etant
donné que chez T. maritima ces deux voies existent (Selig et al., 1997), on se propose de
déterminer si la présence de l’O2 pouvait avoir une incidence sur l’utilisation d’une voie ou de
l’autre.
VII.1. Analyse des produits finaux de la glycolyse par spectroscopie RMN ex
vivo
L’étude du bilan carbone de T. maritima cultivée en présence d’O2 (condition de stress
oxydant long (20h)) a révélé un shift important du métabolisme fermentaire de cette souche
vers la production de lactate se faisant au détriment de l’acétate en présence d’O2. Le shift
observé est d’autant plus important que la présence d’O2 dans le milieu est prolongée. En
effet, le rapport lactate/acétate augmente lorsque les cellules sont exposées à des quantités de
plus en plus importantes en O2 ; celui-ci passe de 1.07 en anaérobiose à 0.28 en présence de
20h d’oxygénation (tableau 5). Cette constatation nous a conduit à approfondir le
métabolisme du glucose chez T. maritima à travers l’étude des voies de la glycolyse par
spectroscopie RMN et l’utilisation du glucose marqué au 13C. Cette expérience nous a permis
de réaliser une étude qualitative et quantitative des flux de carbone qui passent dans la cellule
allant soit vers la production du lactate, soit vers celle de l’acétate avec production
concomitante du CO2. L’analyse des spectres RMN nous a permis également de mettre en
évidence d’autres molécules intéressantes pouvant être produites par T. maritima lors de son
métabolisme fermentaire dans des conditions physico-chimiques différentes (présence ou non
d’oxygène).
A cet effet, T. maritima a été cultivée en fermenteur dans les conditions de stress
oxydant long avec du glucose marqué au
13
C en position C1. Une seconde croissance a été
réalisée en anaérobiose contenant les molécules marquées. La position du carbone marqué sur
139
Résultats et Discussion
la molécule du glucose conditionne les produits de fermentation marqués détectés par
résonance magnétique. L’analyse des produits du métabolisme nous a permis de démontrer
quelle voie de la glycolyse Embden-Meyerhof (EM) ou Entner-Doudoroff (ED) sera
empruntée par T. maritima. Les résultats obtenus sont résumés dans les figures 29, 30, 31 et
32.
Le marquage au 13C de l’acétate et du lactate a été analysé suite à la fermentation par T.
maritima du
13
C1 glucose et du
bactériennes sont en présence du
13
13
C3 glucose, respectivement. Lorsque les cellules
C3 glucose, l’enrichissement isotopique est détecté sur le
groupement méthyle de l’acétate, représenté ici par une seule résonance vers 1.85 ppm sur le
spectre protons (figure 33 et 34). L’analyse du spectre proton réalisé à partir de la
fermentation du
13
C1 glucose, montre également la présence du groupe méthyle de l’acétate
représenté sur les figures 30 et 31 non seulement par un doublon de résonance bi-satellite
centré à 1.85 ppm correspondant à un couplage entre le proton H+ et le carbone
13
C, mais
aussi par une résonance d’amplitude égale à la somme des deux pics d’acétate visualisé sur le
graphe à 1.85 ppm. Ces résultats ont été obtenus quelques soient les conditions de culture en
anaérobiose ou en présence d’O2.
Le lactate est visualisé sur le spectre RMN du carbone 13C1 en condition anaérobie mais
aussi en présence d’O2 dans le milieu. En effet, le marquage se retrouve, après catabolisme du
glucose, sur le groupement carboxyle du lactate présent sur le graphe 29 sous forme d’une
seule résonance vers 17 ppm.
Lorsque le
13
C1 glucose est fermenté, une faible quantité d’alanine est synthétisée (2
mM). L’alanine est marquée au niveau du groupement carboxyle comme représenté sur la
figure 31 par un doublon de résonance de même amplitude centré à 1.52 ppm. Par contre,
quand le 13C3 glucose est métabolisé, on ne détecte pas d’alanine (figure 34).
La quantification des produits de métabolisme (acétate, lactate et L-alanine) obtenue
après intégration de l’aire des pics correspondants aux produits du métabolisme montre une
baisse significative de la concentration des métabolites en condition de stress oxydant long.
VII.2. Analyse de l’expression des enzymes clefs impliquées dans les voies de
glycolyse ED et EM par une étude transcriptomique
Dans le but d’apporter d’avantages de détails sur le métabolisme du glucose chez T.
maritima cultivée en condition de stress oxydant long, nous avons étudié l’évolution du taux
d’expression des gènes codants pour les enzymes clefs intervenant dans les différentes voies
140
Résultats et Discussion
T2
T3
T4
T5
L o g 2 (ra tio d e s ta u x d 'e x p re s s i o n d e s tra n s c rits )
1
0.5
0
TM0066 (ED)
-0.5
TM1155 (ED)
-1
TM0689 (EM)
TM0209 (EM)
-1.5
TM0289 (EM)
-2
-2.5
-3
Figure 26 : Représentation schématique du niveau d’expression de différents gènes
codant des enzymes impliquées dans la glycolyse chez T. maritima en fonction du temps
de culture dans les conditions de stress oxydant long
temps T2 30 min de stress oxydant (O2 dissous = 0µM, potentiel redox = -250 mV ;
temps T3 10h de stress oxydant (O2 dissous 0 µM, potentiel redox -150 mV) ; temps T4
fin du stress quand (O2 dissous = 7 µM, potentiel redox +80 mV) ; temps T5 restauration
de l’anaérobiose (O2 dissous = 0µM, potentiel redox = -485 mV). Les histogrammes
représentent le niveau d’expression des gènes codant pour les enzymes Glucose-6phosphate dehydrogenase (TM 1155), 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase (TM
0066), phosphoglycérate kinase (TM 0689), phosphofructokinase ATP-dépendante-6(TM 209 et TM 0289) ; à différents moments de prélèvements (T2, T3, T4 et T5) par
rapport au taux d’expression de ces gènes au temps T1 (référence anaérobie avant
stress).
141
Résultats et Discussion
métaboliques de la glycolyse (EM et ED) par l’intermédiaire d’une étude transcriptomique.
Cette dernière a été réalisée sur les cellules cultivées en fermenteur et soumises à l’effet du
stress oxydant long. Les échantillons cellulaires ont été prélevés aux différents moments de la
fermentation comme précédemment indiquée dans la figure 19.
Le tableau 3 des annexes rapporte toutes les enzymes impliquées dans les deux voies de
glycolyse chez les bactéries hyperthermophiles et notamment T. maritima.
Au cours de notre étude les quatre enzymes suivantes vont être recherchées. Il s’agit de
la phosphoglycérate kinase (TM 0689) et de la 6-phosphofructokinase ATP-dépendante (TM
0209 et TM 0289) impliquées dans la voie EM et les enzymes glucose-6-phosphate
dehydrogenase (TM 1155) et 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase (TM 0066),
enzymes clefs de la voie ED. L’analyse des taux de transcrits des gènes codant pour ces
différentes enzymes a été réalisée à l’aide de la technique de PCR quantitative en temps réel.
Les résultats sont décrits sur la figure 28 et montrent une variation de l’expression de
tous les gènes testés codant les enzymes impliquées dans la voie EM et dans la voie ED
lorsque les cellules sont soumises à des conditions oxydantes. On observe une répression plus
particulièrement marquée pour le gène TM0066 (voie ED) et ce phénomène est observé à
partir du temps T2 (30 minutes d’oxygénation). En effet, le gène codant pour la 2-keto-3deoxy-6-phosphogluconate aldolase (TM0066) est très réprimée, ce qui suggère un effet
négatif important. Ainsi, le facteur de répression passe d’environ 6 pour des cellules exposées
à 10h de stress oxydant à 8 pour les cellules exposées à 20-25h de stress oxydant. Ce facteur
de répression augmente progressivement au fur et à mesure que le stress oxydant fragilise les
cellules bactériennes. Cette enzyme catalyse la réaction de synthèse de la première molécule
de pyruvate à partir du glucose et qui représente la cinquième étape de la voie d'EntnerDoudoroff (figure 26).
Figure 27 : Réaction de synthèse du pyruvate à partir du glucose
(étape 5 de la glycolyse par la voie ED)
142
Résultats et Discussion
Durant le stress oxydant long, le flux métabolique dirigé vers la voie ED est ainsi
significativement atténué. Le flux métabolique s’oriente alors vers une autre voie de la
glycolyse qui est celle d'Embden-Meyerhof, voie permettant l’assimilation du glucose et sa
décomposition en pyruvate.
Pour la voie EM, l’enzyme la plus fortement touchée par cette répression de
l’expression des gènes due à la présence prolongée de l’O2 dans le milieu est la
phosphoglycérate kinase (TM 0689). Le facteur de répression de l’expression des transcrits
codant pour cette enzyme est inférieur d’un facteur 2 et 4 pour des périodes d’exposition à
l’O2 de 10h et 20-25h respectivement. Cette enzyme catalyse la réaction réversible de la
synthèse du 3-phosphoglycérate avec récupération d'ATP à partir de la molécule 1,3diphosphoglycérate (figure 27).
Figure 28 : Réaction de synthèse du 3-phosphoglycérate à partir de du 1,3diphosphoglycérate
La répression de cette voie est corrélée d’une part, à la diminution de la vitesse de
consommation de glucose par T. maritima observée pendant la phase du stress oxydant long,
et d’autre part à l’arrêt de la croissance de T. maritima. En effet, la réaction de récupération
d’énergie étant réprimée, il s’ensuit un arrêt de la croissance de T. maritima.
VII.3. Discussion
Les données de la spectroscopie RMN révèlent que, chez T. maritima, les deux voies
EM et ED fonctionnent simultanément dans les deux conditions de culture testées en
fermenteur (anaérobiose et stress oxydant long). Cependant, la contribution relative de
chacune de ces deux voies peut être déterminée à travers l’analyse du spectre des protons en
mesurant le ratio molaire entre l’acétate marqué au
13
C et l’acétate non marqué issu de
l’intégration des résonances correspondantes. A l’issue de ces calculs, nous montrons qu’en
143
Résultats et Discussion
anoxie, T. maritima métabolise 90% du glucose en utilisant la voie EM et 10% en la voie ED.
En revanche, en conditions de stress oxydant prolongé, T. maritima utilise toujours
simultanément les deux voies de glycolyse EM et ED, mais, la contribution de la voie ED
diminue de 10% à 5% environ.
Par ailleurs, les voies EM et ED ne sont pas affectées de la même façon par le stress
oxydant long. En effet, les transcrits codant pour les enzymes spécifiques de la voie ED sont
plus significativement réprimés que ceux de la voie EM. D’autre part, tous les gènes codant
les enzymes clefs de la voie EM se caractérisent par une légère activation au temps T5
correspondant au retour de l’anaérobiose. En revanche, le gène TM0066 impliqué dans la voie
ED reste fortement réprimé malgré la restauration de l’anaérobiose dans le milieu de culture.
Le facteur de répression est égal à environ 2 unités logarithmiques sur une base 2. Cette
différence importante montre, qu’en présence prolongée d’oxygène, la voie ED est
relativement plus affectée que la voie EM.
Les résultats obtenus au cours de cette étude sont inattendus. En effet, Selig et al. (1997)
ont montré dans leurs travaux, qui concernent l’analyse comparative des voies de la glycolyse
EM et ED, que tous les anaérobies hyperthermophiles testés à savoir les archées des genres
Pyrococcus (Pyrococcus furiosus), Thermococcus (Thermococcus celer), Desulfurococcus
(Desulfurococcus amylolyticus) et la bactérie du genre Thermotoga (Thermotoga maritima)
fermentent le glucose en pyruvate principalement via la voie EM. La voie ED, quand à elle,
survient uniquement chez les hyperthermophiles aérobies. Sulfolobus acidocaldarius, par
exemple, dégrade le glucose en pyruvate entièrement grâce à la voie ED non phosphorylée
(De Rosa et al., 1984; Bartels, 1989; Selig et al., 1997). La voie ED a aussi été rapportée chez
l’archée aérobie modérément thermophile Thermoplasma acidophila (Budgen and Danson,
1986; Danson, 1988). A partir de ces observations, Selig et al. postulent en généralisant que la
voie ED est une voie glycolytique qui a été conservée chez les hyperthermophiles aérobies.
En d’autres termes, chez les hyperthermophiles la voie ED serait préferentiellement associée
au catabolisme oxydatif ou respiratoire des sucres en présence d’O2. Or, contrairement au
postulat de Selig et al. (Selig et al., 1997), nos résultats montrent que chez T. maritima, c’est
la voie EM qui est préférentiellement utilisée en présence d’O2 et non la voie ED comme
attendu.
Enfin, les résultats de la spectroscopie RMN couplés à ceux de la transcriptomique
montrent que chez Thermotoga maritima, la voie de glycolyse ED est plus sensible à la
présence de l’O2. Ce résultat est plutôt surprenant dans la mesure où cette voie existe
144
Résultats et Discussion
essentiellement chez les hyperthermophiles aérobies tels que l’archée Sulfolobus
acidocaldarius (De Rosa et al., 1984; Bartels, 1989).
Nos résultats ne démontrent pas un shift vers une voie de glycolyse particulière par
rapport à une autre (EM ou ED) en condition de stress oxydant long. T. maritima continue à
utiliser les deux voies de glycolyse même en présence d’O2 ; cependant, les deux voies EM et
ED présentent incontestablement des sensibilités différentes vis-à-vis de la toxicité de l’O2 et
on conclut que la voie ED est significativement plus réprimée en présence d’O2.
145
Résultats et Discussion
13C1
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Glucose
Glucose
fructose
Lactate
Acétate
fructose
Acétate
Lactate
13C1
Figure 29 : spectre carbone des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en C1
(13C1)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
146
Résultats et Discussion
13C1
13C1
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Acétate
Acétate
Figure 30 : spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en C1
(13C1)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
147
Résultats et Discussion
13C1
13C1
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Acétate
Alanine
Acétate
Alanine
Figure 31 : zoom du spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en
C1 (13C1)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
148
Résultats et Discussion
13C3
13C3
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Glucose+tampon Tris
Glucose+tampon Tris
Figure 32: spectre carbone des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en C3
(13C3)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
149
Résultats et Discussion
13C3
13C3
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Acétate
Acétate
Figure 33 : spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en C3
(13C3)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
150
Résultats et Discussion
13C3
13C3
glucose anaérobiose
glucose 20h stress O2
Acétate
Acétate
Figure 34 : zoom du spectre proton des produits métaboliques de T. maritima cultivées en fermenteur en présence de glucose marqué en
C3 (13C3)
à gauche : T. maritima en anaérobiose, à droite : T. maritima en présence d’O2. t=0 et t=6 correspondent respectivement au temps de
démarrage de la culture juste après l’inoculation du fermenteur (t0) et le temps d’arrêt de la culture (tfinal) ; t=1, t=2, t=3, t=4 et t=5
correspondent aux différents moments de prélèvements pendant la croissance en conditions de stress oxydant de 20h et la culture
référence anaérobie reportée plus haut dans la figure 21.
151
Conclusion générale
CONCLUSION GENERALE
152
Conclusion générale
Nous avons dans un premier temps utilisé avec succès un fermenteur de 2 L pour
cultiver en anoxie la bactérie hyperthermophile anaérobie T. maritima, tout en contrôlant sa
croissance sous une atmosphère gazeuse contenant notamment des concentrations bien
définies d’O2. Lors de la fermentation des sucres par T. maritima, plusieurs paramètres
physico-chimiques ont pu être suivis (température, pH, potentiel redox, CO2 gazeux) en
continu dont l’O2 dissous à haute température, qui restait un challenge d’un point de vue
méthodologique jusqu’à ce jour. L’analyse de ces paramètres au cours de la croissance de T.
maritima nous a permis de mieux appréhender le métabolisme de cette bactérie, notamment
en ce qui concerne sa réponse au stress oxydant. Par ailleurs, nous avons élaboré un modèle
mathématique qui nous a permis d’évaluer la productivité des gaz H2 et CO2 par T. maritima
en condition fermentaire. Nous savons désormais que nous pouvons appliquer ce procédé de
culture à tous les micro-organismes hyperthermophiles du domaine des Bacteria ou des
Archaea qu’ils soient aérobies, microaérobies ou anaérobies dans le cadre de recherches
fondamentales ou appliquées visant notamment a étudier la croissance de ces microorganismes en fonction de la pression partielle d’O2, mais également d’H2 dans la phase
gazeuse.
Au cours de cette étude et grâce à l’utilisation du fermenteur, nous avons donc pu
maîtriser les introductions d’O2 dans le milieu de culture et démontrer que T. maritima était
capable de tolérer l’O2 dans son milieu de culture. Cette observation avait été faite auparavant
par Le Fourn et al. (2008) chez T. maritima cultivée en batch dans de petits flacons
pénicillines (Le Fourn et al., 2008). Cependant dans les conditions de culture appliquées par
les auteurs, la concentration en oxygène dans la phase gazeuse n’était pas contrôlée et T.
maritima était soumise à une concentration initiale en O2 (0,5 %) qui diminuait au cours du
temps. La méthodologie que nous avons mise en place nous a permis de travailler à taux
constant en O2 pour essayer de simuler le comportement de T. maritima dans les différentes
conditions oxydantes où cette bactérie pouvait se trouver dans son habitat naturel, en
l’occurrence les cheminées hydrothermales marines (Huber et al., 1986; Rusch and Amend,
2004; Rusch et al., 2005). Dans ce but, nous avons d’une part appliqué (i) un stress court (30
minutes d’exposition à une concentration d’O2 dissous constante de 25µM, soit 0.6 ml O2L-1),
puis un stress long (20 heures d’exposition à un débit d’air entrant constant de 1 ml d’air/min,
soit 110 ml O2L-1). Dans les deux cas de figures, T. maritima s’est trouvée capable non
seulement de tolérer les différentes expositions à l’oxygène, mais également de réduire le
potentiel d’oxydo-réduction du milieu de culture et favoriser ainsi son métabolisme anaérobie.
Cette capacité de réduction est remarquable et n’avait jamais été rapportée auparavant chez
153
Conclusion générale
des hyperthermophiles anaérobies. On retrouve cependant une capacité similaire chez les
methanoarchaea (Oremland, 1988; Fetzer and Conrad, 1993; Bandyopadhyay et al., 1999),
micro-organismes anaérobies connues pour être particulièrement sensibles à l’O2 et exigeant
des potentiels de l’ordre de -400 mV pour pouvoir se développer. C’est précisément ce niveau
de potentiel que T. maritima est capable d’atteindre suggérant que cette bactérie ne se
contente pas seulement de l’absence d’O2, mais nécessite également des potentiels d’oxydoréduction très bas pour croître. Néanmoins, nos travaux démontrent que T. maritima peut
survivre, voire se développer modérément lors de phases oxygénées de courtes ou longues
durées.
Dans nos conditions de culture et en dépit de l’effet toxique de l’O2, T. maritima s’est
montrée capable de consommer l’O2 et de le réduire en H2O avec une vitesse estimée à 73.6
µmoles O2 min-1mg protéines-1. Cette vitesse est comparable à celle mesurée chez certaines
bactéries sulfato-réductrices (de 10 et 260 µmoles O2 min-1mg protéines-1), notamment celles
appartenant au genre Desulfovibrio (Marschall et al., 1993; Krekeler et al., 1997; Van Niel
and Gottschal, 1998). Certaines de ces bactéries qui sont reconnues pour la plupart comme
étant anaérobies strictes sont également capables de tolérer l’oxygène (Risatti et al., 1994;
Sass et al., 1996, , 1997; Cypionka, 2000) et peuvent dans certains cas l’utiliser de manière
énergétique sans avoir pour autant la capacité à se diviser (Dannenberg et al., 1992; Gomes et
al., 1997; Cypionka, 2000).
Par une approche transcriptomique, nous avons démontré, que quelque soit le type de
stress appliqué (court ou long) à T. maritima, les enzymes intervenant dans la protection
contre le stress oxydant, sont les mêmes à savoir la FprA (fprA), l’alkyl hydroperoxyde
réductase (ahp), la thiol peroxydase thiorédoxine-dépendante (bcp2), la rubrérythrine (rbr), la
BCP peroxyrédoxine (bcp1) et la neelarédoxine (nlr). Nos résultats ont mis particulièrement
en exergue l’importance de l’oxygène réductase FprA dans la consommation de l’O2. En
effet, en présence de faibles concentrations en oxygène, les cellules surproduisent la FprA
pour anticiper et se protéger des effets néfastes de ce gaz. L’expression de cette enzyme est
fortement dépendante de l’état d’oxydation du milieu (Lakhal et al., 2011). Un homologue de
la FprA a précédemment été purifié chez la bactérie sulfato-réductrice Desulfovibrio gigas.
Cette enzyme appelée la rubrédoxine oxygène oxydoréductase est aussi capable de réduire
l’O2 directement en H2O (Chen et al., 1993b). Ces résultats démontrent donc des similitudes
dans le système de détoxication mis en place par T. maritima, bactérie capable d’utiliser le
154
Conclusion générale
thiosulfate et le soufre élémentaire comme accepteurs finaux d’électrons (Huber et al., 1986;
Ravot et al., 1995; Huber and Hannig, 2006) et les bactéries sulfato-réductrices.
En ce qui concerne l’alkyl hydroperoxyde réductase (Ahp) et la thiol peroxydase
thiorédoxine-dépendante ou BCP peroxyrédoxine (Bcp2), elles sont impliquées dans la
détoxication de fortes concentrations en anion peroxyde qui est produit lors d’un stress
oxydant (Fridovich, 1978; Halliwell, 1990; Storz and Imlay, 1999) chez E. coli (Jeong et al.,
2000; Seaver and Imlay, 2001) et chez la bactérie sulfato-réductrice D. vulgaris
Hildenborough (Fournier et al., 2006). En ce qui concerne la rubrérythrine (Rbr) et la BCP
peroxyrédoxine (Bcp1) prennent le relais de Ahp et les Bcp 1 et 2 pour éliminer le peroxyde,
lorsque sa concentration est relativement faible (vers la fin du stress oxydant, ou tout début de
la restauration de l’anaérobiose). La rubrérythrine est une protéine qui joue le rôle d’une
catalase chez D. vulgaris et permet à cette bactérie d’éliminer les espèces réactives d’O2
(Lumppio et al., 2001). Elle assure également la protection des cellules de Sprillum volutans
contre le peroxyde d’hydrogène (Alban et al., 1998). De son côté, la neelarédoxine
appartenant à la même unité multicistronique que la Rbr, est responsable de la réduction de
l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène (Auchere et al., 2003; Rodrigues et al., 2007b).
Cette enzyme présente également une importante activité superoxyde réductase chez de
nombreuses bactéries et archées anaérobies comme Desulfovibrio gigas (Chen et al., 1993b)
et Archeoglobus fulgidus (Abreu et al., 2000), mais également chez des micro-organismes
microaérophiles tels que Treponema pallidium (Auchere et al., 2003). Elle joue également un
rôle dans la protection des cellules de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough vis à vis du
superoxyde cytoplasmique (Voordouw and Voordouw, 1998; Fournier et al., 2003).
L’ensemble de ces enzymes précitées intervient pour éliminer les espèces réactives d’O2
générées pendant le stress oxydant, et elles constituent donc un système efficace pour
détoxiquer le milieu de T. maritima de toutes traces de peroxydes et de superoxydes.
Bien que T. maritima tolère la présence d’O2 et se soit montrée capable de consommer
ce gaz, nos travaux ont clairement montré que ce dernier a des effets toxiques sur la
physiologie, mais également sur le métabolisme de cette bactérie. En effet, à la fois la
croissance et le processus fermentaire ont été affectés suite à l’exposition à l’O2. Que les
cellules de T. maritima soient soumises à la présence momentanée (30 minutes) ou prolongée
(20 heures) de l’O2, celles-ci ne se développent plus et cet arrêt de croissance persiste jusqu’à
la restauration de l’anaérobiose mais également la baisse du potentiel d’oxydo-réduction.
155
Conclusion générale
Concernant le métabolisme, en anaérobiose, tel qu’il l’est rapporté dans la littérature, T.
maritima produit de l’acétate, du lactate, H2 et CO2 comme produits majeurs du métabolisme
à partir du glucose. Cependant, en présence d’O2, bien que les produits du métabolisme soient
identiques, nous avons observé un déplacement du métabolisme vers le lactate au dépens de
l’acétate avec une production moindre en hydrogène. La présence d’O2 induit donc un
déplacement du métabolisme vers des molécules plus réduites comme le lactate. Certaines
enzymes impliquées dans la voie de dégradation du glucose ont donc été désactivées ou
fortement altérées par la présence de l’O2. Tel est le cas de l’hydrogénase de T. maritima. En
effet, Les études transcriptomiques réalisées sur le transcrit de l’hydrogénase de T. maritima
(TM 1424) ont montré que l’expression de ce gène était fortement réprimée en présence d’O2.
Par ailleurs, nous avons montré que cette absence d’activité hydrogénasique était directement
corrélée à un arrêt de production d’H2 durant la phase oxydante. Ces résultats vont à
l’encontre des résultats précédemment obtenus chez une espèce proche phylogénétiquement
de T. maritima, en l’occurrence, T. neapolitana (Jannasch et al., 1988). Chez cette bactérie,
une stimulation de la production d’H2 a été observée en conditions de microaérophilie (Van
Ooteghem et al., 2002). Un résultat qui a été cependant démenti récemment par Eriksen et al.
(2007) (Eriksen et al., 2008). Néanmoins, si tel était le cas pour T. neapolitana, la relation
qu’aurait cette bactérie d’un point de vue métabolique en relation avec l’O2 pourrait indiquer
donc qu’au sein d’un même genre (Thermotoga), les espèces réagiraient de façon différente
vis à vis de l’O2 et que vraisemblablement cette différence de réponse pourrait être le reflet
d’une sensibilité plus ou moins importante de l’hydrogénase de chacune des espèces à l’O2.
On retrouve d’ailleurs ce même type de phénomène chez les bactéries anaérobies sulfatoréductrices et précisément chez Desulfovibrio vulgaris Hildenborough qui manifeste une
activité hydrogénasique malgré la présence d’oxygène. En effet, chez cette bactérie,
l’hydrogénase à fer périplasmique est produite abondamment et le gène hydA codant pour
cette hydrogénase est fortement induit après 60 minutes d’oxygénation du milieu (Fournier et
al., 2003; Fournier et al., 2006). Les auteurs attribuent une nouvelle fonction à cette
hydrogénase à fer, celle de protéger la cellule contre le stress oxydant (Fournier et al., 2006).
En ce qui concerne toujours le métabolisme, nous avons pu constater qu’en conditions
de stress oxydant long, une partie significative du glucose (environ 73%) était métabolisée
selon un processus oxydatif en utilisant l’O2 comme accepteur final d’électrons pour produire
de l’H2O. Ce type de métabolisme a déjà été observé chez les bactéries mésophiles anaérobies
du genre Gluconobacter produisant de l’acide acétique à partir l’éthanol (De Ley and
Kersters, 1964; Dismukes et al., 2001). C’est la première fois que nous mettons en évidence
156
Conclusion générale
cette capacité oxydative faisant intervenir l’oxygène chez une anaérobie hyperthermophile du
domaine des Bacteria.
Il a été rapporté qu’en condition d’anaérobiose, T. maritima dégradait le glucose en
utilisant la voie Entner-Doudoroff (ED ; 15 %) et la voie Embden-Meyerhof (EM ; 85 %)
(Selig et al., 1997). Sachant que la voie ED est préférentiellement utilisée par les
hyperthermophiles aérobies (exemple : Sulfolobus acidocaldarius (Bartels, 1989; Selig et al.,
1997)), il était intéressant de voir si la présence d’oxygène dans la phase gazeuse modifiait le
comportement métabolique de T. maritima. En l’occurrence grâce aux analyses de
spectroscopie RMN, nous avons pu montrer que les voies empruntées lors de la glycolyse par
T. maritima lorsqu’elle était soumise à des conditions oxiques étaient également les voies ED
et EM avec une amélioration de l’utilisation de la voie EM (95 %) au dépens de la voie ED
(5%). Il semblerait donc que contrairement à nos attentes, la voie ED serait réprimée en
présence d’O2. Ces résultats ont d’ailleurs été confirmés par la détermination des taux
d’expression des transcrits codant les enzymes clefs de la voie ED qui sont inférieurs dans des
conditions oxiques.
Finalement, l’ensemble de nos données obtenues via la transcriptomique ou l’analyse
des produits du métabolisme souligne à la fois une toxicité de l’oxygène sur le métabolisme
fermentaire de T. maritima, mais une capacité certaine de cette dernière à pouvoir
s’accommoder de la présence de ce gaz quand il est présent en quantités raisonnables dans
l’atmosphère.
157
Perspectives
Perspectives
158
Perspectives
Le présent travail a permis de mettre en évidence l’étonnante capacité de la souche
hyperthermophile anaérobie Thermotoga maritima à faire face à la présence d’oxygène. C’est
certainement grâce à cette capacité que cette bactérie peut se maintenir, voire croître, dans les
systèmes hydrothermaux marins qu’elle habite où les conditions d’oxygénation sont diverses
et variées. Dans ce type d’écosystème, à côté de T. maritima, on trouve notamment des
hyperthermophiles anaérobies sulfato-réducteurs appartenant à l’ordre des Thermococcales
du domaine des Archaea (Rusch et al., 2005; Huber et al., 2006), mais également des
hyperthermophiles microaérophiles appartenant à l’ordre des Aquificales du domaine des
Bacteria capables d’utiliser l’O2 lorsque ce gaz est présent à de faibles pression partielles dans
l’environnement (Huber and Stetter, 2001b; Eder and Huber, 2002). Ce n’est que très
récemment qu’il a été démontré que des membres des Thermococcales possédaient des
systèmes de détoxication de l’O2 similaires à T. maritima (Kobori et al., ; Le Fourn et al.,
2008). Auquel cas, il est tout à fait normal de penser que les populations hyperthermophiles
anaérobies indigènes aux systèmes hydrothermaux marins puissent mutualiser leurs efforts
pour lutter contre la toxicité de l’oxygène in situ. A cela s’ajoute la capacité des
microaérophiles très répandus dans les environnements chauds marins à consommer
énergétiquement l’O2, mais également la faible solubilité de l’O2 à haute température qui
apportent une protection supplémentaire aux hyperthermophiles anaérobies vis à vis de l’O2.
C’est dans ce sens, qu’il serait important de tester l’effet de l’O2 sur la croissance d’autres
micro-organismes importants d’un point écologique comme les membres des Aquificales ou
des Thermococcales dans les systèmes hydrothermaux marins pour mieux appréhender la
dynamique spatiotemporelle de détoxication de l’O2 dans les environnements marins chauds.
En débutant les travaux de cette thèse, nous étions partis du principe qu’en élucidant chez T.
maritima, les mécanismes enzymatiques de détoxication de l’O2, nous allions peut-être mettre
en évidence un mécanisme de détoxication ancestral de ce gaz, sachant que T. maritima se
situe dans les branches basses de l’arbre phylogénétique basé sue l’analyse des séquences de
gènes codant pour l’ARNr 16S (Huber et al., 1986; Huber and Hannig, 2006). Les récents
travaux de Le Fourn et al. (2011) concernant T. maritima viennent de mettre en évidence que
cette bactérie aurait acquis son système enzymatique de détoxication de l’O2 par l’ancêtre des
Thermotogales (Bacteria) qui l’aurait hérité de l’ancêtre des Thermococcales (Archaea) via
des transferts latéraux de gènes (Le Fourn et al., 2008). Auquel cas, le rôle des Archaea,
plutôt que celui des Bacteria aurait été primordial dans l’adaptation des micro-organismes
anaérobies à la présence d’O2 dans l’atmosphère primitive. Il est important désormais de
savoir indépendamment des micro-organismes hyperthermophiles, comment certains
159
Perspectives
anaérobies comme les bactéries anaérobies sulfato-réductrices, par exemple, ont acquis cette
capacité à détoxiquer l’O2, voire à l’utiliser de manière énergétique. Il est, en effet, fort
probable que cette capacité de détoxication a été transférée tout d’abord d’anaérobie à
anaérobie pour devenir plus sophistiquée au fur et à mesure de l’évolution microbienne chez
les microaérobies, puis les aérobies qui respirent l’oxygène. Il est donc de tout premier intérêt
de continuer à connaître les systèmes enzymatiques mis en place par le vivant pour lutter
conte l’effet toxique de l’oxygène chez des représentants biologiques localisés à différents
niveaux de l’arbre phylogénétique que ce soit dans le domaine des Archaea, des Bacteria,
voire des Eucarya. En effet, nous pourrons ainsi conclure sur les groupes microbiens qui ont
joué un rôle prépondérant dans le transfert de cette information génétique de tout premier plan
au cours l’évolution microbienne.
160
Annexes
Annexes
161
Annexes
Tableau 1 : Composition du milieu de culture minérale de T. maritima
Produits chimiques
g.L-1
NH4Cl
1
K2HPO4
0.3
KH2PO4
0.3
CaCl2
0.1
KCl
0.1
NaCl
25
Oligoéléments de Balch
10 mL
Tableau 2 : Composition du milieu de culture non réduit de T. maritima
Produits chimiques
g.L-1
NH4Cl
1
K2HPO4
0.3
KH2PO4
0.3
CaCl2
0.1
KCl
0.1
NaCl
25
Oligoéléments de Balch
10 mL
MgCl2
3
Extrait de levure
1
Glucose
3.16
162
Annexes
Tableau 3 : Liste de toutes les enzymes intervenants des les deux voies EM et ED de la
glycolyse chez T. maritima
Enzymes clefs de la voie EM
Enzymes clefs de la voie ED
hexokinase ATP-dépendante
Glucose-6-phosphate dehydrogenase TM1155
glucose-6-phosphate isomérase TM1385
2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate
aldolase
(ED conventionnelle phosphorylée) TM0066
ATP-dependent-6-phosphofructokinase
2-keto-3-deoxygluconate
TM0209 TM0289
phosphorylée)
fructose-l,6bisphosphate aldolase TM0273
triose-phosphate isomérase
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase TM0688
phosphoglycérate kinase TM0689
phosphoglycérate mutase TM1374
Enolase TM0877
pyruvate kinase TM0208
pyruvate
ferredoxin
oxydoréductase
TM0015 TM0016 TM0017 TM0018
phosphate acétyltransférase
acétate kinase
NADH:ferredoxin oxydoréductase
hydrogénase
Lactate dehydrogénase
Pyruvate carboxylase
163
aldolase
(ED
non
Références Bibliographiques
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Résumé
Résumé
La bactérie hyperthermophile Thermotoga maritima a été cultivée dans un fermenteur
dans lequel la concentration en O2 a été rigoureusement contrôlée. A 80°C et pH 7, il a été
démontré que T. maritima pouvait survivre à des expositons de durées variables à l’O2 et
qu’elle était capable de le consommer. La vitesse spécifique de consommation de l’O2 a été
estimée à 73.6 µmoles O2.min-1.g protéines-1 lors d’une courte exposition à l’O2 (30 min). De
longues expositions à l’O2 (20 h) nous ont permis de démontrer que la présence d’O2 ralentissait
la croissance de T. maritima et conduisait à un shift du métabolisme vers la production de
lactate aux dépens de l’acétate et à un arrêt de production d’H2. Dans ces conditions, il a été
constaté que 73% du glucose était consommé selon un métabolisme partiellement oxydatif
faisant intervenir simultanément les deux voies Embden-Meyerhof et Entner-Doudoroff de la
glycolyse. En l’occurrence, l’oxydation incomplète du glucose est corrélée à la réduction de
l’O2 en eau. Les études transcriptomiques ont montré que cette réduction de l’O2 résultait d’une
cascade de réactions intermédiaires faisant intervenir des enzymes de type peroxydases
[activation de l’expression des enzymes Ahp (alkyl hydroperoxyde réductase), Bcp1 et Bcp2
(thiol peroxydase thioredoxin-dépendante)] qui acheminent les électrons libérés via les radicaux
libres. D’autres enzymes comme la rubréryhtrine et la neelarédoxine interviendraient pour
détoxiquer les espèces réactives d’O2. Les électrons libérés seraient au final utilisés pour réduire
l’O2 en H2O par l’enzyme FprA, dont l’expression varie en fonction du potentiel redox du
milieu de culture. Ce schéma est proposé comme un des éléments essentiels du dispositif
enzymatique permettant la consommation de l’O2 et la protection des cellules contre les effets
des espèces réactives de l’oxygène chez T. maritima.
Mots clés
Thermotoga maritima, oxygène, stress oxydant, métabolisme oxydatif, espèces réactives de
l’oxygène.
Abstract
Batch cultures of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima were
performed in a bioreactor where O2 concentrations in the gas phase were strictly controlled.
At 80°C and pH 7, we demonstrated that T. maritima survived despite being exposed to
oxygen at different times and that it consumed it. O2 uptake rate was estimated at 73.6 µmoles
O2 min-1g proteins-1 during a short exposure to O2 (30 minutes). A long time exposure of T.
maritima cultures to oxygen (20h) led to a drastic reduction in growth, together with a shift in
glucose metabolism towards lactate instead of acetate production and a stop in H2 production.
Under these conditions, it has been observed that 73% of glucose was partially oxidised by
using both Embden-Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic payhways. Uncomplete
oxidation of glucose is correlated to a reduction of O2 to H2O. Transcription analyses revealed
that this reductive process of O2 involved enzymes like peroxidases [activation of alkyl
hydroperoxide reductase (ahp), bcp1 and thioredoxin-dependent thiol peroxidase (bcp 2)].
Moreover, genes encoding reactive oxygen species (ROS)-scavenging systems (neelaredoxin
and rubrerythrin), were found to be upregulated during oxygen exposure. The oxygen
reductase FprA, which expression was shown to depend on the redox level of the culture
medium, is proposed as a primary consumer of O2. All these enzymes are essential for T.
maritima to consume O2 consumption and to fight against the toxic effects of ROS in cells.
Key Words
Thermotoga maritima, oxygen, oxidative stress, O2 uptake rate, oxidatif metabolism, ROS
scavenging.