Journée FIVATE La FIVATE et le blocage embryonnaire dans la

Journée FIVATE
La FIVATE
et le blocage embryonnaire
dans la culture prolongée
J.F. Velez de la Calle
Laboratoire Glasgow, Unité FIV Clinique Pasteur-Saint Esprit, 29200-Brest
<[email protected]>
Mots clés : FIVATE, culture prolongée, blastocyte
Dans la recherche de l’améliora-
tion des résultats d’implantation
en fécondation in vitro, le transfert au
stade blastocyste a été souvent pro-
posé pour de très nombreuses raisons.
Tout d’abord, le transfert (à J5 ou
J6) correspond au moment estimé de
l’implantation de l’embryon dans l’es-
pèce humaine. De ce fait, l’embryon
transféré dans l’utérus, est sensé trou-
ver, a priori, un environnement plus
approprié à son stade, comparé à
l’embryon de 2, 4 ou 8 cellules.
En effet, l’embryon conçu in vitro,
est trop souvent transféré à J2 ou J3,
stade auquel, dans les conditions na-
turelles il se trouve encore dans la
trompe. Or, il a été démontré que les
conditions physico-chimiques sont
différentes entre la trompe et l’utérus.
Les faibles rendements en matière de
taux d’implantation dans l’espèce hu-
maine, peuvent donc s’expliquer, par
un environnement utérin défavorable
pour l’embryon à J2-J3.
Dans cette quête d’amélioration
des résultats, il faut rappeler que les
contractions utérines engendrées par
la ponction et/ou le transfert embryon-
naire, sont parfois à l’origine des cer-
tains échecs d’implantation suite au
rejet probable de l’embryon ou à l’ef-
fet délétère des prostaglandines et
autres cytokines propres aux phéno-
mènes inflammatoires. L’efficacité du
transfert tardif peut donc être liée
aussi, à une hyper contractilité utérine
moins importante, fruit de la distance
entre le transfert et la ponction et/ou
de l’imprégnation en progestérone.
La réceptivité endométriale et la
fenêtre implantatoire jouent un rôle
non négligeable dans l’efficacité du
transfert d’embryon. Il est bien connu
que l’endomètre, lors des cycles sti-
mulés, est en avance par rapport à
l’âge de l’embryon (J2-J3). Cette
avance histologique et « non-
concordance » de l’endomètre serait
moins défavorable pour le blastocyste
qui se trouverait dans un environne-
ment propice.
Une autre explication avancée, au
sujet de l’efficacité du transfert au
stade blastocyste, est le tri plus au
moins « spontané » exercé sur les em-
bryons obtenus. En effet, il est connu
que tous les embryons résultant de la
superovulation, n’ont pas la même
« capacité » implantatoire. Certains
d’entre eux y compris, à morphologie
intacte identique (J2-J3), vont s’arrêter
dans leur division cellulaire. Le fait
donc de prolonger leur culture, per-
met d’optimiser ce transfert, par la vi-
sualisation d’une étape précédant
juste le moment de l’implantation.
Cette « visualisation » peut être
d’autant plus utile, qu’elle permet
aussi d’évaluer le blastocyste éclos,
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étape indispensable à la nidation, parfois responsable
d’échecs dans les cas de zone pellucide épaisse, assez
fréquents chez la femme de plus de 37 ans.
Le transfert des blastocystes est actuellement proposé
aussi, pour diminuer le taux de grossesses multiples. En
effet, la faible efficacité du transfert à J2-J3, incite souvent
les praticiens à proposer des transferts avec plusieurs
embryons. Sans avoir une réelle amélioration des résul-
tats, cette politique de transfert augmente de manière non
négligeable les risques de grossesse multiple. Ayant par
définition une meilleure efficacité avec les blastocystes,
on peut se permettre de proposer donc un seul embryon
au moment du transfert.
Lors de notre étude, nous nous sommes intéressés au
blocage embryonnaire pendant la culture prolongée. Ce
blocage embryonnaire est souvent associé à la période de
compaction, c’est-à-dire au stade morula. En effet, ce
stade est particulièrement délicat puisque pendant celui-
ci, se produisent des changements lipidiques à l’origine
des membranes. Durant cette période de compaction,
l’embryon est très thermolabile et fragile.
Dans notre exposé et bien que pratiquant la culture
prolongée depuis 1996, nous allons présenter les résultats
de notre centre entre 2000 et 2005. En effet, on peut
considérer que ces dernières cinq années correspondent
pour nous, à une amélioration notable en la matière.
Matériel et méthodes
Nous donnons ci-dessus l’évolution de notre techni-
que de culture lors de ces 6 dernières années, dans la
mesure où nous pensons qu’elle a une incidence sur les
résultats observés.
Année 2000 : 2 incubateurs à mélange CO2-air et un
incubateur de paillasse (3 gaz). Niveau de C02 à 5 %.
Utilisation du milieu Ferticult (FC) pour la fécondation (J0)
et C20 (Scandinavian) à partir de J2. Culture intégrale en
microgouttes sous huile (boites 1006 flacon). Pas d’obser-
vation ni de changement d’embryons à J4. Patientes (cul-
ture prolongée) ayant eu plus de deux échecs de grossesse,
représentant 14,5 % de notre activité ayant montré un
clivage (80 ponctions/560).
Année 2001 : Idem pour le nombre d’incubateurs et le
taux de CO2. Culture en boîtes Nunc (4 puits) sans huile et
pas d’observation ni changement à J4. Milieux idem avec
deux périodes de milieu pour blastocyste (Irvine). Pour-
centage de patientes concernées de 16,2 % (81/500).
Année 2002 : 3 incubateurs à mélange CO2-air et un
incubateur de paillasse, avec l’arrivée d’une tour Coda.
Mêmes conditions de culture sauf séquence « maison »
FC-C20 et deux mois avec milieux séquentiels Cook.
22,2 % de nos patientes (128/565).
Année 2003 : idem nombre d’incubateurs, boîtes de
culture et tour Coda. Passage à 6 % de CO2 et en fin
d’année, filtres coda pour gaz. Changement des embryons
à J4. 24,3 % de nos patientes (120/493). Milieux :
FC+CCM30 ; séquence Cook et “Global”.
Année 2004 : 4 incubateurs à mélange CO2-air et
incubateur de paillasse protégés par un onduleur de
grande capacité. Milieu : FC+CCM30 et deux mois Glo-
bal. 26,8 % de la population (proposition à toutes les
patientes ayant plus de 3 embryons de grade I), soit 135
cycles/503.
Année 2005 : Décision praticiens pour la culture pro-
longée avec 3 embryons ou plus de grade I. Conditions
identiques de travail avec cependant, habits opérateurs
type bloc chirurgical. 33,6 % de nos patientes (161/563*).
Culture avec milieu FC+CCM30 sauf 1 mois avec milieu
global.
* Jusqu’au 15 décembre 2005
Résultats
Effectifs
Cette étude concerne 5 318 ovocytes inséminés en FIV
et 2 110 injectés (MII) observés sur 705 ponctions avec
culture prolongée. Les taux de fécondation ont été respec-
tivement de 66,5 % (3 534 embryons) et de 83,5 % (1 761
embryons). Les embryons de gradeIàJ2représentaient
61 % (2 158) et 64,1 % (1 129) de la cohorte. 97 % des
blastocystes ont été obtenus à J5 (J0 = ponction). Les blas-
tocystes uniquement observés à J6, dans nos conditions de
culture et avec notre milieu de référence (FC+CCM30),
sauf pour les milieux Cook, n’ont jamais donné de gros-
sesse clinique.
La figure 1 montre l’évolution de notre activité en
matière de blocage embryonnaire (BE), du ratio
blastocyste/embryon (B/E) ; du taux de grossesses clini-
ques par ponction ayant bénéficié d’un transfert de blas-
tocystes (G/P) et du taux de grossesses cliniques à trois
mois (G/P > 3 m). Toutes les valeurs observées en 2005
sont significativement différentes (P < 0,001) par rapport à
celles de l’année 2000.
Discussion
En 2000, nous avions repris la culture prolongée après
l’avoir interrompue en 1999 à cause du nombre important
de cycles présentant des blocages embryonnaires (> 30%)
et du risque de grossesses monozygotes-dyzygotes (12 %
dans notre série) que nous avions signalé comme étant le
fruit de l’utilisation du milieu S2 [4].
Depuis cette année de « transition », nous avons ob-
tenu des résultats plus consistants en matière de grosses-
ses, en accord avec la littérature, voire bien supérieurs
(2005).
Ne connaissant pas l’importance du taux de blocage
embryonnaire spontané in vivo dans l’espèce humaine,
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nous pouvons penser que les résultats observés dans notre
centre, sont normaux, voire, assez bas (depuis 2003),
traduisant une assez bonne méthodologie de la culture
cellulaire dans son ensemble et l’utilisation d’une sé-
quence des milieux tout à fait adaptée.
Il faut souligner que ce blocage embryonnaire n’est pas
systématiquement observé lors des stades précédant le
stade blastocyste et en particulier celui de la compaction
des blastomères (morula) mais aussi entre le blastocyste
débutant et l’expansé à J5 et J6 (données non présentées
dans ce résumé). Ces blocages « avancés » expliquent
peut-être l’absence de grossesse chez certaines patientes.
Nous ne saurions dire si l’arrêt de l’embryon à ce stade est
le fruit d’une altération au stade morula ou bien d’une
modification épigénétique ayant eu lieu en amont. Cepen-
dant, il est intéressant de constater que, « dans nos condi-
tions de travail », nos résultats ont été beaucoup plus
intéressants (moins de blocages et plus de grossesses)
depuis que nous changeons les embryons à J4, contraire-
ment à ce qui était préconisé par Gardner et al. [2]
Il ne faut pas oublier que les résultats sont aussi in-
fluencés par différents facteurs pouvant modifier les « per-
formances » du système de culture. La patiente (âge, anté-
cédents, stimulation ovarienne) ; la ponction ovocytaire
(température seringues, stérilisation vagin et équipements,
aiguilles) ; le statut des ovocytes au moment de la ponc-
tion (maturité, état méiotique, cytoplasme, zone pellu-
cide) ; les conditions de manipulation entre la ponction et
la culture (paramètres physico-chimiques) ; les milieux
(macromolécules, antibiotiques) ; les techniques de labo-
ratoire (manipulation des ovocytes, d’embryons, statuts
spermatiques et la sélection de spermatozoïdes) ; les
conditions de culture (incubateurs, gaz, stabilité électri-
que, calibration) ; l’environnement du laboratoire (tempé-
rature, humidité, qualité air ; présence des composés or-
ganiques volatiles) [1-3].
Je voudrais attirer donc l’attention du lecteur sur l’inter-
prétation de nos résultats, comme étant le fruit d’une
méthodologie de travail qui nous est propre. En effet,
depuis de nombreuses années de pratique de la biologie
de la reproduction dans l’AMP, j’ai constaté que les résul-
tats des autres étaient rarement extrapolables par le simple
fait de changer un milieu.
Il nous semble par conséquent, avoir obtenu une pro-
gression harmonieuse dans nos résultats concordant avec
les modifications introduites par nos soins. Par ailleurs, les
fabricants de milieux non seulement ont fait des modifica-
tions qui nous sont inconnues (en particulier sur les quan-
tités des molécules) dans la composition desdits milieux,
mais aussi dans leur stabilité et dans l’approvisionnement
des matières premières, permettant d’avoir une bien
meilleure reproductibilité.
Aujourd’hui, « dans nos conditions de travail », nous
avons atteint en 2005, des résultats comparables (voire
meilleurs) à ceux décrits par les équipes américaines [2]
avec un ratio blastocyste/embryon proche de 67 % et un
taux de grossesses cliniques de 60 % (54,3%>à3mois)
observés chez 33,6 % de nos patientes (population glo-
bale, toutes techniques confondues) présentant à J2 des
embryons clivés.
Ces résultats nous incitent de plus en plus à proposer
aux couples cette solution, d’autant plus que les taux de
grossesses cliniques à 3 mois sont excellents (2005).
Efficacité culture
66,8
60,2
54,3
0
20
40
60
80
100
2000 2001 2002 2003 2004 2005
% B/E
% BE
% G/P
% G/P > 3m
Figure 1.
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Faut-il pour autant proposer à toutes nos patientes le
transfert au stade blastocyste ?
La réponse n’est pas si simple, si nous tenons compte
de l’analyse de notre population. En effet, les femmes ne
bénéficiant pas de culture prolongée sur les 6 années
évaluées, présentent en moyenne : 40 % en moins
d’ovocytes/ponction ; 50 % en moins d’embryons et
60 % en moins d’embryons de grade I (données non
présentées). Par ailleurs, leur taux de grossesse est 60 %
moins important. Ceci est le reflet d’une population avec
une réserve et une qualité ovocytaire moins bonnes, la-
quelle population est plus aléatoire et plus difficile à
cerner. Par ailleurs, les incertitudes encore d’actualité en
matière de culture embryonnaire (reproductibilité des mi-
lieux, chaîne du froid,...) font que ce choix absolu reste
encore délicat sur le plan éthique.
Finalement, dans tous les cas, l’équipe pluridiscipli-
naire doit procurer une information détaillée à tous les
couples, avec les résultats du centre, avant de décider de
la mise en œuvre.
Équipe clinico-biologique de la clinique Pasteur à
Brest : J.-J. Chabaud, A. Hassoun, B. Letellier, C. Le Roux,
G. Lucas, S. Madec, S. Masson, J.F. Velez de la Calle.
Références
1. Cohen J, et al. Environmental factors affecting development of
embryos. In : Ares Serono Symposia-Alpha, Cancun. 2001.
2. Gardner D. Prolonged culture of embryos. In : Ares Serono
Symposia-Alpha, Cancun, 2001.
3. Pool T. Gamete and embryo culture systems. In : Ares Serono
Symposia-Alpha, Cancun, 2001.
4. Vélez de la Calle J, Chabaud JJ. High incidence of dizygotic triplet
pregnancies from human blastocyst transfer in a IVF program. ESHRE,
1999.
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