Utilisation des mutations induites pour l`étude de l`embryogenèse

BA
SE Biotechnol. Agron. Soc. Environ.2011(1),195-205 Lesur
Utilisationdesmutationsinduitespourl’étudede
l’embryogenèsechezleharicotPhaseolus vulgaris L.et
deuxplantesmodèles,Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.et
Zea mays L.
SouleymaneSilué(1),Jean-MarieJacquemin(2),Jean-PierreBaudoin(1)
(1)Univ.Liège-GemblouxAgro-BioTech.UnitédePhytotechnietropicaleetd’Horticulture.PassagedesDéportés,2.
B-5030Gembloux(Belgique).E-mail:[email protected]
(2)CentreWallondeRecherchesAgronomiques(CRA-W).DépartementdeBiotechnologie.ChausséedeCharleroi,234.
B-5030Gembloux(Belgique).
Reçule22janvier2010,acceptéle24juin2010.
L’amélioration du haricot commun Phaseolus vulgaris L. par hybridations interspéciques avec les espèces Phaseolus
coccineus L.etPhaseolus polyanthusGreenm.utiliséescommeparentsfemellessesoldegénéralementparl’avortementdes
embryonshybrides.L’identicationdesgènesintervenantdansledéveloppementnormaldesembryonspermettraitd’expliquer
enpartiel’avortementdesembryonshybrides;lesmutationsinduitespourraientdoncêtreunealternativechezPhaseoluspour
identierlesgènesclésdel’embryogenèse.Cetteétudeprésentequelquesexemplesd’utilisationdesmutationsinduitesdans
l’identicationdesgènesindispensablesaubondéroulementdel’embryogenèsechezArabidopsis thaliana(L.)Heyhn.etZea
mays L.,plantesmodèlesdel’étudedel’embryogenèsechezlesdicotylédonesetlesmonocotylédones,respectivement.Chez
cesdeuxespèces,desmutantsdudéveloppementembryonnaireontétéidentiésenutilisantlamutagenèseinsertionnelleetla
mutagenèsechimiqueàl’ÉthylMéthaneSulfonate(EMS).ChezArabidopsis,lesmutantssontaffectésdanslapolaritéapico-
basale,l’organisationradialeetlesétapespost-embryonnairesetcertainsembryonsmutantssontaffectésdanslasignalisation
del’auxine.Chezlemaïs,lesmutantsdefective kernel(dek),altérésauniveaudel’embryonetdel’albumen,etlesmutantsemb
pourlesquelsseull’embryonestaffecté,ontétéidentiés.Chezleharicotcommun,desplantesdécientesdanslaformation
desgrainesontétéidentiéessuiteàlamutagenèseàl’EMS.Lesembryonsdesgrainesdecesplantesarrêtentdecroîtreà
différentsstadesdedéveloppementetprésententdesanomaliesprincipalementauniveaudususpenseuretdescotylédons.
Phaseolus,hybridationinterspécique,embryogenèse,Arabidopsis,Zea,mutagenèseinduite.
Phaseolus vulgarisArabidopsis
thalianaZea maysBreedingofcommonbean,Phaseolusvulgaris L.,throughinterspecichybridizations
with the species Phaseoluscoccineus L. and Phaseoluspolyanthus Greenm. as female parents leads to the abortion of
immature embryos. Identication of genes required for embryo development could partly explain the abortion of hybrid
embryos;inducedmutationscouldthusbeanalternativetoidentifykeygenesinvolvedinPhaseolusembryogenesis.This
paperisareviewwhichshowsafewexamplesoftheuseofinducedmutationsintheidenticationofessentialgenesfor
embryogenesisintwomodelplants,Arabidopsis thaliana(L.)Heyhn.fordicotsandZea mays L.formonocots.Inthese
twospecies,embryodevelopmentmutantshavebeenisolatedusinginsertionalmutagenesisandchemicalmutagenesiswith
EthylMethaneSulfonate(EMS).Arabidopsisembryomutantsareaffectedinapical-basalaxispolarity,radialpatternandin
post-embryonicstages.SomeArabidopsisembryomutantsaredefectedinauxinsignalisation.Inmaize,defective kernel(dek)
mutantsareaffectedintheembryoandtheendosperm,whileinembryo specic(emb)mutants,onlytheembryoisaffected.
Incommonbean,plantsdecientinseeddevelopmentwereisolatedusingEMSmutagenesis.Embryosinsidetheseedsfailto
growthatdifferentstagesofdevelopmentandshowabnormalitiesmainlyinthesuspensorandthecotyledons.
Phaseolus,interspecichybridization,embryogenesis,Arabidopsis,Zea,inducedmutagenesis.

 Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2011(1),195-205 SiluéS.,JacqueminJ.-M.&BaudoinJ.-P.
DanslegenrePhaseolus,leharicotcommun(Phaseolus
vulgaris L.) est l’espèce économiquement la plus
importanteavecplusde90%delaproductionmondiale
de haricot. Il constitue la principale légumineuse
alimentaire de plus de 300millions de personnes en
Amérique latine et en Afrique centrale et de l’Est
(Broughton et al., 2003). La production mondiale en
haricot sec en 2007 était estimée à 19,29millions de
tonnes.Lasurfacetotaleconsacréeàcetteproduction
représentaitenviron26,92millionsd’hectarespourun
rendementmoyende0,72t.ha-1.Lerendementmoyen
en Amérique du Nord et dans l’Union européenne
était de 1,63t.ha-1 et pour l’Afrique, il n’était que de
0,59t.ha-1 (FAO, 2009). Ce faible rendement est dû
d’une part, aux contraintes biotiques et abiotiques
de production auxquelles le haricot commun est
très sensible et d’autre part, à l’absence de variétés
résistantesoutolérantesàcescontraintesauseindupool
géniqueprimaireduharicotcommun.Eneffet,plusde
200agentspathogènes(fongiques,bactériensetviraux)
sontconnuschezleharicotcommunetcertainsd’entre
eux causent des pertes économiques considérables
(Caixetaetal.,2003).Lesfacteursabiotiquestelsqueles
hautestempératuresetlasècheressecontribuentaussià
réduirelesrendementsduharicot(Raineyetal.,2005).
Dans les travaux d’amélioration variétale du
haricot commun, les hybrides interspéciques ont
étéexploitéspourintroduiredesgènesutilesquisont
absentsoufaiblementexpriméschezcettelégumineuse.
Les croisements ont été réalisés surtout avec les
deux espèces donneuses PhaseoluscoccineusL. et
PhaseoluspolyanthusGreenm.phylétiquementlesplus
prochesdePhaseolusvulgaris.Cesdeuxespècessont
utilisées comme parents maternels an de favoriser
l’introgression des gènes utiles de ces deux taxons.
Malheureusement, ces croisements donnent lieu très
souventàdesavortementstrèsprécocesdesembryons
hybrides(Busogoroetal.,1999;Baudoinetal.,2004).
L’avortement des embryons hybrides est attribué
en partie à des raisons nutritionnelles: les mauvais
fonctionnements de l’albumen, du suspenseur et des
tissus maternels entraineraient une compétition entre
l’albumenetl’embryond’unepart,etentrelesuspenseur
et l’embryon d’autre part. Ces différentes anomalies
entraventl’alimentationnormaledel’embryonhybride
et le maintien d’un équilibre minéral et hormonal
nécessaireaumétabolismedel’embryogenèse(Geerts
et al., 2002; Toussaint et al., 2004). L’utilisation de
l’embryoculture a permis la régénération de plantes
hybrides issues de ces différents croisements. Les
embryonshybridesmisencultureétaientâgésde7à
33joursetavaienttousatteintlestadecordiformetardif
ou cotylédonaire (Camarena et al., 1987; Kuboyama
etal.,1991).
Par ailleurs, l’identication des gènes majeurs
impliqués dans l’embryogenèse de Phaseolus
permettrait d’avoir une meilleure compréhension du
phénomèned’avortementdesembryons.
Comme cela s’est fait chez des plantes modèles
(Devic, 1995; McElver et al., 2001; Tzafrir et al.,
2004; Vernoud et al., 2005), les mutations induites
(provoquéespar desagents extérieurset causantdes
modicationsdanslegénome)pourraientêtreutilisées
chez Phaseolus pour identier les gènes majeurs
intervenantdansl’embryogenèse.
L’objetdecetteétudeestdemontrerquel’utilisation
des mutations induites chez le haricot commun
permettrait de mieux comprendre les mécanismes
fondamentauxconduisantàl’avortementdesembryons
au cours du développement embryonnaire chez
Phaseolus.Dansunpremiertemps,nousdécrironsles
mutations induites au niveau de l’embryogenèse des
plantesainsiquelestypesdemutationsutiliséschez
les plantes modèles pour l’identication des gènes
de l’embryogenèse. Ensuite, quelques cas d’études
réalisées chez deux plantes modèles, Arabidopsis
thaliana (L.) Heyhn. (dicotylédone) et Zea mays L.
(monocotylédone), sont présentés. Nous faisons
égalementunesynthèsedequelquesmutantsaffectés
dans la signalisation de l’auxine chez Arabidopsis.
Dans la dernière partie, nous présentons quelques
exemplesd’utilisationdesmutationsinduiteschezle
haricot commun et leur potentialité dans l’étude de
l’embryogenèse.
Les mutations induites sont provoquées par
l’action d’agents mutagènes ou d’éléments d’ADN
transposablesandecréeretd’augmenterlavariabilité
au sein d’une population. D’une façon générale,
les mutations entrainent des modications dans
n’importequellerégiondel’ADN.Cesmodications
se caractérisent soit par des gains ou des pertes de
fonction.L’exploitationdesmutantspermetdelocaliser
etd’identierdesgènesaffectésetdedéterminerleur
fonctionbiologique(Meunier,2005).
Lesagentsmutagènessontdesproduitschimiques
ou des facteurs physiques dont les actions sont
aléatoires;n’importequellepartiedugénomeougène
peut subir une modication (Morère et al., 2003). Il
existe une spécicité des agents mutagènes dans la
mesure où, pour un agent mutagène donné, certains
changementsdeséquencesontprivilégiésparrapport
auxautreschangementspossibles.Lamutagenèsepeut
cependantseréaliserparinsertiond’élémentsétrangers

MutationsinduitesetembryogenèsechezP. vulgaris,A. thalianaetZ. mays
ounon(ADN-Toutransposons)danslegénomed’un
organisme, il s’agit de la mutagenèse insertionnelle
(Parinovetal.,2000;McElveretal.,2001).
Chez les angiospermes (plantes à eurs), l’embryo-
genèseestconstituéedetroisétapesmajeures(Parket
al.,2008).Lapremièreétapecomportelaformationdu
patrondel’embryon.Cedernierpassepardifférents
stades de développement nommés en fonction de la
forme de l’embryon: le zygote, une seule cellule,
se divise activement pour former des embryons
préglobulaires(lequadrant,unembryonde4cellules;
l’octant,un embryonde8cellules, etc.).L’embryon
passera ensuite par les différents stades globulaires,
triangulaires,cordiformes,torpillesetcotylédonaires.
Laformation dupatron estachevéedans l’embryon
austadecordiformecorrespondantàl’embryogenèse
précoce. Les cellules qui donneront les différents
méristèmesettissussontalorspositionnées.Cepatron
sertdebaseauxétapesultérieuresdel’embryogenèse
etàlaformationdelaplanteadulte.Ladeuxièmephase
correspondàuneétapedecroissanceetdematuration
pendantlaquellel’embryonemmagasinedesréserves
pour assurer la germination après la dormance. La
dernièreétapecorrespondàladormancequiestunétat
derepos végétatif permettantaux graines d’attendre
les bonnes conditions climatiques pour germer. Ces
trois étapes se déroulent de manière séquentielle et
chaquephasededéveloppementnécessitel’expression
de différents groupes de gènes (Devic et al., 2001;
McElver et al., 2001). La  représente les
différentesphasesdel’embryogenèsechezA.thaliana
ainsiquelesprincipauxgènesimpliqués.
Malgré des différences morphologiques
importantes, les plans d’organisation et la séquence
desévènementsaboutissantàl’embryonmaturesont
globalement conservés pour l’ensemble des plantes,
qu’elles soient monocotylédones ou dicotylédones.
L’embryogenèse de ces deux classes de plantes
est même parfaitement comparable jusqu’au stade
8cellules. Ainsi, chez le maïs qui constitue la
plante modèle pour l’étude de l’embryogenèse
des monocotylédones (Fontanet etal., 2008), le
développement embryonnaire suit, dans l’ensemble,
le même schéma que chez A.thaliana. Toutefois,
quelquesdifférencesexistent:
– ledéveloppementdumaïss’effectueselonunplan
 de division différent de celui d’Arabidopsis,
 l’embryonetlesuspenseurrésultanttousdeuxd’une
 sériededivisionsasymétriques,
– chez le maïs, l’axe établi par les méristèmes
 caulinaireetracinairedel’embryonestobliquepar
 rapportàl’axeembryon-suspenseur,alorsqueces
 deuxaxessontconfonduschezArabidopsis,
– chezlemaïs,iln’yaqu’unseulcotylédon(appelé
 scutellum) sur l’axe duquel se situe le méristème
 apical; chez Arabidopsis, par contre, deux
 cotylédons sont positionnés de façon symétrique
 autourdel’axe,
– danslecasdumaïs,leméristèmeapicalcommence
 à produire des feuilles durant le développement
 embryonnaire, l’entrée en dormance de la graine
 ayant lieu lorsque la plantule est constituée de
 6primordiafoliaires;chezA.thaliana,lespremières
 feuillesn’apparaissentqu’aprèslagerminationdela
 graine,
– enn,chezlemaïs,lesréservessontaccumuléesau
 seindel’albumen,quiconstituelaplusgrandepartie
 dugrainàmaturité,d’oùladénominationdegrain
 albuminé.Enrevanche,lagrained’Arabidopsisoù
 les réserves sont contenues au sein même de
 l’embryonestunegraineexalbuminée,toutcomme
 pourleharicotcommun.
Chezcettedernièreespèce, lesétudesantérieures
surl’embryogenèseontmontréqueledéveloppement
embryonnaire suivait le même plan d’exécution que
celuiobservé chez Arabidopsis (Yeunget al., 1979;
Geerts,2001;Nguemaetal.,2007).ChezP.vulgaris,
le stade cordiforme correspondant à la formation
du patron de l’embryon est atteint 8jours après
l’anthèse.Lamontrelesdifférentsstadesde
l’embryogenèsechezlegénotypeBAT93deP.vulgaris,
cultivé en chambre conditionnée à Gembloux
(températuresjour/nuit:24/20°C,photopériodejour/
nuit de 12h/12h, humidité relative: 75%). Cette
représentation schématique a été faite à partir de
coupes histologiques. Les graines en développement
ontétéxéesdans2%deparaformaldéhydepréparé
dans 0,1M de tampon phosphate. Les échantillons
sont ensuite déshydratés dans un gradient croissant
d’éthanol et enrobés dans une résine méthacrylique
hydrophile:le2-hydroxyethylmethacrylate(HEMA).
Enn,descoupesde5à7μmsonteffectuéesàl’aide
d’unmicrotomerotatif(Silué,2009).
L’embryogenèse précoce est une étape de
morphogenèse qui aboutit à la formation de deux
axes, un axe radial qui traduit la mise en place des
différentstissus(l’épiderme,leparenchyme,lecortex,
l’endoderme,lepéricycleetlestissusvasculaires)et
unaxe apico-basalcorrespondant àla miseen place
des différents organes [le méristème apical, le(s)
cotylédon(s),l’hypocotylesituésouslescotylédons,la
radiculeetleméristèmeracinaire]().C’est
aucoursdupassagedustadeglobulaireàl’émergence
duoudescotylédon(s)qu’apparaitleplanapico-basal
del’embryon,bienquelespremierssignesdepolarité
selon cet axe soient observables dès la première
divisionduzygote,tandisquel’axeradialn’estdéni
qu’austadeglobulaire(Ravenetal.,2007).Auniveau

 Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2011(1),195-205 SiluéS.,JacqueminJ.-M.&BaudoinJ.-P.
L’embryogenèsechezArabidopsis thalianaL.Heynh.adaptédeDucreux(2002),Vernoudetal.(2005),Ravenetal.
(2007)—ArabidopsisthalianaL. Heynh. embryogenesis adapted from Ducreux (2002), Vernoud et al. (2005), Raven et al.
(2007).
:Représentationschématiquedesprincipalesphasesdudéveloppementdel’embryonetlesprincipauxgènesimpliquésdustadezygote
austadecotylédonairematureà10joursaprèspollinisation(JAP)—Schematic drawing of key developmental stages of the embryo from
zygote stage to the late cotyledonary stage at 10 days after pollination (DAP) ;:Embryonaustadecordiforme(patrondel’embryon)
avecprésentationdesdifférentespartiesdesaxesapico-basaletradial—Heart shape embryo (embryo body) with components of apical-
basal and radial axis.
a
b

MutationsinduitesetembryogenèsechezP. vulgaris,A. thalianaetZ. mays
del’évolutionetdelasélectionnaturelle,lesindividus
lesplusaptesàsurvivreserontceuxquipourrontplus
facilement capter la lumière (seront donc plus hauts
que leurs voisins) et qui sauront mieux coloniser
le sol à la recherche de nutriments (possédant un
systèmeracinairemieuxadapté).Cescaractéristiques
fondamentales résultent d’un bon établissement de
l’axeapico-basalaucoursdel’embryogenèse(Devic,
1995),soulignantainsil’intérêtdelacompréhension
desmécanismesgénétiquesdel’embryogenèse.
Au cours de l’embryogenèse, de nombreux gènes
doivent s’exprimer pour permettre au zygote de
se diviser de manière régulière, de compléter sa
morphogenèse et de se différencier en un embryon
mature capable de surmonter la dessiccation et de
produireuneplanteviable(McElveretal.,2001).
La majorité des connaissances actuelles sur le
programmegénétiquedel’embryogenèsedesvégétaux
supérieurs provient de l’étude de mutants. De tels
mutants affectant le développement embryonnaire à
différents stades de développement ont été identiés
chez les plantes modèles Arabidopsis thaliana L. et
Zea mays L.ayantsubidifférentstypesdemutagenèse:
chimique, insertionnelle ou physique (Parinov et al.,
2000;Tilletal.,2004).Lesagentsmutagèneslesplus
utiliséssontl’ÉthyleMéthaneSulfonate(EMS)pour
lamutagenèsechimique,l’ADN-Tetlestransposons
pour la mutagenèse insertionnelle, les rayonsX et
gammapourlamutagenèsephysique(McElveretal.,
2001;Vernoudetal.,2005).
Arabidopsis
thaliana
Chez Arabidopsis, de nombreux mutants affectant
différents évènements au cours de l’embryogenèse
ontétéisolésparmutagenèseinduite.Deuxstratégies
complémentaires,baséessurlecriblagephénotypique
desiliquesimmatures(Meinke,1985)etdeplantules
engermination(Jürgensetal.,1991),ontétéemployées
and’isolerdesmutantsaltérésauniveaudelaphase
d’embryogenèse précoce. En fonction des données
issuesdecesdeuxapprochesdemutagenèse(chimique
etinsertionnelle),lenombredegènesessentielsaubon
développementdelagraineafaitl’objetd’évaluations.
Grâce à l’analyse d’un grand nombre de mutants
embryon-létaux, McElver et al. (2001) et Tzafrir
  Développement embryonnaire chez le génotype BAT93 de Phaseolus vulgaris L. — Embryo development in
Phaseolusvulgaris L. genotype BAT93.
Représentationschématiquedesprincipauxstadesdudéveloppementdel’embryondustade2cellulesàl’anthèseaustadecotylédonaire
âgéà12joursaprèsanthèse(JAA).Lesbarresà0et3JAAreprésentent100µm,à5et8JAA500µmetà12JAA1000µm—Schematic
drawing of key developmental stages of the embryo from the 2 cells stage at the anthesis to the late cotyledonary stage at 12 days after
anthesis (DAA). Scale bars at 0 and 3 DAA represent 100 µm, at 5 and 8 DAA 500 µm, and at 12 DAA 1,000 µm.