méth étude cycle

Méthode: utilisation de colorants en microscopie optique
l’hématoxyline
 un colorant basique et qui a une
affinité pour les molécules acides,
 met en évidence la répartition
de l’ADN, de l’ARN et des
protéines acides dans les cellules.
Méthode: utilisation de traceurs en microscope à fluorescence
Les événements morphologiques de la mitose.
Observation en microscopie à fluorescence de cellules
PtK1 fixées au glutaraldéhyde à divers stades de la
mitose puis perméabilisées et colorées.
Les microtubules (rouge: la rodamine fixée sur la
tubuline)ont été visualisés par des méthodes
d’immunofluorescence indirecte, et les chromosomes
(vert) mis en évidence par le colorant d’ADN Hoechst
33342. Échelle (I) : 10 μm.
A) Début de prophase
B) Fin de prophase
C) Rupture de l’enveloppe nucléaire et début de la prométaphase
D) Pro-métaphase
E) Fin de pro-métaphase
F) Métaphase
G) Anaphase
H) Télophase
I) Fin de mitose
(Tiré de CL Rieder & A Khodjakov, 1997. Mitosis and
checkpoints that control progression through mitosis in
vertebrate somatic cells. Progress in Cell Cycle Research,
vol. 3, avec la permission de Plenum Press, New York).
Les cellules endothéliales d’artères
pulmonaires de bovins colorées au DAPI
exposent leur noyau, seul compartiment
subcellulaire qui contient l’ADN.
Le cytosquelette d’actine (le « squelette »
de la cellule) est quant à lui coloré en vert
Par un Ac marqué à la fluorescéine..
Méthode: La cytophotométrie
La photométrie est une méthode de mesure, par des moyens optiques, de
concentration des substances colorées dans un milieu non opaque. C’est un
aspect de la densitométrie. La connaissance du volume de substance
traversée permet de déterminer les quantités. La cytophotométrie se
pratique au microscope sur des préaparations cytologiques (cellules ou
organites cellulaires). En ce sens la méthode est analytique et permet de
localiser les substances cibles au sein des structures biologiques comme
avec l’autoradiographie.
Protocol expérimental
Les cellules sont fixées puis marquées avec un colorant: l’acridine orange ou Hoescht 33258.
Cependant, la réaction nucléale de Feulgen est considérée comme la coloration type en
cytophotométrie:
Le principe de la méthode est de dissocier les deux brins d'ADN grâce à une hydrolyse ménagée
par l'acide chlorhydrique (HCl) et de colorer ensuite ceux-ci au moyen de la fuschine qui réagit
avec les fonctions réductrices de l'ADN.
 La concentration de colorant doit être proportionnelle à la concentration d’ADN.
 La culture est balayée par une lumière monochromatique
 La lumière émise est captée par une cellule photoélectrique qui mesure l’intensité de coloration
de chaque noyau.
 on peut ainsi obtenir pour chaque mesure l’image photo de la cellule étudiée et ainsi
déterminer son état selon sa quantité d’ADN.
 L’acridine orange est un composé organique.
 Il est utilisé comme un fluorescent cationique des acides nucléiques
 colorant sélectif utile pour la détermination du cycle cellulaire.
 Il interagit avec l'ADN et de l'ARN par intercalation ou attractions électrostatiques respectivement.
Permet l’analyse simultanée du contenu en ADN et en ARN des cellules:
intercalé à l’ADN
signal fluorescent vert (FL1)
fixé à l’ARN
signal fluorescent rouge (FL2)
Méthode: La cytométrie en flux
mesure de la quantité
d’ADN par cellule par
cytométrie en flux
la longueur des phases
du cycle cellulaire (G1,
S, G2 + M)
La progression des
cellules dans le cycle
Conditions:
 une population de
cellules sélectionnées par
le cytomètre (toutes dans
la même phase).
 Les cellules sont
cultivées en présence d’une
molécule fluorescente qui
se lie à l’ADN
A l’aide d’un cytomètre en
flux, on mesure la
fluorescence dans chaque
cellule.
Illustration de « Molecular Biology of the Cell »
Albert et al. Garland Publishing Inc.
Limites de l’analyse par cytométrie
Des informations multiples…..mais limitées :
Cellules en G0 et G1 confondues
Cellules en G2 et M confondues
On ne peut pas mesurer les cellules en S car
on n’observe pas de pic ?
Instantané (cliché) d’une population à un moment donné contenant des
informations multiples
Méthode: autoradiographie
Protocol expérimental
Certaines
Méthode: immunocytochimie
-Pour repérer la phase S, on utilise la bromodesoxyuridine (moins dangereuse que les marqueurs
radioactifs) qui s’incorpore dans l’ADN en réplication et que l’on révèle avec un anticorps marqué avec
un fluorochrome ou une enzyme (immnocytochimie).
- Le BrdU, peut être injecté chez l’homme Pour l’étude de certaines formes de cancer qui ont un cycle
cellulaire accéléré.
Seuls les
cellules en S
sont
marquées
ADN en
réplication
La BrdU a une structure analogue à celle de la
thymidine et s’incorpore dans l’ADN.
La dénaturation acide.
The Click-iT® EdU Assay from Invitrogen is a novel
alternative to the BrdU assay.
EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) provided in the kit is a
nucleoside analog of thymidine and is incorporated into
DNA during active DNA synthesis.
1 Detection is based on a click reaction, a coppercatalyzed covalent reaction between an azide and an
alkyne.
2
In this Click-iT® EdU Imaging Kits application, the EdU
contains the alkyne and the Alexa Fluor® dye contains
the azide.
The advantages of the Click-iT® EdU labeling are readily
evident while performing the assay.
The small size of the dye azide allows for efficient detection
of the incorporated EdU using mild conditions.
Standard aldehyde-based fixation and detergent
permeabilization are sufficient for the Click-iT®
detection reagent to gain access to the DNA. This is in
contrast to BrdU assays that require DNA denaturation
(typically using HCl or heat or digestion with DNase) to
expose the BrdU so that it may be detected with an
anti-BrdU antibody (Figure 1).