Dc production et controle_2010

Cellules dendritiques en
immunothérapie
anti-tumorale
Production et contrôle
U ité U917
Unité
MIcroenvironnement et CAncer
DIU Biothérapie
8 janvier 2011
MICA
Pr Karin TARTE
Unité INSERM U917
Faculté de Médecine, Rennes
UF SITI
CHU Pontchaillou, Rennes
La cellule dendritique (DC) –
Généralités
é é
é
• Localisation, phénotype, rôle très
variables
Sous-types (pDC, LC, CD14pos DC, CD141pos DC)
Stade de maturation
Contexte de son activation
IMMUNOGENE OU TOLEROGENE
• Cellule p
pivot de la réponse
p
immunitaire
adaptative et innée
• Cellule très rare in vivo (~10/l de sang)
Les DC myéloïdes comme cellules
pivot de la réponse immunitaire
NKT
TAM
Lpc B
T reg
NK
CROSSPRESENTATION
TCD4
TCD8
T
Cible
Capacités
p
fonctionnelles des DC myéloïdes
y
en fonction du stade de maturation
DC
immatures
DC matures
Ag bactériens
ou viraux
Récepteurs
Lectiniques
(CD205...)
Ag
RFc
TLR4 (LPS)
(LPS), TLR2 (lipoprotéines
(lipoprotéines, peptidoglycane...)
DC-SIGN (HIV,
M. tuberculosis...)
TLR8 (ARN simple brin,
brin imiquimod)
TLR3 (ARN dble brin)
NOD (dérivés
du peptidoglycane)
Ag
CD38
HMGB1
CD91
LOX
Hsp-Ag
v5
CCR1
CCR5
TNF, IL
IL-1,
1, IL
IL-6,
6,
CCL3, CCL4, CCL5
Cellule
apoptotique
Tissus (LC et DC intersticielles) :
Capture de ll’A
Ag
CD70
Signal de danger
Vaisseaux
lymphatiques:
Maturation
MFG-E8
CMH I
CD83
CMH II
DCLAMP
CD86
CD80
CCR7
IL-12
CCL21
CCL19
Ganglions (IDC):
Activation des
lymphocytes T
Schéma général d’organisation
du ganglion
Afferent lymphatic
vessels
Subcapsular
p
sinus
CXCL13
CC
CB
TFH
CXCL12
T cells
B cells
FRC
CCL19
CCL21
HEV
Katakai et al. J Exp Med
2004
Interaction T-DC
Mempel et al. Nature 2004;427:154
Cahalan et al. Semin Immunol 2005;17:442
Beltman et al. Immunity
y 2007;204:771
;
Environ 25 x 106 TCR de spécificités différentes
Chaque DC scanne 500 à 5000 T/h, si 100 DC portent l’Ag la probabilité de
rencontrer le T spécifique
p
q en 2 heures est de 95%
Quand Ag spécifique, contact prolongé plusieures heures puis
dissociation/prolifération T
Présentation de l’Ag
g aux lymphocytes
y p
y
B
par les DC
Présentation
aux lymphocytes T/CMH
Présentation
P
é
t ti
aux lymphocytes B
DC pulsées avec HEL
+ B Tgiques pour BCR
spécifique
é
de HEL (MD4)
= signal calcique
+ dextran-FITC
(marque HEV)
Qi et al. Science 2006;312:1672
Obtention des DC myéloïdes- 1
• Paramètres influençant les capacités fonctionnelles
intrinsèques des DC :
- Origine, méthode de purification des cellules de
départ
- Milieu de culture
- Cocktail/durée de maturation
- Etat du donneur (sain ou atteint de cancer)
- Congélation
QU’EST-CE QUI EST REINJECTE (DC tolérogènes)?
NECESSITE DE CONTROLES DE LA PRODUCTION
(définition de critères de libération de lots simples,
rapides, reproductibles)
UTILISATION DE REACTIFS GRADE CLINIQUE
VALIDATION PAR L’AFSSaPS + CPP
Obtention des DC myéloïdes- 2
• Certitudes (DC matures)
• Travail sur le cocktail de maturation
» Nouveaux agents en particulier ligands de TLR (poly I:C, dérivés
bacteriens., vaccins..) qui ne sont peut-être pas redondants ou autres
(CD40L...). ATTENTION TLR3L et chargement mRNA/électroporation
» Durée optimale de maturation (Phénomènes précoces/tardifs, DC
« exhausted »)
• Nouveaux travaux d’amonts,
d amonts, nouveaux critères de
qualification des DC (tenir mieux compte du
contexte in vivo et des interactions cellulaires)
• Autres types de DC
»
»
»
»
MO-DC obtenues en GM-CSF + IL-15
MO DC obtenues
MO-DC
bt
en IL-3
IL 3 ett IFN
IFN-

Utilisation de LC
Utilisation de DC CD141pos?
Obtention des DC myéloïdes - 3
• Différenciation
Diffé
i ti d
de monocytes
t in
i vitro
it
(MO-DC): méthode de référence
DC immature
DC mature
(irréversible)
MO
Cytaphérèse
+/- mobilisée
Etape
p 1
Purification
des monocytes
p 2
Etape
Différentiation
en iDC
Etape
p 3
Maturation
Ag tumoraux
à internaliser
(lysats, corps
apoptotiques,
ARN)
Peptides
CMH-restreints
Obtention des DC myéloïdes - 4
• Etape 1: purification des monocytes
MO
Cytaphérèse
+/- mobilisée
• Elutriation (taille et densité)
- Elutriateur Beckman
- ELUTRA®
Pureté > 80% en CD14
Rendement: environ 80% des CD14
5 x 109 cellules de départ
Enrichissement en PN, faible taux
de GR au dépa
p rt
• Adhérence (cyta mobilisée,
CellFactories, contam B++ et NK)
(CliniMacs®
• Billes magnétiques CD14 (CliniMacs®,
cout++)
Obtention des DC myéloïdes -5
5
• Etape
Et
2:
2 diffé
différentiation
ti ti en iDC
DC immature
MO
Contrôles::
Contrôles
Culture 5 à 6 jours (proto 48h)
Milieu
RPMI, X
X-VIVO,
VIVO, AIMV
SVF, SAB, PA, HSA
GM-CSF +
IL-4 ou IL-13
IFN-
IL-15
GM-CSF + IL-3
IL-3 + IFN-
Phénotypage (CD14, CD19, CD3, CD83, CD86, CD80, ...)
Capacité d’endocytose/Phagocytose
d endocytose/Phagocytose de produit marqué
Obtention des DC myéloïdes -6
6
• Etape
p 3: m
maturation des DC
DC mature
(i é
(irréversible)
ibl )
DC immature
i
!
Contrôles::
Contrôles
6 – 48 heures
TNF +
IL 1 IL
IL-1,
IL-6,
6 PGE2
Poly (I:C) +/- PGE2
autres ligands des TLR
éventuellement en association
(disponibilité ! Réponse anti-virale!)
Vaccins (BCG, Typhim,
Influvac) + PGE2
IL-1, poly (I:C), IFN-, IFN-
Phénotypage (CD14, CD83, CD86, CD80, CD70, CCR7 ...)
Activation T (prolifération,
(prolifération polarisation Th1)
Synthèse de cytokines +/+/- CD40L (IL(IL-10, IL
IL--12 +/+/- ILIL-23, IL15/IL
IL15/IL--15R)
Migration en transwell (CCL19, CCL21)
Irréversibilité de la maturation (reculture)
Autres (IDO +/+/- IFN, survie, interaction DC
DC--NK, interaction DCDC-T
reg, interaction DCDC-T....)
Quelques éléments
o Elutriation
El t i ti pour purification
ifi ti d
des monocytes
t
(>> adhérence)
o Culture en RPMI-2% albumine humaine (mais
problématique des lots) en présence de GM-CSF et IL-4
o Maturation courte (6-12h) avec cocktail Schuler (TNF,
IL-1, IL-6, PGE2) ou activation des TLR (TNF + poly(I:C))
o Congélation DC « matures » (charge avant pour Ag non
connus,, charge
g après
p
pour
p
peptides)
p p
)
o Un aliquot décongelé pour tests fonctionnels
o Garder de l’ARN pour évaluations ulterieures (puces, Q
PCR) ex: Delta-4/Jagged-1, DAP12/IRF-8, IL-6....
Autres méthodes d’obtention


Purification à partir du sang par gradients de
densité au metrizamide ((traitement p
par FLT3L
augmente le nombre de DC circulantes)
Différenciation
ff
in vitro de CSH CD34pos
purifiées
8-11 j
CD34+
Billes magnétiques
g
Cytaphérèse mobilisée
GM CSF
GM-CSF
TNF
SCF ou Flt3L
+/- IL-4 ou TGF-
Mélange de LC
+ DC intersticielles
Pas de stade immature vrai (TNF obligatoire dès le départ)
Etape de charge par l’antigène
l antigène
Ag tumoral connu:
A.
Cellule tumorale
• Peptides CMH –restreints
(plusieurs classe I et ajout
peptides classe II)
• Peptides modifiés, peptides
xénogéniques
• Protéines/Longs peptides
• ADNc (adénovirus, lentivirus)
Ag tumoral inconnu:
• Elution de peptides tumoraux
• Lysats cellulaires
• Cellules apoptotiques ou nécrotiques (attention à la
méthode d’induction de la mort) +/- ciblage des RFc
• ARN (possibilité d’ajout de mol costim…)
• exosomes
• Charge in vivo (injection intratumorale ou targetind DC)
AUTOLOGUE ou ALLOGENIQUE
CMH I
CD80
CD86
DC
B
B.
Fusion
Transfert de mb
+
Cellule tumorale
Auto ou allo
C.
DC
+
LMC, LAM
Différenciation
ff
GM-CSF
IL-4
TNF ou CD40L
+/- agents pharmacologiques
Injection
j
au
stade mature
(migration gg)
CMH II
Ag tumoral ++
Costimulation ++
Production
d’exosomes
Utilisation de corps apoptotiques
Tumeur
-irradiation
MM
Anti-CD138
Anti-CD20
Dhodapkar et al. J Exp Med 2002 195:125
Dhodapkar et al. PNAS 2002 99:13009.
Franki et al. Blood 2008 111:1504.
TIL
FL
RFc
Maturation
DCm
MM
DCi
FL
Efficacité >
Id KLH
Id-KLH
Contrôles
ô
liés
é à l’antigène
è

Ag peptidique



Ag non connu





Activation de clones T, IVS
Ch
Chargement
de
d chaque
h
peptide
id sur des
d DC différentes
diffé
Difficulté de qualification des DC (et de suivi)
Mais ce qu’on sait mesurer n’est pas forcément le plus
intéressant
CQ de la préparation tumorale autologue (pureté des
populations tumorales, viabilité, quantité)
CQ de lignées allogéniques (cultures contrôlées,
contrôlées absence
de contamination bact, virale, mycoplasme... Organismes
agréés)
Adj
Adjuvant
nt (consensus
( ns ns s = KLH
KLH, stade
st d imm
immature)
t
)
Contrôle
ô de la migration in vivo

Marquage des DC à l’ 111In-oxine (stable)
Intradermique
Intranodal
Intralymphatique
Quillien V et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005 32:731.
Contrôle
ô de la migration in vivo

Marquage des iDC avec des particules
superparamagnétiques de fer et IRM
(études + fines)
De Vries IJ et al. Nat Biotech 2005 23:1407
Contrôle
ô de la migration in vivo

Problème de la migration des T activés in
vivo
Site de priming conditionne le site de migration
((mucosal versus p
peripheric
p
LN))
Dû aux DC (Mora et al. Nature 2003; 424:88)
Dû aux FRC (Hammerschmidt et al J Exp Med 2008; 205:2483)
 Site de priming joue sur le type de réponse induite
(CLN=Tolérance; MLN/PLN=Pas de tolérance)
 Problème de recrutement des Teff vers et au sein
de la tumeur
 Expression de CXCR3 sur TCD8 dans le mélanome
est associée à la survie (Mullins et al Cancer Res 2004; 64: 7697)

Prélèvements aphérèse
LAM-1
Ficoll (si poly >5%)
Arret si poly ≥ 15%
Analyse 1 :
Num lame
CD14
CD3
TOPRO-3
Purification
Par élutriation
Lymphocytes
Congélation pour I Monitoring
Analyse 2 :
Monocytes
2.106 cellules/ml
Num/formule
CD14, CD3
CD19 CD56
CD19,
TOPRO-3
Milieu RPMI – Alb Hum 2%
GM-CSF + IL-4 (200 U/ml)
iDC
5 x 106 pour ARN
Analyse 3 :
Validation I
Phagocytose
g y
(3-4 h. )
Maturation
mDC
Congélation en poches
5.106 cell/ml
Cellules tumorales Apopt.Autologues (1:1)
+ KLH (25µg/ml)
(25 / l)
Milieu RPMI – Alb Hum 2%
TNF (40ng/ml)
Poly I:C = Ampligen = 50µg/ml
IL-1 ((25 ng/ml)
g )
(12 heures)
+
Num Malassez + Coulter
TOPRO-3, CD86, CD83, CD14
CD80, HLA-DR, HLA-ABC, CD40
CCR7, CD208, CD3
+
4 x pour vaccin (> 10 x 106/injection – ID)
1 x monitoring à la décongélation
1 x stock sécurité
Analyse 4 :
Validation II
Num Malassez + Coulter
TOPRO-3, CD86, CD83, CD14
CD80, HLA-DR, HLA-ABC, CD40
CCR7, CD208, CD3
LAM-2
Analyse 5:
Validation III
5 x 106 pour ARN
Num Malassez + Coulter
TOPRO 3 CD86,
TOPRO-3,
CD86 CD83,
CD83 CD14
CD80, HLA-DR, HLA-ABC, CD40
CCR7, CD208, CD3
Migration en réponse à CCL21
Polarisation Th1/Th2 (TCD4 naïfs)
Stimulation CD40L
Dosage IL-12,
IL-12 IL-10
IL-10, IL-15
Reculture 24 heures sans cytokine
TOPRO-3, CD86, CD83, CD14
CD80 HLA-DR,
CD80,
HLA DR HLA-ABC,
HLA ABC CD40
CCR7, CD208, CD3
Migration en réponse à CCL21
Essai bicentrique Nantes-Rennes (initiation Marc Grégoire)
Et au final.... -1






Réponses immunitaires de + en + importantes
(essai 1 Schuler) donc DC immunogènes sans
réponse
é
s clinique
li i
Optimisation des DC via l’amélioration des
connaissances fondamentales
Optimisation de la charge par l’Ag in vitro ou in
vivo
Optimisation des conditions d’injection (site
PRECIS,
E
, dose,, fréquence)
f q
)
Optimisation du monitoring
Problème de la standardisation des essais
(Figdor et al. Nat Med 2004 5: 475-480)
Et au final....
final
-2
2


Résultats préliminaires encourageants sur petits
essais
Agrément
gr m nt par la
a FD
FDA du
uS
Sipeucel-T
p uc
(Dendréon)
(D
n r on)
en avril 2010 pour K prostate = PBMC + GM-CSF-
PAP 36h suite à essai phase III randomisé
multicentrique (512 pts) démontrant
dém ntr nt amélioration
méli r ti n de
la médiane de survie/placebo de 4.1 mois (25.8 vs
21.7,, Kantoff et al NEJM 2010; 363:411)


Plus de 300 papiers publiés sur plus de 4500 pts
sans efficacité clinique
q
Essai phase III de Schuler multicentrique dans
mélanome vs dacarbazine = echec mais qualité
vaccinale
i l mauvaise
i
Et au final.... -3
3

Le contexte vaccinal

Optimisation de la migration vers les ganglions par
pré-conditionnement par cytokines ou ligand de TLR
comme imiquimod en topique
(Martin-Fontecha
(M
i F
h et al.
l JE
Exp M
Med
d 2003 198:
198 615
615-621;
621 N
Nair
i et al.
l JI
Immunoll 2003;
2003
171:6275)


Activation NK
A ti ti NKT en chargeant
Activation
h
t les
l DC par de
d l’l’
galactosylceramide (Nieda et al. Blood 2004 103: 383-389 Chang et al. J Exp
Med 2005 201: 1503-1517)

Activation T en stimulant les DC par
aminobisphonates (Fiore et al. Blood 2007 110: 921-927)
Et au final.... -4
4

Le contexte vaccinal

Elimination des T rég





Cyclophosphamide faible dose (Lutsiak et al. Blood 2005 105:2862-2868; Ghiringhelli et al. Cancer
Immunol Immunother 2007 56:641-648)
Ontak (IL2/DTT) et PAS Daclizumab (anti-CD25) car ½ vie longue empêche l’émergence de T efficaces
(Jacobs et al Clin Can Res 2010; 16
16: 5067)
Fludarabine (Beyer et al. Blood 2005 106: 2018-2025)
Anti-CTLA4 (Sanderson et al. JCO 2005 23:741-750; Ribas et al. JCO 2005 23:8968-77).
ATTENTION AUTO-IMMUNITE, effet médié par Treg?
Inhibition du TGF-d
TGF- d’IDO
IDO (1-MT)
(1-MT), du métabolisme
de l’arginine (Viagra, nitroaspirine), de PD-1, de
STAT3...
Demain = targeting des DC in vivo?
Nouvelles opportunités avec DC CD41pos qui expriment XCR1
CPP
Pro
omotio
on
AFSS
SaPS
Conclusion
Services cliniques
Service préleveur
Production
des DC
Immunomonitoring
CQ
des DC
UTC
Développement pré-clinique
(Structure de transfert
multidisciplinaire)
AFSSaPS

Description du procédé
(matières premières = PTA +
consommables, méthodes, lieux)





et des contrôles:
Produit cellulaire de départ (site de prélèvement, mode
opératoire, transport, validation)
P d it iintermédiaires
Produits
t
édi i
((quand
d –iDC,
iDC mDCDC comment)
t)
Produits finis (quand –mDC chargées décongeléescomment)
Administration (transport, stabilité)
Renseignements
g m
relatifs
f aux données noncliniques et cliniques
- Chirurgie
- Radiothérapie
- Chimiothérapie
N
Nouvelles
ll stratégies
é i
- Blocage T régulateurs
(cyclophosphamide,
(cyclophospham
de, Ontak...)
- Activation des T effecteurs
(anti-OX40…)
g molécules suppressives
pp
- Blocage
(IDO, arginase, TGF-CTLA4,
STAT3...)
- Targeting DC in vivo
Immunothérapie conventionnelle
- Administration
Ad i i t ti d
de cytokines
t ki
- Anticorps anti-tumeur
- Vaccination peptidique
- Vaccination
Vaccinati n dendritique
- Transfert de T spécifiques
( CTL, T...)
Thérapeutique combinatoire