La résistance aux antibiotiques des germes bactériens isolés à été

Bull. Inst. Natn. Scien. Tech. Mer de Salammbô, Vol. 33, 2006
75
ETUDE DE LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES DES BACTERIES ISOLEES
DE MYTILUS GALLOPROVINCIALIS.
Kaouthar BOUAMAMA*, M. EL BOUR, R. MRAOUNA et A. EL ABED.
*Institut National des Sciences et Technologies de la Mer
28, Rue 2 Mars 1934, 2025 Salammbô- Tunisie
E-mail : [email protected]
Mytilus galloprovincialis )( 70
12 Propioni acnesAeromonas hydrophila
Mytilus galloprovincialis25
RESUME
L’étude des résistances vis-à-vis de différentes substances antibiotiques pour des espèces bactériennes (aérobies
et anaérobies) isolées chez Mytilus galloprovincialis a été réalisée par la méthode standard de l’antibiogramme.
Ainsi, 50 souches bactériennes aérobies et 20 souches anaérobies appartenant à plus de 25 espèces différentes
ont été isolées et testées. Les résultats obtenus montrent des profils à plusieurs résistances vis-à-vis des
différentes familles d’antibiotiques testés. Les résultats obtenus révèlent des profils à 12 résistances différentes
notamment chez l’espèce anaérobie (Propioni acnes). Aussi, chez l’espèce aérobie pré dominante ( Aeromonas
hydrophila) nous avons mis en évidence au moins 6 antibiotypes différents. Ces résultats montrent la
prépondérance de bactéries multirésistantes aux antibiotiques hébergeant dans la moule Mytilus galloprovincialis
prélevée d’un milieu naturel (la lagune de Bizerte).
Mots clés : Mytilus galloprovincialis, bactéries, profil de résistance aux antibiotiques, lagune de Bizerte.
ABSTRACT
Study of the antibiotic resistance of bacteria isolated from Mytilus galloprovincialis : The sensitivity of
various aerobic and anaerobic bacterial species isolated from Mytilus galloprovincialis to different types of
antibiotics. Thus, sensitivity of 50 aerobic and 20 anaerobic species was tested to 15 antibiotics including
(betalactams, aminosids, cephalo porins, phenicols, cyclins, macrolids, nitrofurans, sulfamids, rifamycins).
According to results obtained, all strains tested demonstrate resistances profiles to 3 to 12 antibiotics tested.
Multi resistant profiles to 12 different antibiotics were detected for the anaerobic species (Propioni acnes). For
the main aerobic species isolated, Aeromonas hydrophila we described more than 6 different antibiotypes.
According to these results, it seems that the multi resistant antibiotic bacteria were well spread in Mytilus
galloprovincialis brought from natural Tunisian lagoon ecosystems (Lagoon of Bizerta)..
Key words: Mytilus galloprovincialis, resistance profile, Bizerta Lagoon.
INTRODUCTION
L'utilisation fréquente des produits antibiotiques en
aquaculture ainsi que le rejet en eau de mer des
populations bactériennes diverses sont considérées
comme facteurs principaux de l’augmentation de la
fréquence de micro-organismes résistants aux
antibiotiques dans l’environnement aquatique et
côtier (Aviles et al., 1988).
Les bivalves filtreurs peuvent être indirectement
infestés par ces germes multi résistants notamment du
groupe des Entérobactéries qui constituent la part
anthropique prépondérante des rejets pour les
espèces (Enterobacter, Aeromonas, Vibrio,
Salmonella). L’utilisation accrue des antibiotiques en
aquaculture côtière ainsi que les rejets en mer d’eaux

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usées épurées n’est pas sans incidence sur l’arrivée en
ces zones de différentes populations de bactéries
multi résistantes (El Bour et al, 2004). En dépit d’une
anthropisation accrue sur ses berges, la lagune de
Bizerte héberge la totalité des stations mytilicoles
tunisiennes (Dellali et al, 2000). En vue d’évaluer la
fréquence de multi résistance chez les populations
bactériennes associées à M.galloprovincialis de la
lagune de Bizerte, nous avons entrepris d’identifier
ces différentes espèces bactériennes aérobies et
anaérobies et de déterminer leurs profils de résistance
vis-à-vis des différentes familles d’antibiotiques
Dans le cas de cette étude, nous décrivons les
différents profils de résistance aux antibiotiques des
bactéries isolées de la moule méditerranéenne Mytilus
galloprovincialis prélevée dans un écosystème
tunisien côtier : la lagune de Bizerte.
MATERIEL
Prélèvement des moules : Mytilus galloprovincialis
provient de 3 stations mytilicoles de la lagune de
Bizerte: Echaara (CH), Ferme Mytilicole de Bizerte
(FMB), Menzel Jemil (MJ). Les prélèvements
mensuels (5 individus/site) ont été effectués pendant
6 mois (de Mars à Septembre) de l’année 2001
(Figure 1).
METHODES
Préparation des échantillons et isolement
bactérien :
Les différents prélèvements de moules sont
maintenus au frais jusqu'à leur arrivée au laboratoire
dans 2 h à 4h qui suivent l’échantillonnage. Au
laboratoire, les analyses sont effectuées le jour même.
Ainsi, les échantillons sont rincés, essuyés avec de
l’alcool et stérilisés à la flamme au préalable d’être
ouverts. La masse molle (un prélèvement de 5
individus) est broyée et les différents types de
populations bactériennes sont isolées par technique de
cultures sélectives et d’épuisement utilisant des
milieux standards sélectifs: MaConkey, Tryptocase
Caseine Soja, Thiosulfate Bile Sucrose, Gélose au
Sang et Gélose Chocolat (Hariharan et al., 1995).
Identification des différentes espèces bactériennes : Les
différentes espèces de bactéries aérobies et anaérobies
mésophylles (poussant à des température entre 24 et
32C°) a été réalisé au moyen de tests morphologiques
(types de colonies, coloration de Gram) ainsi que les
tests biochimiques : détermination d’enzymes
respiratoires (catalase et oxydase) ainsi ainsi que
l’utilisation des systèmes : Api 20E, 20NE, Rapid
32A (Hariharan et al., 1995)..
Figure1 : présentation de la lagune de Bizerte avec les sites de prélèvements : CH, MJ et FMB.

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Détermination du profil de résistance aux
antibiotiques
Effectuée selon la technique de l’antibiogramme
(Chabbert, 1982). Pour chaque type de bactérie
isolée, une préculture (24 h en bouillon TSB) est
diluée au ½ en eau physiologique. La préparation est
utilisée pour inonder des boites gélosées Mueller
Hinton. Le surplus est aspiré et Les boites ainsi
préparées sont séchées pendant 20mn avant de
déposer les disques d’antibiotiques à la surface
gélosée. Après incubation de 18 à 24h à 37°C, la
lecture est faite en mesurant les diamètres
d’inhibition en mm. Pour chaque antibiotique, le
diamètre lu est comparé aux diamètres critiques D
(diamètre maximal) et d (diamètre minimale) pour
déterminer si la bactérie est sensible ou résistante à
l’antibiotique. Les antibiotiques utilisés appartiennent
à 9 familles différentes et sont les plus utilisés dans
l’étude de la résistance des bactéries.
Pénicillines : Pénicilline (P)(6g), Amoxicilline
(AMX)(25g), Oxacilline (OX)(5g), Céphalosporines :
Céfoxitines (FOX)(30g), Céftriaxone (CRO)(30g),
Aminosides : Streptomycine (S)(10UI), Tobramycine
(NN)(10g), Néomycine (N)(30UI),
Phénicols : Chloramphénicol (C)(30g),
Tétracyclines : Tétracycline (TE)(30UI),
Nitrofuranes : Furanes (FM)(300g),
Sulfamides : Triméthoprime-sulfamide (SXT)(1,25
+23,75g),
Rifamycines : Rifampicine (RA)(3030g), acide
oxolinique (AR)(10g),
Macrolides: Oléandomycine (OL)(15UI).
RESULTATS
1- Les différentes espèces bactériennes présentes
chez Mytilus galloprovincialis
Par méthodes d’épuisement sélective, nous avons pu
identifier 50 souches de bactéries aérobies qui
appartiennent à 20 espèces différentes. Les espèces
les plus fréquentes sont : Aeromonas hydrophila
(31%), Enterobacter sakazakii (15%) et
Pseudomonas cepacia (13%) (Tableau N°I et II).
L’ensemble de ces espèces appartient essentiellement
au groupe des Entérobactéries (48 souches). Les
espèces non entérobactéries sont restreintes à deux
souches : 1 souche de V.alginolyticus et une souche
de V. paraheamolyticus. Par ailleurs, 20 souches
anaérobies ont été isolées. Ces bactéries
appartiennent à 6 espèces différentes dont l’espèce
dominante est Proprionibacterium acnes (65%) et
Clostridium perfringens (15%). Les espèces :
Clostridium bifermentans, Actinomyces meyeri,
Capnocytophaga spp, et fusobacterium necrophrum
sont représentées chacune par une seule souche.
(Tableau N°III).
2- Caractérisation antibiotypique des espèces
bactériennes identifiées chez Mytilus
galloprovincialis
Les résultats obtenus concernant les différentes
fréquences de résistance antibactérienne ainsi que les
différents antibiotypes pour les différentes
populations aérobies et anaérobies sont représentés
dans la Figure N°2 et le Tableau N°IV. Les résultats
obtenus montrent que les antibiotypes des bactéries
aérobies identifiées comptent des multi résistance
allant de 3 à 11 antibiotiques différents. Parmi ces
profils, c’est l’antibiotype à 8 résistances qui est le
plus commun. Ce sont des résistances aux
bétalactamines, aminosides et macrolides en plus des
cyclines. Pour les bactéries anaérobies, les
antibiotypes révélés comptent des multi résistances
allant de 6 à 12 antibiotiques différents. Ce sont les
profils à 7 et 9 antibiotiques qui sont les plus
communs. Pour toutes les espèces identifiées, il
semblerait que ce sont les sulfamides, les furanes et le
phénicols qui demeurent les plus efficaces.
DISCUSSION
La moule Mytilus galloprovincialis est un bivalve à
large répartition méditerranéenne. En Tunisie, la
production mytilicole est assez importante surtout au
niveau de la lagune de Bizerte et représente 94% de
l’ensemble des bivalves. Les travaux intéressant
l’étude des populations bactériennes associées aux
moules sont restreintes à l’étude de Chakroun (1964)
et en Tunisie Dellali et al. (2000-2001a-b) et Dellali
(2001).
Les résultats obtenus par Dellali (2001) sur les
bactéries associées à Mytilus galloprovincialis au
niveau de la lagune de Bizerte décrivent une
prédominance d’Aeromonas hydrophila (82.24%)
comme le démontre notre étude suivi d’autres
espèces : Vibrio parahaemolyticus (10.68%),
Aeromonas sobria (4.5%) et Vibrio vulnificus
(2.2%).Beaucoup de travaux cependant, ont souligné
la dominance des Vibrionacaes (Toti et al.,1996),
(Bouchriti et El Marrakchi, 1995), (Harriharan et al.,
1995), (Kiiyukia et al., 1989), (El Sahn et al., 1982),
(Alonzo et al., 1981). Les études antérieures des
populations bactériennes anaérobies sont restreintes à
celles de Dellali et al. (2001), qui a détecté la
présence de Clostridium perfringens chez les moules
de la lagune de Bizerte, et Harriharan et al. (1995) qui
a décrit chez Mytilus
edulis les espèces suivantes : Clostridium difficile
(15%), Clostridium sporogenes (13%), Bacteroides
buccae et Fusobacterium……………………………….

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Tableau I: Caractéristiques biochimiques des espèces aérobies identifiées par système Api 20E
Souches
OX
CAT
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
F %
Aeromonas hydrophila
+
+
+
+
-
-
v
-
-
+
v
v
+
+
+
-
-
-
v
v
+
+
31
Enterobacter sakazakii
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
v
+
v
+
+
+
-
+
+
+
+
+
15
Pseudomonas cepacia
+
+
v
-
v
v
-
-
-
+
-
v
+
-
-
-
-
-
-
-
-
13
Aeromonas salmonicida
+
+
-
+
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
v
-
4
Bordetella alcalignes spp
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
Enterobacter cloacae
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
4
Pseudomonas aeruginosa
+
+
-
+
-
v
+
v
+
+
-
+
v
+
-
-
-
-
-
+
-
v
4
Pseudomonas fluorescens
+
+
-
+
-
-
+
-
v
v
v
v
v
+
-
-
-
v
-
+
+
v
4
Aeromonas sobria
+
+
+
-
-
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
2
Enterobacter amnigenus
+
+
+
-
-
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
2
Klebsiella ornithinolytica
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
Klebsiella oxytoca
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
Listonella damsela
+
+
-
+
+
+
-
-
-
+
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2
Klebsiella pneumoniae
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
Pasteurella spp
+
+
+
+
-
+
-
-
-
+
-
+
+
-
-
-
+
-
+
-
-
-
2
Salmonella arizonae
+
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
-
+
2
Serratia liquefaciens
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
Sphingomonas multivorum
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
2
Tot. Souches
48
Légende :
(+) : réponse positive au test; (-) réponse négative au test ; (v) : réponse variable au test.
OX: oxydase; CAT: catalase; ONPG: ortho-nitro-B-D-galactopyranoside; ADH: arginine; LDC:lysine; ODC: ornithine; CIT: citrate de sodium;
H2S:thiosulfate de sodium; URE: urée; TDA: tryptophane; IND: tryptophane; VP: créatine pyruvate de sodium; GEL: gélatine de Kohn,
GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; SAC: saccharose; MEL: melibiose; AMY: amygdaline;
ARA: arabinose.
Tableau II: Caractéristiques biochimiques des espèces aérobies identifiées par systèmes Api 20NE
Souches OX
CAT
NO3 TRP GLU ADH URE ESC GEL PNG GLU ARA MNE MAN NAG MAL GNT CAP ADH
MLT
CIT PAC
Vibrio alginolyticus + + + + + - - + + - + - + + + + + - - + + -
Vibrio parahaemolyticus + + + + + + + + + + + - + + + + + - - + + -
Légende: (+) : réponse positive au test; (-) réponse négative au test ; (v) : réponse variable au test.
OX: oxydase; CAT: catalase; NO3: nitrate de potassium; TRP: tryptophane; GLU: glucose; ADH: arginine; URE: urée; ESC: esculine; GEL: gélatine;
PNPG; p-nitrophényl-B-D-galactopyranoside; GLU: glucose; ARA: arabinose; MNE: mannose; NAG: N-acetyl-glucosamine; MAL: maltose;
GNT: gluconate; CAP: caprate; ADI: adipate; MLT: malate; CIT: citrate; PAC: phényl-acétate.

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Tableau III : Caractéristiques biochimiques des bactéries anaérobies identifiées par système Api ID 32A
Souches
OX
CAT
URE
ADH
αGal
βGal
βGP
α Glu
βGlu
αAra
βGur
βNAG
MNE
RAF
GDC
α Fuc
NIT
Proprioni acnes
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
+
v
-
-
-
+
C. perfringens
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
C.bifermentans
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
Actinomyces meyeri
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
-
-
+
-
F. necrophorum
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
Capnocytophaga spp
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
suite des tests :
IND
PAL
ArgA
ProA
LGA
PheA
LeuA
PyrA
TyrA
AlaA
GlyA
HisA
GGA
SerA
F %
Proprioni acnes
+
+
+
+
-
-
+
-
-
+
+
-
-
-
65
C. perfringens
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
15
C.bifermentans
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5
Actinomyces meyeri
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
-
+
5
F. necrophorum
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5
Capnocytophaga spp
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
5
Total des souches
20
Légende: (+) : réponse positive au test; (-) réponse négative au test ; (v) : réponse variable au test.
OX: oxydase; CAT: catalase; URE: urease; ADH: arginine dihydrolase; αGAL: alpha GALactosidase; βGAL: beta GALactosidase;
βGP: beta GALactosidase 6 phosphate; α GLU: alpha GLUcosidase; βGLU: beta glucosidase; α ARA: alpha arabinosidase; βGUR: beta GlucURonidase;
βNAG: beta-N-Acetyl-Glucosaminidase; MNE: MaNnosE; RAF: RAFinose; GDC: ac. Glutamique DeCarboxylase; α FUC: alpha FUCosidase; NIT: nitrate;
IND: indole; PAL: Phosphate Alcaline; ArgA: arginine Arylamidase; ProA: Proline Arylamidase; LGA: Leucyl Glycine Arylamidase; PheA: Phenylalanine
arylamydase; LeuA: Leucine Arylamidase; PyrA: Ac.Pyroglutamique Arylamidase; TyrA: Tyrosine Arylamidase; AlaA: Alanine ;
Arylamidase; GlyA: Glycine Arylamidase; HisA: Histidine Arylamidase; GGA: Glutamyl ac. Glutamique Arylamidase; SerA: Serine Arylamidase.