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Cours et TP de microbiologie générale MICROBIOLOGIE GENERALE AM Davila, M Naïtali et C Tinsley 1ère année – 2014/2015 Cours/TP Demi promo A Demi promo B Cours 1 11 sept 11 sept Cours 2 11 sept 11 sept TP 1 18 sept 12 sept TP 2 19 sept 13 sept TP 3 20 sept 16 sept Cours 3 26 sept 26 sept Cours 4 27 sept 27 sept 2 salles de TP (CBAI, Bioger) Blouse en coton si possible, cheveux attachés • Enseignement du bloc « Sciences de la Vie et du Milieu ». • Pré-requis : bases solides en biologie générale, biochimie, génétique et biologie moléculaire. Principales références utilisées • Physiologie de la cellule bactérienne : une approche moléculaire Objectifs du cours de microbiologie FC Neidhardt, JL Ingraham, M Schaechter • Bases qui seront utilisées dans d’autres parties du tronc commun et dans les modules intégratifs. • Structures, génétique, métabolisme et physiologie. • Interactions avec les autres composants de la biosphère (biotiques et abiotiques). Rôle dans l’équilibre écologique de la planète. Importance dans les activités humaines. • Cours de microbiologie générale A Meyer, J Deiana, A Bernard • LM Prescott , JP Harley, DA Klein • Molecular genetics of bacteria L Snyder et W Champness • Microbial ecology Objectifs des TP de microbiologie R Atlas et R Bartha • Mettre en pratique quelques unes des principales méthodes expérimentales utilisées en microbiologie. • Etude d’un transfert génétique entre bactéries (conjugaison). • Identification d’une souche bactérienne, étude de sa morphologie et de son métabolisme. Bloc SVM Microbiologie • Bacterial metabolism G Gottschalk • Microbiology webbed out T Paustian et U Wisconsin • Microbes-edu.org 1 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Classification des organismes cellulaires Programme du cours • • • • • • Introduction Spécificités structurales des procaryotes Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines ANIMAUX PLANTES EUCARYOTES PROTISTES micro-algues protozoaires levures moisissures FUNGI Domaine de la microbiologie PROCARYOTES EUBACTERIES ARCHAE Grandes caractéristiques du monde microbien Méthodes expérimentales Illustrées dans les travaux pratiques •Petite taille Invisibilité Possibilité de dissémination Rapport surface/volume élevé, capacités d’échange élevées Simplicité des structures cellulaires • Etude des individus isolés : difficile – Observations microscopiques (photonique, électronique, après ou non coloration ou marquage) – Cytométrie de flux (auto-fluorescence, gfp, marqueur de viabilité) • Etude sans culture préalable •Diversité morphologique • Etude après propagation : souvent nécessaire – Techniques de culture, d’isolement et de dénombrement •Diversité taxonomique • Techniques de manipulation aseptique •Diversité physiologique et métabolique Bloc SVM 2 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Classification des organismes cellulaires Programme du cours Arbre phylogénétique de Woese • Introduction • Spécificités structurales des procaryotes Bactéries à Gram - – Morphologie bactérienne (taille, forme, arrangement) – Structures des cellules bactériennes • • • • Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines Firmicutes (Gram + à bas % G+C) Actinobactéries (Gram + à haut % G+C) Taille des microorganismes Forme et arrangement des microorganismes entre eux Forme sphérique coque Protozoaires 1 mm Spirochètes 0,2 à 0,7 x 5 à 500 µm - diplocoques (b) - streptocoques (a) - tétrades (c) - sarcines (d) - staphylocoques (e) Cellules sanguines Levures 10 µm Forme en bâtonnet Escherichia coli 0,5 x 2 à 3 µm Bactéries 1 µm P = 10-12 g, d=1 Virus 0,01 µm Mycoplasma pneumoniae 0,1 µm Filtration stérilisante bacille vibrion Forme hélicoïdale ou vibroïde Forme spiralée spirille spirochète Forme mycénienne mycobactérie actinomycète Bloc SVM 3 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Neisseria gonorrhoeae E coli Les bacilles et vibrions Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus Clostridium Pseudomonas Salmonella Vibrio Staphylococcus Lactobacillus Listeria Bacillus Les coques des streptocoques Les formes spiralées spirochète Campylobacter jejuni Les formes hélicoïdales Treponema pallidum Helicobacter pilori Borrelia burgdorferi Bloc SVM 4 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Les formes mycéniennes Programme du cours actinomycète • Introduction • Spécificités structurales des procaryotes – Morphologie bactérienne (taille, forme, arrangement) – Structures des cellules bactériennes • • • • Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines Propionibacterium Des éléments constants et d’autres non La cellule procaryote La paroi bactérienne Enveloppe caractéristique des procaryotes Barrière à la diffusion de certaines molécules Résistance à la pression osmotique (5 à 20 atm) Forme (exosquelette) Cytosquelette de B. subtilis Sphéroplaste d’E. coli Protéines MreB, cytoplasmiques, analogues aux filaments d’actine des cellules eucaryotes Bloc SVM 5 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Coloration de Gram Paroi des bactéries à Gram positif Lactobacillus sp. Bactéries à Gram positif (firmicutes, actinobactéries) (20 à 80 nm) à Gram négatif (protéobactéries) Paroi des bactéries à Gram négatif (enveloppes cellulaires) (5 à 8 nm) Caractéristique constante dans un genre donné (8 à 15 nm) Escherichia coli Différence de structure Différence de composition chimique (1 à 3 nm) Le peptidoglycane une structure constante mucopeptide ou muréine ou mucocomplexe / DAP NAG : N-acétylglucosamine NAM : acide N-acétylmuramique DAP : Acide mésodiaminopimélique •liaisons glycosidiques ß1-4 entre NAM et NAG •ordre invariable des acides aminés du tétrapeptide (pentapeptide) •existence des formes D des acides aminés •pontage entre la D-alanine et L-lysine Bloc SVM Pontage entre la D-alanine et L-lysine direct ou par des ponts inter-peptidiques 6 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Coloration de Gram Gram positive Gram negative G : N-acétylglucosamine M : acide N-acétylmuramique La paroi des bactéries à Gram positif Acide teïchoique = déterminant antigénique charge de surface adhésion, récepteur Bloc SVM Les enveloppes cellulaires des bactéries à Gram négatif Porines (protéines majeures) = diffusion des molécules < 600 Da Autres protéines (protéines mineures) = transport des molécules > 600 Da LPS et phospholipides = diffusion des molécules hydrophobes 7 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Espace périplasmique Le LPS : une endotoxine Antigène somatique • Significatif chez les bactéries à Gram négatif • Contient des protéines différentes de celles du cytoplasme • Elles sont impliquées dans des fonctions variées – Transport de molécules – Dégradation de molécules – Mobilité (présence de chimiorécepteurs) Charge de surface Toxine, Pouvoir pathogène Membrane plasmique Particularités de la membrane cytoplasmique des procaryotes (/ eucaryotes) Protéine intrinsèque Structurales • Pas de stérols (sauf chez les mycoplasmes) mais parfois des hopanoïdes • Plus de protéines Protéine extrinsèque Fonctionnelles • Respiration : déshydrogénases, coenzymes, ATPase • Photosynthèse : pigments antennaires et centres réactionnels • Synthèse d’éléments de la paroi et des pili • Assemblage et sécrétion de protéines membranaires et des exo-protéines • Mobilité : structure basale des flagelles • Réception de messages chimiques : chimiotaxie et régulation du métabolisme • Bicouche lipidique - Modèle de la mosaïque fluide - Composition variable • Rôle de barrière sélective : Transfert de substances, production d’énergie Bloc SVM 8 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Des invaginations de la membrane • Le mésosome : Une structure particulière des bactéries à Gram positif, un artéfact, un rôle dans la duplication ? La cellule procaryote • Augmentation de la surface : activité respiratoire intense, photosynthèse Protoplaste 70 % d’eau siège de la plupart des fonctions métaboliques Bacillus Nitrosomonas Les ribosomes bactériens Les ribosomes bactériens Une grande similarité avec ceux des eucaryotes Une grande similarité avec ceux des eucaryotes Synthèse des protéines Ribosomes mRNA Bloc SVM 9 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Le chromosome bactérien •1 seul chromosome, circulaire •Super-enroulé . Le nucléoïde bactérien E. coli PM : 3 103 MDa Paires de bases: 4 700 kb Taille : 1 400 µm P. aeruginosa 5 900 kb C. jejuni 1 721 kb x µm = 2x MDa = 3x kb La cellule procaryote Les plasmides Production de bactériocines, métabolisme, virulence, résistance - bactériocines Tansfert par Réserves E. coli -> colE1 -> colicine Bactéries lactiques - par conjugaison plasmides conjugatifs => pili sexuels - par transduction bactériophage - par transformation plasmide du milieu vers bactérie compétente - métabolisme Carbone Soufre Phosphore Pseudomonas -> TOL Pseudomonas -> CAM E. coli, Salmonella -> LAC - virulence E. coli -> K88 -> antigène d’adhérence S. aureus -> pZA10 -> entérotoxine B - résistance E. coli -> R100 -> antibiotiques, métaux bactérie sulfureuse pourpre Bloc SVM 10 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Des pigments bactériens Substance organique visqueuse définie -> capsule diffuse -> glycocalix Structure non indispensable - hydrolyse - mutation - milieu Protection des bactéries - agent chimique - protozoaires - phagocytose Pyocyanine, Pyoverdine Pseudomonas aeruginosa Transport du fer, active la croissance, létal pour certaines bactéries Rôle dans la virulence Pouvoir pathogène - adhésion à l’épithélium - empêche les défenses de l’hôte Pep = chaîne aminopeptidique Zéaxanthine Staphylococcus aureus Empêche l’action des neutrophiles, action anti-oxydante Support de l’antigénicité Spécificité sérologique Des capsules au service de l’homme … Pathogénicité de Streptococcus pneumoniae Dextrane Leuconostoc mesenteroides => gélifiant Xanthane Xanthomonas campestris => émulsifiant => lubrifiant Bloc SVM 11 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Flagelles Type de Flagelles Exemple Monotriche (unipolaire) Vibrio cholerae Lophotriche (unipolaire) Pseudomonas aeruginosa Amphitriche (bipolaire) Campylobacter Péritriche Escherichia coli Composés principalement de flagelline (protéine). Sous-unités en hélice. Antigène H Nage 40 à 60 révolution/s 20 à 90 µm/s • Nécessite un gradient de protons (force proton-motrice) course - culbute - course • Chimiotactisme, aérotactisme, phototactisme, magnétotactisme … Aérotactisme d’E. coli Pili : pilus sexuel Pili : pili communs ou fimbriae Bien d’autres structures… pour des fonctions variées Protéines de surfaces •S-layer : squelette externe, adhésion, résistance aux protéases des macrophages Bactéries à Gram + : pas de liaison covalente avec la muréine Bactéries à Gram - : couche S ancrée au LPS •Transfert de matériel génétique •Propriétés antigéniques •Adhésion aux surfaces inertes ou entre deux bactéries aux cellules (formation de biofilm, facteur de virulence) •Récepteurs (bactériophages) •Locomotion • Rares chez les gram +, fréquents chez les gram • Essentiellement constitués de protéines, pilines et adhésines. Arrangement en cylindre droit Bloc SVM 12 Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes Les spores Milieu favorable Des formes de résistance bactérienne Milieu défavorable DNA Dipicolinate de calcium Bacillus, Clostridium 10 à 20%, peptidoglycane inhabituel Structure Spore dormante très imperméable peptidoglycane normal -> future paroi Sporange DNA future membrane patrimoine génétique de la cellule végétative cytoplasme De l’ordre de 10 h chez Bacillus La sporulation très imperméable Propriétés des spores Germination des spores Thermorésistance résiste 20 min à 80°C, détruit à 121°C Varie d’une espèce à l’autre, d’un milieu à l’autre Activation Vapeur Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 et 12980, CIP 5281 Chaleur sèche Bacillus atrophaeus ATCC 9372, CIP 7718 Lever la dormance : Procédés mécaniques, physiques, chimiques Résistance aux agents physico-chimiques Initiation : Conditions favorables (hydratation, métabolites effecteurs) - rayons UV, X - ionisation Bacillus pumilus ATCC 27142, CIP 7725 - hautes pressions - agents antiseptiques - désinfectants Oxyde d’éthylène Bacillus atrophaeus ATCC 9372, CIP 7718 Processus autolytique : Destruction du peptidoglycane sporal et libération du dipicolinate de calcium => La spore s'imbibe d'eau Excroissance Emergence d'une nouvelle cellule végétative. Phase active de biosynthèse (protéines) Bloc SVM Action 13 - du dipicolinate de calcium - de l'état déshydraté (15 et 20 % p/p) - de l'imperméabilité des enveloppes - de protéines qui saturent l’ADN et le protège - d’enzymes de réparation de l’ADN Microbiologie générale : Introduction Spécificités structurales des procaryotes
