Diagnostic biologiques Du dépistage au suivi de l’infection 18 juin 2013 Dr NDAYIKUNDA Claudette DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 OBJECTIF • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le dépistage du VIH • Savoir interpréter le résultat d’un test de dépistage du VIH • Connaître les différents tests biologiques utilisés pour le suivi d’un patient infecté par la VIH • Savoir proposer les tests biologiques appropriés à la situation clinique DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Comment détecter le virus ? • En cherchant des traces directes du virus – Virus entier • Culture cellulaire – Particules liés au virus • Antigène – Antigénémie P24 • Génome viral – Charge virale VIH • En cherchant des traces indirectes du virus – Sérologie Le dépistage Les tests « sérologiques » • Sérologie – Détection de particules dans le « sérum » – Antigènes ou anticorps • Quelles méthodes de sérologie – Tests rapides – Tests « ELISA » – Tests Western Blot DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cinétique des marqueurs au cours de l’infection par VIH-1 • Tests utilisés: • • • • ELISA; Tests rapides L’apparition des anticorps demande un certain délai : fenêtre sérologique: 21J (6 à 38j selon les techniques). Pendant cette période, sujet est contagieux mais la sérologie est négative DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Technique ELISA • ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay • Principe du test – Mise en évidence d’anticorps présents dans un sérum par la visualisation d’une réaction colorée DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Tests de 4ème génération DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Test ELISA DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Tests rapides • Principe proche de l’ELISA • Permetde faire le dépistage d’anticorps anti-VIH en moins de 30 minutes par simple lecture visuelle • Sensibilité comparable à celle des ELISA Méthode immunofiltration Test Rapide Détermine • Le Test Rapide Détermine est un test Immunochromatographique Tests Rapides pour la détection d’anticorps anti-VIH •Determine •Oraquik* •Unigold* •Multispot* •Stat-pak •Hemastrip •SUDS* •Capillus *Apprové par la FDA • • • • • • • • Abbot Laboratories OraSure Trinity Biotech Trinity Biotech Chembio Diagnostic Systems SDS Abbott Laboratories Trinity Biotech Test de confirmation (Western Blot) • Met en évidence les anticorps anti-VIH1 ou VIH2, spécifiques des différentes protéines virales. • Avantages et utilisation – Test spécifique – Permet de trancher s’il y a une discordance avec les autres tests – Dans certains pays : utilisé comme test de confirmation si l’ELISA est positif Western Blot DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Diagnostic sérologique de l'infection par le VIH Tests ELISA VIH-1 VIH-2 Très bonne sensibilité ; spécificité > 99 % Temps de réalisation = 2-3 heures Test de Western Blot = CONFIRMATION si nécessaire gp160 gp110 68 55 gp140 gp105 68 56 gp41 40 Positivité du test si présence d'au moins 3 anticorps dont au moins 2 anticorps anti-enveloppe Pratiqué si test(s) ELISA positif(s) Moins sensible, plus spécifique DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux 34 25 gp36 26 18 16 DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Organisation Why mucosal du génome vaccination du VIH Glycoprotéines de l’enveloppe gp41 gp120 env gag pol RU5 17 MA vif vpr p24 CA p7 NC Protéines internes protéase RT intégrase Enzymes virales nef UR3 vpu tat tat rev rev Protéines virales régulatrices DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot •2) Western –blot positif: varie selon les institutions DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • 1) Western –blot négatif: absence de bandes DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • 3) Western blot INDETERMINE : ni positif, ni négatif DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Critères d’interprétation du Western Blot • En cas de Western blot INDETERMINE • il faut rechercher : – Une séroconversion (ag p24) – Une infection par le VIH-2 – Une infection par un variant VIH-1 – Une reactivité non spécifique DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Avantages et inconvénients des tests utilisés • Tests rapides – Avantages • Remise « immédiate » du résultat • Sensibilité et spécificité comparable à celle des ELISA – Inconvénients • Pas adapté au traitement de grands nombres d’échantillons • ELISA – Avantages • Permet l’analyse de grands volumes de spécimens – Inconvénients • • • • Matériel sophistiqué Personnel qualifié Entretien du matériel Source continue d’énergie électrique Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Décompte des CD4 • Pourquoi compter les CD4 ? – Leur niveau est corrélé au fonctionnement du système immunitaire – Indicateur d’initiation du traitement ARV Interprétation de la mesure des CD4 • Valeurs normales : 1000/mm3 • Infections opportunistes mineures : CD4 entre 350 et 200/mm3 • Infections opportunistes majeures (SIDA) – CD4 < 200/mm3 • %CD4, rapport CD4/CD8 – pas d’intérêt (sauf enfants) • Possibles valeurs aberrantes – Infection aiguë – Problèmes techniques Evolution des CD4 sous traitement • La remontée des CD4 est imprévisible – Vitesse de remontée ? – Niveau atteint sous traitement ? • Niveau de départ important +++ – Plus on part de bas, moins cela remontera haut… • Les CD4 continuent à augmenter plusieurs années après la mise sous traitement Méthodes de décompte des CD4+ • Méthode manuelle de décompte : Cyto Sphères (COULTER ) – Très long… • Méthode automatisée de décompte: cytométrie de flux – Permet de traiter un très grand bombre d’échantillon – Très exigeant – Nécessite appareil de mesure, réactifs particuliers, « consommables » particuliers… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique… • Nouvelles méthodes – Appareils portatifs, système à « cassette », un échantillon/20 minutes Décompte manuel (Coulter) Cytométrie de Flux Tests de suivi des PVVIH • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Tests diagnostiques de la Syphilis Hémogramme Examen des selles pour la recherche des parasites et des coccidies • Examen des crachats • Test de grossesse • Chimie sanguine/Bilan hépatique Charge virale (1) • Amplification génique de l’ARN viral • Expression du résultat – En nombre de « copies » de virus par mL de plasma • Par exemple 145 000 copies/mL – Parfois exprimé en log10 de ce chiffre • 145 000 = 5,16 Log10 • Technique – Très exigeant – Nécessite appareil pour la charge virale, laboratoire spécial, centrifugeuses, hottes de préparation, réactifs particuliers, « consommables » particuliers, congélateurs à -80°C… • Très peu de pays en développement arrivent à faire fonctionner la technique… Charge Virale (2) • Intérêt – Avant traitement • Intérêt modéré • Permet d’avoir une idée de la rapidité d’évolution de l’infection – Sous traitement • EXAMEN ESSENTIEL ++++ • Seule méthode biologique fiable d’évaluation de l'efficacité du traitement Charge virale (3) • Sous traitement – La charge virale diminue très vite – La charge virale doit être indétectable après 6 mois de trithérapie – La charge virale doit rester en permanence indétectable sous traitement • Gage d'efficacité des traitements à long terme DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 PLASMA LYMPHOCYTES T4 CIRCULANTS Etats du virus dans la circulation Lympho CD4 au repos Lympho CD4 activé Virus latent Virus en réplication PCR ADN VIH Virus libre Antigène p24 soluble Burgard, V PCR ARN VIH ou Charge virale Complexée à des Ac Libre Apres Dissoc. Ag p24 36 DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Hémogramme • Etude qualitative et quantitative des éléments trouvés dans le sang humain. • Il est important dans l’initiation du traitement et le suivi du patient sous ARV. Paramètres les plus importants • Numération cellulaire – Décompte des globules blancs – Décompte des globules rouges – Décompte des plaquettes • Hémoglobine • Volume globulaire Méthodes utilisées • Méthode automatique –Les cellules sanguines sont comptées selon leurs tailles. • Méthode manuelle –Les cellules sanguines sont comptées en utilisant un hématimètre après dilution Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Importance de la biochimie • Les tests de la chimie sanguine permettent: – D’évaluer la façon dont le patient pourra tolérer certains traitements – De faire le bilan de certaines « comorbidités » avant traitement • • • • Hépatite Insuffisance rénale Diabète … – De faire le suivi du patient déjà sous thérapie pour déceler tout effet secondaire cliniquement silencieux Chimie sanguine • Les tests de la chimie sanguine comportent: – Un bilan hépatique et pancréatique • SGOT, SGPT, Bilirubine, phosphatase alcaline, glycémie (amylase, lipase) – Un bilan rénal • Créatine, urée – Un bilan lipidique • Cholestérol (+ fractions LDL et HDL) • Triglycérides Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Techniques et coloration des selles • Techniques – Examen direct – Concentration des selles – Enrichissement des selles • Colorations – Etat frais dilué au sérum physiologique – Colorations diverses en fonction des parasites recherchés Recherche des leucocytes dans les selles • Coloration au bleu de Méthylène • La présence de beaucoup de polynucléaires peut indiquer une atteinte invasive d’origine bactérienne, alors que les éosinophiles attirent l’attention sur une atteinte parasitaire Interprétation des résultats Négatif: Absence de parasites ou d’œufs Positif: Présence de parasites ou d’œufs Recherche de Coccidies • Méthode de coloration de Ziehl Nielsen modifiée • Les principales coccidies sont: – Cryptosporidium – Cyclospora – Isospora belli Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachats Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus Analyse des crachats = recherche de tuberculose • La tuberculose est l’infection opportuniste prédominante chez les patients VIH+ • Importance +++ – Du diagnostic en cas de symptômes – Du dépistage en l’absence de symptômes Recherche des Bacilles Acido Alcoolo Résistants (BAAR) • Coloration de Ziehl Nielsen – Étalement des crachats – Faire sécher le frottis à l’air libre – Fixer le frottis – Colorer (Ziehl Nielsen) Lecture au microscope • Ces bacilles peuvent être retrouvés dans les spécimens suivants: – – – – – Crachats Sang Selles Urines Tissus • A l’examen direct – Présence de bacilles acidoalcoolo résistants (BAAR) Suivi biologique des personnes infectées par le VIH • • • • • • • Décompte des lymphocytes T (CD 4) Charge virale Hémogramme Chimie sanguine Examen parasitologique des selles Examen de crachat Sérologies pour les pathologies associées – Toxoplasmose – Syphilis – Cytomegalovirus DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 1 • Espérance, 28 ans, vient consulter parce qu’elle tousse depuis trois mois, elle a perdu 10 kg • Son mari est mort l’année d’avant, on lui a dit que c’était le SIDA. • Elle a un enfant qui a 2 ans, et il est malade du SIDA, il prend un traitement ARV • Espérance a fait un test de dépistage du VIH, dans un laboratoire en ville, et elle amène le résultat qui est négatif Que dites-vous à Espérance ? Que faites-vous ? DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 F1 CLASSIFICATION DU VIH-1 F2 K Groupes M, N, O Sous-types A, B, C, D, F, G, H, J, K Sous-sous-types A- A2, F1- F2, B- D formes Recombinantes Circulantes (CRFs) CRF01 à CRF37 B D C Groupe M H A CRF02-AG CRF01-AE G J SIVcpzUS (Recombinants Uniques ) Groupe N SIVCPZGAB Groupe O SIVCPZANT 0.1 DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 2 • Deogratias, 22 ans, a eu un test de dépistage qui est positif pour le VIH. Il a quelques ganglions sous les aisselles, et son ancienne partenaire était séropositive pour le VIH, ce qui a motivé la réalisation du dépistage. • Que proposez-vous à Déo pour les examens complémentaires biologiques ? DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux DIU des grands lacs 2010 : Tests biologiques - Mardi 18 juin 2013 Cas clinique 3 • Sidonie, 40 ans, est sous traitement ARV par Duovir-N depuis 1 an. Elle avait perdu 20 kg avant le début du traitement, qu’elle a presque intégralement repris. Les CD4 avant traitements étaient à 110/mm 3 • Elle tolère bien son traitement, les CD4 sont remontés à 220/mm3 • La charge virale est à 15 000 copies/ml Quelle est la signification de ce résultat ? Que proposer à Sidonie ? DIU de la région des grands lacs P5S1 juin 2010- Tests biologiques : du dépistage au suivi - Dr C. Arvieux Points à retenir • Le dépistage du VIH dans la région des grands lacs repose essentiellement sur les TESTS RAPIDES • Pour la décision de mise sous traitement, on utilise la numération des lymphocytes CD4 • Pour le suivi de l’efficacité du traitement antiviral, le meilleur examen est la mesure de la charge virale VIH Points à retenir (suite) • Le laboratoire va amener une aide importante pour le suivi de la toxicité des traitements – Hémogramme – Chimie sanguine • Le laboratoire va amener une aide importante pour le diagnostic des complications du VIH, notamment les infections opportunistes – Tuberculose – Infections parasitaires digestives C’est fini !