ppt

« Actualités ( commentées…)
du Diagnostic Virologique »
Patrice Morand
Laboratoire de Virologie
Faculté de Médecine-CHU Grenoble
DU Antibiologie Grenoble 2007
- Y a t-il du nouveau en Sérologie ?
- Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
-Les difficultés d’interprétation de la charge virale
- Intérêts et limites du séquençage moléculaire
Y a t-il du nouveau en Sérologie (1) ?
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage
des primo-infections à VIH et à VHC ?
E
Y
Y
Y
YY
Ag Ac
YY
E
Y
Y
Sérum
Patient
YY
E
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac )
dans le dépistage des primo-infections à VIH
- 5 000 primo-infection / an / France ? .
- 50 % symptomatiques.
-Intérêt du dépistage des primo-infection.
.pour l’individu infecté :
traitement de la primo-infection symptomatique ?
30%- 50% des infections découvertes au stade SIDA
.pour ses partenaires :
transmission très fréquentes à partir de patients en
primo-infection
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac )
dans le dépistage des primo-infections à VIH
Ac
ARN
Ag p24
11-12 14-15
J 0 Fenêtres
virologiques
20-21
ARN
28-29
jours
Ag P24
Fenêtre sérologiques
Raccourcissement
de la fenêtre sérologique
Sérologie 3° G (Ac)
Test sérologiques combinés (Ac +Ag)
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac )
dans le dépistage des primo-infections à VIH
- Nouveaux Test combinés Ag- Ac ( les plus récents) :
- gain moyen en jours /test Ac lors d’une séroconversion = 5 jours
- sensibilité détection Ag variable mais se rapprochant de parfois
des test Ag P24 (5 à 20 pg/ml )
- quelques cas de résultats douteux avec 3 génération +
Suspicion de PI VIH avec 4e génération négatif ou douteux :
toujours faire Ag P24 ou ARN
Kwon JA J Virol Method 2005
Ly TD J Virol Method 2004
Sérologie combinée Ag + Ac dans l’infection VHC
- Alternative au DGV dans pays en développement ?
- Panels de séroconversions VHC
.délai moyen apparition
Ac = 66 jours
Ag- Ac délai moyen = 40 jours
ARN = 35 jours
5 jours (0-24)
. Spécificité test Ag-AC 99.8%
- Intérêt en France ? :
- transfusion sur les 2.5 millions de dons en France
2 cas de contamination prévenus par DGV
1 cas de contamination prévenu par Ag-Ac
- suivi hémodalysé ?
- suivi sujet à risque de primo-infection (épidémie chez homosexuel VIH +)
Laperche S , Transfusion 2005
Y a t-il du nouveau en Sérologie (2) ?
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type
HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type
HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
- Séroprévalence HSV2 :
. USA: + 30 % dans la population générale (1980-1990)
. France étude herpimax : HSV2 +:
17.9% femmes 13.5 % hommes
. 100 patients HSV2
.20 « diagnostiqués »
.60 symptomatiqués et non diagnostiqués
. 20 asymptomatique
. La majorité des transmission HSV2 à partir d’une excrétion
asymptomatique
- des herpes génitaux HSV1 dans les pays occidentaux :
. 30% - 50% des premiers épisodes?
Malkin JE, 2002
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type
HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
herpes génital (HSV2) et VIH:
- Patient HSV2 + VIHAugmentation X2 du risque d’être contaminé par HIV
- Patient HSV2+VIH+
Probable augmentation du risque de transmettre VIH
herpes génital et herpes néonataux
- USA Seattle
- Netherlands National
1 in 3,200
1 in 35,000
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type
HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
HSV1 et HSV2
85 % identité en aa
Glycoprotéine
très semblables :
ex : gD
Tests non spécifiques
glycoprotéines
très différentes
ex / gG1 et gG2
Tests spécifiques de types
Sensibilité HSV2 80 à 98%
(délai de séroconver. 20-60 jours)
Spécificité HSV2 95 %
Wald A, Clin Infect Dis 2002
Aslley -Morrow R, Sex Transm Dis 2003
Doctor test Anticorps HSV2 :
POCkit  HSV2
Sérologies spécifiques de types : l ’immunoblot
0
1
0
2
0
3
0
4
0
5
0
6
0
7
0
8
IgG cont.
gD
gG2
gG2
gG1
gB1 pep
IgG cont.
HSV-1
HSV-2
1 +2
Non
typable
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type
HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
. Intérêts épidémiologiques : oui
.IVS va lancer une nouvelle
enquête de séroprévalence HSV 2
. Intérêts individuels : très discuté
Couple avec un partenaire porteur de l’herpes génital ?
Femme enceinte ?
Sujet à multipartenariat sexuel (CDAG)
….
problème du HSV1 génital et de la méconnaissance
de l’herpes génital dans le milieu médical
Y a t-il du nouveau en Sérologie (3) ?
Les sérologies pour dater l’infection VIH :
Test spécifiques pour diagnostiquer une infection < 6 mois
sang sur buvard et quantification des Ac anti enveloppe (V3,gp41)
Sensibilité 88% Spécificité 98%
Ex Mars –Septembre 2003 :
Découvertes séro +
% d’infections récentes < 6mois
Homosexuel masc.
111
58 %
Héterosex
156
32 %
Lot F, Eurosurveillance 2004
Barin F, J Clin Microbiol 2005
Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :
.L’avidité des IgG pour l’antigène augmente avec le temps :
une avidité élevée est en faveur d’une infection ancienne
. Infection à CMV chez la femme enceinte :
Femme Enceinte
Sero + : 50 %
Femme Enceinte
Sero - : 50 %
Réactivation
Primo-infec
Fréquence
10-30 %
1- 4%
transmission
0.2- 2 %
35- 50%
fœtus sympto
excep
excep
10 %
10 %
Mortalité
CMV: 1ere cause d ’infection congénitale (0,4 à 2,3%) en France
Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :
chez la femme enceinte face à des IgM anti-CMV avec ou sans signe clinique
de primo-infection :
avidité < 20% primo-infection ds les deux mois précédent
> 70 % infection datant de plus de 3 mois
. à ne pas mettre entre toute les mains
. à utiliser avec les autres stratégies pour dater l’infection
. sérums antérieurs
. culture ou PCR dans les urines
. Si doute Liquide amniotique
Evolution des anticorps anti-CMV avec le temps :
IgG
IgM
IgG
IgM
Persistance prolongée des IgM
Avidité
des IgG
IgG
IgM
IgM
Réactivation
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
Exemple 1 : infection respiratoires basses :
148 LBA (2001-2002)
(chez 111 adultes dont 78 % immunodéprimé ,113 LBA sous ATB )
Groupe 1
Suspicion d’infections
respiratoires basses
n= 117
Sub-groupe 1
Transplantés pulmonaires
n= 31
Groupe 2
Absence d’infection
n= 31
Sub-groupe 2
Transplantés pulmonaires
n= 26
4 types de Cultures cellulaires
11 RT PCRs Qualitatives
Garbino J, Am J Respi Crit Care Med, 2004
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
Groupe 1
Groupe 2
n= 117
n= 31
P<0.01
34 virus respiratoires (29%)
2 virus respiratoires (7%)
- PCR positive 3 fois plus souvent que la culture ( p< 0.001)
- 45 % des infections virales : printemps- été
- Virus le plus fréquent dans le LBA : rhinovirus > VRS
- Mortalité à J 30 ds groupe 1 :
-Virus + = 10%
-Virus - = 14%
P=0.49
Garbino J,2004
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
Sub Groupe 1
Transplantés :
17 /31 = 55%
Rhinovirus
RSV
Influenza A /B
Parainfluenza
Adenovirus
P <0.001
9
4
2
1
1
Sub Groupe 2
Transplantés :
1/26= 4%
Rhinovirus 1
Virus présent uniquement au moment des symptômes
pas de métapneumovirus ni de coronavirus
CMV
4
CMV
4
Co- infect. bact/fung 5 (16%) versus 6 (23%)
Garbino J 2004
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
Sub Groupe 1
Transplantés :
17 /31 = 55%
P <0.001
Sub Groupe 2
Transplantés :
1/26= 4%
Pas de différence de survie à J30 selon la présence ou non
de virus dans le LBA
LBA virus + = 89 %
LBA virus - = 100 %
Garbino J 2004
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
- 72 greffés médullaires adultes ( 75 % allogreffe) (Oct. 99-Avril 2001)
. prélèvement nasal et gorge systématique J0 S3 S8 S16 S26
. prélèvement si suspicion infection respiratoire :
- nez-gorge si infection haute
- LBA si besoin dans infection basse
. Culture et PCR
. 41 infections respiratoires hautes et 11 infections basses (9LBA)
. Inf. hautes : 25 PCR + (61%) vs 10 Culture + ( 24%) ( p< .0001)
. Inf. basses :
8 PCR + (73%) vs 1 culture + ( 9%) ( p= .008)
Van Kraaij M, Clin Infect, Dis 2005
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie
Moléculaire?
- Virologie moléculaire et infections respiratoires basses :
-3 fois plus de prélèvements positifs pour les Virus
respiratoires
-mise en évidence de nouveaux virus
. métapneumo, coronaV, boccaV.
(. Ou de virus respiratoires haut dans les LBA)
-Rôle en terme de mortalité et morbidité pas toujours
évident
-Peu d’antiviraux
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la
Biologie Moléculaire?
Exemple 2 : l’herpes génital tout venant:
334 prélèvements de patients (HSV2 séro+) avec lésions
suspectes d’herpes génital :
PCR HSV 2
Pos
Neg
Pos
157
5
Neg
104
68
Cult.
Cult. + : 10 4 copies (101 à 10 6 )
Cult. - : 10 1 copies (101 à 10 4 )
Ryncarz AJ, J Clin Microbiol 1999
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la
Biologie Moléculaire?
-Exemple 2 : l’herpes génital femme enceinte
. 100 femmes enceintes asymtomatique à l ’accouchement:
. 0 culture positive (littérature 0.05 à 2.3%)
. 9 PCR positives
. Aucun herpès néonatal
. 2 femmes asympto. avec culture négative et herpès néonatal
. 2 PCR + (avec une CV élevée)
Que faire devant une culture- PCR+ ?
Cone RW, JAMA 1994
Cas clinique
Femme enceinte sur le point d ’accoucher
dans une clinique privée :
- Lésions grande lèvre droite. Premier épisode
- Antigène : + avec neutralisation douteuse: faux + ?
- PCR le même jour : HSV +
Césarienne
Culture positive le lendemain HSV2
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 1 : les charges virales faibles chez le VIH
- BLIPs : épisodes transitoires de 50 < CV< 1000 copies/ml chez des patients
compliants :
.Fréquence ? 30 % lors d’un suivi tous les 3mois ?
. Pas prédictif d’un échec virologique
. n’entraînent pas l’apparition de mutants résistants ?
Nettles Re, JAMA 2005
Sungkanuparph S, Clin Infect Dis 2005
Macias J, J Infect , 2005
-Virémie persistantes > 400 -10000
. apparition résistances
. évolution clinique à terme
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 2 Charge virale VHC en fin de traitement :
208 patients ARN VHC – par technique conventionnelle (50 UI/mL)
à la fin du Tt Peg IFN +Riba
TMA (10UI/mL)
26 ARN +
182 ARN -
22 rechutes
(96%)
26 rechutes
(14%)
P<0.0001
Gerotto J hepatol 2006
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 3 :
valeur prédictive de la Charge virale EBV pour la prise en charge
des syndrome lymphoprolifératifs post transplantation SLPT
Slifkin M, Drugs 2004
EBV copies /µg DNA or /mL serum (log10)
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
5
37 %
0%
100 % 80 %
80 %
100 %
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
PBMC SERUM
healthy
(n=32)
PBMC
IM
(n=17)
SERUM
a
SERUM
NPC
(n=10)
PBMC
PTLD
(n=5)
Brengel-Pesce, J Med virol 2002
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
EBV load (copies/µg ADN)
16,000
14,000
12,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
anti-CD20
tonsillectomy
07/99
09/99
localized PTLD
11/99
01/00
03/00
05/00
systemic PTLD
Brengel Pesce J Med Virol, 2002
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
Etude
Méthode
Sensibilité
Spécificité
Cut-off
Gärtner et al
(2002)
Quantitative PCR
(copies/µg ADN)
87%
91%
10 000
Grenoble PCR en temps réel :
CV élevée > 10 000 copies / ml
CV tres élevée > 100 000 copies/ml
Variation significative 1log
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
- intérêt d’une cinétique hebdomadaire les 3 premiers mois
pour les greffes à haut risque ( R-/D+, IS+++) : Augmentation
rapide de la charge virale = prédictive
- possibilité de charge virale élevée sans maladie seulement 50
% des CV élevé font un SLPT ?(Wagner Blood 2004). Charge
virale haute : à interpréter avec précaution en tenant compte
des autres facteurs de risque de SLPT
- possibilité de charge virale faible dans maladie localisée
- possibilité d’absence de rémission malgré évolution favorable
de la cv ?
- intérêt de la mesure des CTL anti EBV ?
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 3 la MEH
Plutôt oui :
.16 patients
- réaugmentation chez un patients traité
décès
- >100 copies / ml mauvais pronostic ?
Domingues, J Clin Microbiol 1998
. 27 enfants avec réponse au TT
- 7 rechutes
- 2 / 7 réapparition secondaire de l ’ADN HSV
Ito; Clin Infect Dis 2000
Plutôt non :
- 26 patients MEH (98 LCR)
- diminution CV sous traitement
- pas de corrélation avec gravité
Revello , Clin Diagn Virol 1997
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 4 :
Faut-il mesurer autres choses en plus des charges virales
. VIH et ADN Proviral
.322 patients de la cohorte Séroco suivi 8 ans (1988-1996)
.dans les 6 mois qui suivent la séroconversion, l’ADN est
plus prédictif de la progression de la maladie que l’ARN ou les CD4
.ensuite ( 6-24mois) facteur prédictif indépendant de ARN ou CD4
Rouzioux C, J Infect Ds 2005
. ARN Messager du cycle lytique et herpes virus ?
. + Prédictif d’une maladie virale ?
Intérêts et limites des génotypages viraux
Intérêts et limites des génotypages viraux « pré
thérapeutiques »
En routine
Genotypage VHC
Genotypage Papilloma
Intérêt pour les autres virus ?
Génotypage VHB
Soustypage VIH
Intérêts et limites des génotypages des résistances
par séquençage moléculaire
Exemple Génotypage VIH
-intérêt certains en cas d’échec virologique et dans les primo-infec
et probable en début de traitement
- interprétation spécialisée
- les questions en suspend :
. sensibilité suffisante du séquençage ?
. différences d’interprétation selon les algorithmes
. intérêt de l’association avec critères pharmacologiques
. corrélation phénotype –génotype
Conclusions :
La sérologie a un avenir :
indispensable en épidémiologie
intéressante dans des cas individuels difficile à condition
d’avoir des bons sérologistes
La biologie moléculaire va remplacer la culture virale (et la détection
d’Ag) en routine
garder un petit nombre de centre de référence pour collectionner
les souches
l’ amélioration de la sensiblité pose des pb d’interprétations médicale
les VPP pour les maladies à Herpes virus chez le transplantés sont
difficile à établir
le génotypage des résistances nécessite une expertise