Pôle laboratoires CHUN (François Plénat) commission ReDIF

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Plate-forme de Recherche Clinique
en CYTOMIQUE
 Biomarqueurs cellulaires innovants
 CPER 2007-2013: Innovations thérapeutiques et
Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B)
 Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires
du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche
clinique et translationnelle



Mutualisation des compétences
Complémentarités humaines et technologiques
Ouverture régionale et interrégionale
 Ensemble type « Flow cytometry core
facility »
 Cytométrie en flux multiparamétrique
 Cell Search Veridex
 Image Stream System (Amnis)
 Une démarche commencée en 2005!
Cytométrie de flux multiparamétrique
 Navios (Beckman Coulter)
 Software Kaluza
 CMF 3 lasers 10 couleurs <… 5
 Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE,
Dr M de CARVALHO)
 Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V
LATGER)
 Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr A
DALLOUL)
 Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)
Cancéropole
Cytométrie de flux multiparamétrique
Evénements rares et populations discrètes… après « single
platform » et
 Onco-Hématologie






NoE European Leukemia Net
STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM)
Maladie Résiduelle LLC
Myélodysplasies
Projet INCA SIGLAM
Phase périphérique des LMNH
 Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie
cellulaire
 Tregs, cellules dendritiques, cellules NK
 Production cytokiniques spécifiques d’Ag
 Microparticules et cellules endothéliales
Cytométrie de flux multiparamétrique (2)
MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMS
Moelle normale
Maladie résiduelle
valorisation démarche détection et quantification
d’événements rares
au sein des « bermudes »
CD13
CD34
SSC
CD45
Publications récentes
 Four- and five-color flow cytometry analysis of
leukocyte differentiation pathways in normal bone
marrow: a reference document based on a systematic
approach by the GTLLF and GEIL.
 Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, Feuillard J, Fossat C,
Husson B, Jouault H, Maynadié M, Lacombe F.
 Cytometry B Clin Cytom. 2010 Jan;78(1):4-10.
 How and why minimal residual disease studies are
necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12
of the European LeukaemiaNet.
 Béné MC, Kaeda JS.
 Haematologica. 2009 Aug;94(8):1135-50.
ELN
http://www.leukemianet.org/content/diagnostics/diagnostics/morphology
 Consensual Documents provided by WP10
 Created by: M.C. Béné , generated 2008/01/12 ,
last changed: 2008/04/22
 …. useful for the immunophenotypic
diagnosis of leukemias by flow cytometry.
 Flow cytometry atlas
 Created by: F Lacombe, C Arnoulet, F Durrieu, J
Feuillard, C Fossat, B Husson, H Jouault, M
Maynadié, MC Béné , generated 2008/07/12 , last
changed: 2009/01/04
Cytométrie de flux
multparamétrique (2)
 Réponse immunitaire antitumorale spécifique (M de
Carvalho, P Eschwege + …)
 Antigènes candidats (cancer
prostate)
 Problématique: événements rares
+ caractérisation
multiparamétrique phénotypique
et fonctionnelle de sous
populations cellulaires
 Signatures cytokiniques
 Transfert de l’expérience
acquise dans la réponse
spécifique anti-mycobacterium
tuberculosis et anti-adenovirus
Cytométrie de flux
multiparamétrique (3)
 Microparticules, thrombose et cancer (V LatgerCannard, Th Lecompte)

Standardization of platelet-derived
microparticle counting using calibrated beads
and a Cytomics FC500 routine flow cytometer:
a first step towards multicenter studies?
 Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L,
Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, DignatGeorge F.

J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub
2008 Oct 18.
Projets en cours
 Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)
(V Latger, MC Béné)
 Déficit en molécules GPI-linked
 Lymphocytoses B (JF Lesesve, MCB)
 SIGLAM (MCB - INCA)
 Activation intracellulaire
 Septiflux recherche translationelle Inserm
 (J Feuillard Limoges, S Gibot et Immuno
Nancy)
 Marqueurs lymphoïdes et monocytaires
Cell Search Veridex®
 Combinaison de méthodes



Immunologiques spécifiques
Séparation immunomagnétique
Quantification en imagerie photonique automatisée
 Standardisation et automatisation de la phase
préparative
 Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL)
soit #10-7
 outil de choix pour l'étude des cellules
endothéliales circulantes en recherche clinique.
 Validation antérieure en recherche clinique
pour les cellules tumorales circulantes pour des
études pronostiques.
 Capacités d’isolement des cellules en vue
d’études moléculaires complémentaires
Projets Cell Search
Cancéropole et au-delà…
 Cellules Tumorales Circulantes (CTCs)


Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi –
GSK/NOVARTIS – INCA?)
Poumon
 AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet,
JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P
Oudet, M Beau-Faller

Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S
Loric LIBM)
 Validation clinique en réseau interrégional, national, voire
européen (IMI?)
 Cellules Endothéliales Circulantes (CECs)



Thérapies antiangiogéniques
Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot)
Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J
Hubert, Necker)
Résultats littérature
 Stratification
 Baseline levels
predicts outcome
 Changes predicts
survival
Cell search CTCs (1)
 CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix,
M Beau-Faller, P Oudet)
 Evaluation de l’intérêt clinique de la détection
des cellules tumorales circulantes dans le
cancer bronchique métastatique
 Avec ajout de marqueurs d’intérêt (EGFR, X)
 Isolement des cellules en vue d’études
moléculaires
 CERONC – Prostate (P Eschwege, J
Hubert, D Peiffert)
 Evaluation préthérapeutique
Autres projets CTCs
 Cancer Poumon
 Projet CIRCUBRON
 C Clement Duchene
 Cancer ORL
 Collaboration CAV:
 G Dolivet, R
Mastronicola
 Dilution limite
 B Faivre: Thrombose,
Hémostase et Cancer
ORL
Cell Search CECs (2)
 Projet Sepsis
 CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF)
 Quantification des CEC
 Isolement des CECs pour études
moléculaires
 Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville)
 Evaluation des CECs comme biomarqueurs
d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des
tumeurs vasculaires rénales
 Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares
(GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O
Rouvière)
Sepsis…. STB
 Résultats
préliminaires
 Collaboration
Bordeaux
 Sepsis (CPRC)
 C3, B2
 Suivi séquentiel
Autres projets CECs
 Hémangiomes (propranolol-6)
 Maladie Rendu-Osler
 Vascularites (10)
 Suites infarctus (<20)
 Anévrysmes aortiques?
 Eclampsie (2)
 Thérapeutiques anti-angiogéniques
(12)
Imagerie en flux
Image stream X AMNIS®

Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux
combinant cytométrie en flux et imagerie photonique
 Observation directe, de la localisation
précise, cellule par cellule, des marqueurs
fluorescents utilisés pour identifier:
membrane, organites intracellulaires, noyau.

Parmi les applications réalisables en simultané






Marquages membranaires multiples et colocalisation de
marqueurs de surface
Marquages nucléaires (FISH en suspension)
Translocation nucléaire,
Apoptose
Etudes fonctionnelles
Coopérations cellulaires (synapse immunologique)
Image stream X AMNIS
Applications…. etc
 Biologie cellulaire – Immunologie
Signalisation Cellulaire
Analyse Morphologique
Interactions cellulaires
Mort cellulaire
 Cancérologie
Cycle Cellulaire
Dommage de l’ADN
ImageStream Layout
detector
Spectral
decomposition
element
detector
Spectral
decomposition
element
cells
in in
flow
cells
autofocus
flow
autofocusvelocity
detector
brightfield
illuminator
brightfield
illuminator
laser
laser
velocity
detector
Shape Change, Primary Monocytes
MCP-1 causes
a ‘loss
in circularity’
the variance
Circularity
= average
radius
divided by in
radial
majority of the monocytes
Untreated
Untreated
9.5
MCP-1
MCP-1
60.9
NF-kB translocation in whole blood subsets
Monocytes
9_BF
6_SSC
7_DAPI
2_FITC NFkB
3_PE CD14
2_FITC NFkB
3_PE CD14
4_PETR CD45
11_AF647 CD16
12_A750 CD3
316
943
1142
3592
T cells
9_BF
325
718
969
1246
6_SSC
7_DAPI
4_PETR CD45
11_AF647 CD16
12_A750 CD3
Internalization / trafficking in primary cells
Incubate PBMC with
CpGB
Label pDC with BDCA
PE, CD71 or CD107a
FITC
Collect 20,000 event
image files on the
ImageStream
Quantify: Internalization
and colocalization of
CpGB to endosomes and
lysomes
Chongwei Cui
Dr. Pat FitzgeraldBocarsly
UMDNJ
T cell / APC interactions
17.6
1.3
Identification of molecular
recruitment to the immune synapse.
Dr. Brandon
Burbach
University of
Minnesota
EDF – FISH analysis
Jurkat cells probed with ChrX (Spectrum Green) and Chr8 (Spectrum Orange)
ImageStream: Standard
Imaging
Cells exhibit common artifacts
associated with defocus making
spot counting difficult
ImageStream: Extended
Depth of Field Imaging
Same sample (different cells) with
WFC element. FISH spots
maintain size independent of focal
position within nucleus
Cell Cycle / Mitosis /
Apoptosis
InterphaseProphaseMetaphase
CV= 4.0
Anaphase Telophase AtypicalApoptotic
• HL60 cells were labeled
with anti-HLA AF488 and
DRAQ5
• DNA condensation
pattern and Brightfield
contrast help distinguish
the phases of mitosis
from apoptotic and
interphase nuclei
Plate-forme de recherche clinique
en CYTOMIQUE
 Biomarqueurs cellulaires innovants
 CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de
la Santé (ITTS-CIC-B)
 Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires
du CHUN (REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC
Faure) dédié à la recherche clinique
 Ensemble type « Flow cytometry core
facility »
 Cytométrie en flux multiparamétrique
 Cell Search Veridex
 Image Stream System (Amnis)
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