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LA CYTOMETRIE EN FLUX (définition et principes) DUPERRAY Christophe Service Régional de Cytométrie en Flux INSERM U475 Parc Euromédecine 99, rue Puech Villa 34197 Montpellier cedex 5 Qu’est ce que la Cytométrie en flux? C’est une technologi e qui permet la mesure simult anée de plusieurs caractéristiques physiques d’une cellul e. Quelles sont les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)? Sa taille relativ e (Forward Scatter), Sa granula rité ou sa complexit é int erne relativ e (Side Scatter), Son int ensité relativ e de fluorescence. Défini tion : La cy to mè tri e e n flu x e st dé fi n ie c omme l’étu de p ré cis e d e c el lul es is olée s en tr a în ée s p a r u n f lu x l iq u id e. Ell e pe r me t u n e ca ra ct é ris a t ion : In d ivi d u e lle , Qu a nt it a tiv e, Qu a li ta tiv e d e la c el lul es Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de: Fluidique: Pour introdui re et canaliser les cellu les, Optique: Une source d’excitation et de récupération des signaux, Electronique: Pour convertir les sign aux optiques en des sign aux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur. Principes de la cytométrie vus par les militaires Population Hétérogène Seuil Traitement des données Analyses quantitatives Décision Population Hétérogène SEUIL Seuil POPULATION HETEROGENE Informatique TRAITEMENT DES DONNEES Traitement des données LASER ANALYSES QUANTITATIVES DES SIGNAUX LUMINEUX COMPTAGE DECISION DE TRI Analyses quantitatives Décision Echantillon Liquide entraineur Laser Principe du centrage hydrodynamique Echantillon Liquide entraineur Laser Principe du centrage hydrodynamique L’OPTIQUE La source d’excitation consiste en: Un laser ou une lampe. Des lentill es pour mettre en forme et focalis er la source d’excitation. L’optique de collection des signaux consiste en: Un système de miroirs et de filt res pour diriger et sélectionn er certaines longu eurs d’onde vers les détecteurs. Figure 4: utili sée. Spectres d’émi ssion. La puissance est fonc tion du typ e de la source les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)? Sa taille relativ e (Forward Scatter), Sa granula rité ou sa complexit é int erne relativ e (Side Scatter), Son int ensité relativ e de fluorescence. FORWARD SCATTER (Diffusion aux petits angles) La lumi ère diffractée est collectée sous un petit angle (compris entre 1 e t 10 degrés), Le signal est relatif à la taill e de la cellul e. SIDE SCATTER (Diffusion aux grands angles) La lumi ère diffractée est collectée à 90° de l’axe du laser, Le signal est relatif à la granularité et la complexité cellulai re. MONOCYTES GRANULOCYTES LYMPHOCYTES Figure 8: Utili sation de la double diff usion de la lumière pour distingue r les diver ses sous popula tions sangu ines (FSC: diffusion aux petit s ang les, SSC dif fusion aux grands ang les). QU’EST CE QUE LA FLUORESCENCE? Le fluorochrome absorbe l’énergie du LASER, Le fluorochrome réemet l’énergie absorbée par: + vibration et dissipation de chaleur, + émission de photons d’une longu eur d’onde plus élevée. Déviation de Stokes Laser Spectre d’absorption Spectre d’émission COLORANT LIAISON/FONCTION l EX. * l EM. @ Hoechst 33342 ADN (bases A-T) 365 402 DAPI ADN (bases A-T) 357 451 Iodure de Propidium ADN (intercalant) 370, 560 631 Bromure d’Ethidium ADN (intercalant) 370, 530 622 Acridine Orange ARN/ADN 492/492 527/630 Alexa 430 conjugaison 430 540 FITC conjugaison 490 543 PE conjugaison 565 578 PerCP conjugaison 488 675 APC conjugaison 642 660 PerCP/Cy5.5 conjugaison 488 695 Cy5.5 conjugaison 678 703 APC/Cy7 Protéines 650 767 Rhodamine 123 potentiel mitochondrial 505 534 BCECF-AM pH 440 530 SNARF-1 PH/traceur 488 580/630 Cascade blue traceur Ca2+ 399 423 450-500 660 331 405/480 506 526 Fura Red INDO-1-AM Fluo-3 Ca2+ Ca2+ Caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d’onde d’excitation, @: longueur d’onde d’émission). R R 540 520 500 480 SP500 PASSE BAS 460 Passe-bas Passe-haut 540 PASSE BANDE R 520 500 480 500/50 460 540 520 500 480 Bande-passe 460 Figure 5: Dif férents type s de filtr es utili sés en C MF. (R: Réflection, : longueu r d’onde ) Figure 6: Différents types de filtres utilisés en CMF. LP500 PASSE HAUT Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux Exemple de trajet optique d’un cytomètre en flux PARAMETRE SIGNIFICATION UTILISATION Dif fusion de la lumi ère aux petit s ang les Proportionne l au diamètre cell ulair e Identification morpho logique des cellules Dif fusion de la lumière à ang le droit Proportionne l au contenu cell ulair e Identification morpho logique des cellules Fluor escences Tableau 1: Proportionne ll es à l’intensité Marqueu rs cell ulair es, ADN, de marquage ARN, fonc tions cellulair es... Signification des principaux signaux ob tenu s en cytométrie en flux. Intensité (volts) Unités arbitraires 1024 10 Conversion Source Lumineuse Temps 0 0 Photomultiplicateur Flux Figure 9: Principe de fon ctionn ement d’un conv ertis seur analogique d igital (ADC). CELLULE : Unités arbitraires 10 1024 Nombre de cellules 900 1 0 10 Intensité (volts) Unités arbitraires 1024 2 450 0 1024 10 0 Conversion 10 0 1024 3 Source 450 Lumineuse 0 Temps 0 0 0 Photomultiplicateur 10 1024 900 4 Flux 0 10 0 1024 5 450 0 etc 0 450 900 AVANTAGE ET LIMITES DE LA CMF Ce qui distingu e la CMF des autres techniques analytiqu es et préparativ es est qu’elle réunit les cinq caractéristiques essentielles suiv antes: analyse quantit ativ e, sensibilit é de détection, rapidité, analyse multip aramètrique cellu le par cellul e, tri. ANALYSE QUANTITATIVE SENSIBILITE DE DETECTION VITESSE DE TRAVAIL L’ANALYSE SIMULTANEE DE PLUSIEURS PARAMETRES LE TRI PRINCIPES DE L’IMMUNOFLUORESCEN CE Les anticorps monoclonaux (AcM), dirigés contre des composants membranaires spécifiques, permettent de distinguer des sous-populations lymphocytaires. Marqueur fluorescent Anticorps Antigène CELLULE Figure 1: IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE Marqueur Fluorescent Anticorps anti-immunoglobuline de souris Anticorps de souris Antigène CELLULE Streptavidine + Marqueur Fluorescent Anticorps de souris biotynilé Antigène CELLULE Figure 2: IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Concentration 1µg/ml 2µg/ml 4µg/ml 8µg/ml 16µg/ml 32µg/ml Controle Moyenne de fluorescence 350 Moyenne de Fluorescence 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 Concentration de l'AcM en µg/ml ÉTUDE DE LA SATURATION D’UN AcM (sim ulation) 40 Pour les marquages multiples plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanément. Dans ce cas, il faut que: -leurs longueurs d’onde d’excitation correspondent à la source lumineuse du cytométre (en général 488nm pour les cytométres les plus courants), -leurs longueurs d’onde d’émission soient suffisamment éloignées pour que leurs signaux soient analysés séparément. Spectre d’émission du FITC Longueur d’onde FILTRES SIGNAUX ++ + - Spectre d’émission de la PE Longueur d’onde FILTRES SIGNAUX +/- ++ + Spectre d’émission de la Cyanine Longueur d’onde FILTRES SIGNAUX - +/Figure 13: ++ Fuites de fluorescence. a b a b Figure 14: Cytogramme biparamètrique (F ITC/PE) réalisé (a) sans compensation et (b) avec compensation de fluorescence. L’analyse multiparamétrique en cytométrie en flux des réactions d’immunofluor escence permet d’identif ier simult anément plusieurs marqueurs membranaires et/ou intr acytoplasmiques de suspensions cellul aires d’origine anim ale. La facilit é avec laquelle nous pouvons maint enant étudier simult anément plusieurs antig ènes fournit de grands moyens pour l’étude de populations cellul aires complexes. Analyse multiparamétrique : réglage de la sensibilité Analyse multiparamétrique : réglage fluorescence 1 Analyse multiparamétrique : réglage fluorescence 2 Analyse multiparamétrique : double marquage Analyse multiparamétrique : double marquage R1 Analyse multiparamétrique : double marquage R1 Analyse multiparamétrique : double marquage R1 R2 Analyse multiparamétrique : double marquage R1 R2 Analyse multiparamétrique : double marquage R1 R2 R3 Analyse multiparamétrique : double marquage R1 R2 R3 Analyse multiparamétrique : double marquage MARQUAG E SPECIFIQUE DE L’ADN CELLULAIRE POUR LA MESURE DU CYCLE ASCII.2 3500 3000 C e 2500 l l 2000 N u 1500 m b 1000 e r 500 0 0 32 64 96 128 160 ASCII.2 DNA Content 3500 3000 192 224 256 CELL CYCLE DATA Mean G1= 96.4 CV G1 = 3.2 C e 2500 l l 2000 % G1 = 63.0 Mean G2=190.0 CV G2 = 3.9 % G2 = 7.8 N u 1500 m b 1000 e r % S G2/G1 500 0 0 32 64 96 = 29.0 =1.970 128 160 192 224 256 Chi Sq.= 2.4 DNA Content Ana lyse du cycle cellulaire d’une lign ée tumorale. Evaluation de la quantité d’ADN par marquage à l’iodure de propidium Evaluation du cycle cellulaire sur des populations révélées par immunofluorescence Cellules totales Cellules totales et cellules marquées
