Hippocampe Groupe 2 26 au 28 mars 2007
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Hippocampe Groupe 2 26 au 28 mars 2007 Etude neurobiologique : les effets des anti-mitotiques (MAM) sur le développement du cerveau Observations Echographie du cerveau de deux foetus. On trouve des anomalies sur le second : • Sur l’arrière du crâne, une poche de liquide ; • du liquide infiltré dans le cortex ; • des malformations. IRM du cerveau de deux fœtus. On trouve aussi des anomalies sur le second : • Asymétrie des ventricules et hétérotopies périventriculaires : accumulation irrégulière des cellules autour des ventricules ; • Autres malformations (au niveau du cortex, par exemple). Problématique et hypothèses Quelles peuvent être les causes de ces malformations ? Hypothèses : Causes environnementales : médicaments, chocs, pollution, hygiène de vie (alimentation, drogue, etc) Causes héréditaires : maladies génétiques ou maladies de la mère On apprend que la mère, ne sachant pas encore qu’elle était enceinte, a suivi un traitement chimiothérapique : elle a pris un médicament antimitotique. Pour le représenter nous utiliserons un médicament semblable appelé MAM. Ce médicament pourrait être responsable des malformations de l’enfant. Test colorimétrique Principe noyau mitochondrie Formazan (violet) Enzyme : succinate déshydrogénase cellule Substrat : MTT (jaune) Première expérience pour vérifier si le test est efficace Matériel : - 1 plaque de culture - 1 micropipette - 1 pipette - 2 tubes - 1 portoir - Des embouts + 1 centrifugeuse - Cellules Milieu de culture MTT de concentration 1 mg/mL Protocole opératoire • Dilution en cascade au demi, depuis le puits 6 au puits 1, ce qui donne un nombre croissant de cellules dans les puits de culture • Ajout de MTT de concentration 1 mg/mL et de volume 50 µL/puits. Résultats Passage de la plaque contenant le formazan dans un spectrophotomètre. Principe : Un spectrophotomètre Courbes étalon L’absorbance augmente avec le nombre de cellules, donc le test est efficace et permet de mesurer le nombre de cellules, sachant que la concentration est proportionnelle à l’absorbance. Test des effets du MAM Matériel : - 2 plaques de culture 1 micropipette Des embouts - MAM de concentrations différentes Mitogène Milieu de culture H2O2 - Protocole opératoire Première plaque : cellules non différenciées Deuxième plaque : cellules différenciées Dans les deux : 1ère ligne: cellules + milieu (référence) 2ème ligne: cellules + MAM (1 µM ) 3ème ligne: cellules + MAM ( 10 µM ) 4ème ligne: cellules + MAM ( 20 µM ) 5ème ligne: cellules + mitogène (témoin de prolifération) 6ème ligne: cellules + H2O2 (témoin de mort) Résultats : N2A non différenciées H2O2 a bien tué les cellules comme prévu. Le milieu les a maintenues en vie. Le mitogène aurait du les faire proliférer : il est possible que nous n’ayons pas utilisé le bon produit. Le signal du MAM a diminué de + de 60%. En comparaison avec H2O2, le MAM a fait mourir les cellules. Résultats: N2A différenciées Avec le mitogène, elles ont bien proliféré. Le milieu les a maintenues en vie. Le MAM a le même effet que le milieu. Les cellules différenciées ne sont donc pas sensibles au MAM. Test qualitatif au microscope optique Matériel : - 1 plaque de culture 24 puits 1 micropipette Des embouts - Milieu de culture MAM Neurones N2A non différenciées Neurones sans MAM à t = 0 Neurones + MAM (10 µM ) à t = 0 N2A non différenciées sans MAM à t = 0 N2A non différenciées avec MAM (20µM) à t = 0 Neurones sans MAM à t = 1 Neurones avec MAM (10 µM) à t = 1 N2A non différenciées sans MAM à t =1 N2A non différenciées avec MAM (20 µM) à t = 1 Résultats • Le MAM n’a pas eu d’effet significatif sur les neurones (cellules différenciées) • On peut deviner, grâce à leur forme, que les cellules sont mortes ; cependant, n’ayant pas l’habitude de reconnaître leur état, nous ne pouvons pas l’affirmer avec certitude. CONCLUSION Le MAM a donc un effet nocif uniquement sur les cellules non différenciées. Ce constat explique les malformations du fœtus, dont le cerveau est en formation : ses cellules ne sont pas encore différenciées.
