ADN - Free
publicité
Enzymes recopiant les acides nucléiques Enzymes recopiant l’ADN ou l’ARN DNA polymérase DNA dépendante DNA polymérase RNA dépendante RNA polymérase DNA dépendante RNA polymérase RNA dépendante Ces enzymes synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’ -> 3’ La synthèse se fait de manière complémentaire et antiparallèle. L’enzyme fonctionne en présence de nucléosides triphosphates (XTP) ou de désoxynucléosides (dXTP) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES ADN POLYMÉRASES - Un brin d'ADN matrice - Une amorce oligonucléotidique - Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'(OH) 5' 5' 3' Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 DNA polymérase DNA dépendante Ces enzymes recopient l’ADN en ADN. Elles nécessitent une amorce d’acide nucléique. La réaction catalysée est: (dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi Amorce avec une extrémité 3’-OH libre La nouvelle chaîne est synthétisée dans le sens 5’ 3’ Règle de complémentarité et de polarité inverse Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La DNA polymérase 1 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Fragment de KLENOW Le fragment de Klenow est préparé à partir de la DNA polymérse 1 d’E.coli. Ce fragment ne possède plus d’activité exonucléasique 5’ 3’ mais garde l’activité polymérasique et l’activité exonucléasique 3’ 5’. Cette enzyme est utilisée au laboratoire car elle permet de contrôler si la base qui vient d’être ajoutée obéit à la règle e complémentarité. (fonction d’édition) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 LES ARN POLYMÉRASES - Synthèse d'ARN sans amorce préalable. - Présence de nucléotides : NTPs et d'ions magnésium (Mg2+). Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 - Une synthèse du brin nouveau dans le sens 5' 3'. - Absence de fonction d'édition. - Nécessité de reconnaître le promoteur spécifique correspondant. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Plan du cours : première partie Qu’est ce que la biologie moléculaire ? A : rappels sur le génome Les nucléotides Les acides nucléiques La chromatine B: Les outils de la biologie moléculaire Enzymes qui coupent les acides nucléiques Enzymes qui changent les contraintes des AN Enzymes qui travaillent sur les phosphates Enzymes qui recopient les acides nucléiques C: Les techniques de la biologie moléculaire Purification des acides nucléiques Electrophorèse sur gel Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La transcription inverse du génome rétroviral Synthèse des deux brins de l ’ADN proviral à partir de l ’ARN génomique t-RNA Lys3 5’ U3 ’ U3 RR’ ’ RR U5 ’’ U5 U5 PBS ’ PBS PBS PPT R’ RR U3 ’ U3 U3 U3 U5 ’ U5 U5 PBS PBS 3’ LTR LTR Le t-RNA sert d’amorce à la transcriptase inverse pour la synthèse de l’ADN « strong stop » La RNAse H dégrade l’ARN dans un heteroduplex ADN/ARN Premier saut de brin : le DNA néo synthétisé s’apparie à la région R de l ’ARN. Elongation de l’ADN par la transcriptase inverse ( brin - ) La RNAse H dégrade la plus grande partie de l’ARN à l’exception d’une région riche en purines (ppt) Synthèse du second brin d ’ADN ( brin + ) La région riche en purines et le t-RNA sont dégradés par la RNAse H Second saut de brin : le DNA néo synthétisé s’apparie à la région PBS de l ’ARN. La synthèse de l ’ADN proviral est complétée Les extrémités de l ’ADN proviral sont redondantes. Il s’agit des LTR, nécessaires à l’intégration Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Préparation des acides nucléiques L’ADN se trouve dans le noyau des cellules eukaryotes. La première étape de la préparation consistera à isoler les noyaux des autres organites On utilisera la technique de centrifugation différentielle. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Isolement de noyaux On découpe finement le morceau d’organe à extraire On homogénéise de manière douce dans une solution tampon placée entre 0°C et 4°C. On filtre à froid l’homogénat pour éliminer les morceaux de tissus et les cellules intactes On centrifuge le filtrat à 600g pendant 10’ On reprend le culot de noyaux à froid dans un tampon Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La centrifugation vitesse angulaire (rad.s -1 ) V vitesse de sédimentat ion (cm.s ) -1 reff rayon effectif(c m) g .reff 2 v .reff .S 2 S= M (1-V.r) f Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Principes de la centrifugation Saccharose La sédimentation en gradient de saccharose sépare les macromolécules en fonction de leur masse moléculaire Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Une centrifugation en gradient de Chlorure de Césium sépare les macromolécules en fonction de leur densité Séparation selon le poids moléculaire ou la densité Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Centrifugation en gradient de Chlorure de Césium Supposons que l'on traite ce mélange d'ADN et d'ARN par une RNase on n'observe plus qu'une bande qui migre à la densité de l'ADN. (b) a On charge un échantillon d'ADN dans un tube et un échantillon de protéine dans un autre. A l'équilibre, on obtient les bandes en c et d. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 c densité Dans le tube e on fait centrifuger un échantillon de chromatine. On obtient une bande en e b densité Si l'on charge un mélange d'ADN et d'ARN sur sur un gradient de Chlorure de Césium 6M et que l'on centrifuge à l'équilibre, chaque macromolécules se répartit selon sa densité. (a) d e Isolement de noyaux On découpe finement le morceau d’organe à extraire On homogénéise de manière douce dans une solution tampon placée entre 0°C et 4°C. On filtre à froid l’homogénat pour éliminer les morceaux de tissus et les cellules intactes On centrifuge le filtrat à 600g pendant 10’ On reprend le culot de noyaux à froid dans un tampon Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Extraction et purification de l'ADN Les noyaux sont éclatés mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruit les membranes et la protéinase digère les protéines associées à l'ADN Centrifugation à haute vitesse Extraction par le phénol Les macromolécules vont au fond du tube Il y a séparation de la phase aqueuse et de la phase phénolique. L'ADN va dans la phase aqueuse et les protéines dénaturées restent à l'interphase Précipitation à l'éthanol à froid Centrifugation en gradient de chlorure de césium Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 DNA f Loi de Beer-Lambert I0 I l %T 100 T I T I0 A log 10 I0 I T = Transmission A = Absorbance La loi de Beer-Lambert A .l.c : Absorbance molaire (L mol -1 cm-1 ) l : Trajet optique (cm) c : Concentrat ion (mol L-1 ) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Absorbance molaire L'absorbance molaire est une caractéristique physique associée à une molécule. Molécule λmax (nm) ε.10-3(M-1.cm-1) Trp 280 219 5,6 47,0 Tyr 274 222 193 1,4 7,0 48,0 L'absorbance molaire des acides nucléiques est la moyenne de l'absorbance molaire de chaque base. Phe 257 206 188 0,2 9,3 60,0 His 211 5,9 Cys 250 0,3 Adénine 260,5 13,4 Adénosine 259,5 14,9 Guanine 275 8,1 Cytosine 267 7,1 Uracil 259,5 8,2 Thymine 264,5 7,9 DNA 258 6,6 (par base) RNA 258 7,4 (par base) Pour l'ADN natif, on estime qu'une absorbance de 0,212 sous 1 cm de traversé correspond à une concentration de 10 µg/ml Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Spectre d'absorption de l'ADN A260nm A280nm ADN d'E Coli natif 2 lmax : 258 nm 0.31 0.16 A260nm si A280nm < 1.85 l'ADN est contaminé par des protéines Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Dénaturation de l'ADN Quand on chauffe une molécule d'acide nucléique, elle se dénature. La double hélice se sépare. Il y a rupture des liaisons hydrogènes et désempilement des bases. La dénaturation de l'ADN s'accompagne d'un effet hyperchromique. L'absorbance de la molécule augmente. t° t° On peut donc suivre la dénaturation thermique d'un acide nucléique en mesurant la variation de l'absorbance en fonction de la température. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Hyperchromicité ADN d'EColi à 25°C ADN d'EColi à 82°C lmax : 258 nm hyperchromicité Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La température de demi dénaturation ( tm) est la température pour laquelle 50% de l'ADN est dénaturé Absorbance (260 nm) Courbe de dénaturation thermique tm=48°C Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Effet de la force ionique Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Effet de la composition en paires GC La stabilité des acides nucléiques dépend de la teneur en GC de l'acide nucléique. Appariement G-C = 3 liaisons hydrogènes Appariement A-T = 2 liaisons hydrogènes Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Gels d'électrophorèse L'électrophorèse Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique La particule atteint très rapidement une vitesse limite v= q: charge de la particule; E: champ électrique; f: coefficient de frottement particule/solvant q.E/f avec _ q v E v + q dépend de la charge de la macromolécule f dépend de la taille (encombrement) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Gel de polyacrylamide En faisant varier la concentration d'acrylamide et de bis acrylamide, on obtient des mailles très différentes par polymérisation. CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH méthylène bis acrylamide Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Electrophorèse sur Gel de polyacrylamide Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Détermination du poids moléculaire d'un AN Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Plan du cours : deuxième partie D : Réplication de l’ADN Définitions élémentaires Mécanismes de la réplication chez EColi Mécanisme de la réplication chez les eucaryotes Mécanismes de la réparation E: La Transcription Les prokaryotes Les eucaryotes F: La Traduction Le Code génétique L’initiation L’élongation La terminaison G : De l ’ADN aux protéines Comment cela a-t-il commencé ? Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 !! ?? La réplication de l'ADN chez E.coli ● Généralités ● Définitions élémentaires ● Mécanismes de la réplication Origine de réplication Initiation de la réplication Déplacement de la fourche de réplication Fragments d'Okazaki Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Généralités sur la réplication Trois propriétés sont communes à tout système de réplication La réplication est semiconservative La réplication est bidirectionnelle Les brins neo synthétisés ont une origine commune Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Réplication de la double hélice d ’ADN En séparant les brins de l'ADN, il est possible de copier chaque brin. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Modèles possibles de réplication A partir de la structure WatsonCrick du DNA on peut construire plusieurs modèle de réplication un modèle conservatif Chaînes parentales ou semi conservatif. Après une division Après 2 divisions Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Expérience de Meselson et Stahl La première évidence expérimentale d'une réplication semi-conservative On cultive des bactéries E.coli dans un milieu contenant un isotope lourd de l'Azote 15N Quand tout l'ADN est marqué, on transfert les cellules dans un milieu de culture avec de l'azote normal léger 14N On prélève ensuite à des temps variables un échantillon de la culture et on analyse l'ADN sur un gradient de densité de ClCs Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La réplication est semi-conservative La densité de 15N est supérieure à la densité de 14N. Si la réplication était conservative, on observerait après une division deux bandes: une lourde et une légère. En réalité on observe un seule bande de densité intermédiaire. La réplication est semi-conservative. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Modèles possibles de réplication Unidirectionnelle ou Bidirectionnelle Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La réplication est bidirectionnelle La microscopie électronique nous montre que la progression de la réplication est bidirectionnelle ce qui est confirmé par une expérience de marquage à la thymidine tritiée. Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Mode d'action des DNA polymérases La réplication de l'ADN est catalysée par une DNA polymérase DNA dépendante La réplication nécessite un modèle l'ADN matrice et une petite séquence oligonucléotidique, l'amorce ou primer. Les substrats de la DNA polymérase sont les 4 désoxynucléotides triphosphate: dATP, dGTP, dCTP et dTTP Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 DNA polymérase DNA dépendante Cette enzyme recopie de l’ADN en ADN. Elle nécessite une amorce d’acide nucléique. Amorce avec une extrémité 3’-OH libre La réaction catalysée est: (dXMP)n + dXTP (dNMP)n+1 + PPi La nouvelle chaîne est synthétisée dans le sens 5’ 3’ Règle de complémentarité et de polarité inverse Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 L' ADN POLYMÉRASE - Un brin d'ADN matrice - Une amorce oligonucléotidique - Une synthèse du brin nouveau 5' 3' 3'(OH) 5' 5' 3' Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 La polymérase sélectionne la dATP car la thymine est complémentaire de la Guanine La formation de la liaison ester entre le 3'OH du nucléotide n et le phosphate α du nucléotide n+1 entraîne l'élimination d'un pyrophosphate Cyt Thy Gua Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01 Polymérisation des nucléotides Séquence Quick Time dans Réplication (Polymerisation des nucléotides) Pr. Jacques PAOLETTI SC-L3BH-01
