techniques_analyse_nov2007 JF Emile
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DES de pathologie : Pathologie moléculaire Techniques d’analyse de l’ADN J.F. Emile Service de pathologie, Hôpital Ambroise Paré Faculté de Médecine Paris-Ile de France Ouest et INSERM U602 Pathologie moléculaire • Objectifs du cours : – Comprendre l’importance de la biologie moléculaire dans le diagnostic anatomopathologique, notamment en pathologie tumorale – Comprendre et critiquer des articles de pathologie moléculaire – Notions de base pour pouvoir s’impliquer dans une activité de pathologie moléculaire au sein d’un laboratoire Prise en charge d’un prélèvement en anatomie pathologique Toujours Fixation Prélèvement tumoral frais Inclusion en paraffine Rarement Congélation Biologie moléculaire Diagnostic histologique Pathologie moléculaire • Analyses in situ – Protéines (expression) : immunohistochimie (chromogène, IF, confocal, cinétique,…) – ARN (expression) : HIS (chromogène, sondes radiactives) – ADN • FISH, CISH (Amplification, réarrangements) • TUNEL (apoptose) • Analyses « en tubes » Techniques d’analyse « en tube » de l’ADN : Plan du cours • • • • Extraction de l’ADN et contrôle de qualité Amplification de l’ADN Séquençage Analyses de l’ADN – – – – – – Détection de séquences exogènes (ex: pathogènes) Analyse des microsatellite (LOH et MSI) Détection de mutations Clonalité (HUMARA) Méthylation de l’ADN Analyses à haut débit Extraction de l’ADN pour analyse Pour les analyses « en tubes », un contrôle morphologique préalable est nécessaire • Macroscopie : insuffisant • Microscopie Coupes sériées : – Histologie sur première et dernière coupes. – Biologie moléculaire sur les coupes du milieu • Microdissection – Manuelle – Laser 1 cm Micro-dissection manuelle Exon 11 du gène KIT Extraction de l’ADN tissulaire • Prélèvements frais ou congelés – Protocole « classiques » de biologie moléculaire – Une étape de broyage mécanique est souvent utile • Prélèvements fixés et inclus en paraffine Lésions induites par le formol : – Dérivés hydroxyméthyl : • XXX-NH-CH2-OH – Ponts méthylènes entre deux fonctions amines : • XXX-NH-CH2-NH-XXX • Sur acides nucléiques intra- ou inter-brins • Entre acides nucléiques et protéines Extraction de l’ADN à partir de tissus fixés en formol • Nombreux protocoles publiés • ADN : trois étapes principales : – Déparaffinage – Digestion enzymatique – Purification de l’ADN Extraction d’ADN : le déparaffinage • Pas indispensable • Xylène puis alcool à dilutions croissante puis tampon aqueux – Sur coupes (microdissection) : attention aux contaminations – en tubes • Par la chaleur : température > 56° Extraction d’ADN : Influence de la température D’après Overton et al, Cytometry 1994 Extraction ADN : Digestion enzymatique D’après Diaz-Cano et al, Diagn Mol Pathol 1997 Purification – Phénol/chloroforme/alcool isoamylique – Colonnes d’affinité – Autres : chauffage, « salting-out », … – Prendre en compte : Simplicité, fiabilité, rendement, degré de pureté requis, toxicité,... Les protocoles d’extraction d’ADN • Nombreux • Très variés : – Ex : 7 mn au micro-onde dans H2O – Ex : 7 jours avec déparaffinage au xylène, digestion prolongée avec protéinase K et purification phénol/chloroforme. – Tous les intermédiaires Facteurs influant sur la qualité et la quantité d’ADN obtenu • • • • Nature du fixateur : Formol ou AFA / Bouin +++ Temps de fixation : 24 heures / qq jours +++ Température de fixation : RT / 4° Imprégnation : Nature des solvants, temps, températures, pression,… • Mode de conservation des blocs ou des coupes • Epaisseur des coupes ? Extraction d’ADN : aspects pratiques • Importantes variations en fonction de la provenance des prélèvements Problème pour les études multicentriques • Deux situations principales : – Blocs entiers ou macrodissection – Microdissection ou lames rares La fragmentation de l’ADN conditionne la taille des PCR D’après Poncin et al, Diagn Molec Pathol 1999 Contrôle de l’ADN obtenu • Qualitatif : – PCR dont le produit est de taille > aux tests prévus – PCR multiplex (ex : 150, 300 et 600 bp) – Kit spécifiques • Quantitatif : – Dosage pondéral : non – PCR temps réel PCR multiplex Dosage pondral ADN/nombre de copies de 300bp amplifiables 60 50 40 30 20 10 0 0 500 1000 1500 2000 copies 300bp/µl Qualité de l’ADN extrait de blocs de tissus fixés et inclus en paraffine 0 100% 90% 0 0 1 2 1 3 7 10 80% positif négatif 70% 60% 50% 40% 10 25 6 15 15 47 8 9 16 22 16 30% 20% 10% 0% 1 2 3 4 5 6 7 • Bon pour analyse dans 75% des cas (PCR 250bp +) • Dépends des conditions de traitement des prélèvements Le choix des prélèvements Indications Particularités Frais Extraction ou tri de cellules viables Uniquement prospectif Peu de patients Congelés ARN ADN de haut poids moléculaire Souvent prospectif Peu de patients Coût ++ Contraintes de qualité Fixés ADN fragmenté (<300bp) La majorité des patients Rétrospectif et/ou prospectif Conservation/transport faciles Techniques d’analyse « en tube » de l’ADN : Plan du cours • • • • Extraction de l’ADN et contrôle de qualité Amplification de l’ADN Séquençage Analyses de l’ADN – – – – – – Détection de séquences exogènes (ex: pathogènes) Analyse des microsatellite (LOH et MSI) Détection de mutations Clonalité (HUMARA) Méthylation de l’ADN Analyses à haut débit PCR : vocabulaire • Séquence cible : base de données • Amorces : oligonucléotides choisis avec logiciels appropriés • Matrice : extrait d’ADN du prélèvement • Thermocycleur – Température de dénaturation : 92° – Température d’hybridation : variable (50 à 60°) – Température d’élongation : 72° • Analyse : électrophorèse (minigel d’agarose ou capillaire) Marqueurs de taille Un cycle de PCR Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) Limites de la PCR • • • • Contamination +++ Séquences homologues Qualité de l’ADN à analyser Saturation PCR Exemples de choix d’amorces : Exon 11 de KIT PCR : Analyse des produits • Electrophorèse en gel (agarose) • Migration en capillaire PCR temps réel • Principe : génération, à chaque cycle, d’un signal fuorescent proportionnel au nombre de copies de la séquence cyble Techniques d’analyse « en tube » de l’ADN : Plan du cours • • • • Extraction de l’ADN et contrôle de qualité Amplification de l’ADN Séquençage Analyses de l’ADN – – – – – – Détection de séquences exogènes (ex: pathogènes) Analyse des microsatellite (LOH et MSI) Détection de mutations Clonalité (HUMARA) Méthylation de l’ADN Analyses à haut débit Analyse de séquences Analyse de séquences Analyse de séquences Techniques d’analyse « en tube » de l’ADN : Plan du cours • • • • Extraction de l’ADN et contrôle de qualité Amplification de l’ADN Séquençage Analyses de l’ADN – – – – – – Détection de séquences exogènes (ex: pathogènes) Analyse des microsatellite (LOH et MSI) Détection de mutations Clonalité (HUMARA) Méthylation de l’ADN Analyses à haut débit ADN extrait de tissus inclus en paraffine : recherche d’un agent infectieux 1 2 3 EBV DNA b Globin 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Microsatellites • Séquences répétitives de l’ADN • Généralement non codantes • Présentes en très grand nombre dans pratiquement tout le génome • Certains sont polymorphes Exemple …AGGGTTCAG…CACACA(x)CA…GCCTAAAG… Microsatellites : analyse Microsatellites en PCR multiplex Utilisation des microsatellites pour l’analyse du génome tumoral Non tumoral Tumeur LOH MSI Perte d’hétérozygotie (LOH) Non tumoral Tumeur LOH Microsatellites : analyse Microsatellites : analyse Instabilité génétique (MSI) Non tumoral Tumeur MSI Réparation des erreurs de réplication Les 2 principaux types d’adénocarcinomes colorectaux • Avec instabilité génétique – 15% des formes sporadiques – Formes familiales non polyposiques (HNPCC) • Avec perte d’hétérozygotie – 80% des CCR Remerciements • Quelques illustrations de ce diaporama proviennent : – du site de l'université de Sherbooke http://pages.usherbrooke.ca/bcm-514bl/index.php – du livre "Biologie Moléculaire de la cellule" Alberts, et al. Médecine-Sciences Flammarion
