L`hybridation fluorescente (FISH)

L'hybridation fluorescente
(FISH)
fluorescent in situ hybridization
Définition
• repérer la présence d'anomalies
chromosomiques par un système couplé
anticorps-fluorophore
• Les sondes
• L'hybridation
• La révélation
• L'observation :
Les sondes
un brin d'ADN comportant des nucléotides modifiés, à partir d'un brin matrice de
départ. polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de monobrin (brins
composés de six nucléotides aléatoires)
N : brin complémentaire synthétise entre l'hexamère 1 et l'hexamère 2
M: brin matrice
En rose : les nucléotides marqués
trois types principaux de sondes
• séquences uniques: identification d’une séquence spécifique
• séquences multiples: spécifiques à un chromosome entier.
• ADN -satellite: identification de séquences au niveau du centromère du
chromosome.
Les sondes marquées : la biotine révélée par l'avidine
la digoxygénine révélée par un anticorps anti-digoxygénine,
les deux couplés à un fluorochrome
Le principe
L'ADN cible parmi l'ADN cellulaire
Dénaturation de l'ADN cellulaire par chauffage
Une sonde d'ADN complémentaire de l'ADN cible et
munie d'une molécule de reconnaissance (R).
Hybridation de la sonde et de la séquence cible.
Révélation par reconnaissance de la molécule R par un
anticorps anti R muni d'un fluorophore F.
L'observation au microscope à fluorescence permet de
visualiser la présence de la séquence cible.
La révélation
système biotine-avidine: reconnaître les sondes par des anticorps flanqués de sites
moléculaires fluorescent,
biotine liée de streptavidine possédant un site fluorescent.elles-mêmes reconnues par
des anticorps anti-avidine "équipés" d'un site biotine et d'un site fluorescent (ou
fluorophore).
M : brin d' ADN matrice dénaturé , H : séquence sonde hybridée.
L'observation
microscope à fluorescence, la lumière émise par les sites fluorescent : sites hybridés.
INDICATIONS
Diagnostic de la trisomie 21
Individu A
Individu B
Une sonde pour identifier le chromosome 13 (vert),
une sonde pour identifier le chromosome 21 (rouge)
TECHNIQUE RAPIDE DE
DIAGNOSTIC PRENATAL
•L’amniocentèse :dépister les anomalies chromosomiques
•L’analyse FISH : pas de culture cellulaire. Elle s’applique
directement aux cellules contenues dans le liquide amniotique.
•fréquence anomalies chromosomiques: Les trisomies des
chromosomes 21,13, 18, X et Y représentent 70% des
anomalies.
•Ce test dépiste la trisomie 21, la trisomie 13 et la trisomie 18
ainsi que les anomalies de nombre des chromosomes sexuels
(Turner, triple X, Klinefelter, Double Y).
DIAGNOSTIC PRENATAL
• L’analyse fiabilité: 99,9%
• Le taux de réussite technique: 97%
anomalies numériques des chromosomes 21,
18, 13, X, Y.
• 3 causes principales des échecs :
• le nombre de noyaux est trop faible;
• les noyaux sont d’origine maternelle
• un problème technique lors de la
manipulation.
Diagnostic d'une translocation
équilibrée.
un chromosome ou un fragment de
chromosome se soude à un autre
chromosome.
translocation équilibrée :phénotype
de l'individu est normal : il n'y a
alors ni perte , ni gain de matériel
génétique
ex: translocation équilibrée entre
les chromosomes 11 et 12
Une sonde du chromosome 11
(rose); une sonde caractéristique
du chromosome 12 (vert)
Diagnostic d'une délétion
Une délétion : perte d'un fragment de chromosome.
ex : sd de Di George: anomalies thymiques, cardiaques ,hormonaux et psychiques
individu normal
individu malade
Les deux caryotypes après la
technique du FISH
Individu normal
individu malade
Marquage de l'extrémité du chromosome 22 sonde associée à un marqueur vert;
marquage de la zone absente après délétion, avec une sonde associée à un marqueur
rouge
Étude de cellules malignes
marquage avec un mélange de plusieurs sondes chacune associée à un fluorophore
différent permet une "peinture des chromosomes".
Exemple : étude chromosomique d'une cellule cancéreuse du foie chez l'homme.
a: après révélation;
b: après traitement à l'ordinateur
cellules malignes :
nombreuses anomalies
chromosomiques
Limites du test
•Le FISH : 70% des anomalies en moins de 48 heures.
•Ce test ne dépiste que les anomalies des chromosomes;
• ne dépiste pas les anomalies des gènes des chromosomes.
•recourir à un conseil génétique qui permettra d’envisager le
diagnostic prénatal souhaitable lors de maladie génétique due à
une mutation génique.
Caryotype
Le caryotype(ou caryogramme): arrangement
standard de l'ensemble des chromosomes d'une
cellule. Les chromosomes sont photographiés et
disposés selon un format standard : par paire et
classés par taille.
but : détecter des aberrations chromosomiques
(comme la trisomie 21) ou d'identifier certains
aspects du génome de l'individu, comme le sexe (XX
ou XY).
Caryotype d'un individu de sexe masculin (XY)