ARNm Oligonucléotide ADN
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Gain de fonction, perte de fonction Gain de fonction Sur-expression 24 h après expression physiologique Produit de gène x Sous-expression Perte de fonction 24 h après expression physiologique Produit de gène x Sous-expression Perte de fonction Approche : Perte de fonction Produit de gene x = protéine x expression physiologique protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Sous-expression macromolécule informationnelle Approche : Perte de fonction Produit de gene x = protéine x expression physiologique protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Sous-expression macromolécule informationnelle Déstruction de la protéine x - difficile à envisager Inhibition de l’activité de la protéine x - Anticorps neutralisant - Expression de dominant négatif - Peptide inhibiteur d’interaction Elimination de l’activité de la protéine x - difficile à envisager Inhibition de l’activité de la protéine x - Anticorps neutralisant - Expression de dominant négatif - Peptide inhibiteur d’interaction Anticorps neutralisant -cc-cc- chaîne légère chaîne lourde Anticorps neutralisant Protéine x « active » Protéine x « in-activée » Anticorps neutralisant Site fonctionelle Site fonctionelle bloquée Protéine x « active » Protéine x « in-activée » transfection Anticorps neutralisant Fab (fragment liant l’antigène) -cc-cc- chaîne légère Fc chaîne lourde Anticorps neutralisant Fab (fragment liant l’antigène) -cc-cc- ScFv = Short-chain variable fragment Anticorps neutralisant Anticorps neutralisant ScFv (fragment liant l’antigène) promoteur plasmide ADN codant ScFv promoteur plasmide plasmide transfection Elimination de l’activité de la protéine x - difficile à envisager Inhibition de l’activité de la protéine x - Anticorps neutralisant - Inhibiteur spécifique - Expression de dominant négatif - Peptide inhibiteur d’interaction dominant négatif promoteur TGT AGT plasmide plasmide Mutagenèse dirigée C Protéine x « active » S Protéine x « inactive » dominant négatif substrat PO4 PO4 C C C C S S S S dominant négatif C S S S S S S S C S S S S S S C S C activité ras plasmide vide dominant négatif S17N G15A Elimination de l’activité de la protéine x - difficile à envisager Inhibition de l’activité de la protéine x - Anticorps neutralisant - Expression de dominant négatif - Peptide inhibiteur Peptide inhibiteur d’activité C C C Peptide inhibiteur d’interaction C ADN codant peptide promoteur peptide de synthèse GRKKRRQRRRPPQC plasmide plasmide transfection CPP peptide Approche : Perte de fonction Produit de gene x = protéine x expression physiologique protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Sous-expression macromolécule informationnelle Déstruction spécifique de l’ARNm codant la protéine x Avantage majeure : spécificité du code génétique - spécificité théoriquement absolue - ne nécessite pas de connaissances préalables concernant protéine x Destruction spécifique de l’ARNm codant la protéine x - Stratégie antisens - Stratégie RNAi Destruction spécifique de l’ARNm codant la protéine x - Stratégie antisens - Stratégie RNAi Stratégie d’oligonucléotide antisense Oligonucléotide ADN RNase H ARNm Clivage Stratégie d’oligonucléotide antisense Synthèse chimique d’oligonucléotides transfection Stratégie d’oligonucléotide antisense 1/2-vie d’oligonucléotides ADN 5 minutes Sites propices à l’hybridation peu nombreuses peu prévisible Analogues d’ADN à demi-vie longue Base Base O O O O NH O P O S P O O P O O O Base O HN N O O O phosphodiester bond modification Base N H « Peptide Nucleic Acid » O O P O Base O O O Base HN O O P O O O N O Phosphodiester base modification O O P O O O R ribose modification © ian robbins Destruction spécifique de l’ARNm codant la protéine x - Stratégie antisens - Stratégie RNAi Interférence par ARN (RNAi) = post-translational gene silencing (PTGS) (invalidation post-transcriptionelle) Drosha/DGCR8 pre-miRNA pri-miRNA Exportin 5-RanGTP Dicer miRNA mi = micro © ian robbins PAZ PAZ Ago Ago RISC RISC = RNAi-Silencing Complex PAZ PAZ Ago Ago RITS RITS = RNAi Translational Silencing ARNm codant protéine x PAZ m7GpppG Ago AAAAAAAAA Clivage par RISC P-body PAZ Ago AAAAAAAAA m7GpppG Séquestration par RITS polyribosomes m7GpppG AAAAAAAAA Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver & Craig C. Mello Nature (1998) 391 : 806 Contrôle sans sonde Pas d’ARN micro-injecté ARN double brin ARN antisense Simple brin Effets d’un RNAi contre l’ARNm de mex-3 Hybridation in situ Transcript disappears (RNA degraded) shRNA UUUU pre-miRNA pri-miRNA si = short interfering sh = short hairpin miRNA siRNA Dicer dsRNA ADN codant protéine x orientation antisens Synthèse chimique d’oligonucléotides ARN double brin promoteur plasmide transfection ADN codant tige-boucle shRHA ou miRNA promoteur plasmide Approche : Perte de fonction Produit de gene x = protéine x expression physiologique protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Sous-expression macromolécule informationnelle Destruction spécifique de l’ADN codant la protéine x - souris ko - cellules issues de souris ko Reduire le taux de traduction de l’ADN codant protéine x - ADN formant triple hélice - leurres DNA Faacteur de transcription Oligonucléotide formant triple hélice Oligonucléotide ADN double brin
