Approfondissement des connaissances en biologie moléculaire
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Approfondissement des connaissances en biologie moléculaire [email protected] Master IADE – Année 2012-2013 Plan du cours • Rappels de biologie moléculaire et de biologie cellulaire – Les molécules du vivant – Le support de l’information génétique et son décodage – L’organisation de la cellule animale • Les outils et les approches expérimentales utilisées par les chercheurs • Les mécanismes qui permettent aux cellules de communiquer entre elles – Les récepteurs membranaires : les exemples du récepteur ß2adrénergique et du récepteur de la leptine – Les récepteurs nucléaires: l’exemple du récepteur des glucocorticoïdes • Notions sur la biologie du développement: l’exemple du système hématopoïétique • Notions sur les mécanismes de mort cellulaire: l’exemple des lymphocytes T • Notions sur la biologie du vieillissement : télomères, radicaux libres, l’exemple des réponses immunitaires chez les personnes âgées Rappel sur le support de l’information génétique et son décodage (1) • Le code génétique établit une correspondance entre un triplet de nucléotides, appelé codon, et un acide aminé qui est incorporé dans la protéine. Il se résume à un tableau associant chacun des 64 codons possibles avec un des 20 acides aminés présents dans les protéines • La transmission de l’information de l’ADN à la protéine s’effectue par l’intermédiaire d’un ARN messager Rappel sur le support de l’information génétique et son décodage (2) • Transcription – Processus permettant la synthèse d’un ARN messager à partir de l'ADN – S’effectue dans le noyau cellulaire • Traduction – Processus permettant la synthèse de protéine à partir d’une ARN messager – S’effectue dans le noyau cellulaire – Fait intervenir des ribosomes qui assemblent les protéines en réalisant la lecture séquentielle des codons sur l'ARN messager – Fait intervenir des ARN de transfert qui jouent le rôle d’adaptateurs en interagissant (1) avec le codon auquel ils s'apparient via un triplet de nucléotides complémentaires, l'anticodon, et (2) l'acide aminé correspondant attaché par une liaison ester à leur extrémité 3'-hydroxyle. Rappel sur le support de l’information génétique et son décodage (3) L’organisation de la cellule eucaryote Le noyau cellulaire Hétérochromatine ADN et protéines associées (chromatine) Réticulum endoplasmique Nucléole Centrosome Filaments intermédiaires Pore nucléaire Microtubules Lamina nucléaire Membrane nucléaire euchromatine La chromatine • Forme sous laquelle se présente l'ADN dans le noyau • Constituée d’ADN, d'ARN et de protéines (histones et protéines nonhistones) • Peut se présenter sous deux formes – L’euchromatine : structure décondensée permettant l'expression génique – L'hétérochromatine: Structure condensée qui est consistué d’ADN non transcrits hétérochromatine euchromatine Le nucléosome • Complexe d’ADN et de protéines qui constitue l’unité de base de la chromatine • La particule de cœur du nucléosome est formée d’un cœur protéique de huit protéines histones (deux exemplaires de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4) autour duquel s’enroulent environ 146 paires de bases d’ADN sur un tour trois quarts • Le nucléosome forme un cylindre de 11 nm de diamètre sur 5,5 nm de haut et un poids moléculaire de 205 kDa Les autres protéines qui se lient à l’ADN L’enchaînement des nucléosomes forme un nucléo-filament, aussi appelé fibre de chromatine de 11 nm ou « collier de perles ». L’empilement des nucléosomes adjacents Deuxième niveau de compaction de l’ADN La condensation de la chromatine ADN nucléosomes armature relâché (chromosome interphasique) dense (chromosome métaphasique) boucles Enveloppe nucléaire • Double bicouche lipidique séparant le nucléoplasme et le cytoplasme – Bicouche externe en continuité avec les membranes du réticulum endoplasmique – Bicouche interne tapissée à l'intérieur du nucléoplasme par la lamina • Se désagrège au moment de la mitose • Percée de trous de 120 nm de diamètre appelées pores nucléaires qui permettent les échanges entre le cytoplasme et le nucléoplasme – Diffusion passive pour les les ARN messagers et les protéines de moins de 30 kDa – Diffusion active pour les protéines de poids moléculaire > 30 kDa L’enveloppe nucléaire et ses pores Le nucléole • Sous-compartiment cellulaire du noyau et est le lieu où se produit la transcription des ARN ribosomiques (ARNr), qui constituent avec des protéines, les deux sous-unités des ribosomes. Le rôle du nucléole dans la production des ribosomes noyau protéines ribosomales fabriquées dans le cytoplasme cytoplasme nucléole Le système endo-membranaire Le réticulum endoplasmique Enveloppe nucléaire Noyau Ribosomes Réticulum endoplasmique rugueux Réticulum endoplasmique lisse Réticulum endoplasmique • Sous-compartiment composé d'une membrane et d'une lumière • En continuité avec l'enveloppe nucléaire et en relation avec les autres compartiments, notamment les vésicules de l'appareil de Golgi • Existe sous deux formes: le réticulum endoplasmique rugueux (RER), ou granuleux (REG),et le réticulum endoplasmique lisse (REL) • le réticulum endoplasmique rugueux est couvert de ribosomes. Sa principale fonction est d’assembler et de transporter les protéines destinées à s’associer aux membranes ou à être sécrétées • le réticulum endoplasmique lisse n’est pas associé à des ribosomes. IL participe à la synthèse des lipides (phospholipides membranaires, acides gras, stéroïdes...) et joue un rôle dans la glycosylation des protéines, la détoxification des cellules et le stockage du calcium Les rôles du réticulum endoplasmique • Réticulum endoplasmique granuleux – Synthèse de protéines membranaires ou destinées à être sécrétées • Réticulum endoplasmique lisse – Modification post-traductionnelle des protéines : Nglycosylation des protéines, repliement,... – Synthèse des phospholipides membranaires – Détoxification des substances liposolubles – Stockage des ions calcium Le rôle du réticulum endoplasmique dans la synthèse des protéines destinées à s’associer aux membranes ou à être sécrétées Le rôle du système endo-membranaire dans la synthèse protéique pulse : 1 min [3H]-leucine chasse : 3 min Réticulum Endoplasmique chasse : 20 min Appareil de Golgi chasse : 90 min Vésicules de Sécrétion La membrane plasmique La membrane plasmique • Délimite la cellule et sépare le cytoplasme du milieu extérieur • Constituée d’une bicouche de lipides, essentiellement des phospholipides et du cholestérol • Associée à des protéines – Transmembranaires : insérées dans la double couche phospholipidique – Intracellulaires ou extracellulaires, ancrées par des lipides ou associées à des protéines transmembranaires • Fonctions principales – Protection du fait de son association avec le glycocalyx – Echanges entre les milieux intracellulaire et extracellulaire : canaux ioniques, transporteurs,… – Signalisation cellulaire : récepteurs des cytokines, des facteurs de croissance, des hormones… Les différents types de protéines membranaires Protéines transmembranaires Protéines ancrées par des lipides Protéines associées à des protéines membranaires Le glycocalyx • Composé d'une couche de polyholosides liée de manière covalente aux lipides et aux protéines de la membrane • Présent dans tous les types cellulaires • Très hydrophile et d’épaisseur variable pouvant atteindre 0,5 µm Les radaux lipidiques • Microdomaines de la membrane plasmique, riches en cholestérol et en sphingolipides mais pauvres en DHA (Acide Docosa Hexaénoïque) • Structures rigides constituant des zones privilégiées pour l'activité de certaines protéines qui y sont intégrées • Epaisseur de 70 nm environ Les caractéristiques et le rôle de la mitochondrie • Organite de 1-2 à 10 μm de long et de 0, 5 à 1 μm de diamètre composé d’une membrane externe, d’une membrane interne et contenant un génome mitochondrial • Centrale énergétique de la cellule: c'est dans la mitochondrie que se déroulent les dernières étapes du cycle respiratoire qui convertit l'énergie des molécules organiques issues de la digestion (glucose) en énergie • Participent à la mort cellulaire (apoptose) • Concentration et stockage des ions calcium, sodium et potassium Les outils et approches expérimentales utilisées par les chercheurs Master IADE – Année 2012-2013 Les outils et les approches expérimentales • Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules • Les cultures bactériennes • Clonage et manipulation de l’ADN dans des bactéries • Les cultures de cellules eucaryotes • Les techniques de biologie cellulaire • Souris transgéniques et souris porteuses de mutations génétiques ciblées Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules (1) • Lyse de cellules en absence ou en présence de détergents • Selon les cas : – Purification des organelles, des membranes et du cytosol par centrifugation – Fractionnement par chromatographie d’exclusion, chromatographie sur couche mince ou chromatographie en phase gazeuse – Purification des acides nucléiques par extraction phénol/chloroforme et précipitation en présence d’éthanol Les méthodes de purification et d’analyse des molécules présentes dans les cellules (2) • Séparation et visualisation des protéines par électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide • Séparation et visualisation de fragments d’ADN par électrophorèse à travers un gel d’agarose • Détermination de la séquence nucléotidique d’un gène • Détermination de la séquence d’acides aminés d’une protéine Centrifugation Chromatographie d’exclusion Séparation de protéines par électrophorèse Séparation de fragments d’ADN par électrophorèse Les cultures bactériennes Les plasmides bactériens • Molécule d'ADN surnuméraire et circulaire distincte de l'ADN chromosomique • Capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de cellule • Peuvent contenir des gènes qui permettent à une bactérie d’être résistante à une antibiotique • Peuvent être modifiés par des techniques de recombinaison génétique in vitro et réintroduits dans des bactéries par transfection Le clonage d’un gène dans un plasmide Les principales enzymes utilisées pour modifier des plasmides • Enzyme des restriction : protéine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Il en existe plusieurs centaines qui reconnaissent chacune une séquence différente • ADN ligase : qui répare les brins brisés d'ADN et qui peut former des liaisons phospho-diester covalentes et lier ou connecter des brins d'ADN Exemples d’enzyme de restriction Exemple de ligation
