Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ
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Bioinformatique et Biologie Structurale I/ – Principes et techniques A/ L’information structurale B/ Les différentes techniques de détermination de structure C/ Les nouveaux challenges de la biologie structurale II/ – Application à l’étude d’enzymes d’intérêt médical A/ Un bref aperçu de ce que l’on appelle « Drug design » B/ Recherche d’inhibiteurs d’aminopeptidases de Streptocoques C/ Relations structure-fonction d’hélicases impliquées dans les cancers Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Activité hélicase – Il en existe de 2 types : les ADN-hélicases et les ARN-hélicases – Les ADN-hélicases sont des enzymes qui déroulent l'hélice d'ADN en 2 brins, permettant ainsi la replication et la transcription de l'ADN DNA helicase activity Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonctionnement d’une ADN-hélicase • Les ADN-hélicases sont des protéines ubiquitaires agissant comme des moteurs moléculaires qui exploitent l’énergie libre fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour catalyser la séparation des duplexes d’ADN énergétiquement stables. • On trouve les hélicases chez les procaryotes comme chez les eucaryotes, incluant les virus et les bactériophages. • Ces enzymes rompent les liaisons hydrogène entre les deux brins de l’hélice et se déplacent selon une seule direction sur le brin auquel elles sont liées. • Toutes les hélicases sont aussi des translocases et des ATPases ADN-dépendantes. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Rôle des hélicases Les hélicases sont essentielles à la vie cellulaire et contribuent à la stabilité génomique Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ ADN-Hélicases répertoriées • Since the discovery of the first DNA helicase in Escherichia coli in 1976, and the first eukaryotic one in the lily in 1978, a large humain number of these enzymes have been isolated from both prokaryotic and eukaryotic systems, and the number is still growing. • Most contain conserved helicase motifs that act as an engine to power DNA unwinding. • All DNA helicases share some common properties, including nucleic acid binding, NTP binding and hydrolysis, and unwinding of duplex DNA in the 3' to 5' or 5' to 3' direction. E. coli Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ RecQ Family • Les hélicases de la famille RecQ sont hautement conservées de la bactérie à l’homme et sont requises dans le maintien de l’intégrité du génome. • Elle sont impliquées dans diverses troubles génétiques humains. • On a répertorié 5 hélicases de la famille RecQ chez l’homme : RECQL, WRN, BLM, RECQL4, et RECQL5. • Les hélicases de la famille RecQ ont été ainsi désignées d’après leur homologies avec l’hélicases de E. coli et partagent des voies de recombinaison similaires. • Toutes hélicases RecQ ont des domaines conservés. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Des mutations apparaissant dans WRN et RECQ4 sont à l’origine, respectivement, des syndromes de Werner et de Rothmund-Thomson. Ces 2 maladies, tout comme le syndrome de Bloom, augmentent la prédisposition individuelle au cancer. Chaque maladie est caractérisée par une instabilité génétique, un cancer, et : Syndrome de Bloom Hair loss/graying - Cataracts Subcutaneous fat loss - Osteoporosis Arteriosclerosis - Diabetes mellitus Syndrome de Werner - vieillissement prématuré Sparse hair - Poikiloderma - Short stature - Cataracts - Skeletal defects Syndrome de Rothmund-Thompson Short stature - Immunodeficiency – Photosensitivity Diabetes mellitus - Male sterility Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Possibles rôles de WRN dans la cellule Clearing the path for DNA replication G-rich regions at telomere, rDNA clusters and d(CGG)n repeats. WRN WRN WRN G4 DNA impede fork movement WRN unravels G4 DNA Replication goes on Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ La protéine du Syndrome de Werner impliquée dans le métabolisme du télomère Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ La technique de la molécule unique révèle les propriétés spécifiques des hélicases de la famille RecQ • L’hélicase RecQ fonctionne en tant que monomère • Exemple de moteur moléculaire • Propriétés de fixation de l’ADN • Parcours de l’ADN avec changement de direction Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Vue d’ensemble • Un thématique de recherche axé sur l’étude des relations structure-fonction d’enzymes impliquées dans la régulation du génome et certains cancers • Des expertises complémentaires Biologie Moléculaire Biochimie Enzymologie Bioinformatique Radiocristallographie Physique - Molécule unique Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Structure 3D RecQ E. Coli Une enzyme multifonctionnelle Liaison à l’ADN ATPase Hélicase - désappariement - association dble brin Fonction très conservée dans l'évolution Domaine hélicase Bernstein, D. A., Zittel, M. C., and Keck, J. L. (2003) EMBO J. 22, 4910-4921 Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Fonction très conservée dans l'évolution Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Une Enzyme conservée à travers l’évolution 36 % identité ; 52 % similitudes (Alignement des séquences humaine (WRN) et bactérienne (E. coli) réalisé avec CLUSTALW) Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Modélisation moléculaire de la protéine du Syndrome de Bloom 4 domaines bioinformatique structurale - Modélisation par homologie (MODELLER) - Information structurale d'origine : RecQ E. coli - Alignement de séquences : CLUSTALW Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33, 3109-24. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Etude de mutants : le doigt de zinc contrôle toutes les fonctions de l’enzyme Fixation de l'ADN RecQ BLM E. coli OC - - - C1 C2 +/- +/- +/- + C3 C4 +/- +/- +/- + C1 C2 C3 C4 BLM ATPase Hélicase Liu, J.L., Rigolet, P., Dou, S.X.,Wang, P.Y. and Xi, X.G. (2004). J Biol Chem. 279; 42794-802. Guo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. (2005). Nucleic Acids Res. 33, 3109-24. Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mesure de l'activité de séparation des double brins d'ADN 32 (B) P Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Isoformes et domaines du doigt de zinc Isoforms RecQ5α Helicase core C-terminal extension Zn Finger Helicase activity No 410 aa C C Zn RecQ5β 991 aa RecQ5γ 435 aa C C No C C Zn dRecQ5a 1057 aa yes C C C Not determined C Zn dRecQ5b 470 aa C C C C yes Zn dRecQ5c 468 aa C C Not determined Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Mutations répertoriés Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Etude in vitro et in vivo de mutations associées à des cancer - Etude in vitro et in vivo des conséquences structurales et fonctionnelles de mutations observées chez des malades atteints du Syndrome de Bloom - Mutagenèse dirigée - Enregistrement systématique des données Banque de données Relations structure-fonction des hélicases de la famille de RecQ Etude structurale des hélicases BLM, WRN et RECQL5 Bases moléculaires du fonctionnement de l’enzyme sites de fixation à l’ADN domaines impliqués modélisation des mouvements du moteur moléculaire Enzymes seules complexées à l’ADN Essais de différents ligands de petite taille (inférieure à 20 pdb) simple brin double brin hétéroduplex Nouveau protocole de purification construction sans HIS-Tag Nouvelle technique de cristallisation : microfluidique méthode semi automatique économie de matériel biologique très grand nombre d’essais Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Autres projets • Relations avec le télomère • S3D enzyme complexé à un motif du télomère • Spécificité vis-à-vis de certains substrats • Effet des métaux autre que zinc • Etude de RIG I, un autre membre la famille RecQ [leucémie aiguë] Relations structure-fonction des hélicases de la famille RecQ Cancer et vieillissement prématuré Xu Guang Xi [CR1] Pascal Rigolet [MCF] Sophia Guo [Doctorante] Collaborations - O. MAUFFRET et S. FERMANDJIAN Structure des Acides Nucléiques et Peptides (Institut G. ROUSSY) Etude en solution du doigt de zinc de BLM en complexe avec l'ADN - V. CROQUETTE et D. BENSIMON Laboratoire de physique statistique – département de biologie (ENS PARIS) Etude des propriétés de RecQ par la technique de molécule unique - Thierry BIZEBARD LBPC – Paris - Chen YONG Laboratoire de microfluidique – département de chimie (ENS PARIS) COLLABORATIONS et FINANCEMENT VA. Bohr NIH USA F. Müller Roche Suisse M.Amor-Gueret Institut Curie Orsay V. Croquette D. Bension Paris Programme PCV CNRS JC. Brochon E. deprez Fluorescence G. Zocchi California USA R.Pansu ENS M. Le Bret Dynamique P. Tauc Imagerie IFR d’Alembert Biologie-Physique-Chimie Z. Chen Shanghai Chine Ligue contre le cancer
