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Etude des relations structure/fonction d’une bactériocine anti-Listeria, la mésentéricine Y105 Equipe de Microbiologie fondamentale et appliquée CNRS-FRE 2224, Université de Poitiers Directeur: Pr Jacques Frère Les bactériocines • Synthèse ribosomique • Produites par des bactéries • Spectre antagoniste généralement étroit • Immunité • Deux groupes suivant le producteur: - Gram négatif - Gram positif (bactéries lactiques) Les bactériocines des bactéries lactiques • Applications potentielles: clinique, alimentaire, vétérinaire, cosmétique • Classification sur critères physico-chimiques Classification des bactériocines de bactéries lactiques (d’après Klaenhammer, 1993) • Classe I: Lantibiotiques Petits peptides modifiés (nisine) • Classe II: Peptides thermostables non modifiés IIa: anti-Listeria IIb: deux composants IIc: autres peptides (Eijsink et coll., 2002) • Classe III: Protéines thermosensibles • Classe IV: Complexes Existence controversée (Nes et coll., 1996) Bactériocines de la sous-classe IIa: caractères physico-chimiques • Peptides cationiques • Thermorésistants • Taille réduite (37 à 48 résidus) Bactériocines de la sous-classe IIa: structure hélice a pont disulfure • Non structurés dans l’eau • Structurés dans environnement mimant la membrane feuillet b NH2 COOH épingle à cheveux Fregeau-Gallagher et coll., 1997 1 10 20 30 40 Bactériocines de la sous-classe IIa: spectre d’activité Mésentéricine Y105 Leucocine A Leucocine C Mundticine Mundticine KS Sakacine P Curvacine A Piscicoline 126 Carnobactériocine BM1 Carnobactériocine B2 Bavaricine MN Bactériocine 31 Entérocine P Bifidocine B Sakacine G Pédiocine PA-1 Coaguline Entérocine A Divercine V41 Plantaricine 423 Plantaricine C19 Listériocine 743A Sakacine 5X Lactococcine MMFII KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAFSAGVHRLANGGNGFW KNYGNGVHCTKKGCSVDWGYAWTNIANNSVMNGLTGGNAGWHN KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWSK KYYGNGVSCNKKGCSVDWGKAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKS KYYGNGVHCGKHSCTVDWGTAIGNIGNNAAANWATGWNAGG ARSYGNGVYCNNKKCWVNRGEATQSIIGGMISGWASGLAGM KYYGNGVSCNKNGCTVDWSKAIGIIGNNAAANLTTGGAAGWNKG AISYGNGVYCNKEKCWVNKAENKQAITGIVIGGWASSLAGMGH VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGINSFVSGVASGAGSIGRRP TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQAAGGIGQTVVxGWLGGAIPGK ATYYGNGLYCNKQKCWVDWNKASREIGKIIVNGWVQHGPWAPR ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWASGLAGMGH KYYGNGVTCGLHDCRVDRGKATCGIINNGGMWGDIG KYYGNGVSCNSHGCSVNWGQAWTCGVNHLANGGHGGVC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGTHKC TTHSGKYYGNGVYCTKNKCTVDWAKATTCIAGMSIGGFLGGAIPGKC TKYYGNGVYCNSKKCWVDWGQASGCIGQTVVGGWLGGAIPGKC KYYGNGVTCGKHSCSVNWGQAFSCSVSHLANFGHGKC KYYGNGLSCSKKGCTVNWGQAFSCGVNRVATAGHGKx KSYGNGVHCNKKKCWVDWGSAISTIGNNSAANWATGGAAGWKS KYYGNGLSCNKSGCSVDWSKAISIIGNNAVANLTTGGAAGWKS TSYGNGVHCNKSKCWIDVSELETYKAGTVSNPKDILW • Bactéries proches phylogénétiquement • Genre Listeria et espèce Enterococcus faecalis • Autres bactéries à Gram positif Consensus YGNGV C C V W X > 80%, X < 80% A Bactériocines de la sous-classe IIa: organisation génétique • En général, déterminants génétiques sur un plasmide inducteur protéine kinase régulateur de réponse immunité prébactériocine ABCtransporteur protéine accessoire Transport et maturation Bactériocine mature Protéine accessoire Extérieur • Système de transport dédié (DTS) Membrane • ABC-transporteur et sa protéine accessoire • Hélices transmembranaires Intérieur • Deux domaines cytoplasmiques: N C - hydrolyse ATP ADP + Pi - maturation • Leader à doublet de glycines Peptide leader ATP prébactériocine D’après Simon, 2001 Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (1) A • Modèles proposés • Intervention d’un récepteur? PTS mannose (Dalet et coll., 2001; Gravesen et coll., 2002) B A. Modèle “en douve de tonneau” ou “barrel-stave”. B. Modèle ”en tapis” ou ”carpet”. (Bechinger, 1999) Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (2) • Partie N-terminale - consensus YGNGV - charges positives - feuillet b - premier pont disulfure Bactériocines de sous-classe IIa: mode d’action (3) • Partie C-terminale - hélice a centrale - épingle à cheveux - second pont disulfure - rôle des tryptophanes Notre modèle: la mésentéricine Y105 (1) Héchard et coll., 1992 * Résidus dans la leucocine A I26V* • Peptide de 37 résidus, PM= 3868 • Leuconostoc mesenteroides Y105 • Séquence proche de celle de la leucocine A • Active contre bactéries des genres Listeria, Leuconostoc, Lactobacillus, Carnobacterium, Pediococcus et Enterococcus A22F* Christian Lacombe, communication personnelle Notre modèle: la mésentéricine Y105 (2) • Deux opérons sur le plasmide pHY30 ? immunité pré-MesY105 Héchard et coll., 1999 protéine accessoire ABCtransporteur immunité? pré-MesB105 Préambule • Objectif: étude des relations structure/fonction • Condition: obtenir une collection de MesY105 modifiées • Moyens à mettre en œuvre: - système efficace de production de peptides - protocole mutagenèse adapté - caractérisation des dérivés obtenus Production des bactériocines: protéines de fusion Fusion XmnI (MBP)::MesY105 DraI Maltose PstI Binding Protein PstI mat-mesY mesY malE LacZ • Avantages: XmnI/DraI PstI - E. coli: bactérie facile à manipuler pDMYC02 pMal-C2 - Prendements de production importants pDMYC01 pGEM-T malE mat-mesY 6,6 kpb 3,1 3 kpb kpb - système inductible(New England Biolabs) - purification rapide taq Site de clivage du polypeptide par le facteur Xa Mauvais rendement lié à un clivage inefficace Utilisation du système de transport dédié à MesY105 • Expression chez Leuconostoc (Ln.) mesenteroides • Avantages: - bactérie relativement facile à manipuler - bactériocine mature - sécrétion - purification facilitée Système de production adéquat Expression par Ln. mesenteroides: pFBYC04 système à deux plasmides Leader Terminateur mesI mesY RBS PmesYI EcoRI EcoRI LacZ EcoRI EcoRI • pDMJF01: transport et maturation mesI pMK4 • pDMJF:YI: MesY105 et immunité pDMJF:YI PmesCDE PmesYI 6,4 kpb Immunité mais pas MesY105 mesC mesD mesE mesF apR pFBYC04 mesI mesY mesB-part mesH mesY • Les deux plasmides simultanément Sécrétion de MesY105 pDMJF01 PmesYI mesI PmesCDE mesC mesB-part ori mesD mesE mesF mesH Expression par Ln. mesenteroides: Bilan • Production similaire à la souche sauvage • Production inférieure à DSM20484 (pFBYC04) • Elimination de mesI, mesH et mesF PmesCDE pDMJF01 Production similaire à DSM20484 (pFBYC04)mesB-part PmesYI SystèmemesI satisfaisant expression demesF bactériocines mesCpour mesD mesE mesH pDMJF03 pFBYC04 mesI PmesYI PmesYI mesY PmesCDE PmesCDE mesC mesC mesB-part mesD mesD mesE mesE mesF mesH Expression hétérologue de peptides Utilisation du système à deux plasmides • Production de MesB105 • Production deMesB105 la pédiocine PA-1 - leader de reconnu • Production d’autres peptides - promoteur de MesY105 nécessaire protéine d’immunité codée par mesH Peptide Vaso Intestinal - leader de la pédiocine PA-1 et reconnu co-production de MesY105 MesB105 Mutagenèse aléatoire par PCR: Mise au point d’un protocole Un codon muté par séquence codant MesY105 mature • Conditions particulières de PCR - MnCl2/ MgCl2 = 1/5 - déséquilibre en nucléotides (dGTP limitant) 12 séquences mutées sur 40 analysées Mutagenèse aléatoire par PCR: obtention des peptides dérivés Sur 12 peptides potentiels, 5 non obtenus - séquences ADN vérifiées - problème de maturation ou sécrétion? MesY105 Y3C C14S C14Y R28C W37C 1 10 20 30 KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW --C----------------------------------------------S-----------------------------------Y-------------------------------------------------C--------------------------------------------C MesY105 et ses dérivés : activité anti-Listeria CMI (M) 1 10 20 30 G13E H8L H8Y MesY105 KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW H8L mesY -------L----------------------------s15f w 18f h8y w 37f a21v A24P h8l g13eR28H a24p r28h mes36 1,0E-04 • Mes Y105 et dix dérivés testés H8Y -------Y----------------------------•1,0E-05 Activité antagoniste réduite pour tous les dérivés G13E ------------E-----------------------• Trois groupes en fonction de l’activité S15F --------------F---------------------1,0E-06 *W18F -----------------F------------------1,0E-07 A21V S15F --------------------V---------------A24P -----------------------P------------1,0E-08 W18F A21V R28H ---------------------------H--------1,0E-09 W37F *W37F ------------------------------------F D37 1,0E-10 Christian Lacombe, communication personnelle *mes36 KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGF Dérivés de MesY105 : types de modification • Encombrement stérique (S15F, A21V, R28H) • Charge (H8Y, H8L,G13E) • Polarité (H8L, S15F) • Point de flexibilité de l’hélice (A21V, R28H) • Résidu casseur d’hélice (A24P) • Résidus à l’interface eau/lipides (W18F, W37F, mes36) MesY105 et ses dérivés : structure secondaire • Dichroïsme circulaire en milieu mimant la membrane • Comparaison du degré d’hélicité / MesY105 • Trifluoroéthanol (TFE) Favorise structure en hélice • Lysophosphatidylcholine (LPC) Lipide zwittérionique formant des micelles G13E H8L H8Y S15F W18F 88 A24P R28H MesY105 et ses dérivés : %Ha/ %Ha/ MesY105 MesY105 structure ensecondaire LPC en TFE(2) A21V W37F D37 100 MesY105 MesY105 • Peptides dans l’eau s15f non structurés 97 100 w18f -1 -1 -1 -1 .L.mol (cm De /n /n (cm )) ) (cm .L.mol De De/n 66 MIC/ MesY105 100 1 100 3 76 130% -1 30% 44 • Structuration progressive avec quantités croissantes 0% h8y 74 91 2040% de 22TFE 2 w37f 90 88 2953% • Hélicité différente dans TFE et LPC a21v 99 78 4660% 000 0% • Hélicité variable selon le peptide 68% 180 180 180 -2 -2 -2 h8l 220 220 220 94 260 260 260 89 300 52 300 300 77% 90% g13e n’est pas seule78 98 l’activité -4Hélicité à déterminer -4 -4 -6 -6 -6 7880% 90% a24p 63 50 6000 r28h 36 69 12000 (nm) (nm) 59 72 16600 mes36 MesY105 et ses dérivés : interaction avec les micelles (1) Intensité de fluorescence (U.A.) Fluorescence intrinsèque de MesY105 2,E+06 • Fluorescence intrinsèque des tryptophanes • Longueur 2,E+06 d’onde d’émission dépend du solvant 1,E+06 • Tryptophanes de MesY105: D - exposés au solvant dans tampon aqueux 5,E+05 - peu enfouis dans les micelles 0,E+00 300 320 340 360 380 400 (nm) Ri=0 Ri=12,5 Ri=22 Ri=31 Ri=40,5 420 440 MesY105 et ses dérivés : interactions avec les micelles (2) G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 • Trois dérivés avec substitution de tryptophane: - W18 plus enfoui que W37 - aromaticité importante en position 37 • Autres dérivés: - trois interagissent très peu: activité faible - interaction similaire à MesY105 Lien entre activité et interaction avec la membrane MesY105 et ses dérivés : structure tridimensionnelle • Modélisation sur la base de la leucocine A - structure similaire à la leucocine A - seul a24p est modifié • Résonance magnétique nucléaire - résultats préliminaires - partie N-terminale en feuillet b - partie C-terminale à déterminer Christian Lacombe, communication personnelle G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V • H8L W37F D37 MesY105 et ses dérivés : Bilan (partie N-terminale) Baisse d’activité liée au changement de charge Pas ou peu d’impact sur l’hélicité • H8Y Interactions électrostatiques Reconnaissance par récepteur? • G13E Pas d’impact sur hélicité ou interaction avec les micelles • S15F Position moins importante Interaction au récepteur modulée? G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V •A21V • A24P • R28H W37F D37 MesY105 et ses dérivés : Bilan (hélice a) Pas de rapport entre activité, hélicité et interaction avec les micelles Point de flexibilité de l’hélice? Interaction au récepteur modulée? Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles Hélice a nécessaire mais pas suffisante Lien entre activité, hélicité et interaction avec les micelles Point de flexibilité de l’hélice? Positionnement hélice dans membrane? G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 MesY105 et ses dérivés : Bilan (tryptophanes) • W18F Interface membrane/solvant W18 plus enfoui que W37 • W37F Aromaticité indispensable en position 37 Insertion dans la membrane • mes36 W37 stabilise position dans la membrane (épingle à cheveux) G13E H8L H8Y A24P R28H S15F W18F A21V W37F D37 Conclusion: interaction au récepteur • Récepteur EIItMan (Gravesen et coll., 2002, Dalet et coll., 2001) • Interaction récepteur/ partie N-terminale - rôle de la région conservée • Partie C-terminale module l’interaction - rôle de A21 - spécificité de cible (Fimland et coll., 1996) Conclusion: interaction avec la membrane • Interactions électrostatiques membrane/ région Nphase + terminale hydrophile + W + - rôle des charges F W • W18 et W37 favorisent l’enfouissement de l’hélice R • phase W18, W37 et R28 stabilisent position de l’hélice hydrophobe • Epingle à cheveux • Hélice: - non-transmembranaire - angle faible d’insertion (Bennik et coll., 1998) Bactériocine de classe IIa Bactériocine de classe IIa Interaction initiale avec le PTS EIItMan PTS EIItMan Interaction initiale avec le PTS EIItMan Installation dans la membrane Installation dans la membrane Association de plusieurs molécules Ouverture du PTS EIItMan fuite de matériel cellulaire dissipation de la force protomotrice Destructuration de la membrane Perspectives (1) • Structure tridimensionnelle • Mutagenèse dirigée - A21, R28 - point de flexibilité - plus hydrophobe/ hydrophile - épingle à cheveux - résidus clés N-terminaux Perspectives (2) • Dichroïsme sur modèles plus réalistes • Interaction récepteur/ peptide • Comparaison des spectres • Production de peptides à intérêt thérapeutique Régulation de l’expression IF ATP HPK RR HPK-P ADP Simon, 2001 RR-P Activation des gènes Antimicrobiens: éléments structuraux • Charge du peptide • Hélicité • Domaines hydrophile et hydrophobe de l’hélice • Composition en lipides • Récepteur? Hélice aMesY105 Face apolaire Face polaire = 5,64 = 53,3° = 53,3° Hélice a flexible phase hydrophile phase hydrophobe + + W W F Lysophosphatidylcholine Mutagenèse dirigée MesY105 A21L A21N R28K H27G G25I S15T S15W S12K S12H G13K G13H N17D N17Q 1 10 20 30 KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAASAGIHRLANGGNGFW --------------------L-----------------------------------N------------------------------------------K----------------------------------G---------------------------------I-------------------------T-----------------------------------W--------------------------------K-----------------------------------H------------------------------------K-----------------------------------H---------------------------------------D-----------------------------------Q--------------------
