diapostage

Optimisation des conditions d’actions de
la protéinase K au cours d’une
hybridation in situ sur embryon de
lamproie
Plan général
PARTIE ECONOMIQUE
• Le CNRS : son histoire, sa hiérarchisation,
ses ressources, ses dépenses
• L’IEM : ses structures, ses projets
• L’équipe « développement et évolution des
vertébrés » : ses projets
PARTIE SCIENTIFIQUE
• Introduction
• L’hybridation in situ : une étape décisive
• Mise au point des conditions d’utilisation de
la protéinase K
• Application du nouveau protocole
DISCUSSION
• Utilité de la mise au point
• Application à grande échelle
• Aide précieuse pour la continuité de la
recherche sur les vertébrés
PARTIE ECONOMIQUE
Le Centre National de Recherche
Scientifique
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•
19 octobre 1939 : création
1945 : recherche fondamentale
Années 80 : unités mixtes de recherche
Large spectre de connaissance, implantation
partout dans l’hexagone
Le CNRS en chiffre
•
•
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•
18 délégations
1256 unités de recherche
Plus de 4000 brevets déposés
Création de plus de 100 entreprises depuis
1999
• 81 accords avec 50 pays
Les ressources du CNRS
• Subventions de l’Etat : 72%
• Ressources propres : 15%
• Amortissements : 9%
Les dépenses du CNRS
• Masse salariale : 48%
• Fonctionnement : 23%
• Amortissements : 9%
L’unité immunologie et
embryologie moléculaire
•
•
•
•
Reconnaissance moléculaire et immunité
innée
Immunité acquise et allergie
Morphogenèse et embryologie
moléculaire
Développement et évolution des vertébrés
L’équipe « développement et
évolution des vertébrés »
• Embryologie et histologie
• Génétique du développement : souris,
lamproie
• Comparaison chez les autres vertébrés
PARTIE SCIENTIFIQUE
Introduction
• Lamproie :
cyclostomes
• À la base de
l’évolution des
vertébrés
Pourquoi la lamproie ?
• Étudier la génétique du développement
• Définir les mécanismes moléculaires qui
fondent ce groupe : les vertébrés
• Corrélations avec les autres vertébrés
L’hybridation in situ
• Peu connue chez la lamproie
• Nécessite une mise au point
• Utilisation à grande échelle
Matériel et méthode
Technique d’hybridation
• Synthèse de sondes ARN anti-sens
• Détection d’un brin d’ADNm sur l’embryon
Duplication de l’ADNc
• Intégration d’un ADNc
dans le plasmide
• Amplifié par réaction de
polymérisation en chaîne
Synthèse de matrice PCR
• Nécessaire en grande quantité pour la
synthèse des sondes ARN
• Enzyme utilisée : Taq polymérase (72°C)
Principe de la PCR
Synthèse des sondes ARN
• Transcription in vitro
de l’ADN en ARN
• Incorporation d’un
nucléotide marqué à la
digoxigénine
Hybridation sur embryons in toto
• Fixation des sondes ARN anti-sens
synthétisées sur les ARNm cibles
• Fixation des anticorps anti-digoxigénine sur
les sondes ARN
• Révélation chromogénique
• Visualisation des territoires d’expressions
des sondes ARN
RESULTATS
Mise au point des conditions
d’hybridation sur embryon de
lamproie
• Test des conditions type « roussette »
• Mise au point des conditions d’action de la
protéinase K
• Tests des conditions sur deux nouveaux
gènes : Pitxa1, NeuroD
Tests des conditions « roussette »
Photographie
Résultats
Conclusions
•Taches violettes
•Cassure sur la
partie postérieure
•Débris de
chorion
•Bruit de fond
•Taches violettes
•Cassure sur la
partie antérodorsale
•Débris de
chorion
•Bruit de fond
Conclusion du test
• Présence de bruit de fond : signaux
spécifiques masqués
• Résultat insatisfaisant  Mise au point
Optimisation des conditions
d’action de la protéinase K
• Problème de bruit de fond : réglé
• Incubation à différents temps
• Détermination du temps d’action optimal
7.5min à 37°C
15min à 37°C
22.5min à 37°C
30min à 37°C
45min à 37°C
45min à température
ambiante
Conclusion de l’optimisation
• Apparition des signaux de manière
progressive
• Bruit de fond éliminé
• Temps d’action optimal : 45min à 37°C
Test sur NeuroD
Photographies
Résultats - Observations
Signal spécifique dans
tout le système nerveux
de l’embryon
Discussions
• Conditions
d’hybridations sur
l’embryon de lamproie
• Optimisation à petite
échelle
• Application à grande
échelle
• Mécanismes de la
génétique du
développement des
vertébrés