Optimisation des conditions d’actions de la protéinase K au cours d’une hybridation in situ sur embryon de lamproie Plan général PARTIE ECONOMIQUE • Le CNRS : son histoire, sa hiérarchisation, ses ressources, ses dépenses • L’IEM : ses structures, ses projets • L’équipe « développement et évolution des vertébrés » : ses projets PARTIE SCIENTIFIQUE • Introduction • L’hybridation in situ : une étape décisive • Mise au point des conditions d’utilisation de la protéinase K • Application du nouveau protocole DISCUSSION • Utilité de la mise au point • Application à grande échelle • Aide précieuse pour la continuité de la recherche sur les vertébrés PARTIE ECONOMIQUE Le Centre National de Recherche Scientifique • • • • 19 octobre 1939 : création 1945 : recherche fondamentale Années 80 : unités mixtes de recherche Large spectre de connaissance, implantation partout dans l’hexagone Le CNRS en chiffre • • • • 18 délégations 1256 unités de recherche Plus de 4000 brevets déposés Création de plus de 100 entreprises depuis 1999 • 81 accords avec 50 pays Les ressources du CNRS • Subventions de l’Etat : 72% • Ressources propres : 15% • Amortissements : 9% Les dépenses du CNRS • Masse salariale : 48% • Fonctionnement : 23% • Amortissements : 9% L’unité immunologie et embryologie moléculaire • • • • Reconnaissance moléculaire et immunité innée Immunité acquise et allergie Morphogenèse et embryologie moléculaire Développement et évolution des vertébrés L’équipe « développement et évolution des vertébrés » • Embryologie et histologie • Génétique du développement : souris, lamproie • Comparaison chez les autres vertébrés PARTIE SCIENTIFIQUE Introduction • Lamproie : cyclostomes • À la base de l’évolution des vertébrés Pourquoi la lamproie ? • Étudier la génétique du développement • Définir les mécanismes moléculaires qui fondent ce groupe : les vertébrés • Corrélations avec les autres vertébrés L’hybridation in situ • Peu connue chez la lamproie • Nécessite une mise au point • Utilisation à grande échelle Matériel et méthode Technique d’hybridation • Synthèse de sondes ARN anti-sens • Détection d’un brin d’ADNm sur l’embryon Duplication de l’ADNc • Intégration d’un ADNc dans le plasmide • Amplifié par réaction de polymérisation en chaîne Synthèse de matrice PCR • Nécessaire en grande quantité pour la synthèse des sondes ARN • Enzyme utilisée : Taq polymérase (72°C) Principe de la PCR Synthèse des sondes ARN • Transcription in vitro de l’ADN en ARN • Incorporation d’un nucléotide marqué à la digoxigénine Hybridation sur embryons in toto • Fixation des sondes ARN anti-sens synthétisées sur les ARNm cibles • Fixation des anticorps anti-digoxigénine sur les sondes ARN • Révélation chromogénique • Visualisation des territoires d’expressions des sondes ARN RESULTATS Mise au point des conditions d’hybridation sur embryon de lamproie • Test des conditions type « roussette » • Mise au point des conditions d’action de la protéinase K • Tests des conditions sur deux nouveaux gènes : Pitxa1, NeuroD Tests des conditions « roussette » Photographie Résultats Conclusions •Taches violettes •Cassure sur la partie postérieure •Débris de chorion •Bruit de fond •Taches violettes •Cassure sur la partie antérodorsale •Débris de chorion •Bruit de fond Conclusion du test • Présence de bruit de fond : signaux spécifiques masqués • Résultat insatisfaisant Mise au point Optimisation des conditions d’action de la protéinase K • Problème de bruit de fond : réglé • Incubation à différents temps • Détermination du temps d’action optimal 7.5min à 37°C 15min à 37°C 22.5min à 37°C 30min à 37°C 45min à 37°C 45min à température ambiante Conclusion de l’optimisation • Apparition des signaux de manière progressive • Bruit de fond éliminé • Temps d’action optimal : 45min à 37°C Test sur NeuroD Photographies Résultats - Observations Signal spécifique dans tout le système nerveux de l’embryon Discussions • Conditions d’hybridations sur l’embryon de lamproie • Optimisation à petite échelle • Application à grande échelle • Mécanismes de la génétique du développement des vertébrés